JPH0675502B2 - Ｉｉ型−制限エンドヌクレーアーゼ及びこれを取得する方法並びに相補的２本鎖ｄｎａ−配列を認識しかつ切断する方法 - Google Patents
Ｉｉ型−制限エンドヌクレーアーゼ及びこれを取得する方法並びに相補的２本鎖ｄｎａ−配列を認識しかつ切断する方法Info
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- JPH0675502B2 JPH0675502B2 JP3261616A JP26161691A JPH0675502B2 JP H0675502 B2 JPH0675502 B2 JP H0675502B2 JP 3261616 A JP3261616 A JP 3261616A JP 26161691 A JP26161691 A JP 26161691A JP H0675502 B2 JPH0675502 B2 JP H0675502B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規のＩＩ型−制限エ
ンドヌクレーアーゼＳｓｐ４８００Ｉ、その取得法及び
その使用に関する。
ンドヌクレーアーゼＳｓｐ４８００Ｉ、その取得法及び
その使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼは、
特定のＤＮＡ−配列を認識し、切断可能にするエンドデ
ソキシリボヌクレアーゼである。ここでは、標的配列中
のホスホジエステル橋が、しかも各々のポリヌクレオチ
ド鎖中で１個が加水分解される。従って、ＩＩ−型制限
エンドヌクレーアーゼは、ＤＮＡ−分子の分析のために
重要である。従来、多くのＤＮＡ−配列に関して特異的
なＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼは公知であるが、
ＤＮＡ−配列に関して特異的であって、従来の公知の制
限エンドヌクレーアーゼのいずれによっても認識されな
い他のＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼの供給に対す
る需要があった。
特定のＤＮＡ−配列を認識し、切断可能にするエンドデ
ソキシリボヌクレアーゼである。ここでは、標的配列中
のホスホジエステル橋が、しかも各々のポリヌクレオチ
ド鎖中で１個が加水分解される。従って、ＩＩ−型制限
エンドヌクレーアーゼは、ＤＮＡ−分子の分析のために
重要である。従来、多くのＤＮＡ−配列に関して特異的
なＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼは公知であるが、
ＤＮＡ−配列に関して特異的であって、従来の公知の制
限エンドヌクレーアーゼのいずれによっても認識されな
い他のＩＩ型−制限エンドヌクレーアーゼの供給に対す
る需要があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、従
来はこのような酵素のいずれによっても認識されていな
かった配列を特異的に認識し、切断することを可能とす
る新規の制限エンドヌクレーアーゼを提供することを課
題としている。
来はこのような酵素のいずれによっても認識されていな
かった配列を特異的に認識し、切断することを可能とす
る新規の制限エンドヌクレーアーゼを提供することを課
題としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】この課題は、本発明によ
り、認識配列及び標識付けにより特徴付けられた切断位
置：
り、認識配列及び標識付けにより特徴付けられた切断位
置：
【０００５】
【化４】
【０００６】を有するＩＩ型−制限エンドヌクレーアー
ゼにより解決される。
ゼにより解決される。
【０００７】本発明による新規制限エンドヌクレーアー
ゼ（以後これをＳｓｐ４８００Ｉと称する）は、５０℃
での至適温度を有する。この酵素は、２−メルカプトエ
タノール１．０ｍモル／ｌ、ＭｇＣｌ2 ５ｍモル／ｌ
及びＮａＣｌ １００ｍモル／ｌを有するトリス／ＨＣ
ｌ−緩衝液１０ｍモル／ｌ中、ｐＨ７．５〜８．５で良
好な活性を有する。この至適ｐＨはｐＨ８．０である。
ゼ（以後これをＳｓｐ４８００Ｉと称する）は、５０℃
での至適温度を有する。この酵素は、２−メルカプトエ
タノール１．０ｍモル／ｌ、ＭｇＣｌ2 ５ｍモル／ｌ
及びＮａＣｌ １００ｍモル／ｌを有するトリス／ＨＣ
ｌ−緩衝液１０ｍモル／ｌ中、ｐＨ７．５〜８．５で良
好な活性を有する。この至適ｐＨはｐＨ８．０である。
【０００８】認識配列は、ウィルスＳＶ４０及びアデノ
２、ファージラムダ及びｐｈｉＸ１７４のＤＮＡの完全
消化により及びファージ誘導体Ｍ１３ｍｐ７並びにプラ
スミドｐＢ３２２及びｐＢ３２８を確認することができ
る。これらＤＮＡ分子をＳｓｐ４８００Ｉで処理する。
２、ファージラムダ及びｐｈｉＸ１７４のＤＮＡの完全
消化により及びファージ誘導体Ｍ１３ｍｐ７並びにプラ
スミドｐＢ３２２及びｐＢ３２８を確認することができ
る。これらＤＮＡ分子をＳｓｐ４８００Ｉで処理する。
【０００９】第１表は、実験的に観察された切断位置特
異性と、次の配列：５′−ＴＧＴＡＣＡ−３′を認識す
る酵素に関するコンピュータ測定された切断位置特異性
との比較を示している。
異性と、次の配列：５′−ＴＧＴＡＣＡ−３′を認識す
る酵素に関するコンピュータ測定された切断位置特異性
との比較を示している。
【００１０】
【表１】
【００１１】この酵素の認識配列内の切断位置は、ユニ
バーサルな配列決定プライマーの結合位置に対して約３
０〜２００塩基の間隔で（Messing.J.等の（１９８
１）、Nucl.Acids.Res.２、３０９〜３２１）、この認
識配列を有するＭ１３−誘導体で測定することができ
る。このＭ１３−誘導体の１本鎖ＤＮＡの所で、まず、
ユニバーサルな配列決定プライマーを用いて、ジデソキ
シ連鎖切断法による配列反応が行なわれる（Sanger.F.
等の（１９７７)．Proc.Nutl.Acad.Sci,USA ７４、５
６０〜５６４、Messing.J.等の（１９８１）、Nutl.Aci
ds Res.９．３０９〜３２１）。
バーサルな配列決定プライマーの結合位置に対して約３
０〜２００塩基の間隔で（Messing.J.等の（１９８
１）、Nucl.Acids.Res.２、３０９〜３２１）、この認
識配列を有するＭ１３−誘導体で測定することができ
る。このＭ１３−誘導体の１本鎖ＤＮＡの所で、まず、
ユニバーサルな配列決定プライマーを用いて、ジデソキ
シ連鎖切断法による配列反応が行なわれる（Sanger.F.
等の（１９７７)．Proc.Nutl.Acad.Sci,USA ７４、５
６０〜５６４、Messing.J.等の（１９８１）、Nutl.Aci
ds Res.９．３０９〜３２１）。
【００１２】これと並行して、配列決定プライマーをＴ
４−ポリヌクレオチド−キナーゼ及び［32Ｐ］ＡＴＰを
用いて、５′−末端で、放射能標識付けする。この５′
−末端標識された配列決定プライマーの１本鎖Ｍ１３−
ＤＮＡへのハイブリド結合の後に、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（クレノフ酵素）及びｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰからのデソキシヌクレオチド−三燐酸混合
物を用いる充填反応で部分的２本鎖ＤＮＡが製造され
る。５′−末端で新規合成されたその鎖が放射能標識さ
れているこのＤＮＡを制限エンドヌクレーアーゼＳｓｐ
４８００Ｉで切断する。この切断バッチの半分を、付加
的になおＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて、全ての４種
のデソキシヌクレオチド三燐酸の混合物の存在下で処理
して、平滑なＤＮＡ末端を得る。
４−ポリヌクレオチド−キナーゼ及び［32Ｐ］ＡＴＰを
用いて、５′−末端で、放射能標識付けする。この５′
−末端標識された配列決定プライマーの１本鎖Ｍ１３−
ＤＮＡへのハイブリド結合の後に、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（クレノフ酵素）及びｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰからのデソキシヌクレオチド−三燐酸混合
物を用いる充填反応で部分的２本鎖ＤＮＡが製造され
る。５′−末端で新規合成されたその鎖が放射能標識さ
れているこのＤＮＡを制限エンドヌクレーアーゼＳｓｐ
４８００Ｉで切断する。この切断バッチの半分を、付加
的になおＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて、全ての４種
のデソキシヌクレオチド三燐酸の混合物の存在下で処理
して、平滑なＤＮＡ末端を得る。
【００１３】この反応生成物の分析を、配列決定ゲル
（尿素８モル／ｌ、５％ポリアクリルアミド）上での電
気泳動及び引続くオートラジオグラフィにより行なう。
この結果の解釈は、ブラウン（Brown)N.L.及びスミス
（Smith）M.の方法（Methods inEnzymology６５（１９
８０）、３９１〜４０１）により実施する。放射能標識
付けされたフラグメントの移動距離と配列ライター（Se
quenzleiter)との比較により、切断位置の状態が測定さ
れる。付加的にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理された試
料は、単にＳｓｐ４８００Ｉで切断された試料と比べ
て、４ｂｐだけ延長されたバンドの移動距離を示す。従
って、Ｓｓｐ４８００Ｉは、４ｂｐだけ５′−突出して
いるＤＮＡ−末端を生じることが明らかである。従っ
て、Ｓｓｐ４８００Ｉによるこの切断は、次の特異性を
有する認識配列内で行われる：
（尿素８モル／ｌ、５％ポリアクリルアミド）上での電
気泳動及び引続くオートラジオグラフィにより行なう。
この結果の解釈は、ブラウン（Brown)N.L.及びスミス
（Smith）M.の方法（Methods inEnzymology６５（１９
８０）、３９１〜４０１）により実施する。放射能標識
付けされたフラグメントの移動距離と配列ライター（Se
quenzleiter)との比較により、切断位置の状態が測定さ
れる。付加的にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理された試
料は、単にＳｓｐ４８００Ｉで切断された試料と比べ
て、４ｂｐだけ延長されたバンドの移動距離を示す。従
って、Ｓｓｐ４８００Ｉは、４ｂｐだけ５′−突出して
いるＤＮＡ−末端を生じることが明らかである。従っ
て、Ｓｓｐ４８００Ｉによるこの切断は、次の特異性を
有する認識配列内で行われる：
【００１４】
【化５】
【００１５】実験的に測定された切断位置の数は、配
列：５′ＴＧＴＡＣＡ−３′に関する種々のＤＮＡでの
コンピュータ分析により得られた切断位置の数（第１
表）と同じである。付加的に、このデータを、Gene １
０（１９８０）、３５７〜３７０からの表と比較した。
列：５′ＴＧＴＡＣＡ−３′に関する種々のＤＮＡでの
コンピュータ分析により得られた切断位置の数（第１
表）と同じである。付加的に、このデータを、Gene １
０（１９８０）、３５７〜３７０からの表と比較した。
【００１６】ストレプトマイセス属の微生物を培養し、
この細胞から酵素を取得する方法で、Ｓｓｐ４８００Ｉ
を得るのが有利である。特に、ストレプトマイセス・sp
ecＢＭＴＵ４８００（ＤＳＭ６１８１）を使用するのが
有利である。
この細胞から酵素を取得する方法で、Ｓｓｐ４８００Ｉ
を得るのが有利である。特に、ストレプトマイセス・sp
ecＢＭＴＵ４８００（ＤＳＭ６１８１）を使用するのが
有利である。
【００１７】この微生物ストレプトマイセス・spec Ｂ
ＭＴＵ４８００は、ドイチェン・ザンムルング・フォン
・ミクロオルガニスメン(ＤＳＭ)、(Deutschen Sammlun
g vonMikroorganismen,Macheroder Weg １６，３３００
Brounschweig ＢＲＤ）に寄託されており、寄託番号
ＤＳＭ６１８１を有する。
ＭＴＵ４８００は、ドイチェン・ザンムルング・フォン
・ミクロオルガニスメン(ＤＳＭ)、(Deutschen Sammlun
g vonMikroorganismen,Macheroder Weg １６，３３００
Brounschweig ＢＲＤ）に寄託されており、寄託番号
ＤＳＭ６１８１を有する。
【００１８】取得のために、慣用の生化学的精製法を使
用することができ、この際、その都度に得られるフラク
ション中で、この酵素の存在がその認識配列の切断によ
り容易に立証されうる。基質としては、例えばラムダー
ＤＮＡが好適である。得られるＤＮＡ−フラグメントを
アガロースゲル中、フラグメント分離のために慣用の緩
衝液系中で、エチジウムブロミドの存在下に電気泳動に
より分離する。
用することができ、この際、その都度に得られるフラク
ション中で、この酵素の存在がその認識配列の切断によ
り容易に立証されうる。基質としては、例えばラムダー
ＤＮＡが好適である。得られるＤＮＡ−フラグメントを
アガロースゲル中、フラグメント分離のために慣用の緩
衝液系中で、エチジウムブロミドの存在下に電気泳動に
より分離する。
【００１９】この酵素の取得のために使用される微生物
は、Ｍ１１１−培地（酵母エキス１０ｇ／ｌ、麦芽エキ
ス１０ｇ／ｌ）中で好気的に生長する。至適生長条件
は、２６℃、ｐＨ６．５〜７．５である。２倍化時間は
約２．５時間である。
は、Ｍ１１１−培地（酵母エキス１０ｇ／ｌ、麦芽エキ
ス１０ｇ／ｌ）中で好気的に生長する。至適生長条件
は、２６℃、ｐＨ６．５〜７．５である。２倍化時間は
約２．５時間である。
【００２０】酵素を、慣用の化学的及び機械的方法によ
り、例えば高圧分散、超音波又は酵素的崩解（Ａｕｆｓ
ｃｈｌｕβ）により単離しかつ精製する。本発明方法の
有利な実施形では、細胞をフレンチプレス上で崩解させ
る。上澄みの更なる精製は、有利に、アフィニティ−ク
ロマトグラフィ及びイオン交換体クロマトグラフィによ
り実施する。アフィニティ−クロマトグラフィ用の物質
としては、例えばヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が好適である。好適なカチオン
交換体は、例えばホスホ−セルロース（Ｗｈａｔｍｅ
ｎ）である。
り、例えば高圧分散、超音波又は酵素的崩解（Ａｕｆｓ
ｃｈｌｕβ）により単離しかつ精製する。本発明方法の
有利な実施形では、細胞をフレンチプレス上で崩解させ
る。上澄みの更なる精製は、有利に、アフィニティ−ク
ロマトグラフィ及びイオン交換体クロマトグラフィによ
り実施する。アフィニティ−クロマトグラフィ用の物質
としては、例えばヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が好適である。好適なカチオン
交換体は、例えばホスホ−セルロース（Ｗｈａｔｍｅ
ｎ）である。
【００２１】アニオン交換体としては、ＤＥＡＥ−セフ
ァセル（Sephacel）（Pharmacia）なる名称で入手され
る製品が好適である。しかしながら、当業者に公知の他
のクロマトグラフィ物質も好適である。
ァセル（Sephacel）（Pharmacia）なる名称で入手され
る製品が好適である。しかしながら、当業者に公知の他
のクロマトグラフィ物質も好適である。
【００２２】
【実施例】次の例で本発明を更に説明する。
【００２３】例１ 微生物ストレプトマイセス・spec ＢＭＴＵ４８００
（ＤＳＭ６１８１）を、２６℃で１０〜１２時間培養
し、対数相の終わりに収穫する。培地としてＭ１１１−
培地を使用する。
（ＤＳＭ６１８１）を、２６℃で１０〜１２時間培養
し、対数相の終わりに収穫する。培地としてＭ１１１−
培地を使用する。
【００２４】細胞ペースト（湿重量３０ｇ）を緩衝液Ａ
（トリス−ＨＣｌ ４０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、ＥＤ
ＴＡ０．１ｍモル／ｌ、２−メルカプトエタノール７ｍ
モル／ｌ）（これはプロテアーゼ阻害剤を含有する）
２．４容量中に再懸濁させる。引続き、細胞をフレンチ
プレスに２３０００ｌｂ／ｍ2で２回通すことにより崩
解させ、沈殿を分離する。上澄みにＮＨ4Ｃｌを加える
（最終濃度０．３モル／ｌ）。ポリミン−沈殿により、
核酸を除去する。引続き、遠心分離した上澄みを６０
（Ｗ／Ｖ）％硫酸アンモニウムで処理し、沈殿をヘパリ
ン−セファロース−カラムを通して分別する。溶離のた
めに、ＮａＣｌ ０〜１モル／ｌの勾配を使用する。Ｓ
ｓｐ４８００Ｉは、NaCl０．５〜０．７モル／ｌのフラ
クション中に認められる。この活性フラクションを緩衝
液Ｂ（トリス−ＨＣｌ ４０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、
ＥＤＴＡ ０．１ｍモル／ｌ、２−メルカプトエタノー
ル ７ｍモル／ｌ、グリセリン１０（Ｖ／Ｖ）％）に対
して平衡化させ、ＤＥＡＥ−ファースト−フロウ−カラ
ム上で分別する。溶離のために、ＮａＣｌ ０〜０．５
モル／ｌの勾配を使用する。活性フラクションを緩衝液
Ｂに対して透析させる。
（トリス−ＨＣｌ ４０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、ＥＤ
ＴＡ０．１ｍモル／ｌ、２−メルカプトエタノール７ｍ
モル／ｌ）（これはプロテアーゼ阻害剤を含有する）
２．４容量中に再懸濁させる。引続き、細胞をフレンチ
プレスに２３０００ｌｂ／ｍ2で２回通すことにより崩
解させ、沈殿を分離する。上澄みにＮＨ4Ｃｌを加える
（最終濃度０．３モル／ｌ）。ポリミン−沈殿により、
核酸を除去する。引続き、遠心分離した上澄みを６０
（Ｗ／Ｖ）％硫酸アンモニウムで処理し、沈殿をヘパリ
ン−セファロース−カラムを通して分別する。溶離のた
めに、ＮａＣｌ ０〜１モル／ｌの勾配を使用する。Ｓ
ｓｐ４８００Ｉは、NaCl０．５〜０．７モル／ｌのフラ
クション中に認められる。この活性フラクションを緩衝
液Ｂ（トリス−ＨＣｌ ４０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、
ＥＤＴＡ ０．１ｍモル／ｌ、２−メルカプトエタノー
ル ７ｍモル／ｌ、グリセリン１０（Ｖ／Ｖ）％）に対
して平衡化させ、ＤＥＡＥ−ファースト−フロウ−カラ
ム上で分別する。溶離のために、ＮａＣｌ ０〜０．５
モル／ｌの勾配を使用する。活性フラクションを緩衝液
Ｂに対して透析させる。
【００２５】引続き、緩衝液Ｂで平衡化されたホスホ−
セルロース−カラム上に加える。溶離のために、緩衝液
Ｂ中のＮａＣｌ ０〜１モル／ｌ勾配を使用する。
セルロース−カラム上に加える。溶離のために、緩衝液
Ｂ中のＮａＣｌ ０〜１モル／ｌ勾配を使用する。
【００２６】活性フラクションを一緒にし、ラーガー緩
衝液（Lagerpuffer：トリス−ＨＣｌ ２０ｍモル／
ｌ、ｐＨ８．０、２−メルカプトエタノール １０ｍモ
ル／ｌ、ＮａＣｌ １００ｍモル／ｌ、ＥＤＴＡ ０．
１ｍモル／ｌ及びグリセリン５０（Ｖ／Ｖ）％）に対し
て透析させる。
衝液（Lagerpuffer：トリス−ＨＣｌ ２０ｍモル／
ｌ、ｐＨ８．０、２−メルカプトエタノール １０ｍモ
ル／ｌ、ＮａＣｌ １００ｍモル／ｌ、ＥＤＴＡ ０．
１ｍモル／ｌ及びグリセリン５０（Ｖ／Ｖ）％）に対し
て透析させる。
【００２７】例２ 活性の測定酵素単位の定義 ：Ｓｓｐ４８００Ｉ ＩＵは、ラムダー
ＤＮＡ １μｇを、５０℃で１時間内に最終量２５μｌ
中で切断する。
ＤＮＡ １μｇを、５０℃で１時間内に最終量２５μｌ
中で切断する。
【００２８】インキュベーション緩衝液（トリス−ＨＣ
ｌ １００ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、５０℃、塩化マグ
ネシウム５０ｍモル／ｌ、ＮａＣｌ １ｍモル／ｌ及び
２−メルカプトエタノール１０ｍモル／ｌ）２．５μｌ
の混合物に、水１７．９μｌ中及びラムダＤＮＡ（光学
密度：５．６ＯＤ／ｍｌ）３．６μｌ及びＳｓｐ４８０
０Ｉ−溶液（ＩＵ／μｌ）１μｌを加える。この溶液を
３７℃で１時間インキュベートし、氷上で冷却し、尿素
７ｍモル／ｌ、サッカロース２０（Ｖ／Ｖ）％、ＥＤＴ
Ａ６０ｍモル／ｌ及びブロムフェノールブルー０．０１
（Ｗ／Ｖ）％より成る停止試薬を加える。引続き、１％
アガロースゲル中で、１００Ｖで３〜４時間にわたる電
気泳動により分離を実施する。得られるバンドをＤＮＡ
−長さ−標準との比較により固定する。
ｌ １００ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、５０℃、塩化マグ
ネシウム５０ｍモル／ｌ、ＮａＣｌ １ｍモル／ｌ及び
２−メルカプトエタノール１０ｍモル／ｌ）２．５μｌ
の混合物に、水１７．９μｌ中及びラムダＤＮＡ（光学
密度：５．６ＯＤ／ｍｌ）３．６μｌ及びＳｓｐ４８０
０Ｉ−溶液（ＩＵ／μｌ）１μｌを加える。この溶液を
３７℃で１時間インキュベートし、氷上で冷却し、尿素
７ｍモル／ｌ、サッカロース２０（Ｖ／Ｖ）％、ＥＤＴ
Ａ６０ｍモル／ｌ及びブロムフェノールブルー０．０１
（Ｗ／Ｖ）％より成る停止試薬を加える。引続き、１％
アガロースゲル中で、１００Ｖで３〜４時間にわたる電
気泳動により分離を実施する。得られるバンドをＤＮＡ
−長さ−標準との比較により固定する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブルーノ フライ ドイツ連邦共和国 ペンツベルク ホッホ フェルトシュトラーセ ３ (72)発明者 ミヒャエル ヤルシュ ドイツ連邦共和国 バート ハイルブルン ウンターカルプフゼー 11
Claims (3)
- 【請求項１】 次の認識配列及び標識付けにより特徴付
けられた切断位置： 【化１】 を有し、ストレプトマイセス・ｓｐｅｃ ＢＭＴＵ４８
００（ＤＳＭ６１８１）から得られ、至適温度５０℃及
び至適ｐＨ値８．０を有する、ＩＩ型−制限エンドヌク
レーアーゼ。 - 【請求項２】 次の認識配列及び標識付けにより特徴付
けられた切断位置： 【化２】 を有し、ストレプトマイセス・ｓｐｅｃ ＢＭＴＵ４８
００（ＤＳＭ６１８１）から得られ、至適温度５０℃及
び至適ｐＨ値８．０を有する、ＩＩ型−制限エンドヌク
レーアーゼを取得する方法において、ストレプトマイセ
スｓｐｅｃ ＢＭＴＵ４８００（ＤＭ６１８１）を培養
し、その細胞から酵素を得ることを特徴とする、ＩＩ型
−制限エンドヌクレーアーゼの取得法。 - 【請求項３】 次の認識配列及び標識付けにより特徴付
けられた切断位置： 【化３】 を有し、ストレプトマイセス・ｓｐｅｃ ＢＭＴＵ４８
００（ＤＳＭ６１８１）から得られ、至適温度５０℃及
び至適ｐＨ値８．０を有する、ＩＩ型−制限エンドヌク
レーアーゼを使用することを特徴とする、相補的２本鎖
ＤＮＡ−配列： ５′−ＴＧＴＡＣＡ−３′ を認識しかつ切断する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4032213A DE4032213A1 (de) | 1990-10-11 | 1990-10-11 | Typ ii-restriktionsendonuklease ssp4800i |
| DE4032213.0 | 1990-10-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04258290A JPH04258290A (ja) | 1992-09-14 |
| JPH0675502B2 true JPH0675502B2 (ja) | 1994-09-28 |
Family
ID=6416047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3261616A Expired - Lifetime JPH0675502B2 (ja) | 1990-10-11 | 1991-10-09 | Ｉｉ型−制限エンドヌクレーアーゼ及びこれを取得する方法並びに相補的２本鎖ｄｎａ−配列を認識しかつ切断する方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5183747A (ja) |
| EP (1) | EP0480343B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0675502B2 (ja) |
| AT (1) | ATE131531T1 (ja) |
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