JPH0427858A - アルコール測定方法及び測定装置 - Google Patents
アルコール測定方法及び測定装置Info
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- JPH0427858A JPH0427858A JP2133497A JP13349790A JPH0427858A JP H0427858 A JPH0427858 A JP H0427858A JP 2133497 A JP2133497 A JP 2133497A JP 13349790 A JP13349790 A JP 13349790A JP H0427858 A JPH0427858 A JP H0427858A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/18—Apparatus specially designed for the use of free, immobilized or carrier-bound enzymes
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、固定化アルコールオキシダーゼを用い広範な
濃度範囲のアルコール含有試料の測定に対応できる測定
方法及び測定装置に関するものである。
濃度範囲のアルコール含有試料の測定に対応できる測定
方法及び測定装置に関するものである。
（従来の技術）
固定化酵素を用いる測定装置は、簡便性・迅速性・基質
特異性等の特徴を有し、ｐｎ臨床析・食品分析・環境計
測等の広範な分野において、その応用範囲を広げつつあ
る。
特異性等の特徴を有し、ｐｎ臨床析・食品分析・環境計
測等の広範な分野において、その応用範囲を広げつつあ
る。
このように固定化酵素を用いる測定装置の開発が進展す
るなかで、アルコール、特にエタノールの分析は、食品
・発酵・臨床分野等において開発の要望が多く各種の提
案がなされている。
るなかで、アルコール、特にエタノールの分析は、食品
・発酵・臨床分野等において開発の要望が多く各種の提
案がなされている。
アルコールの測定に利用できる酵素としては、アルコー
ル脱水素酵素（ＥＣ，１，１，１，１）とアルコールオ
キシダーゼ（ＥＣ，１，１，３゜１３）等がを７視され
ている。アルコール脱水素酵素は、ＮＡＤ にコチンア
デニンジヌクレオチド）を補酵素として要求し、分析に
用いる試薬が高価になること、及び酵素自体の安定性が
低いことから、溶液系での利用に留まっている。
ル脱水素酵素（ＥＣ，１，１，１，１）とアルコールオ
キシダーゼ（ＥＣ，１，１，３゜１３）等がを７視され
ている。アルコール脱水素酵素は、ＮＡＤ にコチンア
デニンジヌクレオチド）を補酵素として要求し、分析に
用いる試薬が高価になること、及び酵素自体の安定性が
低いことから、溶液系での利用に留まっている。
一方、固定化酵素を用いる測定装置の中で、アンペロメ
トリックな計測を行う装置、すなわち酵素反応により起
きる電極活性物質の増減を、定電圧を印加した作用電極
からの電流出力値の変化として捉える形式の装置は、高
感度化が容易で安定性も優れるため各種の電極、装置、
方法が開発されている。アンペロメトリックな分析方法
の代表例としては、酸素電極によるものと過酸化水素電
極によるものがある。この２種は固定化酵素を用いる測
定装置に最もよく用いられているが、応答速度・Ｓ／Ｎ
比の点で過酸化水素電極を用いる方法が優れている。こ
のような理由で過酸化水素電極を用いる測定装置に利用
できる酵素として、アルコールオキシダーゼ しかし臨床、食品、発酵等の各分野において対象とする
試料中のアルコール濃度は大きく異なり、単一の固定化
酵素を用いる測定装置で対応することは困難である。何
故なら、オキシダーゼが溶存酸素を利用して基質を酸化
するために、低濃度域での感度を向上すると高濃度のア
ルコール試料か注入されたときに溶存酸素が消費されて
しまい、酵素反応の進行が停止するためにアルコール濃
度と応答値との直線関係が無くなってしまう。
トリックな計測を行う装置、すなわち酵素反応により起
きる電極活性物質の増減を、定電圧を印加した作用電極
からの電流出力値の変化として捉える形式の装置は、高
感度化が容易で安定性も優れるため各種の電極、装置、
方法が開発されている。アンペロメトリックな分析方法
の代表例としては、酸素電極によるものと過酸化水素電
極によるものがある。この２種は固定化酵素を用いる測
定装置に最もよく用いられているが、応答速度・Ｓ／Ｎ
比の点で過酸化水素電極を用いる方法が優れている。こ
のような理由で過酸化水素電極を用いる測定装置に利用
できる酵素として、アルコールオキシダーゼ しかし臨床、食品、発酵等の各分野において対象とする
試料中のアルコール濃度は大きく異なり、単一の固定化
酵素を用いる測定装置で対応することは困難である。何
故なら、オキシダーゼが溶存酸素を利用して基質を酸化
するために、低濃度域での感度を向上すると高濃度のア
ルコール試料か注入されたときに溶存酸素が消費されて
しまい、酵素反応の進行が停止するためにアルコール濃
度と応答値との直線関係が無くなってしまう。
このため従来は低濃度のアルコール試料を測定できるよ
うに装置を構成し、高濃度のアルコール試料を測定する
場合は希釈率を大きくするか、各種濃度の試料に対応す
る装置を複数用意する以外に方法がなかった。ところが
希釈率を大きくすることにより、希釈に伴う誤差も大き
くなり分析上好ましいものではなく、複数の装置を用い
ることは分析コストの上昇をもたらし望ましいものでは
なかった。
うに装置を構成し、高濃度のアルコール試料を測定する
場合は希釈率を大きくするか、各種濃度の試料に対応す
る装置を複数用意する以外に方法がなかった。ところが
希釈率を大きくすることにより、希釈に伴う誤差も大き
くなり分析上好ましいものではなく、複数の装置を用い
ることは分析コストの上昇をもたらし望ましいものでは
なかった。
（発明が解決しようとする諜Ｂ）
本発明は、広い濃度範囲のアルコール試料に対応できる
固定化アルコールオキシダーゼ力ラムを用いる測定方法
、及びその方法を実現する上で、簡便性に優れた測定装
置を提供することを目的とする。
固定化アルコールオキシダーゼ力ラムを用いる測定方法
、及びその方法を実現する上で、簡便性に優れた測定装
置を提供することを目的とする。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは、担体表面に固定化したアルコールオキシ
ダーゼの耐久性等に悪影響を与えることなく、測定時に
カラム中に流れる緩衝液に可逆的阻害剤を添加すること
によりその活性を制御できることを見い出し、また可逆
的阻害剤の濃度を変えることにより単一の固定化アルコ
ールオキシダーゼカラムを用いて広範な濃度領域のアル
コール試料の測定を行うことができることを見出し、本
発明を完成するに至った。
ダーゼの耐久性等に悪影響を与えることなく、測定時に
カラム中に流れる緩衝液に可逆的阻害剤を添加すること
によりその活性を制御できることを見い出し、また可逆
的阻害剤の濃度を変えることにより単一の固定化アルコ
ールオキシダーゼカラムを用いて広範な濃度領域のアル
コール試料の測定を行うことができることを見出し、本
発明を完成するに至った。
本発明は、担体表面にアルコールオキシダーゼを固定化
したカラムに試料を緩衝液とともに導き、カラム中にお
ける酵素反応による酸素の減少量または過酸化水素の生
成量をカラムの下流で検知することによるフロー型アル
コール測定方法であり、且つ前記試料中に含有されるア
ルコール濃度に応した量の可逆的阻害剤を前記緩衝液に
添加することにより測定可能なアルコール濃度範囲を調
整するフロー型アルコール測定方法である。
したカラムに試料を緩衝液とともに導き、カラム中にお
ける酵素反応による酸素の減少量または過酸化水素の生
成量をカラムの下流で検知することによるフロー型アル
コール測定方法であり、且つ前記試料中に含有されるア
ルコール濃度に応した量の可逆的阻害剤を前記緩衝液に
添加することにより測定可能なアルコール濃度範囲を調
整するフロー型アルコール測定方法である。
また本発明は可逆的阻害剤がアジ化化合物である上記フ
ロー型アルコール測定方法である。
ロー型アルコール測定方法である。
更に本発明は、少なくとも、（ａ） 緩衝液と可逆的阻
害剤溶液を混合送液する手段、（ｂ）担体表面にアルコ
ールオキシダーゼを固定化したカラム、及び（ｃ）酸素
電極若しくは過酸化水素電極をこの順で上流より配置し
てなり、更に（ｄ）前記混合送液する手段における緩衝
液と可逆的阻害剤溶液の混合比率を設定する手段を有す
るフロー型アルコール測定装置である。
害剤溶液を混合送液する手段、（ｂ）担体表面にアルコ
ールオキシダーゼを固定化したカラム、及び（ｃ）酸素
電極若しくは過酸化水素電極をこの順で上流より配置し
てなり、更に（ｄ）前記混合送液する手段における緩衝
液と可逆的阻害剤溶液の混合比率を設定する手段を有す
るフロー型アルコール測定装置である。
（作用）
可逆的阻害剤は、酵素反応を阻害するが阻害剤を取り除
くと、可逆的に酵素の活性がもどる性質をもっており、
アジ化化合物が特に好ましい。アジ化化合物としては、
アザイドイオンが緩衝液中に存在すれば良いため、各種
の塩類、例えばアジ化ナトリウム、アジ化カリウム等を
用いることができる。
くと、可逆的に酵素の活性がもどる性質をもっており、
アジ化化合物が特に好ましい。アジ化化合物としては、
アザイドイオンが緩衝液中に存在すれば良いため、各種
の塩類、例えばアジ化ナトリウム、アジ化カリウム等を
用いることができる。
緩衝液に添加するアジ化化合物量は、あらかじめ測定濃
度域の標準物を用いて検量線の直線範囲を見て決定する
。一般にアザイドイオンの濃度が１０μＭ程度で、まっ
たくアザイドイオンを含まない場合に比べて活性が低下
する現象が観察され、５０ｍＭ程度までほぼ直線的に活
性低下が認められる。これを越える高濃度のアザイドイ
オンが存在しても活性低下は進行しない。従って本発明
では試料中のアルコール含有濃度に応じてこの範囲でア
ジ化化合物の添加濃度を調整することにより、一定１の
アルコールオキシダーゼを固定したカラムを用いて、極
めて高濃度のアルコール試料から、低濃度のものまで測
定することが可能となる。
度域の標準物を用いて検量線の直線範囲を見て決定する
。一般にアザイドイオンの濃度が１０μＭ程度で、まっ
たくアザイドイオンを含まない場合に比べて活性が低下
する現象が観察され、５０ｍＭ程度までほぼ直線的に活
性低下が認められる。これを越える高濃度のアザイドイ
オンが存在しても活性低下は進行しない。従って本発明
では試料中のアルコール含有濃度に応じてこの範囲でア
ジ化化合物の添加濃度を調整することにより、一定１の
アルコールオキシダーゼを固定したカラムを用いて、極
めて高濃度のアルコール試料から、低濃度のものまで測
定することが可能となる。
アジ化化合物を緩衝液に添加し、アルコールオキシダー
ゼの活性が低下すると、同一濃度のアルコールが固定化
アルコールオキシダーゼカラムと接触しても反応するア
ルコールの割合が低下し、それに伴って溶存酸素消費量
が低下する。つまり高濃度のアルコールと接触しても酸
素消費量は低い値に留まるために検量線の飽和現象が認
められない。或いは同様に過酸化水素生成量は低い値に
留まるため、過酸化水素電極を用いる場合でも同一感度
レンジで高濃度のアルコール試料を測定することが可能
である。このことは、固定化アルコールオキシダーゼの
アルコールに対するミカエリス定数は比較的大きく、む
しろ酸素に対するミカエリス定数が小さいために、アザ
イドイオンが存在しない場合は検量線の直線範囲が狭い
ことにより生じる現象であると考えられる。
ゼの活性が低下すると、同一濃度のアルコールが固定化
アルコールオキシダーゼカラムと接触しても反応するア
ルコールの割合が低下し、それに伴って溶存酸素消費量
が低下する。つまり高濃度のアルコールと接触しても酸
素消費量は低い値に留まるために検量線の飽和現象が認
められない。或いは同様に過酸化水素生成量は低い値に
留まるため、過酸化水素電極を用いる場合でも同一感度
レンジで高濃度のアルコール試料を測定することが可能
である。このことは、固定化アルコールオキシダーゼの
アルコールに対するミカエリス定数は比較的大きく、む
しろ酸素に対するミカエリス定数が小さいために、アザ
イドイオンが存在しない場合は検量線の直線範囲が狭い
ことにより生じる現象であると考えられる。
従ってアルコールオキシダーゼは測定対象の中で最も高
感度な測定に必要な量を固定化すれば良い。
感度な測定に必要な量を固定化すれば良い。
固定化カラムに送液する緩衝液にアジ化化合物を入れる
ことにより上記の効果がもたらされるが、さらにあらか
じめアジ化化合物を含まない緩衝液と、一定濃度のアジ
化化合物を含む溶液もしくは緩衝液を準備しておき、こ
の二種の液を固定化アルコールオキシダーゼカラムに入
る前に混合すれば同様の効果が得られ、しかも迅速にア
ルコールの定量濃度範囲を変更できる。
ことにより上記の効果がもたらされるが、さらにあらか
じめアジ化化合物を含まない緩衝液と、一定濃度のアジ
化化合物を含む溶液もしくは緩衝液を準備しておき、こ
の二種の液を固定化アルコールオキシダーゼカラムに入
る前に混合すれば同様の効果が得られ、しかも迅速にア
ルコールの定量濃度範囲を変更できる。
合により液の屈折率等が変動し、それが定量結果に影響
を与えるような欠点がない。
を与えるような欠点がない。
緩衝液は特に限定されず、リン酸緩衝液、トリス緩衝液
等の中性付近で強い緩衝能を有するものが用いられる。
等の中性付近で強い緩衝能を有するものが用いられる。
さらに上記の分析について、二種の液体の混合比率を設
定する手段と、その混合を実行する混合送液する手段を
有する装置を用いることにより、極めて簡便に分析を行
える。二種の液体を混合する手段としては、例えば計量
器と撹拌機を備え、あらかじめ設定された計量値に応じ
て混合を行うこともできるが、２台のポンプで各液体を
各々送液する機構をもち、２台のポンプにより送液され
る液体を合流させる混合送液手段が最も好ましい。
定する手段と、その混合を実行する混合送液する手段を
有する装置を用いることにより、極めて簡便に分析を行
える。二種の液体を混合する手段としては、例えば計量
器と撹拌機を備え、あらかじめ設定された計量値に応じ
て混合を行うこともできるが、２台のポンプで各液体を
各々送液する機構をもち、２台のポンプにより送液され
る液体を合流させる混合送液手段が最も好ましい。
この場合は２台のポンプの送液量の合計が一定になるよ
うにし、ポンプ送液量の比率を変えることにより容易に
混合比率を変えられる。また混合比率の設定も流速設定
で代用できるために、装置構成が簡略化できる利点があ
る。
うにし、ポンプ送液量の比率を変えることにより容易に
混合比率を変えられる。また混合比率の設定も流速設定
で代用できるために、装置構成が簡略化できる利点があ
る。
混合比率を設定する手段としては駆動機構にパルスモー
タ−を有するポンプでは流量比をマイクロコンピュータ
−に入力しポンプ流量比を演算するマイクロコンピュー
タを用いて入力パルス周波数を変化させるこにより容易
に流速を変化させられるし、同様にＤＣサーボモーター
とコントローラーを用いる方法を例示できる。
タ−を有するポンプでは流量比をマイクロコンピュータ
−に入力しポンプ流量比を演算するマイクロコンピュー
タを用いて入力パルス周波数を変化させるこにより容易
に流速を変化させられるし、同様にＤＣサーボモーター
とコントローラーを用いる方法を例示できる。
固定化酵素カラムに利用するアルコールオキシダーゼは
、カンディダ属、ビチア属等のメタノール資化酵母に由
来するものや世子閑に由来するものが利用できる。
、カンディダ属、ビチア属等のメタノール資化酵母に由
来するものや世子閑に由来するものが利用できる。
固定化に用いる担体およびその固定化法としては各種公
知のものが用いられる。例えば担体としては、セルロー
ス、アガロース、デキストラン、キチン、コラーゲン、
アミノ酸系ポリマー、ポリスチレン樹脂、ポリアクリル
アミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、イオン交換
樹脂、ガラスビーズ、アルミナ、ジルコニア、セラミッ
ク、砂、カーボン、活性炭、シリカゲル、モレキュラー
シーブ、チタニア、タンニン、シリコンゴム、酸性白土
、ケイソウ土、耐火煉瓦等が例示できる。また固定化方
法としては、担体への物理吸着法、化学結合法等がある
。
知のものが用いられる。例えば担体としては、セルロー
ス、アガロース、デキストラン、キチン、コラーゲン、
アミノ酸系ポリマー、ポリスチレン樹脂、ポリアクリル
アミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、イオン交換
樹脂、ガラスビーズ、アルミナ、ジルコニア、セラミッ
ク、砂、カーボン、活性炭、シリカゲル、モレキュラー
シーブ、チタニア、タンニン、シリコンゴム、酸性白土
、ケイソウ土、耐火煉瓦等が例示できる。また固定化方
法としては、担体への物理吸着法、化学結合法等がある
。
アルコールオキシダーゼ反応の検出方法としては、カラ
ム下流に過酸化水素により発色する比色試薬を注入し分
光光度計で定量する方法や、酸素電極または過酸化水素
電極で検出する方法がある。
ム下流に過酸化水素により発色する比色試薬を注入し分
光光度計で定量する方法や、酸素電極または過酸化水素
電極で検出する方法がある。
この中で酸素電極または過酸化水素電極を用いる方法は
、試料の着色、濁り等の影響を受けず実用上好都合であ
る。
、試料の着色、濁り等の影響を受けず実用上好都合であ
る。
酸素電極の構成としてはガルバニ電池型、クラーク型酸
素電極等が例示され、また過酸化水素電極の構成は過酸
化水素選択透過膜をその表面に有する金、白金等の導体
を作用極とする電極が例示される。
素電極等が例示され、また過酸化水素電極の構成は過酸
化水素選択透過膜をその表面に有する金、白金等の導体
を作用極とする電極が例示される。
本発明の測定方法もしくは測定装置を用いれば、Ｈ’Ｆ
ａ床分析のように高感度を要求される場合も、清酒・ウ
ィスキー等の比較的低感度での測定でも、希釈率を一定
にしたまま一台の測定装置で対応できる。
ａ床分析のように高感度を要求される場合も、清酒・ウ
ィスキー等の比較的低感度での測定でも、希釈率を一定
にしたまま一台の測定装置で対応できる。
（実施例）
以下に実施例を示し本発明をさらに説明するが、もちろ
ん本発明はこれらの例に限定されるものではない。
ん本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１
（１）過酸化水素電極の作成方法
直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、Ｉｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）を参
照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋２．ＯＶで１０分間の
電解処理を行った。その後白金線をよく水洗した後、４
０゛Ｃで１０分間乾燥し、１０％γ−アミノプロピルト
リエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、
洗浄した。
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、Ｉｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）を参
照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋２．ＯＶで１０分間の
電解処理を行った。その後白金線をよく水洗した後、４
０゛Ｃで１０分間乾燥し、１０％γ−アミノプロピルト
リエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、
洗浄した。
生血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔ ｉＯｎ
Ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグル
タルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混
合液を手早く先に用意した白金線上に５μＩのせ、４０
°Ｃで１５分間乾燥硬化して過酸化水素電極を得た。
Ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグル
タルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混
合液を手早く先に用意した白金線上に５μＩのせ、４０
°Ｃで１５分間乾燥硬化して過酸化水素電極を得た。
（２）固定化酵素カラムの作成方法
耐火煉瓦（３０メソシュ〜６０メツシュ分級品）１５０
ｍｇをよく乾燥し、Ｔ−アミノプロピルトリエトキシシ
ランの１０％無水トルエン溶液１ｍｌを加え１時間放置
する。シランカップリング剤をトルエンとメタノールで
よく洗浄後、１２０″Ｃで２時間乾燥する。放冷後、５
％グルタルアルデヒド水溶液を０．５ｍｌ加え、室温で
１時間放置する。この担体をよく水洗する。最後にｐ
Ｈ７゜０のリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、可能な限
り緩衝液を除く。
ｍｇをよく乾燥し、Ｔ−アミノプロピルトリエトキシシ
ランの１０％無水トルエン溶液１ｍｌを加え１時間放置
する。シランカップリング剤をトルエンとメタノールで
よく洗浄後、１２０″Ｃで２時間乾燥する。放冷後、５
％グルタルアルデヒド水溶液を０．５ｍｌ加え、室温で
１時間放置する。この担体をよく水洗する。最後にｐ
Ｈ７゜０のリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、可能な限
り緩衝液を除く。
このアミノシラン化担体に、アルコールオキシダーゼ（
シグマ社製、Ｐｉｃｈｉａ １１土工皇ｒｉｓ由来の
液状酵素標品）２５μｍをｐＨ７゜０のリン酸ナトリウ
ム緩衝液で１０倍に希釈した酵素溶液を加え、室温で１
時間放置する。放置後緩衝液でよく洗浄する。この酵素
固定化担体を外径３ｍｍ、内径２ｍｍ、長さ１０ｃｍの
フン素樹脂製チューブ中に充填する。
シグマ社製、Ｐｉｃｈｉａ １１土工皇ｒｉｓ由来の
液状酵素標品）２５μｍをｐＨ７゜０のリン酸ナトリウ
ム緩衝液で１０倍に希釈した酵素溶液を加え、室温で１
時間放置する。放置後緩衝液でよく洗浄する。この酵素
固定化担体を外径３ｍｍ、内径２ｍｍ、長さ１０ｃｍの
フン素樹脂製チューブ中に充填する。
（３）測定装置
本発明に従う測定には、第１図に示されるフロー型測定
装置を使用した。このフロー型測定装置は試料注入装置
（レオダイン社製７１２５型インジエクタ）（３）と上
述したように作成された過酸化水素電極（７）及び参照
電極としてのＡｇ／ＡｇＣｌ電極（８）が取り付けられ
対極（９）としてステンレス鋼から成る配管が備えられ
た測定用セル（６）とを含んで構成される。内径０．５
ｍｍ、長さ０．５ｍのフッ素樹脂製配管（４）でインジ
ェクタ（３）と固定化酵素カラム（５）、および固定化
酵素カラム（５）と測定用セル（６）とを接続した。測
定用セル（６）の内容積は４０μｌであり、過酸化水素
電極（７）とＡｇ／Ａｇｃｌ電極（８）とが緩衝液の管
路を介して対向して配置される。過酸化水素電極（７）
にはポテンシオスタント（１２）によってＡｇ／ＡｇＣ
１電極に対して＋０．６■の電圧が印加される。これら
は、恒温槽（１１）の内部に設置される。恒温槽（１１
）内の温度は３７°Ｃ± ０．２°Ｃに保持される。緩
衝液（１）の送液には高速液体クロマトグラフィ用のポ
ンプ（２）を用い１，０ｍ１７分の流量で送液される。
装置を使用した。このフロー型測定装置は試料注入装置
（レオダイン社製７１２５型インジエクタ）（３）と上
述したように作成された過酸化水素電極（７）及び参照
電極としてのＡｇ／ＡｇＣｌ電極（８）が取り付けられ
対極（９）としてステンレス鋼から成る配管が備えられ
た測定用セル（６）とを含んで構成される。内径０．５
ｍｍ、長さ０．５ｍのフッ素樹脂製配管（４）でインジ
ェクタ（３）と固定化酵素カラム（５）、および固定化
酵素カラム（５）と測定用セル（６）とを接続した。測
定用セル（６）の内容積は４０μｌであり、過酸化水素
電極（７）とＡｇ／Ａｇｃｌ電極（８）とが緩衝液の管
路を介して対向して配置される。過酸化水素電極（７）
にはポテンシオスタント（１２）によってＡｇ／ＡｇＣ
１電極に対して＋０．６■の電圧が印加される。これら
は、恒温槽（１１）の内部に設置される。恒温槽（１１
）内の温度は３７°Ｃ± ０．２°Ｃに保持される。緩
衝液（１）の送液には高速液体クロマトグラフィ用のポ
ンプ（２）を用い１，０ｍ１７分の流量で送液される。
緩衝液（１）としては、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７，０）に各種濃度のアジ化ナトリウムを添
加したものを用いた。
衝液（ｐＨ７，０）に各種濃度のアジ化ナトリウムを添
加したものを用いた。
測定を終えた緩衝液は、廃液瓶（１０）で捕捉される。
測定値はＡ／Ｄ変換器（１３）でデジタル値に直された
後、通信ケーブル（１４）を介してコンピュータ（１５
）へ送られ解析される。その結果はプリンター（１６）
に出力される。
後、通信ケーブル（１４）を介してコンピュータ（１５
）へ送られ解析される。その結果はプリンター（１６）
に出力される。
（４）測定方法と結果
固定化直後のカラムを測定装置に装着し、まずアザイド
イオンを含まないリン酸緩衝液を送液した。恒温槽温度
が平衡に達した後、０〜１０．０（Ｖ／Ｖ）％のエタノ
ール溶液５μｌを注入した。
イオンを含まないリン酸緩衝液を送液した。恒温槽温度
が平衡に達した後、０〜１０．０（Ｖ／Ｖ）％のエタノ
ール溶液５μｌを注入した。
この検量線を第２図に○印で示す。
次に、アジ化ナトリウムを０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍ
Ｍの濃度で添加した各緩衝液で同様に検量線を作成した
。この結果も第２図に示す。
Ｍの濃度で添加した各緩衝液で同様に検量線を作成した
。この結果も第２図に示す。
第２図に示されるように、アザイトイオンを含まない場
合（○）は、検量線の勾配が大きく、直線性が成立する
範囲は０． １％までである。しかしアジ化ナトリウム
濃度が０．１ｍＭ（・）で１％まで、１ｍＭ（△）で６
％まで、１０ｍＭ （ｘ）で１０％までの直線関係が得
られる。したがって、低濃度のエタノールを分析する際
にはアザイドイオン量を減らし、高濃度のエタノールを
分析する際にはアザイドイオンの量を増量すれば測定出
来ることがわかった。
合（○）は、検量線の勾配が大きく、直線性が成立する
範囲は０． １％までである。しかしアジ化ナトリウム
濃度が０．１ｍＭ（・）で１％まで、１ｍＭ（△）で６
％まで、１０ｍＭ （ｘ）で１０％までの直線関係が得
られる。したがって、低濃度のエタノールを分析する際
にはアザイドイオン量を減らし、高濃度のエタノールを
分析する際にはアザイドイオンの量を増量すれば測定出
来ることがわかった。
実施例２
（１）過酸化水素電極の作成方法
実施例１と同様に作成した。
（２）固定化酵素カラムの作成方法
実施例１と同様に作成した。
（３）測定装置
第３図に示されるフロー型測定装置を使用した。
このフロー型測定装置の試料の注入、カラム、電極等は
実施例１と同様の構成であるが、ポンプと送液用ボトル
それぞれを２基備えている点で異なる。
実施例１と同様の構成であるが、ポンプと送液用ボトル
それぞれを２基備えている点で異なる。
緩衝液（１）は１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）である。アジ化ナトリウム溶液は送液ボトル
（１７）に蓄えられており、これはｐＨ７，０の１００
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に１００ｍＭになるように
アジ化ナトリウムを添加したものである。
Ｈ７，０）である。アジ化ナトリウム溶液は送液ボトル
（１７）に蓄えられており、これはｐＨ７，０の１００
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に１００ｍＭになるように
アジ化ナトリウムを添加したものである。
本実施例ではコンピュータ（１５）が緩衝液とアジ化化
合物を混合送液する手段の混合比率を設定するものであ
り、アジ化ナトリウムの濃度の制御は第４図に示す流れ
図に従って行われる。
合物を混合送液する手段の混合比率を設定するものであ
り、アジ化ナトリウムの濃度の制御は第４図に示す流れ
図に従って行われる。
まず目標とするアジ化ナトリウム濃度を第３図のコンピ
ュータ（１５）に入力する。そしてあらかじめ記憶され
た送液ボトル（１７）中のアジ化ナトリウム濃度と比較
して、それより低ければ希釈率を求める。希釈率から、
２基のポンプの流速比が求められる。例えば１０倍に希
釈する必要があるならば、第１のポンプ（２）の流量９
に対して第２のポンプ（１８）は１の比で送液する必要
がある。この場合、合流後の流速が実施例１と同様に１
．０ｍｌ／ｍｉｎであるため、第１のポンプ（２）は０
．９ｍｌ／ｍｉｎ、第２のポンプ（１日）は０．１ｍｌ
／ｍｉｎとなる。この計算後、ポンプに接続されたコン
トロールケーブル（１９）と（２０）に信号を送り、流
速を変更する。（４）測定方法および結果 固定化直後のカラムを測定装置に装着し、まずアザイド
イオンを含まないリン酸緩衝液を送液しながら、恒温槽
温度が平衡に達した後、０〜１０゜０ （Ｖ／Ｖ）％の
エタノール溶液５μｍを注入した。次に、アジ化ナトリ
ウム濃度を０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭに設定して第
４図の流れ図に従って流速を変更後、各条件で同様に検
量線を作成した。この結果、実施例１と同様の結果が得
られた（第５図）。
ュータ（１５）に入力する。そしてあらかじめ記憶され
た送液ボトル（１７）中のアジ化ナトリウム濃度と比較
して、それより低ければ希釈率を求める。希釈率から、
２基のポンプの流速比が求められる。例えば１０倍に希
釈する必要があるならば、第１のポンプ（２）の流量９
に対して第２のポンプ（１８）は１の比で送液する必要
がある。この場合、合流後の流速が実施例１と同様に１
．０ｍｌ／ｍｉｎであるため、第１のポンプ（２）は０
．９ｍｌ／ｍｉｎ、第２のポンプ（１日）は０．１ｍｌ
／ｍｉｎとなる。この計算後、ポンプに接続されたコン
トロールケーブル（１９）と（２０）に信号を送り、流
速を変更する。（４）測定方法および結果 固定化直後のカラムを測定装置に装着し、まずアザイド
イオンを含まないリン酸緩衝液を送液しながら、恒温槽
温度が平衡に達した後、０〜１０゜０ （Ｖ／Ｖ）％の
エタノール溶液５μｍを注入した。次に、アジ化ナトリ
ウム濃度を０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭに設定して第
４図の流れ図に従って流速を変更後、各条件で同様に検
量線を作成した。この結果、実施例１と同様の結果が得
られた（第５図）。
本実施例に示される装置を用いた場合、さらに容易に広
範囲のアルコール濃度測定が可能であった。
範囲のアルコール濃度測定が可能であった。
（効果）
本発明の測定方法および測定装置により、固定化アルコ
ールオキシダーゼを用いて、広範な分野の種々の濃度範
囲のアルコールの測定に対応できる。
ールオキシダーゼを用いて、広範な分野の種々の濃度範
囲のアルコールの測定に対応できる。
第１図は実施例１に係わるフロー型アルコール測定装置
である。図中において各番号は以下のとおりである。 （１）緩衝液 （２）ポンプ （３）インジェクタ （４）接続配管 （５）固定化酵素カラム （６）測定セル （７）過酸化水素電極 （８）Ａｇ／ＡｇＣ１参照電極 （９）対極 （１０）廃液ボトル （１１）恒温槽 （１２）ボテンシオスタント （１３）Ａ／Ｄ変換器 （１４）通信ケーブル （１５）コンピュータ （１６）プリンター 第２図は、実施例Ｉの結果を示している。 ○；アジ化ナナトリウムＯｍＭ ・；アジ化ナトリウム Ｏ１ＩｍＭ △；アジ化ナトリウム １ ｍＭ ×；アジ化ナトリウム １０ｍＭ 第３図は、実施例２に係わるフロー型アルコール測定装
置である。 （エフ）アジ化ナトリウム溶液の送液ボトル（１８）第
２のポンプ 第４図は、濃度を制御するための流れ図である。 第５図は実施例２の結果を示している。 Ｏ；アジ化ナトリウム ＯｍＭ ・；アジ化ナトリウム ０．１ｍＭ △；アジ化ナトリウム １． ｍＭ×；アジ化ナト
リウム １０ｍＭ
である。図中において各番号は以下のとおりである。 （１）緩衝液 （２）ポンプ （３）インジェクタ （４）接続配管 （５）固定化酵素カラム （６）測定セル （７）過酸化水素電極 （８）Ａｇ／ＡｇＣ１参照電極 （９）対極 （１０）廃液ボトル （１１）恒温槽 （１２）ボテンシオスタント （１３）Ａ／Ｄ変換器 （１４）通信ケーブル （１５）コンピュータ （１６）プリンター 第２図は、実施例Ｉの結果を示している。 ○；アジ化ナナトリウムＯｍＭ ・；アジ化ナトリウム Ｏ１ＩｍＭ △；アジ化ナトリウム １ ｍＭ ×；アジ化ナトリウム １０ｍＭ 第３図は、実施例２に係わるフロー型アルコール測定装
置である。 （エフ）アジ化ナトリウム溶液の送液ボトル（１８）第
２のポンプ 第４図は、濃度を制御するための流れ図である。 第５図は実施例２の結果を示している。 Ｏ；アジ化ナトリウム ＯｍＭ ・；アジ化ナトリウム ０．１ｍＭ △；アジ化ナトリウム １． ｍＭ×；アジ化ナト
リウム １０ｍＭ
Claims (3)
- （１）担体表面にアルコールオキシダーゼを固定化した
カラムに試料を緩衝液とともに導き、カラム中における
酵素反応による酸素の減少量または過酸化水素の生成量
をカラムの下流で検知することによるフロー型アルコー
ル測定方法であり、且つ前記試料中に含有されるアルコ
ール濃度に応じた量の可逆的阻害剤を前記緩衝液に添加
することにより測定可能なアルコール濃度範囲を調整す
るフロー型アルコール測定方法。 - （２）可逆的阻害剤がアジ化化合物である請求項（１）
記載のフロー型アルコール測定方法。 - （３）少なくとも、（ａ）緩衝液と可逆的阻害剤溶液を
混合送液する手段、（ｂ）担体表面にアルコールオキシ
ダーゼを固定化したカラム、及び（ｃ）酸素電極若しく
は過酸化水素電極をこの順で上流より配置してなり、更
に（ｄ）前記混合送液する手段における緩衝液と可逆的
阻害剤溶液の混合比率を設定する手段を有するフロー型
アルコール測定装置。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2133497A JP2928588B2 (ja) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | アルコール測定方法及び測定装置 |
| EP19910108219 EP0458288A3 (en) | 1990-05-22 | 1991-05-22 | Method and apparatus for measurement of alcohols |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2133497A JP2928588B2 (ja) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | アルコール測定方法及び測定装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0427858A true JPH0427858A (ja) | 1992-01-30 |
| JP2928588B2 JP2928588B2 (ja) | 1999-08-03 |
Family
ID=15106154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2133497A Expired - Fee Related JP2928588B2 (ja) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | アルコール測定方法及び測定装置 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0458288A3 (ja) |
| JP (1) | JP2928588B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106670424A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-17 | 浙江六和轻机械有限公司 | 一种铝合金轮毂加工方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4214822C2 (de) * | 1992-05-05 | 1998-12-03 | Inst Bioanalytik Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur kontinuierlichen Bestimmung von Substraten von Oxidoreduktasen |
| FR2772392B1 (fr) * | 1997-12-15 | 2000-03-10 | Toulousaine De Rech Et De Dev | Procede et installation de fabrication de monoesters par alcoolyse d'huile vegetale riche en acide oleique |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2685145B2 (ja) * | 1988-01-25 | 1997-12-03 | 王子製紙株式会社 | 酵素電極 |
-
1990
- 1990-05-22 JP JP2133497A patent/JP2928588B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-05-22 EP EP19910108219 patent/EP0458288A3/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106670424A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-17 | 浙江六和轻机械有限公司 | 一种铝合金轮毂加工方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0458288A3 (en) | 1993-05-05 |
| JP2928588B2 (ja) | 1999-08-03 |
| EP0458288A2 (en) | 1991-11-27 |
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