JPH04258290A - Ｉｉ型−制限エンドヌクレーアーゼ及びこれを取得する方法並びに相補的２本鎖ｄｎａ−配列を認識しかつ切断する方法 - Google Patents
Ｉｉ型−制限エンドヌクレーアーゼ及びこれを取得する方法並びに相補的２本鎖ｄｎａ−配列を認識しかつ切断する方法Info
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- JPH04258290A JPH04258290A JP3261616A JP26161691A JPH04258290A JP H04258290 A JPH04258290 A JP H04258290A JP 3261616 A JP3261616 A JP 3261616A JP 26161691 A JP26161691 A JP 26161691A JP H04258290 A JPH04258290 A JP H04258290A
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- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規のＩＩ型−制限エ
ンドヌクレーアーゼＳｓｐ４８００Ｉ、その取得法及び
その使用に関する。
ンドヌクレーアーゼＳｓｐ４８００Ｉ、その取得法及び
その使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼは、
特定のＤＮＡ−配列を認識し、切断可能にするエンドデ
ソキシリボヌクレアーゼである。ここでは、標的配列中
のホスホジエステル橋が、しかも各々のポリヌクレオチ
ド鎖中で１個が加水分解される。従って、ＩＩ−型制限
エンドヌクレーアーゼは、ＤＮＡ−分子の分析のために
重要である。従来、多くのＤＮＡ−配列に関して特異的
なＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼは公知であるが、
ＤＮＡ−配列に関して特異的であって、従来の公知の制
限エンドヌクレーアーゼのいずれによっても認識されな
い他のＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼの供給に対す
る需要があった。
特定のＤＮＡ−配列を認識し、切断可能にするエンドデ
ソキシリボヌクレアーゼである。ここでは、標的配列中
のホスホジエステル橋が、しかも各々のポリヌクレオチ
ド鎖中で１個が加水分解される。従って、ＩＩ−型制限
エンドヌクレーアーゼは、ＤＮＡ−分子の分析のために
重要である。従来、多くのＤＮＡ−配列に関して特異的
なＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼは公知であるが、
ＤＮＡ−配列に関して特異的であって、従来の公知の制
限エンドヌクレーアーゼのいずれによっても認識されな
い他のＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼの供給に対す
る需要があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、従
来はこのような酵素のいずれによっても認識されていな
かった配列を特異的に認識し、切断することを可能とす
る新規の制限エンドヌクレーアーゼを提供することを課
題としている。
来はこのような酵素のいずれによっても認識されていな
かった配列を特異的に認識し、切断することを可能とす
る新規の制限エンドヌクレーアーゼを提供することを課
題としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】この課題は、本発明によ
り、認識配列及び標識付けにより特徴付けられた切断位
置：
り、認識配列及び標識付けにより特徴付けられた切断位
置：
【０００５】
【化４】
【０００６】を有するＩＩ型−制限エンドヌクレーアー
ゼにより解決される。
ゼにより解決される。
【０００７】本発明による新規制限エンドヌクレーアー
ゼ（以後これをＳｓｐ４８００Ｉと称する）は、５０℃
での至適温度を有する。この酵素は、２−メルカプトエ
タノール１．０ｍモル／ｌ、ＭｇＣｌ２ ５ｍモル／
ｌ及びＮａＣｌ １００ｍモル／ｌを有するトリス／Ｈ
Ｃｌ−緩衝液１０ｍモル／ｌ中、ｐＨ７．５〜８．５で
良好な活性を有する。この至適ｐＨはｐＨ８．０である
。
ゼ（以後これをＳｓｐ４８００Ｉと称する）は、５０℃
での至適温度を有する。この酵素は、２−メルカプトエ
タノール１．０ｍモル／ｌ、ＭｇＣｌ２ ５ｍモル／
ｌ及びＮａＣｌ １００ｍモル／ｌを有するトリス／Ｈ
Ｃｌ−緩衝液１０ｍモル／ｌ中、ｐＨ７．５〜８．５で
良好な活性を有する。この至適ｐＨはｐＨ８．０である
。
【０００８】認識配列は、ウィルスＳＶ４０及びアデノ
２、ファージラムダ及びｐｈｉＸ１７４のＤＮＡの完全
消化により及びファージ誘導体Ｍ１３ｍｐ７並びにプラ
スミドｐＢ３２２及びｐＢ３２８を確認することができ
る。これらＤＮＡ分子をＳｓｐ４８００Ｉで処理する。
２、ファージラムダ及びｐｈｉＸ１７４のＤＮＡの完全
消化により及びファージ誘導体Ｍ１３ｍｐ７並びにプラ
スミドｐＢ３２２及びｐＢ３２８を確認することができ
る。これらＤＮＡ分子をＳｓｐ４８００Ｉで処理する。
【０００９】第１表は、実験的に観察された切断位置特
異性と、次の配列：５′−ＴＧＴＡＣＡ−３′を認識す
る酵素に関するコンピュータ測定された切断位置特異性
との比較を示している。
異性と、次の配列：５′−ＴＧＴＡＣＡ−３′を認識す
る酵素に関するコンピュータ測定された切断位置特異性
との比較を示している。
【００１０】
【表１】
【００１１】この酵素の認識配列内の切断位置は、ユニ
バーサルな配列決定プライマーの結合位置に対して約３
０〜２００塩基の間隔で（Ｍｅｓｓｉｎｇ．Ｊ．等の（
１９８１）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２、３０
９〜３２１）、この認識配列を有するＭ１３−誘導体で
測定することができる。このＭ１３−誘導体の１本鎖Ｄ
ＮＡの所で、まず、ユニバーサルな配列決定プライマー
を用いて、ジデソキシ連鎖切断法による配列反応が行な
われる（Ｓａｎｇｅｒ．Ｆ．等の（１９７７）．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎｕｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ７４、５
６０〜５６４、Ｍｅｓｓｉｎｇ．Ｊ．等の（１９８１）
、Ｎｕｔｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９．３０９〜３２１
）。
バーサルな配列決定プライマーの結合位置に対して約３
０〜２００塩基の間隔で（Ｍｅｓｓｉｎｇ．Ｊ．等の（
１９８１）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２、３０
９〜３２１）、この認識配列を有するＭ１３−誘導体で
測定することができる。このＭ１３−誘導体の１本鎖Ｄ
ＮＡの所で、まず、ユニバーサルな配列決定プライマー
を用いて、ジデソキシ連鎖切断法による配列反応が行な
われる（Ｓａｎｇｅｒ．Ｆ．等の（１９７７）．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎｕｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ７４、５
６０〜５６４、Ｍｅｓｓｉｎｇ．Ｊ．等の（１９８１）
、Ｎｕｔｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９．３０９〜３２１
）。
【００１２】これと並行して、配列決定プライマーをＴ
４−ポリヌクレオチド−キナーゼ及び［３２Ｐ］ＡＴＰ
を用いて、５′−末端で、放射能標識付けする。この５
′−末端標識された配列決定プライマーの１本鎖Ｍ１３
−ＤＮＡへのハイブリド結合の後に、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ（クレノフ酵素）及びｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰからのデソキシヌクレオチド−三燐酸混
合物を用いる充填反応で部分的２本鎖ＤＮＡが製造され
る。５′−末端で新規合成されたその鎖が放射能標識さ
れているこのＤＮＡを制限エンドヌクレーアーゼＳｓｐ
４８００Ｉで切断する。この切断バッチの半分を、付加
的になおＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて、全ての４種
のデソキシヌクレオチド三燐酸の混合物の存在下で処理
して、平滑なＤＮＡ末端を得る。
４−ポリヌクレオチド−キナーゼ及び［３２Ｐ］ＡＴＰ
を用いて、５′−末端で、放射能標識付けする。この５
′−末端標識された配列決定プライマーの１本鎖Ｍ１３
−ＤＮＡへのハイブリド結合の後に、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ（クレノフ酵素）及びｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰからのデソキシヌクレオチド−三燐酸混
合物を用いる充填反応で部分的２本鎖ＤＮＡが製造され
る。５′−末端で新規合成されたその鎖が放射能標識さ
れているこのＤＮＡを制限エンドヌクレーアーゼＳｓｐ
４８００Ｉで切断する。この切断バッチの半分を、付加
的になおＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて、全ての４種
のデソキシヌクレオチド三燐酸の混合物の存在下で処理
して、平滑なＤＮＡ末端を得る。
【００１３】この反応生成物の分析を、配列決定ゲル（
尿素８モル／ｌ、５％ポリアクリルアミド）上での電気
泳動及び引続くオートラジオグラフィにより行なう。 この結果の解釈は、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）Ｎ．Ｌ．及
びスミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｍ．の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５（１９８０）、３９１〜
４０１）により実施する。放射能標識付けされたフラグ
メントの移動距離と配列ライター（Ｓｅｑｕｅｎｚｌｅ
ｉｔｅｒ）との比較により、切断位置の状態が測定され
る。付加的にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理された試料
は、単にＳｓｐ４８００Ｉで切断された試料と比べて、
４ｂｐだけ延長されたバンドの移動距離を示す。従って
、Ｓｓｐ４８００Ｉは、４ｂｐだけ５′−突出している
ＤＮＡ−末端を生じることが明らかである。従って、Ｓ
ｓｐ４８００Ｉによるこの切断は、次の特異性を有する
認識配列内で行われる：
尿素８モル／ｌ、５％ポリアクリルアミド）上での電気
泳動及び引続くオートラジオグラフィにより行なう。 この結果の解釈は、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）Ｎ．Ｌ．及
びスミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｍ．の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５（１９８０）、３９１〜
４０１）により実施する。放射能標識付けされたフラグ
メントの移動距離と配列ライター（Ｓｅｑｕｅｎｚｌｅ
ｉｔｅｒ）との比較により、切断位置の状態が測定され
る。付加的にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理された試料
は、単にＳｓｐ４８００Ｉで切断された試料と比べて、
４ｂｐだけ延長されたバンドの移動距離を示す。従って
、Ｓｓｐ４８００Ｉは、４ｂｐだけ５′−突出している
ＤＮＡ−末端を生じることが明らかである。従って、Ｓ
ｓｐ４８００Ｉによるこの切断は、次の特異性を有する
認識配列内で行われる：
【００１４】
【化５】
【００１５】実験的に測定された切断位置の数は、配列
：５′ＴＧＴＡＣＡ−３′に関する種々のＤＮＡでのコ
ンピュータ分析により得られた切断位置の数（第１表）
と同じである。付加的に、このデータを、Ｇｅｎｅ
１０（１９８０）、３５７〜３７０からの表と比較した
。
：５′ＴＧＴＡＣＡ−３′に関する種々のＤＮＡでのコ
ンピュータ分析により得られた切断位置の数（第１表）
と同じである。付加的に、このデータを、Ｇｅｎｅ
１０（１９８０）、３５７〜３７０からの表と比較した
。
【００１６】ストレプトマイセス属の微生物を培養し、
この細胞から酵素を取得する方法で、Ｓｓｐ４８００Ｉ
を得るのが有利である。特に、ストレプトマイセス・ｓ
ｐｅｃＢＭＴＵ４８００（ＤＳＭ６１８１）を使用する
のが有利である。
この細胞から酵素を取得する方法で、Ｓｓｐ４８００Ｉ
を得るのが有利である。特に、ストレプトマイセス・ｓ
ｐｅｃＢＭＴＵ４８００（ＤＳＭ６１８１）を使用する
のが有利である。
【００１７】この微生物ストレプトマイセス・ｓｐｅｃ
ＢＭＴＵ４８００は、ドイチェン・ザンムルング・
フォン・ミクロオルガニスメン（ＤＳＭ）、（Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ，Ｍａｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １
６，３３００ Ｂｒｏｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ＢＲＤ）
に寄託されており、寄託番号ＤＳＭ６１８１を有する。
ＢＭＴＵ４８００は、ドイチェン・ザンムルング・
フォン・ミクロオルガニスメン（ＤＳＭ）、（Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ，Ｍａｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １
６，３３００ Ｂｒｏｕｎｓｃｈｗｅｉｇ ＢＲＤ）
に寄託されており、寄託番号ＤＳＭ６１８１を有する。
【００１８】取得のために、慣用の生化学的精製法を使
用することができ、この際、その都度に得られるフラク
ション中で、この酵素の存在がその認識配列の切断によ
り容易に立証されうる。基質としては、例えばラムダー
ＤＮＡが好適である。得られるＤＮＡ−フラグメントを
アガロースゲル中、フラグメント分離のために慣用の緩
衝液系中で、エチジウムブロミドの存在下に電気泳動に
より分離する。
用することができ、この際、その都度に得られるフラク
ション中で、この酵素の存在がその認識配列の切断によ
り容易に立証されうる。基質としては、例えばラムダー
ＤＮＡが好適である。得られるＤＮＡ−フラグメントを
アガロースゲル中、フラグメント分離のために慣用の緩
衝液系中で、エチジウムブロミドの存在下に電気泳動に
より分離する。
【００１９】この酵素の取得のために使用される微生物
は、Ｍ１１１−培地（酵母エキス１０ｇ／ｌ、麦芽エキ
ス１０ｇ／ｌ）中で好気的に生長する。至適生長条件は
、２６℃、ｐＨ６．５〜７．５である。２倍化時間は約
２．５時間である。
は、Ｍ１１１−培地（酵母エキス１０ｇ／ｌ、麦芽エキ
ス１０ｇ／ｌ）中で好気的に生長する。至適生長条件は
、２６℃、ｐＨ６．５〜７．５である。２倍化時間は約
２．５時間である。
【００２０】酵素を、慣用の化学的及び機械的方法によ
り、例えば高圧分散、超音波又は酵素的崩解（Ａｕｆｓ
ｃｈｌｕβ）により単離しかつ精製する。本発明方法の
有利な実施形では、細胞をフレンチプレス上で崩解させ
る。上澄みの更なる精製は、有利に、アフィニティニク
ロマトグラフィ及びイオン交換体クロマトグラフィによ
り実施する。アフィニティニクロマトグラフィ用の物質
としては、例えばヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が好適である。好適なカチオン交
換体は、例えばホスホ−セルロース（Ｗｈａｔｍｅｎ）
である。
り、例えば高圧分散、超音波又は酵素的崩解（Ａｕｆｓ
ｃｈｌｕβ）により単離しかつ精製する。本発明方法の
有利な実施形では、細胞をフレンチプレス上で崩解させ
る。上澄みの更なる精製は、有利に、アフィニティニク
ロマトグラフィ及びイオン交換体クロマトグラフィによ
り実施する。アフィニティニクロマトグラフィ用の物質
としては、例えばヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が好適である。好適なカチオン交
換体は、例えばホスホ−セルロース（Ｗｈａｔｍｅｎ）
である。
【００２１】アニオン交換体としては、ＤＥＡＥ−セフ
ァセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）な
る名称で入手される製品が好適である。しかしながら、
当業者に公知の他のクロマトグラフィ物質も好適である
。
ァセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）な
る名称で入手される製品が好適である。しかしながら、
当業者に公知の他のクロマトグラフィ物質も好適である
。
【００２２】
【実施例】次の例で本発明を更に説明する。
【００２３】例１
微生物ストレプトマイセス・ｓｐｅｃ ＢＭＴＵ４８
００（ＤＳＭ６１８１）を、２６℃で１０〜１２時間培
養し、対数相の終わりに収穫する。培地としてＭ１１１
−培地を使用する。
００（ＤＳＭ６１８１）を、２６℃で１０〜１２時間培
養し、対数相の終わりに収穫する。培地としてＭ１１１
−培地を使用する。
【００２４】細胞ペースト（湿重量３０ｇ）を緩衝液Ａ
（トリス−ＨＣｌ ４０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、Ｅ
ＤＴＡ０．１ｍモル／ｌ、２−メルカプトエタノール７
ｍモル／ｌ）（これはプロテアーゼ阻害剤を含有する）
２．４容量中に再懸濁させる。引続き、細胞をフレンチ
プレスに２３０００ｌｂ／ｍ２で２回通すことにより崩
解させ、沈殿を分離する。上澄みにＮＨ４Ｃｌを加える
（最終濃度０．３モル／ｌ）。ポリミン−沈殿により、
核酸を除去する。引続き、遠心分離した上澄みを６０（
Ｗ／Ｖ）％硫酸アンモニウムで処理し、沈殿をヘパリン
−セファロース−カラムを通して分別する。溶離のため
に、ＮａＣｌ ０〜１モル／ｌの勾配を使用する。Ｓ
ｓｐ４８００Ｉは、ＮａＣｌ０．５〜０．７モル／ｌの
フラクション中に認められる。この活性フラクションを
緩衝液Ｂ（トリス−ＨＣｌ ４０ｍモル／ｌ、ｐＨ８
．０、ＥＤＴＡ ０．１ｍモル／ｌ、２−メルカプト
エタノール ７ｍモル／ｌ、グリセリン１０（Ｖ／Ｖ
）％）に対して平衡化させ、ＤＥＡＥ−ファースト−フ
ロウ−カラム上で分別する。溶離のために、ＮａＣｌ
０〜０．５モル／ｌの勾配を使用する。活性フラクシ
ョンを緩衝液Ｂに対して透析させる。
（トリス−ＨＣｌ ４０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、Ｅ
ＤＴＡ０．１ｍモル／ｌ、２−メルカプトエタノール７
ｍモル／ｌ）（これはプロテアーゼ阻害剤を含有する）
２．４容量中に再懸濁させる。引続き、細胞をフレンチ
プレスに２３０００ｌｂ／ｍ２で２回通すことにより崩
解させ、沈殿を分離する。上澄みにＮＨ４Ｃｌを加える
（最終濃度０．３モル／ｌ）。ポリミン−沈殿により、
核酸を除去する。引続き、遠心分離した上澄みを６０（
Ｗ／Ｖ）％硫酸アンモニウムで処理し、沈殿をヘパリン
−セファロース−カラムを通して分別する。溶離のため
に、ＮａＣｌ ０〜１モル／ｌの勾配を使用する。Ｓ
ｓｐ４８００Ｉは、ＮａＣｌ０．５〜０．７モル／ｌの
フラクション中に認められる。この活性フラクションを
緩衝液Ｂ（トリス−ＨＣｌ ４０ｍモル／ｌ、ｐＨ８
．０、ＥＤＴＡ ０．１ｍモル／ｌ、２−メルカプト
エタノール ７ｍモル／ｌ、グリセリン１０（Ｖ／Ｖ
）％）に対して平衡化させ、ＤＥＡＥ−ファースト−フ
ロウ−カラム上で分別する。溶離のために、ＮａＣｌ
０〜０．５モル／ｌの勾配を使用する。活性フラクシ
ョンを緩衝液Ｂに対して透析させる。
【００２５】引続き、緩衝液Ｂで平衡化されたホスホ−
セルロース−カラム上に加える。溶離のために、緩衝液
Ｂ中のＮａＣｌ ０〜１モル／ｌ勾配を使用する。
セルロース−カラム上に加える。溶離のために、緩衝液
Ｂ中のＮａＣｌ ０〜１モル／ｌ勾配を使用する。
【００２６】活性フラクションを一緒にし、ラーガー緩
衝液（Ｌａｇｅｒｐｕｆｆｅｒ：トリス−ＨＣｌ ２
０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、２−メルカプトエタノール
１０ｍモル／ｌ、ＮａＣｌ １００ｍモル／ｌ、
ＥＤＴＡ ０．１ｍモル／ｌ及びグリセリン５０（Ｖ
／Ｖ）％）に対して透析させる。
衝液（Ｌａｇｅｒｐｕｆｆｅｒ：トリス−ＨＣｌ ２
０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、２−メルカプトエタノール
１０ｍモル／ｌ、ＮａＣｌ １００ｍモル／ｌ、
ＥＤＴＡ ０．１ｍモル／ｌ及びグリセリン５０（Ｖ
／Ｖ）％）に対して透析させる。
【００２７】例２
活性の測定
酵素単位の定義：Ｓｓｐ４８００Ｉ ＩＵは、ラムダ
ーＤＮＡ １μｇを、５０℃で１時間内に最終量２５
μｌ中で切断する。
ーＤＮＡ １μｇを、５０℃で１時間内に最終量２５
μｌ中で切断する。
【００２８】インキュベーション緩衝液（トリス−ＨＣ
ｌ １００ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、５０℃、塩化マ
グネシウム５０ｍモル／ｌ、ＮａＣｌ １ｍモル／ｌ
及び２−メルカプトエタノール１０ｍモル／ｌ）２．５
μｌの混合物に、水１７．９μｌ中及びラムダＤＮＡ（
光学密度：５．６ＯＤ／ｍｌ）３．６μｌ及びＳｓｐ４
８００Ｉ−溶液（ＩＵ／μｌ）１μｌを加える。この溶
液を３７℃で１時間インキュベートし、氷上で冷却し、
尿素７ｍモル／ｌ、サッカロース２０（Ｖ／Ｖ）％、Ｅ
ＤＴＡ６０ｍモル／ｌ及びブロムフェノールブルー０．
０１（Ｗ／Ｖ）％より成る停止試薬を加える。引続き、
１％アガロースゲル中で、１００Ｖで３〜４時間にわた
る電気泳動により分離を実施する。得られるバンドをＤ
ＮＡ−長さ−標準との比較により固定する。
ｌ １００ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、５０℃、塩化マ
グネシウム５０ｍモル／ｌ、ＮａＣｌ １ｍモル／ｌ
及び２−メルカプトエタノール１０ｍモル／ｌ）２．５
μｌの混合物に、水１７．９μｌ中及びラムダＤＮＡ（
光学密度：５．６ＯＤ／ｍｌ）３．６μｌ及びＳｓｐ４
８００Ｉ−溶液（ＩＵ／μｌ）１μｌを加える。この溶
液を３７℃で１時間インキュベートし、氷上で冷却し、
尿素７ｍモル／ｌ、サッカロース２０（Ｖ／Ｖ）％、Ｅ
ＤＴＡ６０ｍモル／ｌ及びブロムフェノールブルー０．
０１（Ｗ／Ｖ）％より成る停止試薬を加える。引続き、
１％アガロースゲル中で、１００Ｖで３〜４時間にわた
る電気泳動により分離を実施する。得られるバンドをＤ
ＮＡ−長さ−標準との比較により固定する。
Claims (5)
- 【請求項１】 次の認識配列及び標識付けにより特徴
付けられた切断位置： 【化１】 を有するＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼ。 - 【請求項２】 ストレプトマイセス・ｓｐｅｃ Ｂ
ＭＴＵ４８００（ＤＳＭ６１８１）から得られる、請求
項１記載の制限エンドヌクレーアーゼ。 - 【請求項３】 至適温度５０℃及び至適ｐＨ値８．０
である、請求項１または２記載の制限エンドヌクレーア
ーゼ。 - 【請求項４】 次の認識配列及び標識付けにより特徴
付けられた切断位置： 【化２】 を有するＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼを取得する
方法において、ストレプトマイセス属の微生物を培養し
、その細胞から酵素を得ることを特徴とする、ＩＩ型−
制限エンドヌクレーアーゼの取得法。 - 【請求項５】 次の認識配列及び標識付けにより特徴
付けられた切断位置： 【化３】 を有するＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼを使用する
ことを特徴とする、相補的２本鎖ＤＮＡ−配列：５′−
ＴＧＴＡＣＡ−３′を認識しかつ切断する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4032213A DE4032213A1 (de) | 1990-10-11 | 1990-10-11 | Typ ii-restriktionsendonuklease ssp4800i |
| DE4032213.0 | 1990-10-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04258290A true JPH04258290A (ja) | 1992-09-14 |
| JPH0675502B2 JPH0675502B2 (ja) | 1994-09-28 |
Family
ID=6416047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3261616A Expired - Lifetime JPH0675502B2 (ja) | 1990-10-11 | 1991-10-09 | Ｉｉ型−制限エンドヌクレーアーゼ及びこれを取得する方法並びに相補的２本鎖ｄｎａ−配列を認識しかつ切断する方法 |
Country Status (5)
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|---|---|
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| JP (1) | JPH0675502B2 (ja) |
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Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3826389A1 (de) * | 1987-09-09 | 1989-03-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Typ ii-restriktionsendonuklease ksp632i |
-
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-
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Also Published As
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|---|---|
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| JPH0675502B2 (ja) | 1994-09-28 |
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| EP0480343B1 (de) | 1995-12-13 |
| US5183747A (en) | 1993-02-02 |
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