JPH04258296A - プレプロインスリンのインスリンへの酵素的変換方法 - Google Patents
プレプロインスリンのインスリンへの酵素的変換方法Info
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- JPH04258296A JPH04258296A JP3223243A JP22324391A JPH04258296A JP H04258296 A JPH04258296 A JP H04258296A JP 3223243 A JP3223243 A JP 3223243A JP 22324391 A JP22324391 A JP 22324391A JP H04258296 A JPH04258296 A JP H04258296A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】インスリンは２つのポリペプチド鎖、すな
わち２１個のアミノ酸残基を含むＡ鎖と３０個のアミノ
酸残基を含むＢ鎖から構成されている。ＡおよびＢ両鎖
は、２個のジスルフィド結合を介して連結されている。 すなわち、Ａ７とＢ７およびＡ２０とＢ１９の位置のシ
ステイン残基が互いに結合している。第三のジスルフィ
ド結合がＡ６とＡ１１の間にある。動物およびヒトイン
スリンは膵臓において、プレプロインスリンの形で産生
される。ヒトプレプロインスリンは、たとえば、２４個
のアミノ酸残基を有するプレペプチドに８６個のアミノ
酸残基を有するプロインスリンが結合してなり、以下の
コンフィギュレーション：プレペプチド−Ｂ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（式中、Ｃは３１残基
からなるアミノ酸鎖である）を有する。ランゲルハンス
島からの分泌時にプレペプチドは切断除去されてプロイ
ンスリンを生じる。最後にＣ鎖が蛋白分解的に切断され
て活性ヒトインスリンが生成する。
わち２１個のアミノ酸残基を含むＡ鎖と３０個のアミノ
酸残基を含むＢ鎖から構成されている。ＡおよびＢ両鎖
は、２個のジスルフィド結合を介して連結されている。 すなわち、Ａ７とＢ７およびＡ２０とＢ１９の位置のシ
ステイン残基が互いに結合している。第三のジスルフィ
ド結合がＡ６とＡ１１の間にある。動物およびヒトイン
スリンは膵臓において、プレプロインスリンの形で産生
される。ヒトプレプロインスリンは、たとえば、２４個
のアミノ酸残基を有するプレペプチドに８６個のアミノ
酸残基を有するプロインスリンが結合してなり、以下の
コンフィギュレーション：プレペプチド−Ｂ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（式中、Ｃは３１残基
からなるアミノ酸鎖である）を有する。ランゲルハンス
島からの分泌時にプレペプチドは切断除去されてプロイ
ンスリンを生じる。最後にＣ鎖が蛋白分解的に切断され
て活性ヒトインスリンが生成する。
【０００２】遺伝子操作法により、プレプロインスリン
を微生物内で発現させることが徐々に可能になってきて
いる（ＥＰ−Ａ−３４７ ７８１、ＥＰ−Ａ−３６７
１６３）。プレプロ配列は通常、化学的におよび／また
は酵素的に切断される（ＤＥ−Ｐ−３ ４４０ ９８８
、ＥＰ−Ａ−０ ２６４ ２５０）。既知の酵素的変換
法は、トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢによる切
断に基づくものである（Ｋｅｍｍｌｅｒ， Ｗ． ら：
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４６：６７８６〜
６７９１，１９７１；ＥＰ−Ａ−１９５ ６９１：ＥＰ
−Ｂ−８９００７）。これらの方法の欠点は、反応溶液
からの除去がかなり困難な大量の副生成物の形成である
。とくにヒトプレプロインスリンのヒトインスリン（ヒ
トインスリン、ＨＩ）への変換の場合、大量のｄｅ−Ｔ
ｈｒ（Ｂ３０）−ヒトインスリン（ｄｅ−Ｔｈｒ（Ｂ３
０）−ＨＩ）が形成する。この副生成物はＨＩと、末端
アミノ酸を欠く点でのみ相違し、反応溶液からの除去が
きわめて困難である。
を微生物内で発現させることが徐々に可能になってきて
いる（ＥＰ−Ａ−３４７ ７８１、ＥＰ−Ａ−３６７
１６３）。プレプロ配列は通常、化学的におよび／また
は酵素的に切断される（ＤＥ−Ｐ−３ ４４０ ９８８
、ＥＰ−Ａ−０ ２６４ ２５０）。既知の酵素的変換
法は、トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢによる切
断に基づくものである（Ｋｅｍｍｌｅｒ， Ｗ． ら：
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４６：６７８６〜
６７９１，１９７１；ＥＰ−Ａ−１９５ ６９１：ＥＰ
−Ｂ−８９００７）。これらの方法の欠点は、反応溶液
からの除去がかなり困難な大量の副生成物の形成である
。とくにヒトプレプロインスリンのヒトインスリン（ヒ
トインスリン、ＨＩ）への変換の場合、大量のｄｅ−Ｔ
ｈｒ（Ｂ３０）−ヒトインスリン（ｄｅ−Ｔｈｒ（Ｂ３
０）−ＨＩ）が形成する。この副生成物はＨＩと、末端
アミノ酸を欠く点でのみ相違し、反応溶液からの除去が
きわめて困難である。
【０００３】この副生物の形成を減少させるため、切断
混合物にある種の重金属、とくにニッケルを添加するこ
とができる（ＥＰ−Ａ ０２６４ ２５０）。この方法
での反応の実施は、流出液に多量の重金属が負荷される
ので、工業的観点から望ましいものではない。したがっ
て、最高の特異性と環境への適合性のあるプレプロイン
スリンの変換が求められている。
混合物にある種の重金属、とくにニッケルを添加するこ
とができる（ＥＰ−Ａ ０２６４ ２５０）。この方法
での反応の実施は、流出液に多量の重金属が負荷される
ので、工業的観点から望ましいものではない。したがっ
て、最高の特異性と環境への適合性のあるプレプロイン
スリンの変換が求められている。
【０００４】クロストリパイン（クロストリオペプチダ
ーゼＢ；ＥＣ ３．４．２２．８）は Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ の培養濾液から
の酵素で、分子量約３０，０００〜８０，０００、蛋白
分解活性とアミダーゼ／エステラーゼ活性の両者を有す
る（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｗ．Ｍ．， Ｈａｒｒｉｎｇ
ｔｏｎ， Ｗ．Ｆ．Ｊ．；Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ
．， ２４３（１８）：４６８３〜４６９２，１９６８
）。これはＡｒｇ−Ｃ結合に対する高い特異性が特徴で
ある。すなわち、インスリンの単離されたＢ鎖において
は、クロストリパインはＡｒｇ−Ｇｌｙ結合をＬｙｓ−
Ａｌａ結合の場合の５００倍以上の速度で切断し、また
グルカゴンにおいてはそのＡｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａ
ｌａおよびＬｙｓ−Ｔｙｒのみが切断される。これらの
３つの結合の加水分解の相対的初期速度は１．１／７お
よび１／３００である（Ｌａｂｏｕｅｓｓｅ， Ｂ．：
Ｂｕｌｌ． Ｓｏｃ． Ｃｈｉｍ． Ｂｉｏｌ．， ４
２：１２９３，１９６０）。驚くべきことに、クロスト
リパインはプレプロインスリンにおけるアルギニンの後
のＣ末端の特異的切断をもたらし、Ｂ鎖に存在するアル
ギニン（Ｂ２２）の後のアミノ酸の切断は無視できる程
度であることを発見し、本発明は完成された。
ーゼＢ；ＥＣ ３．４．２２．８）は Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ の培養濾液から
の酵素で、分子量約３０，０００〜８０，０００、蛋白
分解活性とアミダーゼ／エステラーゼ活性の両者を有す
る（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｗ．Ｍ．， Ｈａｒｒｉｎｇ
ｔｏｎ， Ｗ．Ｆ．Ｊ．；Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ
．， ２４３（１８）：４６８３〜４６９２，１９６８
）。これはＡｒｇ−Ｃ結合に対する高い特異性が特徴で
ある。すなわち、インスリンの単離されたＢ鎖において
は、クロストリパインはＡｒｇ−Ｇｌｙ結合をＬｙｓ−
Ａｌａ結合の場合の５００倍以上の速度で切断し、また
グルカゴンにおいてはそのＡｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａ
ｌａおよびＬｙｓ−Ｔｙｒのみが切断される。これらの
３つの結合の加水分解の相対的初期速度は１．１／７お
よび１／３００である（Ｌａｂｏｕｅｓｓｅ， Ｂ．：
Ｂｕｌｌ． Ｓｏｃ． Ｃｈｉｍ． Ｂｉｏｌ．， ４
２：１２９３，１９６０）。驚くべきことに、クロスト
リパインはプレプロインスリンにおけるアルギニンの後
のＣ末端の特異的切断をもたらし、Ｂ鎖に存在するアル
ギニン（Ｂ２２）の後のアミノ酸の切断は無視できる程
度であることを発見し、本発明は完成された。
【０００５】したがって、本発明は、式Ｉ
【化２】
（式中、Ｒ１はｎ個のアミノ酸で、ｎは０または１の整
数であり、Ｒ２は水素、化学的もしくは酵素的に切断除
去できるアミノ酸、または２〜３０個のアミノ酸残基を
有するペプチドであり、Ｒ３はヒドロキシル基、アミノ
酸または２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドであり
、ＸはＬ−アルギニンまたは２〜４５個のアミノ酸を有
しＣ末端およびＮ末端にＬ−アルギニン残基をもつペプ
チドであり、Ｙは遺伝子でコードできるアミノ酸であり
、Ｚは遺伝子でコードできるアミノ酸であり、Ａ１〜Ａ
２０またはＢ２〜Ｂ２９は、天然のまたは１個もしくは
２個以上のアミノ酸残基を置換して修飾したヒトもしく
は動物インスリンのアミノ酸配列である）のプレプロイ
ンスリンのアミノ酸鎖を加水分解する方法において、プ
レプロインスリンをクロストリパインの存在下に加水分
解し、必要に応じてカルボキシペプチダーゼＢにより相
当するインスリンに変換する方法に関する。
数であり、Ｒ２は水素、化学的もしくは酵素的に切断除
去できるアミノ酸、または２〜３０個のアミノ酸残基を
有するペプチドであり、Ｒ３はヒドロキシル基、アミノ
酸または２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドであり
、ＸはＬ−アルギニンまたは２〜４５個のアミノ酸を有
しＣ末端およびＮ末端にＬ−アルギニン残基をもつペプ
チドであり、Ｙは遺伝子でコードできるアミノ酸であり
、Ｚは遺伝子でコードできるアミノ酸であり、Ａ１〜Ａ
２０またはＢ２〜Ｂ２９は、天然のまたは１個もしくは
２個以上のアミノ酸残基を置換して修飾したヒトもしく
は動物インスリンのアミノ酸配列である）のプレプロイ
ンスリンのアミノ酸鎖を加水分解する方法において、プ
レプロインスリンをクロストリパインの存在下に加水分
解し、必要に応じてカルボキシペプチダーゼＢにより相
当するインスリンに変換する方法に関する。
【０００６】ペプチドおよび蛋白質のアミノ酸配列は、
そのアミノ酸鎖のＮ末端から指示される。プロテアーゼ
はペプチドおよび蛋白質のアミノ酸の間のペプチド結合
を加水分解する。クロストリパインはＬ−アルギニン含
有ペプチドまたは蛋白質をアルギニンの後で特異的に加
水分解する。プレプロインスリンに対するこの加水分解
で形成される生成物はＣ末端アルギニン残基を有するイ
ンスリン誘導体もしくはポリペプチド、またはアミノ酸
である。
そのアミノ酸鎖のＮ末端から指示される。プロテアーゼ
はペプチドおよび蛋白質のアミノ酸の間のペプチド結合
を加水分解する。クロストリパインはＬ−アルギニン含
有ペプチドまたは蛋白質をアルギニンの後で特異的に加
水分解する。プレプロインスリンに対するこの加水分解
で形成される生成物はＣ末端アルギニン残基を有するイ
ンスリン誘導体もしくはポリペプチド、またはアミノ酸
である。
【０００７】天然アミノ酸の語が意味する例は、Ｇｌｙ
、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔ
ｙｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｙ
ｓ、Ｈｙｌ、Ｏｒｎ、ＣｉｔまたはＨｉｓである。
、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔ
ｙｒ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｙ
ｓ、Ｈｙｌ、Ｏｒｎ、ＣｉｔまたはＨｉｓである。
【０００８】遺伝子でコードできるアミノ酸の語に含ま
れる例は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃ
ｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈ
ｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏまたはセレノシステインである。
れる例は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃ
ｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈ
ｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏまたはセレノシステインである。
【０００９】式Ｉの好ましいプレプロインスリンは、式
中、Ｒ１はＰｈｅであり、Ｒ２は水素、天然アミノ酸ま
たは２〜３０個の天然アミノ酸を有し末端にＣ末端Ｌ−
アルギニンをもつペプチドであり、Ｒ３はヒドロキシル
基、天然アミノ酸または２〜１０個の天然アミノ酸をも
つペプチドであり、ＸはＬ−アルギニンまたはヒトもし
くは動物のプロインスリンのＣ鎖であり、ＹはＴｈｒ、
ＡｌａまたはＳｅｒからなる群よりのアミノ酸であり、
ＺはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ
、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＭｅｔからなる群よりのアミノ
酸であり、Ａ１〜Ａ２０またはＢ２〜Ｂ２９はヒトまた
は動物のインスリンアミノ酸配列のプレプロインスリン
である。
中、Ｒ１はＰｈｅであり、Ｒ２は水素、天然アミノ酸ま
たは２〜３０個の天然アミノ酸を有し末端にＣ末端Ｌ−
アルギニンをもつペプチドであり、Ｒ３はヒドロキシル
基、天然アミノ酸または２〜１０個の天然アミノ酸をも
つペプチドであり、ＸはＬ−アルギニンまたはヒトもし
くは動物のプロインスリンのＣ鎖であり、ＹはＴｈｒ、
ＡｌａまたはＳｅｒからなる群よりのアミノ酸であり、
ＺはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ
、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＭｅｔからなる群よりのアミノ
酸であり、Ａ１〜Ａ２０またはＢ２〜Ｂ２９はヒトまた
は動物のインスリンアミノ酸配列のプレプロインスリン
である。
【００１０】式Ｉのとくに好ましいプレプロインスリン
は、式中、Ｒ１はＰｈｅであり、Ｒ２は水素または２〜
３０個の天然アミノ酸を有し末端にＣ末端Ｌ−アルギニ
ンをもつペプチドであり、Ｒ３はヒドロキシル基、天然
アミノ酸または２〜１０個の天然アミノ酸をもつペプチ
ドであり、ＸはＬ−アルギニンまたはヒト、ブタもしく
はウシのプロインスリンのＣ鎖であり、ＹはＴｈｒであ
り、ＺはＡｓｎであり、Ａ１〜Ａ２０またはＢ２〜Ｂ２
９はヒト、ブタまたはウシのインスリンのアミノ酸配列
のプレプロインスリンである。
は、式中、Ｒ１はＰｈｅであり、Ｒ２は水素または２〜
３０個の天然アミノ酸を有し末端にＣ末端Ｌ−アルギニ
ンをもつペプチドであり、Ｒ３はヒドロキシル基、天然
アミノ酸または２〜１０個の天然アミノ酸をもつペプチ
ドであり、ＸはＬ−アルギニンまたはヒト、ブタもしく
はウシのプロインスリンのＣ鎖であり、ＹはＴｈｒであ
り、ＺはＡｓｎであり、Ａ１〜Ａ２０またはＢ２〜Ｂ２
９はヒト、ブタまたはウシのインスリンのアミノ酸配列
のプレプロインスリンである。
【００１１】とくに好ましいインスリンは、すでにドイ
ツ特許出願Ｐ３９ １９ ８５２およびＰ４０ １２
８１８．０に提案されているインスリンである。たとえ
ば、以下のアミノ酸配列： ＮＨ２−Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓ
ｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌ
ｅｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌ
ｙ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｃ
ｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ−ＣＯＯＨをもつ
ＩｎｓｕＡｒｇである。
ツ特許出願Ｐ３９ １９ ８５２およびＰ４０ １２
８１８．０に提案されているインスリンである。たとえ
ば、以下のアミノ酸配列： ＮＨ２−Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓ
ｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌ
ｅｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌ
ｙ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｃ
ｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ−ＣＯＯＨをもつ
ＩｎｓｕＡｒｇである。
【００１２】クロストリパイン（ＥＣ ３．４．２２．
８）はクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）
からの細胞外チオールプロテアーゼである。この酵素は
ヘテロダイマーで、他の既知のチオールプロテアーゼの
何れともホモロジーを示さない。この酵素はＡｒｇ−Ｘ
ＸＸ結合、特にＡｒｇ−Ｐｒｏに対してきわめて高い特
異性を有する。その特性は、分子量３０，０００〜８０
，０００、等電点ｐＨ４．８〜４．９である。アクティ
ベーターの例にはシステイン、メルカプトエタノール、
ジチオスレイトールまたはカルシウムイオンがある。
８）はクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）
からの細胞外チオールプロテアーゼである。この酵素は
ヘテロダイマーで、他の既知のチオールプロテアーゼの
何れともホモロジーを示さない。この酵素はＡｒｇ−Ｘ
ＸＸ結合、特にＡｒｇ−Ｐｒｏに対してきわめて高い特
異性を有する。その特性は、分子量３０，０００〜８０
，０００、等電点ｐＨ４．８〜４．９である。アクティ
ベーターの例にはシステイン、メルカプトエタノール、
ジチオスレイトールまたはカルシウムイオンがある。
【００１３】クロストリパインは、たとえば、トシル−
Ｌ−リジン、クロロメチルケトン、過酸化水素、ＥＤＴ
Ａ、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋もしくはＣｄ２＋イオンまたは
クエン酸塩の存在下に阻害される。
Ｌ−リジン、クロロメチルケトン、過酸化水素、ＥＤＴ
Ａ、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋もしくはＣｄ２＋イオンまたは
クエン酸塩の存在下に阻害される。
【００１４】クロストリパインは微生物を用いる発酵に
よって製造される。この方法ではクロストリジウムを栄
養培地中にクロストリパインが蓄積するまで培養する。 適当な例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔ
ｏｌｙｔｉｃｕｍ、とくに Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍＤＳＭ ６２７がある。この
微生物の突然変異株および変異株も、それらがクロスト
リパインを合成する限り適当である。
よって製造される。この方法ではクロストリジウムを栄
養培地中にクロストリパインが蓄積するまで培養する。 適当な例としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔ
ｏｌｙｔｉｃｕｍ、とくに Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍＤＳＭ ６２７がある。この
微生物の突然変異株および変異株も、それらがクロスト
リパインを合成する限り適当である。
【００１５】培養は嫌気的に、単一培養または混合培養
で、たとえば、酵素の不存在下にまたは必要に応じて窒
素、不活性気体または他の酵素以外の気体を導入しファ
ーメンター中で、非撹拌下の深部培養で行われる。発酵
は約１０〜４５℃、好ましくは約２５〜４０℃、とくに
３０〜３８℃の範囲の温度で行われる。発酵はｐＨ５〜
８．５、好ましくは５．５〜８の範囲で起こる。これら
の条件下では、一般的に培養ブロスは１〜３日後に検知
可能な酵素の蓄積を示すようになる。クロストリパイン
の合成は後対数期に始まり、成長の静止期にその最高に
到達する。酵素の産生は活性検定（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，
Ｗ．：Ｍｅｔｈ． ｏｆ Ｅｎｚｙｍ． ４７巻，１
６５〜１７０頁，１９７７）を用いて追跡することがで
きる。
で、たとえば、酵素の不存在下にまたは必要に応じて窒
素、不活性気体または他の酵素以外の気体を導入しファ
ーメンター中で、非撹拌下の深部培養で行われる。発酵
は約１０〜４５℃、好ましくは約２５〜４０℃、とくに
３０〜３８℃の範囲の温度で行われる。発酵はｐＨ５〜
８．５、好ましくは５．５〜８の範囲で起こる。これら
の条件下では、一般的に培養ブロスは１〜３日後に検知
可能な酵素の蓄積を示すようになる。クロストリパイン
の合成は後対数期に始まり、成長の静止期にその最高に
到達する。酵素の産生は活性検定（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，
Ｗ．：Ｍｅｔｈ． ｏｆ Ｅｎｚｙｍ． ４７巻，１
６５〜１７０頁，１９７７）を用いて追跡することがで
きる。
【００１６】クロストリパインの製造に用いられる栄養
溶液は０．２〜６％、好ましくは０．５〜３％の有機栄
養化合物、および無機塩を含有する。適当な有機栄養化
合物は、アミノ酸、ペプトン、同じく肉エキス、たとえ
ばトーモロコシ、小麦、インゲン豆、大豆もしくは綿の
粉砕種子、アルコール製造時の蒸留残留物、肉ミールま
たは酵母エキスである。栄養溶液に添加できる無機塩の
例には、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属、鉄、
亜鉛およびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリ
ン酸塩、さらにアンモニウム塩および硝酸塩がある。
溶液は０．２〜６％、好ましくは０．５〜３％の有機栄
養化合物、および無機塩を含有する。適当な有機栄養化
合物は、アミノ酸、ペプトン、同じく肉エキス、たとえ
ばトーモロコシ、小麦、インゲン豆、大豆もしくは綿の
粉砕種子、アルコール製造時の蒸留残留物、肉ミールま
たは酵母エキスである。栄養溶液に添加できる無機塩の
例には、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属、鉄、
亜鉛およびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリ
ン酸塩、さらにアンモニウム塩および硝酸塩がある。
【００１７】至適発酵条件は各微生物について異なるが
、これらの条件は本技術分野の熟練者には既知であるか
または予備試験によって容易に確立することができる。 クロストリパインは古典的な方法、たとえば硫酸アンモ
ニウム沈殿、イオン交換またはゲル透過クロマトグラフ
ィーによって精製できる。この酵素は慣用方法によって
カップリングさせることができる（Ｃｏｌｏｗｉｃｋ
＆ Ｋａｐｌａｎ：Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．，
ＸＬＩＶ巻）。
、これらの条件は本技術分野の熟練者には既知であるか
または予備試験によって容易に確立することができる。 クロストリパインは古典的な方法、たとえば硫酸アンモ
ニウム沈殿、イオン交換またはゲル透過クロマトグラフ
ィーによって精製できる。この酵素は慣用方法によって
カップリングさせることができる（Ｃｏｌｏｗｉｃｋ
＆ Ｋａｐｌａｎ：Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．，
ＸＬＩＶ巻）。
【００１８】酵素的変換には、遊離もしくは固定化型の
全細胞、および同様に担体に結合させることもできる単
離酵素生成物の両者を使用することが可能である。
全細胞、および同様に担体に結合させることもできる単
離酵素生成物の両者を使用することが可能である。
【００１９】式Ｉのプレプロインスリンのクロストリパ
インによる切断は水性メジウム中で行われるが、これに
は水混和性の有機構成分たとえばアルコール、ケトン、
尿素またはジメチルホルムアミドを混合してもよい。と
くに、反応時のｐＨのコントロールを改善するため、反
応混合物に適当な無機または有機緩衝剤たとえばリン酸
塩、トリス、グリシンＨＥＰＥＳ等を加えることもでき
る。切断時のプレプロインスリンの濃度は、たとえば０
．０１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．
１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌとする。プレプロインス
リンとクロストリパインの割合は〔ｍｇ対単位（Ｕ）〕
１：０．０１〜１：１，０００、好ましくは１：０．１
〜１：５０とする。
インによる切断は水性メジウム中で行われるが、これに
は水混和性の有機構成分たとえばアルコール、ケトン、
尿素またはジメチルホルムアミドを混合してもよい。と
くに、反応時のｐＨのコントロールを改善するため、反
応混合物に適当な無機または有機緩衝剤たとえばリン酸
塩、トリス、グリシンＨＥＰＥＳ等を加えることもでき
る。切断時のプレプロインスリンの濃度は、たとえば０
．０１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．
１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌとする。プレプロインス
リンとクロストリパインの割合は〔ｍｇ対単位（Ｕ）〕
１：０．０１〜１：１，０００、好ましくは１：０．１
〜１：５０とする。
【００２０】反応の温度も同じく、広範囲内を変動させ
ることができる。好ましい温度範囲は０℃〜＋８０℃で
あり、＋２０℃〜＋４０℃の温度がとくに好ましい。
ることができる。好ましい温度範囲は０℃〜＋８０℃で
あり、＋２０℃〜＋４０℃の温度がとくに好ましい。
【００２１】反応のｐＨはｐＨ４〜ｐＨ１２の間を変動
させることができ、ｐＨ６〜ｐＨ９の範囲がとくに好ま
しい。
させることができ、ｐＨ６〜ｐＨ９の範囲がとくに好ま
しい。
【００２２】プレプロインスリンを相当する中間体に変
換するのに要する時間は、反応条件によって広い限界内
を変動させることができる。たとえばそれは１５分〜４
８時間であるが、１時間〜６時間の反応時間が好ましい
。
換するのに要する時間は、反応条件によって広い限界内
を変動させることができる。たとえばそれは１５分〜４
８時間であるが、１時間〜６時間の反応時間が好ましい
。
【００２３】酵素は使用前に、適当な様式でメルカプタ
ンの存在下に活性化される。この目的に適当なメルカプ
タンは、原理的にはＳＨ基を含むすべての化合物である
が、ＤＴＴ、ＤＴＥ、メルカプトエタノール、チオグリ
コール酸またはシステインの使用が好ましい。メルカプ
タンの濃度は広い範囲内で変動させることができるが、
０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度が好ましい。活性化緩衝
液にはまた、Ｃａ２＋イオン、好ましくはＣａＣｌ２を
含有させる。活性化はｐＨ４〜ｐＨ１２、好ましくはｐ
Ｈ６〜ｐＨ８で行われ、ｐＨ７〜ｐＨ８の範囲がとくに
好ましい。適当な緩衝物質はたとえば、トリス、ＨＥＰ
ＥＳ、グリシン等であり、ｐＨの維持のために添加する
ことができる。活性化温度は０℃〜６０℃とすることが
できる。０℃〜１０℃の範囲が好ましく、０℃〜５℃が
とくに好ましい。この方法で活性化された酵素はそのま
ま使用してもよく、また適宜、ＵｌｔｒｏｇｅｌＲ Ａ
ｃＡ ２０２上クロマトグラフィーにより活性化緩衝剤
を除去して使用してもよい。
ンの存在下に活性化される。この目的に適当なメルカプ
タンは、原理的にはＳＨ基を含むすべての化合物である
が、ＤＴＴ、ＤＴＥ、メルカプトエタノール、チオグリ
コール酸またはシステインの使用が好ましい。メルカプ
タンの濃度は広い範囲内で変動させることができるが、
０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度が好ましい。活性化緩衝
液にはまた、Ｃａ２＋イオン、好ましくはＣａＣｌ２を
含有させる。活性化はｐＨ４〜ｐＨ１２、好ましくはｐ
Ｈ６〜ｐＨ８で行われ、ｐＨ７〜ｐＨ８の範囲がとくに
好ましい。適当な緩衝物質はたとえば、トリス、ＨＥＰ
ＥＳ、グリシン等であり、ｐＨの維持のために添加する
ことができる。活性化温度は０℃〜６０℃とすることが
できる。０℃〜１０℃の範囲が好ましく、０℃〜５℃が
とくに好ましい。この方法で活性化された酵素はそのま
ま使用してもよく、また適宜、ＵｌｔｒｏｇｅｌＲ Ａ
ｃＡ ２０２上クロマトグラフィーにより活性化緩衝剤
を除去して使用してもよい。
【００２４】式Ｉのプレプロインスリンの本発明による
切断では、インスリンのＣ末端にアルギニン残基をもつ
インスリン誘導体と、切断された相当するアミノ酸およ
び／またはプレペプチドを生成する。このインスリン誘
導体は、所望により、カルボキシペプチダーゼＢで相当
するインスリンに変換できる。これは、クロストリパイ
ンと同時に同一の反応混合物中で行うこともまた上述の
反応条件下に引き続いて行うこともできるが、この場合
、所望により、カルボキシペプチダーゼＢ処理の前に、
それ自体公知の方法で、たとえばクロマトグラフィーも
しくは結晶化を用いて、インスリン誘導体を単離するこ
ともできる。カルボキシペプチダーゼＢは溶解させた型
または固定化した型で使用できる。カルボキシペプチダ
ーゼＢとインスリン誘導体の割合（重量対重量）は、約
１：１０〜１：５，０００、好ましくは約１：５００〜
１：３，５００、とくに好ましくは約１：１，０００〜
１：３，０００である。
切断では、インスリンのＣ末端にアルギニン残基をもつ
インスリン誘導体と、切断された相当するアミノ酸およ
び／またはプレペプチドを生成する。このインスリン誘
導体は、所望により、カルボキシペプチダーゼＢで相当
するインスリンに変換できる。これは、クロストリパイ
ンと同時に同一の反応混合物中で行うこともまた上述の
反応条件下に引き続いて行うこともできるが、この場合
、所望により、カルボキシペプチダーゼＢ処理の前に、
それ自体公知の方法で、たとえばクロマトグラフィーも
しくは結晶化を用いて、インスリン誘導体を単離するこ
ともできる。カルボキシペプチダーゼＢは溶解させた型
または固定化した型で使用できる。カルボキシペプチダ
ーゼＢとインスリン誘導体の割合（重量対重量）は、約
１：１０〜１：５，０００、好ましくは約１：５００〜
１：３，５００、とくに好ましくは約１：１，０００〜
１：３，０００である。
【００２５】カルボキシペプチダーゼＢとクロストリパ
インの割合（重量対重量）は約１：１〜１０：１、好ま
しくは２：１〜５：１である。
インの割合（重量対重量）は約１：１〜１０：１、好ま
しくは２：１〜５：１である。
【００２６】クロストリパインおよび／またはカルボキ
シペプチダーゼＢ切断の反応生成物は、たとえば、ｐＨ
の低下による沈殿析出および／または既知方法のカラム
クロマトグラフィーを用いる精製に付すことができる。 得られたインスリンは、慣用の表示に処方化して、糖尿
病治療用の医薬として使用できる。
シペプチダーゼＢ切断の反応生成物は、たとえば、ｐＨ
の低下による沈殿析出および／または既知方法のカラム
クロマトグラフィーを用いる精製に付すことができる。 得られたインスリンは、慣用の表示に処方化して、糖尿
病治療用の医薬として使用できる。
【００２７】本発明の方法を以下の実施例により詳細に
記述する。特に指示のない限り、百分率のデータは重量
に関するものである。
記述する。特に指示のない限り、百分率のデータは重量
に関するものである。
【００２８】実施例１
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ
ＤＳＭ ６２７を以下の組成の栄養溶液中で培養する。 カゼインペプトン ３％肉エキス
３％酵母エキス
０．５％システイン
０．０５％ＫＨ２ＰＯ４
０．１５％ｐＨ７．２
ＤＳＭ ６２７を以下の組成の栄養溶液中で培養する。 カゼインペプトン ３％肉エキス
３％酵母エキス
０．５％システイン
０．０５％ＫＨ２ＰＯ４
０．１５％ｐＨ７．２
【００２９】前培養の１％接種を行う。培養は、密閉瓶
中嫌気的条件下、３７℃で約２日間行う。微生物株は５
０％グリセロールを含有する上述の栄養溶液中に−２０
℃で維持する。発酵槽を１％前培養で接種する。容量１
０ｌで栄養溶液８ｌを加えた発酵槽に接種を行う。培養
は、窒素を通じながら、３３℃で一定のｐＨ７．０にお
いて２４時間実施する。培養濾液中の酵素活性を測定す
ると、２０，０００ Ｕ／ｌであった（Ｍｉｔｃｈｅｌ
ｌ， Ｗ．：Ｍｅｔｈ． ｏｆ Ｅｎｚｙｍ．， ４７
巻，１６５〜１７０頁，１９７７）。
中嫌気的条件下、３７℃で約２日間行う。微生物株は５
０％グリセロールを含有する上述の栄養溶液中に−２０
℃で維持する。発酵槽を１％前培養で接種する。容量１
０ｌで栄養溶液８ｌを加えた発酵槽に接種を行う。培養
は、窒素を通じながら、３３℃で一定のｐＨ７．０にお
いて２４時間実施する。培養濾液中の酵素活性を測定す
ると、２０，０００ Ｕ／ｌであった（Ｍｉｔｃｈｅｌ
ｌ， Ｗ．：Ｍｅｔｈ． ｏｆ Ｅｎｚｙｍ．， ４７
巻，１６５〜１７０頁，１９７７）。
【００３０】後処理は、約６，０００ｇでの遠心分離に
よる細胞の除去、孔径０．２２μｍのフィルターを通し
た濾過による滅菌、ついで濾液への６０％氷冷（−２０
℃）メタノールの添加によって行った。次に溶液を−２
０℃に２４時間保持し、ついで遠心分離した（８，００
０ｇ）。ペレットを滅菌二重蒸留水に溶解し、遠心分離
した（１２，０００ｇ）。ペレット中の酵素活性の測定
値は３００ Ｕ／ｍｌ、２００ Ｕ／ｍｇ蛋白質であっ
た。収率は発酵槽中の活性の測定値の７５％であった。
よる細胞の除去、孔径０．２２μｍのフィルターを通し
た濾過による滅菌、ついで濾液への６０％氷冷（−２０
℃）メタノールの添加によって行った。次に溶液を−２
０℃に２４時間保持し、ついで遠心分離した（８，００
０ｇ）。ペレットを滅菌二重蒸留水に溶解し、遠心分離
した（１２，０００ｇ）。ペレット中の酵素活性の測定
値は３００ Ｕ／ｍｌ、２００ Ｕ／ｍｇ蛋白質であっ
た。収率は発酵槽中の活性の測定値の７５％であった。
【００３１】実施例２
細胞は例１の場合と同様に培養した。発酵槽中の製造培
地は次の通りとし、 プロテアーゼペプトン（Ｄｉｆｃｏ） ５
％システイン
０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４
０．１５％ｐ
Ｈ７．２ ２％前培養で接種した。培養濾液中のクロストリパイン
活性は４５，０００ Ｕ／ｍｌであった。
地は次の通りとし、 プロテアーゼペプトン（Ｄｉｆｃｏ） ５
％システイン
０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４
０．１５％ｐ
Ｈ７．２ ２％前培養で接種した。培養濾液中のクロストリパイン
活性は４５，０００ Ｕ／ｍｌであった。
【００３２】後処理は、細胞を除去するための０．３μ
ｍ膜（Ｆｉｌｔｒｏｎ，オメガ膜）接線流濾過、および
溶解したクロストリパインを濃縮するための１０ＫＤ膜
（Ｆｉｌｔｒｏｎ，オメガ膜）接線流濾過によって実施
した。濃縮ファクターは２０とした。濃縮液を次に脱塩
し、ＤＥＡＥ−セルロース上クロマトグラフィーに付し
た。クロストリパイン活性１，０００ Ｕ／ｍｌ；収率
８５％。酵素プレパレーションは使用時まで−２０℃に
保存した。
ｍ膜（Ｆｉｌｔｒｏｎ，オメガ膜）接線流濾過、および
溶解したクロストリパインを濃縮するための１０ＫＤ膜
（Ｆｉｌｔｒｏｎ，オメガ膜）接線流濾過によって実施
した。濃縮ファクターは２０とした。濃縮液を次に脱塩
し、ＤＥＡＥ−セルロース上クロマトグラフィーに付し
た。クロストリパイン活性１，０００ Ｕ／ｍｌ；収率
８５％。酵素プレパレーションは使用時まで−２０℃に
保存した。
【００３３】実施例３
Ａ． クロストリパインの活性化
酵素プレパレーション５０μｌ（２００ Ｕ／ｍｌ，２
８６ Ｕ／ｍｇ，実施例１より） 活性化緩衝液１μｌ（２５０ｍＭ ＤＴＴ，１２５ｍＭ
ＣａＣｌ２） ─混合物中含量 ＤＴＴ ５ｍＭ ＣａＣｌ２ ２．５ｍＭ ─氷上で２時間インキュベーション ─切断反応用には酵素を２５ｍＭ トリス／ＨＣｌ緩衝
液ｐＨ７．８で１：４０に希釈する。
８６ Ｕ／ｍｇ，実施例１より） 活性化緩衝液１μｌ（２５０ｍＭ ＤＴＴ，１２５ｍＭ
ＣａＣｌ２） ─混合物中含量 ＤＴＴ ５ｍＭ ＣａＣｌ２ ２．５ｍＭ ─氷上で２時間インキュベーション ─切断反応用には酵素を２５ｍＭ トリス／ＨＣｌ緩衝
液ｐＨ７．８で１：４０に希釈する。
【００３４】Ｂ． （Ｂ３１）Ａｒｇ−インスリンを
遊離させるためのクロストリパイン切断混合物１００μ
ｌ ＩｎｓｕＡｒｇ（１ｍｇ／ｍｌ）２０μｌ
ＫＣｌ（１Ｍ） ５μｌ トリス／ＨＣｌ（１Ｍ，ｐＨ７．８
）５５μｌ 水 ２０μｌ クロストリパイン（１：４０希釈）─
混合物中含量 ＩｎｓｕＡｒｇ ０．５ｍｇ／ｍｌクロ
ストリパイン ２．５ Ｕ／ｍｌＤＴＴ
１２．５μＭトリス／ＨＣｌ
２５ｍＭ ＫＣｌ １００ｍＭＣａＣｌ２
６μＭ─２８℃で１〜２時
間インキュベーション、反応はＨＰＬＣによって容易に
チェックできる。ついで反応はトシル−Ｌ−リジンクロ
ロメチルケトン（ＴＬＣＫ）で停止させる。 ─１μｌのＴＬＣＫ（１５ｍＭ）の添加により反応を停
止。 ─４℃で保存 ─結果：ヒトインスリン−Ａｒｇ。ＨＰＬＣで検出可能
なヒトインスリン（ｄｅ Ｂ３０）は形成しない。
遊離させるためのクロストリパイン切断混合物１００μ
ｌ ＩｎｓｕＡｒｇ（１ｍｇ／ｍｌ）２０μｌ
ＫＣｌ（１Ｍ） ５μｌ トリス／ＨＣｌ（１Ｍ，ｐＨ７．８
）５５μｌ 水 ２０μｌ クロストリパイン（１：４０希釈）─
混合物中含量 ＩｎｓｕＡｒｇ ０．５ｍｇ／ｍｌクロ
ストリパイン ２．５ Ｕ／ｍｌＤＴＴ
１２．５μＭトリス／ＨＣｌ
２５ｍＭ ＫＣｌ １００ｍＭＣａＣｌ２
６μＭ─２８℃で１〜２時
間インキュベーション、反応はＨＰＬＣによって容易に
チェックできる。ついで反応はトシル−Ｌ−リジンクロ
ロメチルケトン（ＴＬＣＫ）で停止させる。 ─１μｌのＴＬＣＫ（１５ｍＭ）の添加により反応を停
止。 ─４℃で保存 ─結果：ヒトインスリン−Ａｒｇ。ＨＰＬＣで検出可能
なヒトインスリン（ｄｅ Ｂ３０）は形成しない。
【００３５】Ｃ． ヒトインスリン遊離のためのカル
ボキシペプチダーゼＢ切断混合物 クロストリパイン切断混合物２００μｌカルボキシペプ
チダーゼＢ（１：１００希釈）１０μｌ─混合物中のカ
ルボキシペプチダーゼ含量：２．５μｇ／ｍｌ ─２８℃で２〜４時間インキュベーション、反応はＨＰ
ＬＣで容易にチェックできる。 ─反応のためには、カルボキシペプチダーゼＢ（７５９
Ｕ／ｍｌ，１５０ Ｕ／ｍｇ，ブタ膵臓より）は２５
ｍＭ トリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．８で１：１，００
０に希釈する。 ─結果：ヒトインスリン。ＨＰＬＣで検出可能なインス
リン（ｄｅ Ｂ３０）は形成しない。
ボキシペプチダーゼＢ切断混合物 クロストリパイン切断混合物２００μｌカルボキシペプ
チダーゼＢ（１：１００希釈）１０μｌ─混合物中のカ
ルボキシペプチダーゼ含量：２．５μｇ／ｍｌ ─２８℃で２〜４時間インキュベーション、反応はＨＰ
ＬＣで容易にチェックできる。 ─反応のためには、カルボキシペプチダーゼＢ（７５９
Ｕ／ｍｌ，１５０ Ｕ／ｍｇ，ブタ膵臓より）は２５
ｍＭ トリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．８で１：１，００
０に希釈する。 ─結果：ヒトインスリン。ＨＰＬＣで検出可能なインス
リン（ｄｅ Ｂ３０）は形成しない。
【００３６】Ｄ． ＨＰＬＣ分析
切断はＲＰ １８カラム（０．１２５Ｍ ＮＨ４（ＳＯ
４）２，Ｈ２ＳＯ４でｐＨ４に調整、２５〜５０％アセ
トニトリル勾配）またはＣ８カラム（０．１％ＴＦＡ，
２０％〜５０％アセトニトリル勾配）を用いてチェック
した。
４）２，Ｈ２ＳＯ４でｐＨ４に調整、２５〜５０％アセ
トニトリル勾配）またはＣ８カラム（０．１％ＴＦＡ，
２０％〜５０％アセトニトリル勾配）を用いてチェック
した。
【００３７】実施例４
クロストリパイン：２００ Ｕ／ｍｌ（実施例１より）
活性化緩衝液：５００ｍＭ トリス／ＨＣｌ，ｐＨ７．
８１００ｍＭ ＤＴＴ ２５ｍＭ ＣａＣｌ２ 活性化：クロストリパイン溶液 １００μｌ活性化緩
衝液 １０μｌフォールディン
グ混合物： ヒトプレ−Ｂ鎖−Ａ鎖インスリンＳ−スルホネート３５
．７ｍｇ １Ｍメルカプトエタノール３１５μｌ １Ｍアスコルビン酸１０５μｌ ２０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ１０．７，１００μｌフォ
ールディングは冷室中４℃で一夜行い、フォールディン
グ収量は０．１５２ｍｇ／ｍｌであった。ｐＨ５．０に
おけるｐＨ沈殿によって不純物を除去したのち、トリス
を最終濃度５０ｍＭになるように添加し、ｐＨをＨＣｌ
で７．８に調整した。酵素溶液３０μｌを加えた。切断
は３０℃で行い、ＨＰＬＣで追跡した。 結果：上述のプレプロインスリンはヒトインスリン−Ａ
ｒｇに切断できる。インスリン（ｄｅ Ｂ３０）の形成
は微小である。
活性化緩衝液：５００ｍＭ トリス／ＨＣｌ，ｐＨ７．
８１００ｍＭ ＤＴＴ ２５ｍＭ ＣａＣｌ２ 活性化：クロストリパイン溶液 １００μｌ活性化緩
衝液 １０μｌフォールディン
グ混合物： ヒトプレ−Ｂ鎖−Ａ鎖インスリンＳ−スルホネート３５
．７ｍｇ １Ｍメルカプトエタノール３１５μｌ １Ｍアスコルビン酸１０５μｌ ２０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ１０．７，１００μｌフォ
ールディングは冷室中４℃で一夜行い、フォールディン
グ収量は０．１５２ｍｇ／ｍｌであった。ｐＨ５．０に
おけるｐＨ沈殿によって不純物を除去したのち、トリス
を最終濃度５０ｍＭになるように添加し、ｐＨをＨＣｌ
で７．８に調整した。酵素溶液３０μｌを加えた。切断
は３０℃で行い、ＨＰＬＣで追跡した。 結果：上述のプレプロインスリンはヒトインスリン−Ａ
ｒｇに切断できる。インスリン（ｄｅ Ｂ３０）の形成
は微小である。
Claims (9)
- 【請求項１】 式Ｉ 【化１】 （式中、Ｒ１はｎ個のアミノ酸で、ｎは０または１の整
数であり、Ｒ２は水素、化学的もしくは酵素的に切断除
去できるアミノ酸、または２〜３０個のアミノ酸残基を
有するペプチドであり、Ｒ３はヒドロキシル基、アミノ
酸または２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドであり
、ＸはＬ−アルギニンまたは２〜４５個のアミノ酸を有
しＣ末端およびＮ末端にＬ−アルギニン残基をもつペプ
チドであり、Ｙは遺伝子でコードできるアミノ酸であり
、Ｚは遺伝子でコードできるアミノ酸であり、Ａ１〜Ａ
２０またはＢ２〜Ｂ２９は、天然のまたは１個もしくは
２個以上のアミノ酸残基を置換して修飾したヒトもしく
は動物インスリンのアミノ酸配列である）のプレプロイ
ンスリンのアミノ酸鎖を加水分解する方法において、プ
レプロインスリンをクロストリパインの存在下に加水分
解し、必要に応じてカルボキシペプチダーゼＢにより相
当するインスリンに変換する方法。 - 【請求項２】 式Ｉにおいて、Ｒ１はＰｈｅであり、
Ｒ２は水素、天然アミノ酸または２〜３０個の天然アミ
ノ酸を有し末端にＣ末端Ｌ−アルギニンをもつペプチド
であり、Ｒ３はヒドロキシル基、天然アミノ酸または２
〜１０個の天然アミノ酸をもつペプチドであり、ＸはＬ
−アルギニンまたはヒトもしくは動物のプロインスリン
のＣ鎖であり、ＹはＴｈｒ、ＡｌａまたはＳｅｒからな
る群よりのアミノ酸であり、ＺはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓ
ｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＭ
ｅｔからなる群よりのアミノ酸であり、Ａ１〜Ａ２０ま
たはＢ２〜Ｂ２９はヒトまたは動物のインスリンのアミ
ノ酸配列であるプレプロインスリンを使用する請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 式Ｉにおいて、Ｒ１はＰｈｅであり、
Ｒ２は水素または２〜３個の天然アミノ酸を有し末端に
Ｃ末端Ｌ−アルギニンをもつペプチドであり、Ｒ３はヒ
ドロキシル基、天然アミノ酸または２〜１０個の天然ア
ミノ酸をもつペプチドであり、ＸはＬ−アルギニンまた
はヒト、ブタもしくはウシプロインスリンのＣ鎖であり
、ＹはＴｈｒであり、ＺはＡｓｎであり、Ａ１〜Ａ２０
またはＢ２〜Ｂ２９はヒト、ブタまたはウシインスリン
のアミノ酸配列であるプレプロインスリンを使用する請
求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 ｐＨ４〜１２、好ましくは６〜９で実
施する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 式Ｉのプレプロインスリンの濃度は０
．０１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．
１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌとする請求項１〜４のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 プレプロインスリン／クロストリパイ
ンの比（ｍｇ対単位）は１：０．０１〜１：１，０００
、好ましくは１：０．１〜１：５０とする請求項１〜５
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 反応温度は０℃〜＋８０℃、好ましく
は＋２０℃〜＋４０℃とする請求項１〜６のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項８】 カルボキシペプチダーゼＢはクロスト
リパインと同時に存在させるかまたはクロストリパイン
による切断後に使用する請求項１〜７のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項９】 クロストリパインおよび／またはカル
ボキシペプチダーゼＢは固定化型として存在させる請求
項１〜８のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE40281183 | 1990-09-05 | ||
| DE4028118 | 1990-09-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04258296A true JPH04258296A (ja) | 1992-09-14 |
| JP3005335B2 JP3005335B2 (ja) | 2000-01-31 |
Family
ID=6413629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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