JPH04273058A - セルロース系ゲル濾過充填剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、セルロース系ゲル濾過
充填剤に関する。更に詳しくは水溶性低分子物質混合物
の分離・分取用ゲル濾過充填剤で、分配係数が特定の分
子量範囲で急激に変化する特性を備えたセルロース系ゲ
ル濾過充填剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】セルロースあるいはその各種誘導体の粒
状物は、近年クロマトグラフィー材料として使用される
ようになっている。

【０００３】クロマトグラフィー用充填剤として用いら
れるセルロース担体は、粒度、担体内部のポアーサイズ
等がその分離目的に応じて設計されている。

【０００４】日本化学会誌１９８４年　　Ｎｏ５、７２
２〜７２７頁にはセルロース有機酸エステルからの多孔
性セルロース球状粒子の製造とその粒子の性質に関する
研究報告がなされている。

【０００５】また、特開昭５７−３８８０１号公報には
、同様に、セルロース有機酸エステルからの多孔性セル
ロース球状粒子の製造法が開示されている。

【０００６】これらのクロマトグラフィー用セルロース
担体は、分子量の比較的大きい蛋白質の分離にその有用
性が示されている。

【０００７】しかしこれらの方法において製造される多
孔性セルロース粒子は、セルロース担体内部のポアーサ
イズが小さくなるとともに、そのポアー量も少なくなり
、分離精度が低下する問題点がある。

【０００８】近年、水溶性低分子物質（分子量数千以下
）の混合物、例えばオリゴ糖の混合物、アミノ酸・ペチ
プドの混合物から特定の分子量範囲の製品を分離・分取
するために、イオン交換樹脂、ゲル濾過剤等が用いられ
ているが、たとえば、オリゴ糖の３糖以上のような分子
量５００〜１０００の範囲にある物質では、ゲル濾過に
よって分離性能よく分画することが困難とされている。

【０００９】日本化学会誌１９８１年　　Ｎｏ１２、１
８８３〜１８８９頁にはセルロース球状ゲルの製造とそ
のゲルクロマトグラフィーに対する性能に関する研究報
告がなされている。

【００１０】この報告では、セルロースへの橋かけ効果
について検討されており、球状セルロースをエピクロル
ヒドリンを用いて架橋反応せしめると、未架橋球状セル
ロースのポアーサイズよりも小さくならないことが事実
として報告されている。同報告には、この現象は架橋反
応によって水素結合が破壊され、かえってセルロースの
網目構造が大きくなり、ポアーサイズが増大するためで
あると考察されている。即ち、従来分子量数千以下のポ
アーサイズの小さいセルロース粒子は、架橋することに
よっても得られ難いと理解されていた。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、水溶
性低分子物質の混合物を高速分離するのに適したセルロ
ース系ゲル濾過充填剤を提供することにある。

【００１２】本発明の他の目的は、特定の比較的低分子
量範囲で、分配係数が急激に変化する特性を備えた、高
速分取用のセルロース系ゲル濾過充填剤を提供すること
にある。

【００１３】本発明のさらに他の目的および利点は、以
下の説明から明らかになろう。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、本発明
の上記目的および利点は、（ａ）ＩＩ型セルロース結晶
相とセルロース非晶相から実質的になり、（ｂ）セルロ
ース非晶相にはセルロース分子鎖間に架橋が存在し、（
ｃ）平均粒子径が５０μｍよりも小さい球状粒子から実
質的になり、（ｄ）マルトヘキサオースの分配係数が０
．２５以下であり、マルトースの分配係数とマルトヘキ
サオースの分配係数の差が０．２５以上であり、そして
マルトースの分配係数とグルコースの分配係数の差が０
．１０以下であり、そして（ｅ）マルトトリオースとマ
ルトテトラオースとの分離度が０．４０以上である、こ
とを特徴とするセルロース系ゲル濾過充填剤によって達
成される。

【００１５】本発明のセルロース系ゲル濾過充填剤は、
第１にＩＩ型セルロース結晶相とセルロース非晶相とか
ら構成されている。それ故、天然セルロースすなわちＩ
型セルロースからなるセルロース微粒子とは完全に相違
する。

【００１６】ＩＩ型セルロースとＩ型セルロースとは周
知のとおり、Ｘ線回析により区別される。ＩＩ型セルロ
ースのＸ線回析図には、Ｉ型セルロースに明瞭に存在す
る回析角（２θ）１７°の回析ピークが実質的に存在し
ない。

【００１７】前記ＩＩ型セルロースは、セルロースを一
担セルロース誘導体に変換したのち、加水分解などによ
りセルロースを再生させたセルロースのことである。

【００１８】第２にセルロース非晶相にはセルロース分
子鎖間に架橋が存在する。ＩＩ型セルロースの（１０１
）面及び（００２）面に由来するＸ線回析角（２θ）２
０°付近の回析ピークが明瞭に存在するという特徴があ
る。

【００１９】又セルロース非晶相に存在するセルロース
分子間の架橋は、セルロース分子の水酸基同志を架橋剤
分子を介して橋かけする。

【００２０】架橋度は、例えばエピクロルヒドリンを架
橋剤として使用した場合、ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸
収スペクトルにおいてアルキレンのＣＨ伸縮振動に帰属
する吸収ピークの吸光度によって特定することができる
。本発明のセルロース系ゲル濾過充填剤は０．０６５〜
０．１５６ｍｇ−１．ｃｍ−２の吸光度を有することが
好ましく、０．０９４〜０．１４０ｍｇ−１．ｃｍ−２
の吸光度を有していることがより好ましい。

【００２１】第３に、平均粒子径が５０μｍよりも小さ
い球状粒子から実質的になる。平均粒子径が５０μｍ以
上になると分離ピークがブロードとなり、目的とする物
質間の分離度が小さくなる。分離度を大きくするために
カラム長を長くする必要が生じ、そのため分離時間が長
くなり好ましくない。又平均粒子径が５０μｍ以下にな
るとカラムに溶離液を通じた時の圧力が高くなり、高流
量で分離することができなくなり好ましくない。

【００２２】分離度を大きくするためには、平均粒子径
が小さいことが好ましいが、加えて粒度分布が大きいと
前述の如くカラム圧が上昇、又分離度も低下するなど問
題が多く、平均粒子径±２０％の粒径範囲内に全粒子数
の９０％が存在する粒径分布を有するものが特に好まし
く使用される。

【００２３】第４に、水溶性高分子物質混合物を分離す
る場合、特定の分子量範囲で、分配係数が急激に変化す
るという特徴を有している。たとえばマルトオリゴ糖の
混合物を各々のピークに分離した場合、以下の特徴を有
している。即ち、マルトヘキサオースの分配係数が０．
２５以下であり、マルトースの分配係数とマルトヘキオ
ースの分配係数の差が０．２５以上であり、そしてマル
トースの分配係数とグルコースの分配係数の差が０．１
０以下であり、さらにマルトトリオースとマルトテトラ
オースとの分離度が０．４０以上である特徴を有してい
る。

【００２４】マルトヘキサオースの分配係数が０．２５
を越えると、比較的分子量の高い物質（数千以上）が排
除され難くなるため、たとえば、分子量が数百から数万
に至る広い範囲の混合物から、特定の分子量である数百
〜数千の物質を分離しようとする場合、必要なゲルベッ
ド層が長くなりすぎるため望ましくない。換言すれば分
取カラムとして適用する時、カラム長が大きくなること
、また繰り返し分取を行なう場合、１サイクル当りの時
間が長くなり、単位時間当りの分取量が低下すること等
の不都合があり好ましくない。

【００２５】またマルトースの分配係数とマルトヘキサ
オースの分配係数の差が０．２５未満になると、特定の
分子量範囲である数百〜数千の物質の分離ピーク間の距
離が狭くなり、分離が悪くなるため好ましくない。

【００２６】さらにマルトースの分配係数とグルコース
の分配係数の差が０．１０を越えると、特定の分子量範
囲である数百〜数千以外の低分子量域での必要なゲルベ
ット層が長くなるため、これもカラム長が大きくなり、
繰り返し分取を行なう場合、１サイクル当りの時間が長
くなり、単位時間当りの分取量が低下すること等で好ま
しくない。

【００２７】本発明のセルロース系ゲル濾過充填剤は例
えば以下の如き製造法により製造することができる。そ
の製造法について説明する。

【００２８】本発明のセルロース系ゲル濾過充填剤は、
ポリエチレングリコールによる排除限界分子量が約１，
０００〜約１０，０００の範囲にある微小非架橋セルロ
ース粒子を塩基性化合物を含む水性媒体中で膨潤処理し
、水洗、乾燥せしめ、次いで親水性非プロトン性有機溶
媒中で塩基性化合物の存在下、架橋反応せしめることに
よって得られる。

【００２９】前記排除限界分子量が約１，０００〜約１
０，０００の範囲にある微小非架橋セルロース粒子とし
ては、たとえば特願平２ー０４７１４９号明細書に記載
された製造法によって得られるものが使用できる。

【００３０】上記方法によれば、（１）ビスコースと水
溶性のアニオン性高分子化合物とを、水酸化カルシウム
の存在下に混合してビスコースの微粒子分散液を生成せ
しめ、（２）（ｉ）上記分散液を加熱するかあるいは上
記分散液を凝固液と混合することによって該分散液中の
ビスコースを凝固させ次いで酸で中和してセルロースの
微粒子を生成させるかあるいは（ｉｉ）上記分散液を酸
で凝固および中和してセルロースの微粒子を生成し、次
いで（３）該セルロースの微粒子を母液から分離し、そ
して必要により脱硫、酸洗い、水洗あるいは乾燥して鋭
利な粒径分布を有する非架橋セルロース粒子を得ること
ができる。

【００３１】このような微小非架橋セルロース粒子は、
例えば苛性ソーダ水溶液の如き塩基性化合物を含む水性
媒体中での膨潤処理に付される。この膨潤処理によって
、非架橋セルロース粒子の内部に粒子形成時に発生した
歪みを除去することができ、次いで行われる架橋反応を
円滑に且つ制御容易とすることが可能となる。上記のと
おり、従来、このような微小非架橋セルロース粒子は、
架橋によって排除限界分子量として表わされるところの
ポアーサイズが小さくならず、かえって網目構造が大き
くなるとされていた。

【００３２】上記の如く、架橋反応を実施する前に、膨
潤処理を実施して架橋反応時のセルロース粒子の膨潤性
を調節することによって、セルロース粒子の網目構造を
大きくすることを防止できることを、本発明の一部の発
明者において明らかにした。

【００３３】また、次いで実施される架橋反応は、親水
性非プロトン性有機溶媒例えばジメチルスルホキシド、
ジメチルホルムアミド中、塩基性化合物例えば苛性ソー
ダ、苛性カリの存在下に、架橋剤例えばエピクロルヒド
リンを、膨潤処理された非架橋セルロース粒子に反応せ
しめることにより行われる。

【００３４】このようにして得られた本発明のセルロー
ス系ゲル濾過材は、上記のとおり、平均粒子径が小さく
且つ排除限界分子量も小さく、分配係数が特定の分子量
数百〜数千の範囲で、急激に変化する（即ち分配係数の
差が大きい）ため、オリゴ糖等の水溶性低分子物質の混
合物の高速分離・分取用として良好な性能を示すことに
なる。

【００３５】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳述する。なお
、その前に本明細書における種々の特性値の測定法を記
述する。

【００３６】粒子径測定法 試料を約０．１ｇ　採取し、純水２５ｍｌ中に投入して
攪拌分散せしめ、光透過式粒度分布測定器にて測定する
。平均粒子径は体積基準にて算出した。

【００３７】ＣＨ伸縮吸収帯の吸光度 微小セルロース粒子１〜３ｍｇを精秤し、赤外線吸収ス
ペクトル測定用臭化カリウム粉末（ＫＢｒと略）約２０
０ｍｇを精秤し、両者をめのう乳鉢中でよく混練粉砕す
る。 次いでこのセルロース粒子と混練粉砕したＫＢｒ粉末を
かき集め、錠剤成型機にて、赤外線吸収スペクトル測定
用のＫＢｒ錠剤とし、透過法赤外吸収スペクトルを測定
する。得られた赤外スペクトルに於いて２８００〜３０
００ｃｍ−１にピークを持つＣＨ伸縮吸収帯の吸光度を
求め、セルロース１ｍｇ当りの吸光度に換算する。

【００３８】即ち ｗ　　　　　　；微小セルロース粒子採取量（ｍｇ）、
Ｍ　　　　　　；ＫＢｒ粉末採取量（ｍｇ）、ｍ　　　
　　　；ＫＢｒ錠剤重量（ｍｇ）、Ａ　　　　　　；Ｃ
Ｈ伸縮吸収帯の吸光度、Ｔ（ｐ）；ＣＨ伸縮吸収帯ピー
クトップに於ける透過率（％）、 Ｔ（ｂ）；ＣＨ伸縮吸収帯ピーク波数に於けるベースラ
インの透過率（％）。但しベースラインは２０００〜４
０００ｃｍ−１の範囲に於いてＯＨ伸縮吸収帯とＣＨ伸
縮吸収帯の両方のピークすそ野を接点ですくい取るよう
に引く。 Ａｏ　　　　；微小セルロース粒子１ｍｇ当りのＣＨ伸
縮吸収帯の吸光度、 とするとき、

【００３９】

【式１】 で表わされる。

【００４０】分配係数 １６ｍｍφ×３５ｃｍのジャケット付樹脂カラムに、水
を充填液として流速３ｍｌ／ｍｉｎで６０分間かけて、
ゲルを充填する。カラム内温度を６０℃に維持し、カラ
ムが安定した後、分子量が既知のマルトオリゴ糖を用い
て各々の溶出容量を求め、下記式で定義される分配係数
Ｋｎを算出した。

【００４１】

【式２】

【００４２】Ｖｎ：マルトオリゴ糖の溶出容量（ｍｌ）
、Ｖｏ：ブルーデキストラン（分子量２００万）の溶出
容量（ｍｌ）、 Ｖｔ：カラム内容量（ｍｌ）。

【００４３】分析条件は次の通りである。

【００４４】 １　　サンプルサイズ　　　　　　　　　　１００ｍｇ
／ｍｌ、　２μｌ、 ２　　溶離液　　　　　　　　　　　　　　　　　　純
水、３　　温度　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　６０℃、４　　流量　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．５　ｍｌ／ｍｉｎ、５　　検出器　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ＲＩ検出器、６　　
ポンプ　　　　　　　　　　　　　　　　　　（株）島
津製作所製ＬＣ−６Ａ型。

【００４５】分離度 前記分配係数を求めた方法と同一条件でマルトトリオー
スとマルトテトラオースの分離度Ｒを下記式より算出し
た。

【００４６】

【式３】

【００４７】Ｖ３、Ｖ４は試料注入時からピークの最大
値を得るまでの溶出容量を表わす。 Ｖ３：マルトトリオースの溶出容量（ｍｌ）、Ｖ４：マ
ルトテトラオースの溶出容量（ｍｌ）、又 Ｗ３、Ｗ４はピークのベースライン上での幅を示す、Ｗ
３：マルトトリオース　　ピーク幅の溶出容量（ｍｌ）
、Ｗ４：マルトテトラオース　　ピーク幅の溶出容量（
ｍｌ）。

【００４８】実施例１ （１）．針葉樹からなるパルプ５００ｇを２０℃、１８
重量％の苛性ソーダ溶液２０ｌに１時間浸漬し、２．８
倍に圧搾した。２５℃から５０℃まで昇温しながら１時
間粉砕し、老成し、次いでセルロースに対して３５重量
％の二硫化炭素（１７５ｇ）を添加して、２５℃で１時
間硫化しセルロースザンテートとした。該ザンテートを
苛性ソーダ水溶液で溶解して、ビスコースを得た。該ビ
スコースはセルロース濃度９．３重量％、苛性ソーダ濃
度５．９重量％、粘度６２００センチポイズであった。

【００４９】（２）．５ｌのポリ容器に１０．８％のポ
リアクリル酸ソーダ水溶液（分子量１０万）３２００ｇ
、炭酸カルシウム１３０ｇおよび水酸化カルシウム４０
ｇを入れてホモミキサーで攪拌した。分散後、液温２５
℃のもとで、上記ビスコース液８００ｇを入れ、ラボス
ターラーにて５００ｒｐｍの攪拌を１０分間行った。ビ
スコースの微粒子を生成せしめた後、引き続き攪拌しな
がら液温を２５℃から７５℃まで２５分間で昇温し、７
５℃で１５分間維持してビスコース微粒子を凝固せしめ
た。凝固ビスコース粒子をＧ４型ガラスフィルターによ
って母液から分離した後、５重量％塩酸で中和しセルロ
ース粒子として、大過剰の水で洗浄した後１０５℃の通
風乾燥機にて５時間乾燥した。得られたセルロース粒子
は、ポリエチレングリコールによる排除限界分子量が６
０００であった。

【００５０】（３）．次いで、該セルロース粒子２００
ｇを２０℃の１０重量％の苛性ソーダ水溶液中で膨潤し
た後、ガラスフィルターによって母液から分離した後、
水洗乾燥せしめた。

【００５１】（４）．次いで、該セルロース粒子１００
ｇ、ジメチルスルホキシド１０００ｇおよびエピクロル
ヒドリン２００ｇを２ｌのフラスコに入れ、攪拌下で十
分にセルロース粒子を膨潤させた後、苛性ソーダ１５ｇ
を溶解した苛性ソーダ水溶液３１５ｇを少量ずつ徐々に
添加した。苛性ソーダ水溶液の添加は、液温を２０℃に
調節しながら１時間かけて実施した。

【００５２】ついで液温を１時間で５０℃まで昇温し以
後５０℃に調節しながら架橋反応を完結させた。生成し
た微小架橋セルロース粒子は、ガラスフィルターによつ
て、母液から分離し、次いで１重量％の塩酸で中和し、
大過剰の水で洗浄した。

【００５３】得られた架橋セルロース粒子は平均粒子径
３０μｍ、ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルに
おいてアルキレンのＣＨ伸縮振動に帰属する吸収ピーク
の吸光度は０．００９ｍｇ−１．ｃｍ−２であった。

【００５４】この架橋セルロース粒子を内径１６ｍｍ、
長さ３５ｃｍのカラムに充填し、マルトオリゴ糖を分離
した。

【００５５】マルトオリゴ糖の分配係数、分配係数の差
及びマルトトリオースとマルトテトラオースの分離度を
表１に示した。

【００５６】

【表１】

【００５７】前記架橋セルロース粒子を内径２２ｍｍ、
長さ６０ｃｍのカラムに充填し、室温下、純水溶離液０
．５ｍｌ／ｍｉｎの条件でラミナリオリゴ糖混合物を分
離した結果、ラミナリトリオースとラミナリペンタオー
スは完全に２つのピークに分離できた。

【００５８】実施例２ 実施例１で平均粒子径１７μｍに変更した以外は同条件
で架橋セルロース粒子を得た。

【００５９】この架橋セルロース粒子のマルトオリゴ糖
の分配係数、分配係数の差及びマルトトリオースとマル
トテトラオースの分離度を表２に示した。

【００６０】

【表２】

【００６１】前記架橋セルロース粒子を内径２２ｍｍ、
長さ６０ｃｍのカラムに充填し、室温下、純水溶離液０
．３ｍｌ／ｍｉｎの条件でデキストラン加水分解物を分
離した結果、分子量１０００以下のオリゴ糖成分の分離
は良好であった。

【００６２】比較例１ 実施例１において、工程（３）の苛性ソーダ水溶液中で
の膨潤処理を付さないで、工程（４）の架橋処理を行な
って得られた平均粒子径３２μｍの架橋セルロース粒子
の特性を表３に示した。

【００６３】

【表３】

【００６４】実施例１と同様、内径２２ｍｍ、長さ６０
ｃｍのカラムにてラミナリオリゴ糖混合物を分離した結
果、各成分のピーク巾がブロードとなり、良好な分離が
できなかった。

【００６５】比較例２ 実施例１で平均粒子径１２０μｍに変更した以外、同条
件にて、架橋セルロース粒子を得た。

【００６６】この架橋セルロース粒子のマルトオリゴ糖
の分配特性を表４に示した。

【００６７】

【表４】

【００６８】実施例１と同様、内径２２ｍｍ、長さ６０
ｃｍのカラムにてラミナリオリゴ糖混合物を分離した結
果、各成分のピーク巾がブロードとなり、良好な分離が
できなかった。

【００６９】

【発明の効果】本発明のセルロース系ゲル濾過剤は、分
配係数が特定の分子量範囲で急激に変化するため、特に
分子量が数千以下の水溶性物質であるオリゴ糖をゲル濾
過法で分離・分取する用途に用いた場合、高性能の分離
を達成する。また本発明のゲル濾過剤は安全性および化
学的安定性に優れているため、食品、医薬品分野での分
取用分離材として広範囲に使用することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　（ａ）ＩＩ型セルロース結晶相とセル
   ロース非晶相から実質的になり、（ｂ）セルロース非晶
   相にはセルロース分子鎖間に架橋が存在し、（ｃ）平均
   粒子径が５０μｍよりも小さい球状粒子から実質的にな
   り、（ｄ）マルトヘキサオースの分配係数が０．２５以
   下であり、マルトースの分配係数とマルトヘキサオース
   の分配係数の差が０．２５以上であり、そしてマルトー
   スの分配係数とグルコースの分配係数の差が０．１０以
   下であり、そして（ｅ）マルトトリオースとマルトテト
   ラオースとの分離度が０．４０以上である、ことを特徴
   とするセルロース系ゲル濾過充填剤。