PL167810B1

PL167810B1 - Sposób enzymatycznej hydrolizy lancucha aminokwasu przedproinsuliny PL PL

Info

Publication number: PL167810B1
Application number: PL91291617A
Authority: PL
Inventors: Michael Doerschug; Klaus-Peter Koller; Ruediger Marquardt; Johannes Meiwes
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-09-05
Filing date: 1991-09-04
Publication date: 1995-11-30
Also published as: JP3005335B2; YU147491A; LV10508A; HUT58823A; IE75723B1; PL291617A1; CA2050606A1; FI914151A0; EP0474212B1; NO300980B1; LTIP712A; NO913474D0; US5728543A; CS271191A3; ATE145922T1; CZ283234B6; JPH04258296A; GR3021909T3; HU214676B; KR100188800B1

Abstract

I. Sposób enzymatycznej hydrolizy lancucha aminokwasu przedproinsuliny o wzorze przedstawio- nym na rysunku, w którym R 1 oznacza n aminokwa- sów, przy czym n oznacza liczbe calkowita 0 albo 1, R oznacza wodór, dajacy sie odszczepic chemicznie albo enzymatycznie aminokwas albo peptyd o 2 do 30 resztach aminokwasowych, R 3 oznacza grupe hydro- ksylowa, aminokwas albo peptyd o 2 do 10 aminokwa- sach, X oznacza L-arginine albo peptyd o 2 do 45 aminokwasach, przy którym C-krancowo i N-kranco- wo stoi reszta L-argininy, Y oznacza dajacy sie kodo- wac genetycznie aminokwas, Z oznacza dajacy sie kodowac genetycznie aminokwas, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza naturalna albo zmieniona przez wy- miane jednej albo kilku reszt aminokwasowych se- kwencje aminokwasu ludzkich albo zwierzecych insulin, znam ienny tym , ze jako enzym stosuje sie Clostripain. WZÓR PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest enzymatyczny sposób przemiany przedproinsulin w insuliny przez hydrolizę łańcucha aminokwasu przedproinsuliny.

Insuliny składają się z dwóch łańcuchów polipeptydowych, łańcucha A, który zawiera 21 reszt aminokwasowych i łańcucha B o 30 resztach aminokwasowych. Łańcuchy A i B są połączone ze sobą przez dwa mostki dwusiarczkowe, przy czym reszty cysteiny są połączone ze sobą w pozycji a7 i B7 oraz A20 i B19. Trzeci mostek dwusiarczkowy istnieje między A6 i A11. Zwierzęce i ludzkie insuliny tworzą się w trzustkach w postaci przedproinsulin. Ludzka przedproinsulina składa się np. z przedpeptydu o 24 resztach aminokwasowych, przy czym

167 810 bezpośrednio stoi proinsulina o 86 resztach aminokwasowych o następującej konfiguracji: przedpeptyd-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, przy czym C oznacza Łańcuch aminokwasu o 31 resztach. Podczas wydalania z wysepek trzustkowych (Langerhansa) przedpeptyd zostaje oddzielony i powstaje proinsulina. Następnie zostaje rozszczepiony proteolitycznie łańcuch C i · powstaje czynna insulina ludzka.

Metody inżynierii genetycznej pozwalają w rosnącej mierze na ekspresję przedproinsulin w mikroorganizmach (opis patentowy EP-A nr 347 781, opis patentowy eP-A nr 367 163). Odszczepianie przedprosekwencji następuje z reguły chemicznie albo enzymatycznie (opis patentowy DE-P nr 3 440 988, opis patentowy EP-A nr 026 4250). Znane enzymatyczne metody przemiany polegają na rozszczepianiu za pomocą trypsyny i karboksypeptydazy B (Kemmber W. et al. J.Biol.Chem., 246 (1971) 6786-6791; opis patentowy EP-A nr 195 691; opis patentowy EP-B nr 89007. Wadą tej metody jest powstawanie dużych ilości produktów ubocznych, które tylko z trudem trzeba oddzielić z roztworu reakcyjnego. Szczególnie przy przemianie ludzkiej przedproinsuliny w insulinę ludzką (Humaninnsulin, HI) powstają większe ilości insuliny ludzkiej Des-Thr(B30) (Des-Thr(B30)-HI). Ten produkt uboczny odróżnia się od HI tylko przez brak stojącego na końcu aminokwasu i jest bardzo trudny do oddzielania z roztworów reakcyjnych.

W celu uniknięcia tego tworzenia produktu ubocznego można dodawać określone metale ciężkie, w szczególności nikiel, do zestawu rozszczepiania (opis patentowy EP-A nr 0264 250). Tego rodzaju prowadzenie reakcji nie jest pożądane z wieloprzemysłowego punktu widzenia ze względu na wysokie obciążenia ścieków metalami ciężkimi. Występuje dlatego zapotrzebowanie na możliwie specyficzną i znośną dla środowiska przemianę przedproinsulin.

Clostripain (clostripeptydaza B; EC 3.4.22.8) jest enzymem z przesączu hodowli Clostridium histolyticum o masie cząsteczkowej około 30 000 do 80 000, który wykazuje zarówno aktywność proteolitycznąjak również aktywność amidazy-esterazy (Mitchell, W.M. Harrington, W.F., J.of Biol.Chem., 243 (18), 4683-4692, 1968). Odznacza się on wysoką specyficznością dla wiązań Arg-C. Tak w wyodrębnionym łańcuchu B insuliny wiązanie Arg-Gly jest rozszczepiane przez Clostripain 500-krotnie szybciej niż wiązanie Lys-Ala i w glukagonie zostają rozszczepione tylko Arg-Arg, Arg-Ala i Lys-Tyr. Szybkości hydrolizy dla tych wiązań stoją w stosunku 1, 1Π i 1/300 do siebie (Labouesse, B., Bull.Soc. Chim.Biol., 42, 1293, 1960).

Nieoczekiwanie obecnie znaleziono, że Clostripain (klostripaina) rozszczepia przedproinsulinę specyficznie C-końcowo za argininą, bez wystąpienia za znajdującą się w łańcuchu B argininą (B22) znaczniejszego rozszczepiania łańcucha aminokwasu.

Wynalazek dotyczy zatem sposobu hydrolizy łańcucha aminokwasu przedproinsuliny o wzorze, przedstawionym na załączonym rysunku, w którym R¹ oznacza n aminokwasów, przy czym n oznacza liczbę całkowitą 0 albo 1, R² oznacza wodór, dający się odszczepić chemicznie albo enzymatycznie aminokwas albo peptyd o 2 do 30 resztach aminokwasowych, R³ oznacza grupę hydroksylową, aminokwas albo peptyd 2 do 10 aminokwasach, X oznacza L-argininę albo peptyd o 2 do 45 aminokwasach, przy którym C-końcowo i N-końcowo stoi reszta L-argininy, Y oznacza dający się kodować genetycznie aminokwas, Z oznacza dający się kodować genetycznie aminokwas, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza natuaralną albo zmienioną przez wymianę jednej albo kilku reszt aminokwasowych sekwencję aminokwasu ludzkich albo zwierzęcych insulin, który charakteryzuje się tym, że jako enzym stosuje się Clostripain.

Sekwencję aminokwasu peptydów i protein określa się od N-krańcowego końca łańcucha aminokwasu. Proteazy hydrolizują wiązanie peptydowe między aminokwasami peptydów i protein. Clostripain hydrolizuje zawierające L-argininę peptydy albo proteiny specyficznie za argininą. Jako produkty reakcji hydrolizy przedproinsuliny powstają pochodne insuliny albo polipeptydy, które mają C-końcowo resztę argininy, albo aminokwasy.

Pod pojęciem naturalne aminokwasy rozumie się np. Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Hyp, Trp, Arg, Lys Hyl, Orn, Cit albo His.

Dla pojęcia dający się kodować genetycznie aminokwas są np. Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro albo selenocysteina.

Korzystne są przedproinsuliny o wzorze, przedstawionym na załączonym rysunku, w którym R¹ oznacza Phe, r2 oznacza wodór, naturalny aminokwas albo peptyd o 2 do 30

167 810 naturalnych aminokwasach, który kończy się C-krańcowo L-argininą, R³ oznacza grupę hydroksylową, naturalny aminokwas albo peptyd o 2 do 10 naturalnych aminokwasach, X oznacza L-argininę albo C-Łańcuch ludzkiej albo zwierzęcej proinsuliny, Y oznacza aminokwas z grupy Thr, Ala albo Ser, Z oznacza aminokwas z grupy Asn, Gln, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala albo Met, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza sekwencję aminokwasu ludzkich albo zwierzęcych insulin.

Szczególnie korzystne są przedproinsuliny o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R¹ oznacza Phe, R² oznacza wodór albo peptyd, o 2 do 30 naturalnych aminokwasach, który kończy się C-krańcowo L-argininą, r3 oznacza grupę hydroksylową, naturalny aminokwas albo peptyd, o 2 do 10 naturalnych aminokwasach, X oznacza L-argininę albo C-Łańcuch ludzkiej, świńskiej albo bydlęcej proinsuliny, Y oznacza Thr, Z oznacza Asn, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza sekwencję aminokwasu ludzkiej, świńskiej albo bydlęcej insuliny.

W szczególności korzystne są insuliny, które zostały już zaproponowane w niemieckich zgłoszeniach patentowych nr P 39 19 852 i nr P 40 12 818.0. Na przykład InsuArg o następuj ącej sekwencji aminokwasu:

NH2-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn-COOH

Clostripain (EC 3.4.22.8.) jest pozakomórkową tioloproteazą z Clostridien’u. Enzym jest heterodimerem i nie ma żadnej homologii z innymi znanymi tioloproteazami. Enzym ma nadzwyczajnie wysoką specyficzność dla wiązań Arg-XXX w szczególności Arg-Pro. Można ją scharakteryzować przez masę cząsteczkową między 30 000 i 80 000 i punkt izoelektryczny, od pH 4,8 do 4,9. Jako aktywatory działają np. cysteina, merkaptoetanol, ditiotreitol albo jony wapnia.

W obecności np. tosylo-L- lizyno-chlorometyloketonu, nadtlenku wodoru, EDTA, jonów Co2+-, Cu2+-, Cd2+- albo cytrynianu Clostripain jest hamowany.

Wytwarzanie Clostripain’u przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów przez fermentację. W tych procesach hoduje się laseczki beztlenowe zarodnikujące (Clostridien), dotąd aż Clostripain nagromadzi się w pożywce. Przydatny jest np. Clostridium histolylicum, w szczególności Clostridium histolyticum DSM627. Przydatne są również mutanty i warianty wymienionych mikroorganizmów, jeśli syntetyzują Clostripain.

Hodowlę przeprowadza się anaerobowo osobno albo w hodowli mieszanej, np. wgłębnie w stojącej hodowli w nieobecności tlenu albo w fermentorach, ewentualnie przy wprowadzaniu azotu, gazów szlachetnych albo innych gazów, oprócz tlenu. Fermentację przeprowadza się w zakresie temperatur od około 10 do 45°C, korzystnie około 25 do 40°C, w szczególności 30 do 38°C. Fermentację prowadzi się w zakresie pH między 5 i 8,5, korzystnie między 5,5 i 8. W tych warunkach wykazuje odwar hodowlany na ogół po 1 do 3 dni znaczniejsze nagromadzenie enzymu. Synteza Clostripain’u rozpoczyna się w późnej log-fazie i osiąga swe maksimum w stałej fazie wzrostu. Produkcję enzymu można śledzić za pomocą testu aktywności (Mitchel W., Meth. of Enzym., tom 47 (1977), str. 165-170).

Zastosowany do produkcji Clostripain’u roztwór odżywczy zawiera 0,2 do 6%, korzystnie 0,5 do 3%, organicznych związków azotu jak również sole nieorganiczne. Jako organiczne związki azotu wchodzą w rachubę: aminokwasy, peptony, dalej wyciągi mięsne, zmielone nasiona, np. kukurydzy, pszenicy, fasoli, soji albo rośliny bawełny, pozostałości destylacji z wytwarzania alkoholu, mączki mięsne albo wyciągi z drożdży. Z soli nieorganicznych roztwór odżywczy może zawierać np. chlorki, węglany, siarczany albo fosforany metali alkalicznych albo metali ziem alkalicznych, żelazo, cynk i mangan, lecz również sole amonowe i azotany.

Optymalne warunki fermentacji są dla każdego mikroorganizmu wprawdzie różne, ale albo są już znane specjalistom albo też łatwe do ustalenia w łatwych próbach wstępnych. Oczyszczanie Clostripain’u można przeprowadzać klasycznymi sposobami np. przez strącanie z siarczanem amonu, chromatografię z wymieniaczami jonów albo chromatografię żelową. Łączenie enzymu jest możliwe według powszechnie używanych metod (Colowick i Kaplan, Meth. Enzymol., tom XLIV).

167 810

Do reakcji enzymatycznej można stosować zarówno całe komórki w postaci wolnej albo unieruchomionej jak również wyodrębniony produkt enzymu, który może być również związany na nośniku.

Rozszczepianie przedproinsulin o wzorze, przedstawionym na rysunku, za pomocą Clostripain’u przeprowadza się w środowisku wodnym, do którego można również dodać mieszające się z wodą składniki organiczne, jak np. alkohole, ketony, mocznik,

N, N-dwumetyloformamid. W szczególności do zestawu reakcyjnego dla lepszej kontroli wartości pH można dodać odpowiednie bufory nieorganiczne albo organiczne jak fosforan, Tris, glicyna, HEPES i podobne. Stężenie przedproinsulin podczas rozszczepiania wynosi np. między

O, 01 mg/ml i 100 mg/ml, korzystnie między 0,1 mg/ml i 10 mg/ml. Stosunek przedproinusliny do Clostripain’u wynosi (mg do jednostek, Units (U)) 1:0,01 do 1:1000, korzystnie 1:0,1 do 1:50.

Temperatura przy reakcji jest również zmienna w szerokim zakresie. Korzystny jest zakres temeperatur między 0°C i +80°C, szczególnie korzystna temeperatura między +20°C i +40°C.

Wartość pH w reakcji może się zmieniać między pH 4 i pH 12, szczególnie korzystny jest zakres między pH 6 i pH 9.

Czas, który jest potrzebny do przemiany przedproinsulin w odpowiednie produkty pośrednie, można zmieniać zależnie od warunków reakcji w szerokim zakresie, np. może on wynosić między 15 min i 48 h, korzystny jest czas trwania reakcji między 1h i 6h.

Enzym przed zastosowaniem jest aktywowany w odpowiedni sposób w obecności merkaptanu. Jako merkaptany wchodzą przy tym w rachubę w zasadzie wszystkie związki, które zawierają grupy SH, korzystnie stosuje się DTT, DTE, merkaptoetanol, kwas tioglikolowy albo cysteinę. Stężenie merkaptanu można zmieniać w szerokim zakresie, korzystne są stężenia między 0,1 mM i 100 mM. Dalej bufor aktywacji zawiera jony Ca²⁺, korzystnie CaCk. Aktywacja zachodzi między pH 4 i pH 12, korzystnie między pH 6 i pH 8, szczególnie korzystny jest zakres pH 7 do pH 8. W celu utrzymania wartości pH można dodać odpowiednią substancję buforową, np. Tris, HEPES, glicynę i podobne. Temperatura aktywacji może wynosić między 0°C i 60°C, korzystny jest zakres 0°C do 10°C, szczególnie korzystny 0°C do 5°C. Tak aktywowany enzym może być stosowany bezpośrednio, albo ewentualnie przez chromatografię przez ®Ultrogel AcA 202 uwolniony od buforu aktywacji.

Rozszczepianie według wynalazku przedproinsuliny o wzorze, przedstawionym na załączonym rysunku, prowadzi do pochodnych insuliny z resztami argininy przy C-krańcowym końcu insulin i odpowiednich odszczepionych aminokwasów i/albo peptydów. Pochodne insuliny można w razie potrzeby za pomocą karboksypeptydazy B przeprowadzić w odpowiednie insuliny. To może nastąpić w tym samym zestawie reakcji równocześnie razem z Clostripain’em, lecz również w wyżej wymienionych warunkach reakcji kolejno, przy czym pochodna insuliny może być ewentualnie wyodrębniona przed obróbką karboksypeptydazą B za pomocą znanych metod jak np. chromatografia albo krystalizacja. Karboksypeptydazę B można stosować w postaci rozpuszczonej albo unieruchomionej. Stosunek karboksypeptydazy B do pochodnej insuliny wynosi (ciężar do ciężaru) około 1:10 do 1:5000, korzystnie około 1:500 do 1:3500 i szczególnie korzystnie około 1:1000 do 1:3000.

Stosunek karboksypeptydazy B do Clostripain’u wynosi (ciężar do ciężaru) około 1:1 do 10:1 i korzystnie 2:1 do 5:1.

Produkty reakcji rozszczepiania Clostripain’em i/albo karboksypeptydazą B można np. wytrącić przez obniżenie wartości pH i/albo oczyścić za pomocą znanych metod chromatografii kolumnowej. Otrzymaną insulinę można preparować w przyjętych postaciach podawania i stosować jako środki lecznicze do leczenia Diabetes mellitus.

W następujących przykładach opisano szczegółowo sposób według wynalazku. Dane procentowe odnoszą się do ciężaru, jeśli nie podano inaczej.

Przykład I. Clostripain - zestaw rozszczepiania do uwolnienia (B31)Arg-insuliny.

100	μΐ Insu-Arg	(1 mg/ml)
20	μ! KCl	(IM)
5	ml Tris/Hd	(1M, pH7,8)
55	μΐ H2O
20	μ! Clostripain (rozcieńczenie 1:40).

167 810

Zawartość w zestawie:

Insu-Arg	0,5	mg/ml
Clostripain	2,5	U/ml
DTT	12,5	μM
Tris/HCl	25	mM
KCl	100	mM
CaCl2	6	pM.

- Wylęganie 1-2h w temperaturze 28°C, reakcję można łatwo kontrolować przez HPLC, potem zatrzymanie reakcji za pomocą ketonu tosylo-L-lizyno-chlorometylu (TLCK).

- Zatrzymanie reakcji przez dodanie 1μ1 TLCK (15 mM).

- Składowanie w temperaturze 4°C.

- Wynik: ludzka insulina-Arg (Human-Arg).

Za pomocą HPLC nie daje się zmierzyć tworzenie ludzkiej insuliny (DES B30) [HumanInsulin (Des B30)].

Analityka HPLC.

Rozszczepiania skontrolowano z zastosowaniem kolumny RP 18 (0,125 M NH4 (SO4)2, za pomocą H2SO4 nastawiono na pH 4,25-50% gradient acetonitrylu) lub kolumny C8 (0,1 % TFA, 20%-50% gradient acetonitrylu).

Przykład Π.

Clostripain: 200 U/ml.

mM Tris/HCl, pH 7,8 mMDTT mM Ca Cl2.

μ1 roztworu Clostripain’u μl buforu aktywacji.

Bufor aktywacji: 500 100 25

Aktywacja: 100

Zestaw fałdowania;

35,7 mg ludzkiego sulfonianu pre-B-łańcuch-A-lańcuchowej insuliny-S

315 μΐ 1M merkaptoetanolu

105 μ.1 1M kwasu askorbinowego

100 mil 20 mM buforu glicyny, pH 10,7.

Fałdowanie następowało w ciągu nocy w chłodni w temeperaturze 4°C, wydajność fałdowania wynosiła 0,152 mg.ml. Po oddzieleniu od zanieczyszczeń przez strącanie przy pH 5,0 dodaje się Tris w stężeniu końcowym wynoszącym 50 mM i nastawia wartość pH na 7,8 za pomocą HCl. Dodano 30 μ1 roztworu enzymu.

Rozszczepianie prowadzono w temperaturze 30°C i obserwowano za pomocą HPLC.

Wynik: wyżej wymieniona przedproinsulina daje się rozszczepiać do ludzkiej insuliny Arg (Insulin Arg). Tworzenie insuliny (Des B 30) [Insulin (Des B 30)] jest minimalne.

167 810

167 810 (A-D (A-6) (A-7)

Gly - NH-X

I

Cys-S-S (A-20) (A-21)

Cys—‘ Cys—Cys-Z - R^

I (A-ll) ]

S T

S S (1) (B-2)

R - R¹-HN-Val- Cys(B-7)

-Cys-Y (B-19) (B-30)

WZÓR

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz

Cena 1,50 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób enzymatycznej hydrolizy łańcucha aminokwasu przedproinsuliny o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R¹ oznacza n aminokwasów, przy czym n oznacza liczbę całkowitą 0 albo 1, R² oznacza wodór, dający się odszczepić chemicznie albo enzymatycznie aminokwas albo peptyd o 2 do 30 resztach aminokwasowych, R³ oznacza grupę hydroksylową, aminokwas albo peptyd o 2 do 10 aminokwasach, X oznacza L-argininę albo peptyd o 2 do 45 aminokwasach, przy którym C-krańcowo i N-krańcowo stoi reszta L-argininy, Y oznacza dający się kodować genetycznie aminokwas, Z oznacza dający się kodować genetycznie aminokwas, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza naturalną albo zmienioną przez wymianę jednej albo kilku reszt aminokwasowych sekwencję aminokwasu ludzkich albo zwierzęcych insulin, znamienny tym, że jako enzym stosuje się Clostripain.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się przedproinsulinę o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R1 oznacza Phe, R2 oznacza wodór, naturalny aminokwas albo peptyd o 2 do 30 naturalnych aminokwasach, który kończy się C-krańcowo L-argininą, r3 oznacza grupę hydroksylową, naturalny aminokwas albo peptyd, o 2 do 10 naturalnych aminokwasach, X oznacza L-argininę albo albo C-łańcuch ludzkiej albo zwierzęcej proinsuliny, Y oznacza aminokwas z grupy Thr, Ala albo Ser, Z oznacza aminokwas z grupy Asn, Gln, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala albo Met, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza sekwencję aminokwasu ludzkich albo zwierzęcych insulin.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym,że stosuje się przedproinsulinę o wzorze, przedstawionym na rysunku, w którym R1 oznacza Phe, R2 oznacza wodór albo peptyd, o 2 do 30 naturalnych aminokwasach, który kończy się C-krańcowo L-argininą, r3 oznacza grupę hydroksylową, naturalny aminokwas albo peptyd, o 2 do 10 naturalnych aminokwasach, X oznacza L-argininę albo C-łańcuch ludzkiej, świńskiej albo bydlęcej proinsuliny, Y oznacza Thr, Z oznacza Asn, Al do A20 albo B2 do B29 oznacza sekwencję aminokwasu ludzkiej, świńskiej albo bydlęcej insuliny.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces przeprowadza się przy wartości pH między 4 i 12, korzystnie między 6 i 9.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się stężenie przedproinsulin o wzorze, przedstawionym na załączonym rysunku, między 0,01 mg/ml i 100 mg/ml, korzystnie między 0,1 mg/ml i 10 mg/ml.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek przedproinsuliny do Clostripain'u wynosi (mg do U) 1:0,01 do 1:1000, korzystnie 1:0,1 do 1:50.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się temperaturę reakcji między 0°C i +80°C, korzystnie między +20°C i +40°C.