JP2862940B2 - 固定化酵素およびそれを用いる測定装置 - Google Patents
固定化酵素およびそれを用いる測定装置Info
- Publication number
- JP2862940B2 JP2862940B2 JP2061703A JP6170390A JP2862940B2 JP 2862940 B2 JP2862940 B2 JP 2862940B2 JP 2061703 A JP2061703 A JP 2061703A JP 6170390 A JP6170390 A JP 6170390A JP 2862940 B2 JP2862940 B2 JP 2862940B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- electrode
- alcohol
- immobilized
- enzyme
- measurement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/002—Electrode membranes
- C12Q1/003—Functionalisation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、安定な固定化アルコールオキシダーゼとそ
れを用いる高精度かつ安定なアルコール測定装置に関す
るものである。さらに本発明は、同時にグルコース濃度
を測定できる高精度かつ安定なアルコール測定装置に関
するものである。
れを用いる高精度かつ安定なアルコール測定装置に関す
るものである。さらに本発明は、同時にグルコース濃度
を測定できる高精度かつ安定なアルコール測定装置に関
するものである。
（従来の技術） 固定化酵素を用いる測定装置は、簡便性・迅速性・基
質特異性等の特徴を有し、臨床分析・食品分析・環境計
測等の広範な分野において、その応用範囲を広げつつあ
る。
質特異性等の特徴を有し、臨床分析・食品分析・環境計
測等の広範な分野において、その応用範囲を広げつつあ
る。
このように固定化酵素を用いる測定装置の開発が進展
するなかで、アルコール、特にエタノールの分析は、食
品・発酵・臨床分野等において開発の要望が多く各種の
提案がなされている。しかし、アルコール測定に用いら
れる酵素についてはいまだ充分な安定性のあるものが得
られていない。
するなかで、アルコール、特にエタノールの分析は、食
品・発酵・臨床分野等において開発の要望が多く各種の
提案がなされている。しかし、アルコール測定に用いら
れる酵素についてはいまだ充分な安定性のあるものが得
られていない。
アルコールの測定に利用できる酵素としては、アルコ
ール脱水素酵素（EC1.1.1.1）やアルコールオキシダー
ゼ（EC1.1.3.13）等が知られている。
ール脱水素酵素（EC1.1.1.1）やアルコールオキシダー
ゼ（EC1.1.3.13）等が知られている。
しかしアルコール脱水素酵素は、NAD（ニコチンアデ
ニンジヌクレオチド）を補酵素として要求し、分析に用
いる試薬が高価になること、また酵素自体の安定性が低
いことから、溶液系での測定用に留まっている。
ニンジヌクレオチド）を補酵素として要求し、分析に用
いる試薬が高価になること、また酵素自体の安定性が低
いことから、溶液系での測定用に留まっている。
一方アルコールオキシダーゼは固定化して測定に用い
た例が知られている。固定化酵素を用いる測定装置とし
ては、アンペロメトリックな計測を行う装置があり、こ
の計測装置は酵素反応により起きる電極活性物質の増減
を、定電圧を印加した固定化酵素電極からの電流出力値
の変化として捉える形式の装置であり、高感度化が容易
で安定性も優れるため各種の電極、装置、方法が開発さ
れている。アンペロメトリックな分析方法の代表例とし
ては、酸素電極によるものと過酸化水素電極によるもの
があるが、応答速度、S/N比の点で過酸化水素電極を用
いる方法が優れており、過酸化水素電極を用いる測定装
置が注目される。
た例が知られている。固定化酵素を用いる測定装置とし
ては、アンペロメトリックな計測を行う装置があり、こ
の計測装置は酵素反応により起きる電極活性物質の増減
を、定電圧を印加した固定化酵素電極からの電流出力値
の変化として捉える形式の装置であり、高感度化が容易
で安定性も優れるため各種の電極、装置、方法が開発さ
れている。アンペロメトリックな分析方法の代表例とし
ては、酸素電極によるものと過酸化水素電極によるもの
があるが、応答速度、S/N比の点で過酸化水素電極を用
いる方法が優れており、過酸化水素電極を用いる測定装
置が注目される。
しかし、従来の固定化アルコールオキシダーゼは、活
性が比較的低いものしか得られず、またその安定性も実
用上不満足なものである。そのため、より安定な酵素の
探索、固定化方法および測定方法に各種の工夫がなされ
報告されている。
性が比較的低いものしか得られず、またその安定性も実
用上不満足なものである。そのため、より安定な酵素の
探索、固定化方法および測定方法に各種の工夫がなされ
報告されている。
例えば、カンディダ属の酵母から得られた酵素によっ
て約20日の寿命を持つ固定化酵素電極（以下単に酵素電
極という）が作成された例がある（末信一朗；電気化学
および工業物理化学、56、1122（1988））。この例で
も、非使用時の酵素電極の保存に注意を払っている上
に、測定試料数は多くはなく必ずしも充分な安定性は得
られていない。
て約20日の寿命を持つ固定化酵素電極（以下単に酵素電
極という）が作成された例がある（末信一朗；電気化学
および工業物理化学、56、1122（1988））。この例で
も、非使用時の酵素電極の保存に注意を払っている上
に、測定試料数は多くはなく必ずしも充分な安定性は得
られていない。
また本願発明者もアルコールオキシダーゼの固定化方
法と測定方法に関する改善を行ってきた（特願昭63−21
7641号、特願昭63−218844号）。しかし安定性に関して
はまだ充分ではなかった。
法と測定方法に関する改善を行ってきた（特願昭63−21
7641号、特願昭63−218844号）。しかし安定性に関して
はまだ充分ではなかった。
さらにこれらの固定化酵素を用いる測定装置では、測
定可能範囲を越える高濃度のアルコールを測定した後
で、低濃度のアルコールに対する応答が小さくなるとい
う欠点があった。
定可能範囲を越える高濃度のアルコールを測定した後
で、低濃度のアルコールに対する応答が小さくなるとい
う欠点があった。
また、発酵・食品分野において、甘味成分あるいは原
材料であるグルコースと、生成物あるいは主要成分であ
るアルコールを同時に測定する必要性は高いが、従来の
不安定な固定化アルコールオキシダーゼを用いた場合、
充分に満足できる同時測定装置を開発することはできな
かった。
材料であるグルコースと、生成物あるいは主要成分であ
るアルコールを同時に測定する必要性は高いが、従来の
不安定な固定化アルコールオキシダーゼを用いた場合、
充分に満足できる同時測定装置を開発することはできな
かった。
（発明が解決しようとする課題） 本発明は、安定な固定化アルコールオキシダーゼとそ
れを用いる高精度かつ安定なアルコール測定装置を提供
することを目的とする。特に、室温以上での耐温性に優
れ、高濃度のアルコール注入後においても、感度変動が
少ない測定装置を提供することを目的とする。
れを用いる高精度かつ安定なアルコール測定装置を提供
することを目的とする。特に、室温以上での耐温性に優
れ、高濃度のアルコール注入後においても、感度変動が
少ない測定装置を提供することを目的とする。
さらに本発明は、高精度かつ安定なグルコースおよび
アルコール測定装置を提供することを目的とする。
アルコール測定装置を提供することを目的とする。
（課題を解決するための手段） アルコールオキシダーゼの特性を調査検討し、各種固
定化方法および測定方法を試みた結果、本発明を完成す
るに至った。
定化方法および測定方法を試みた結果、本発明を完成す
るに至った。
本発明者等は固定化アルコールオキシダーゼ電極を用
いた測定において、高濃度のアルコール溶液を測定した
後、低濃度のアルコール溶液を測定すると応答が小さく
なる現象に関して実験を行った。
いた測定において、高濃度のアルコール溶液を測定した
後、低濃度のアルコール溶液を測定すると応答が小さく
なる現象に関して実験を行った。
アルコールオキシダーゼを、牛血清アルブミンと混合
し、さらにグルタルアルデヒドを混合して白金電極上に
展開し固定化した酵素電極を得た。この酵素電極を作用
電極とし、白金線を対極として、銀・塩化銀電極を参照
電極とする３電極系を用いて測定した。pH7.5のリン酸
ナトリウム緩衝液中で作用電極に対銀・塩化銀参照電極
＋0.6Vの電圧を印加した。測定温度は室温（25℃）であ
る。まず、0.1〜1mM相当のエタノール緩衝液に加え、感
度を記録した。この濃度領域では、出力電流値は加えた
エタノール濃度に比例する。次に1M相当のエタノールを
加え１分間放置し、その後新しい緩衝液と入れ換えて、
再度低濃度のエタノールで感度を確認した。
し、さらにグルタルアルデヒドを混合して白金電極上に
展開し固定化した酵素電極を得た。この酵素電極を作用
電極とし、白金線を対極として、銀・塩化銀電極を参照
電極とする３電極系を用いて測定した。pH7.5のリン酸
ナトリウム緩衝液中で作用電極に対銀・塩化銀参照電極
＋0.6Vの電圧を印加した。測定温度は室温（25℃）であ
る。まず、0.1〜1mM相当のエタノール緩衝液に加え、感
度を記録した。この濃度領域では、出力電流値は加えた
エタノール濃度に比例する。次に1M相当のエタノールを
加え１分間放置し、その後新しい緩衝液と入れ換えて、
再度低濃度のエタノールで感度を確認した。
その結果、感度は約50％に低下することがわかった。
ところが、このように高濃度のエタノールに曝された酵
素電極を、緩衝液中で約１時間放置すると、感度は初期
値の約90％まで回復する。そこで次に、10mM相当の過酸
化水素を加えて１分間放置した後、感度を測定すると高
濃度のアルコールに曝した場合と同様の感度低下が認め
られ、また経時的に感度が回復する現象が観察された。
このことは、アルコールオキシダーゼが反応生成物であ
る過酸化水素により生成物阻害を受けることを示してい
る。またアルコールオキシダーゼによって触媒される反
応により、過酸化水素以外にアルデヒドが生成し、アル
デヒドもアルコールオキシダーゼの失活原因となる可能
性がある。
ところが、このように高濃度のエタノールに曝された酵
素電極を、緩衝液中で約１時間放置すると、感度は初期
値の約90％まで回復する。そこで次に、10mM相当の過酸
化水素を加えて１分間放置した後、感度を測定すると高
濃度のアルコールに曝した場合と同様の感度低下が認め
られ、また経時的に感度が回復する現象が観察された。
このことは、アルコールオキシダーゼが反応生成物であ
る過酸化水素により生成物阻害を受けることを示してい
る。またアルコールオキシダーゼによって触媒される反
応により、過酸化水素以外にアルデヒドが生成し、アル
デヒドもアルコールオキシダーゼの失活原因となる可能
性がある。
このような生成物による失活を防止するには、過酸化
水素等を極力素早く固定化アルコールオキシダーゼ近傍
から排除すればよい。そして担体表面にできるだけ薄い
層、理想的には単一層を形成するようにアルコールオキ
シダーゼを固定化することによりこのような目的が達成
できることがわかった。
水素等を極力素早く固定化アルコールオキシダーゼ近傍
から排除すればよい。そして担体表面にできるだけ薄い
層、理想的には単一層を形成するようにアルコールオキ
シダーゼを固定化することによりこのような目的が達成
できることがわかった。
本発明は、表面がアミノシラン化処理され、アミノ基
が形成されたケイソウ土系ケイ酸担体の、該アミノ基に
多官能性アルデヒドを結合し、アルコールオキシダーゼ
を接触させ、該アルコールオキシダーゼが結合されたケ
イソウ土系ケイ酸担体を備える固定化酵素である。
が形成されたケイソウ土系ケイ酸担体の、該アミノ基に
多官能性アルデヒドを結合し、アルコールオキシダーゼ
を接触させ、該アルコールオキシダーゼが結合されたケ
イソウ土系ケイ酸担体を備える固定化酵素である。
さらに本発明は固定化酵素を充填したカラムを上流側
に備え、前記カラム下流側に過酸化水素電極を配置した
フロー型アルコール測定装置である。
に備え、前記カラム下流側に過酸化水素電極を配置した
フロー型アルコール測定装置である。
（作用） 本発明では、アルコールオキシダーゼを単一層に配置
するため、酵素層内部での過酸化水素等の残留がなく、
生成物によるアルコールオキシダーゼの失活を防止する
ことができる。
するため、酵素層内部での過酸化水素等の残留がなく、
生成物によるアルコールオキシダーゼの失活を防止する
ことができる。
本発明で用いるアルコールオキシダーゼは担子菌、酵
母等が生産する酵素があり、特にメタノール資化酵母の
ペルオキシソーム中に大量に含まれている。
母等が生産する酵素があり、特にメタノール資化酵母の
ペルオキシソーム中に大量に含まれている。
担体としては、天然のケイソウ土や、その造粒体、ケ
イソウ土を高温処理した耐火煉瓦等のケイソウ土系ケイ
酸が用いられる。
イソウ土を高温処理した耐火煉瓦等のケイソウ土系ケイ
酸が用いられる。
固定化法には物理吸着法、化学結合法等がある。
これらの担体および固定化方法を検討した結果、最も
耐熱安定性が改善され、かつ長寿命な固定化酵素が得ら
れる方法は、用いる担体がケイソウ土系ケイ酸担体であ
り、担体表面にアミノシラン化処理を施し、担体表面に
形成されたアミノ基に多官能性アルデヒドを結合し、好
ましくは過剰の多官能性アルデヒドを除去した後、アル
コールオキシダーゼを接触せしめて、担体にアルコール
オキシダーゼを結合させる方法であった。アミノシラン
化処理はγ−アミノプロピルトリエトキシシラン、４−
アミノブチルジメチルメトキシシラン、４−アミノブチ
ルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤を用
い、通常シランカップリング剤の無水ベンゼン溶液に担
体を浸漬して行う。尚アミノシランカップリング剤の代
わりにアミノチタンカップリング剤を用いることもでき
る。多官能性アルデヒドとしてはグルタルアルデヒド、
グリオキザール等がある。
耐熱安定性が改善され、かつ長寿命な固定化酵素が得ら
れる方法は、用いる担体がケイソウ土系ケイ酸担体であ
り、担体表面にアミノシラン化処理を施し、担体表面に
形成されたアミノ基に多官能性アルデヒドを結合し、好
ましくは過剰の多官能性アルデヒドを除去した後、アル
コールオキシダーゼを接触せしめて、担体にアルコール
オキシダーゼを結合させる方法であった。アミノシラン
化処理はγ−アミノプロピルトリエトキシシラン、４−
アミノブチルジメチルメトキシシラン、４−アミノブチ
ルトリエトキシシラン等のシランカップリング剤を用
い、通常シランカップリング剤の無水ベンゼン溶液に担
体を浸漬して行う。尚アミノシランカップリング剤の代
わりにアミノチタンカップリング剤を用いることもでき
る。多官能性アルデヒドとしてはグルタルアルデヒド、
グリオキザール等がある。
この方法では、第１にケイソウ土系ケイ酸担体を用い
ることにより、表面にかなり粗い細孔を有する担体上に
酵素を固定化できる。従って基質であるアルコールと生
成された過酸化水素がともに細孔内に残留することなく
排除され、アルコールオキシダーゼに対する阻害が極め
て起こりにくい。
ることにより、表面にかなり粗い細孔を有する担体上に
酵素を固定化できる。従って基質であるアルコールと生
成された過酸化水素がともに細孔内に残留することなく
排除され、アルコールオキシダーゼに対する阻害が極め
て起こりにくい。
ケイソウ土系ケイ酸担体としては、天然のケイソウ土
や、その造粒体、ケイソウ土を高温処理した耐火煉瓦等
が例示される。これらはいずれも１μｍ程度の１次粒子
が集合したもので、比較的粗い細孔径を有する。比較的
類似の担体としては、シリカゲルがあるが、シリカゲル
はより細孔径が細かいため、ケイソウ土系ケイ酸担体の
方がより効果に優れる。各種担体に固定化したアルコー
ルオキシダーゼの寿命を検討したところ、ケイソウ土系
ケイ酸担体に固定化したものが最も長寿命であった。こ
の理由としては前記の細孔の差に基づく生成物の迅速な
除去効果が第一の原因と考えられ、さらにケイソウ土系
ケイ酸担体に含まれる微量のカルシウム・鉄等による安
定化効果があるのか、あるいは比較的強固にシランカッ
プリング剤が結合し酵素の脱落が少ないことも安定性に
寄与している可能性が考えられる。
や、その造粒体、ケイソウ土を高温処理した耐火煉瓦等
が例示される。これらはいずれも１μｍ程度の１次粒子
が集合したもので、比較的粗い細孔径を有する。比較的
類似の担体としては、シリカゲルがあるが、シリカゲル
はより細孔径が細かいため、ケイソウ土系ケイ酸担体の
方がより効果に優れる。各種担体に固定化したアルコー
ルオキシダーゼの寿命を検討したところ、ケイソウ土系
ケイ酸担体に固定化したものが最も長寿命であった。こ
の理由としては前記の細孔の差に基づく生成物の迅速な
除去効果が第一の原因と考えられ、さらにケイソウ土系
ケイ酸担体に含まれる微量のカルシウム・鉄等による安
定化効果があるのか、あるいは比較的強固にシランカッ
プリング剤が結合し酵素の脱落が少ないことも安定性に
寄与している可能性が考えられる。
アルコールオキシダーゼは、比較的温和な架橋剤であ
るグルタルアルデヒドでも失活が起きる危険性がある
が、本発明の好ましい態様では、シランカップリング剤
と多官能性アルデヒドをあらかじめ担体に結合してか
ら、アルコールオキシダーゼを接触、固定させるため、
過剰のアルデヒドによって酵素が不必要な修飾を受けて
失活することがない利点もある。
るグルタルアルデヒドでも失活が起きる危険性がある
が、本発明の好ましい態様では、シランカップリング剤
と多官能性アルデヒドをあらかじめ担体に結合してか
ら、アルコールオキシダーゼを接触、固定させるため、
過剰のアルデヒドによって酵素が不必要な修飾を受けて
失活することがない利点もある。
本発明の固定化酵素は、アルデヒドの生産、アルコー
ル除去用等のリアクターとしても用いられるが、特にア
ルコール測定装置に好ましく利用される。
ル除去用等のリアクターとしても用いられるが、特にア
ルコール測定装置に好ましく利用される。
測定装置は、生成物阻害を防ぎ長寿命の測定装置を作
成するために、カラムリアクター方式の装置が望まし
い。第２図は、カラムリアクター方式フロー型測定装置
を示したものであり、本発明の固定化酵素を充填したカ
ラムを上流側に備え、カラムの下流側に過酸化水素電極
を配置したフロー型測定装置を例示した。この測定装置
では、固定化酵素の活性が直接測定される電流値として
現れる。
成するために、カラムリアクター方式の装置が望まし
い。第２図は、カラムリアクター方式フロー型測定装置
を示したものであり、本発明の固定化酵素を充填したカ
ラムを上流側に備え、カラムの下流側に過酸化水素電極
を配置したフロー型測定装置を例示した。この測定装置
では、固定化酵素の活性が直接測定される電流値として
現れる。
また、このアルコールオキシダーゼ固定化カラムと過
酸化水素電極を用いた測定系にグルコース測定用電極を
組み合せると、極めて迅速・高精度のアルコールおよび
グルコース同時測定装置を構成できる。
酸化水素電極を用いた測定系にグルコース測定用電極を
組み合せると、極めて迅速・高精度のアルコールおよび
グルコース同時測定装置を構成できる。
グルコース測定用電極は、過酸化水素電極または酸素
電極上に、グルコースオキシダーゼあるいはピラノース
オキシダーゼを固定化することにより作成できる。
電極上に、グルコースオキシダーゼあるいはピラノース
オキシダーゼを固定化することにより作成できる。
グルコース測定用電極は、固定化カラムの上流側また
は、過酸化水素電極の下流側のどちらにも配置できる
が、高濃度アルコールがグルコースと共存する系では固
定化カラムの内部で、著しい溶存酸素の消費と過酸化水
素の生成が起きる。従って望ましくは固定化カラムの上
流側にグルコース測定用電極を配置する。もちろん複流
路型のフロー型測定装置を作成することも可能である
が、注入された試料を分流する際の分流比が、配管の汚
染等により変動する可能性が大きく、より高精度の測定
を行うために直列配置型の装置を構成することが望まし
い。
は、過酸化水素電極の下流側のどちらにも配置できる
が、高濃度アルコールがグルコースと共存する系では固
定化カラムの内部で、著しい溶存酸素の消費と過酸化水
素の生成が起きる。従って望ましくは固定化カラムの上
流側にグルコース測定用電極を配置する。もちろん複流
路型のフロー型測定装置を作成することも可能である
が、注入された試料を分流する際の分流比が、配管の汚
染等により変動する可能性が大きく、より高精度の測定
を行うために直列配置型の装置を構成することが望まし
い。
もちろん、グルコース測定用電極以外の、固定化酵素
電極を併用することにより各種同時測定装置を構成でき
る。例えば、ショ糖、果糖、マルトース等の糖類、さら
に乳酸等の有機酸、グルタミン酸等のアミノ酸の同時測
定装置を作成できる。さらにpH電極、ナトリウム・アン
モニア等のイオン選択性電極も用いることができる。
電極を併用することにより各種同時測定装置を構成でき
る。例えば、ショ糖、果糖、マルトース等の糖類、さら
に乳酸等の有機酸、グルタミン酸等のアミノ酸の同時測
定装置を作成できる。さらにpH電極、ナトリウム・アン
モニア等のイオン選択性電極も用いることができる。
（実施例） 以下に実施例を示し本発明をより具体的に説明する
が、もちろん本発明はこれらのみに限定されるものでは
ない。なお、％は重量％を表す。
が、もちろん本発明はこれらのみに限定されるものでは
ない。なお、％は重量％を表す。
実施例１ （１）電極の作成方法 直径2mmの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび1500番のエメリー紙で平滑
に仕上げる。この白金線を作用極、1cm角型白金板を対
極、飽和カロメル電極（以下SCEと略す）を参照極とし
て、0.1M硫酸中、＋2.0Vで10分間の電解処理を行った。
白金線をよく水洗した後、40℃で10分間乾燥し、10％γ
−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶
液に１時間浸漬後、洗浄した。
その線の一端をやすりおよび1500番のエメリー紙で平滑
に仕上げる。この白金線を作用極、1cm角型白金板を対
極、飽和カロメル電極（以下SCEと略す）を参照極とし
て、0.1M硫酸中、＋2.0Vで10分間の電解処理を行った。
白金線をよく水洗した後、40℃で10分間乾燥し、10％γ
−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶
液に１時間浸漬後、洗浄した。
牛血清アルブミン（シグマ社製、Fraction V）20mgを
蒸留水1mlに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを0.2
％になるように加える。この混合液を手早く先に用意し
た白金線上に５μｌのせ、40℃で15分間乾燥硬化して過
酸化水素選択透過膜を形成した。これを過酸化水素電極
とした。
蒸留水1mlに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを0.2
％になるように加える。この混合液を手早く先に用意し
た白金線上に５μｌのせ、40℃で15分間乾燥硬化して過
酸化水素選択透過膜を形成した。これを過酸化水素電極
とした。
（２）固定化酵素カラムの作成方法 第１図はアルコールオキシダーゼの固定化を示したも
のである。担体として耐火煉瓦を使用した。耐火煉瓦
（60メッシュ〜80メッシュ分級品）150mgをよく乾燥
し、γ−アミノプロピルトリエトキシシランの10％無水
トルエン溶液1mlを加え１時間放置する。このシランカ
ップリング剤をトルエンとメタノールでよく洗浄後、12
0℃で２時間乾燥する（第1b図）。放冷後、５％グルタ
ルアルデヒド水溶液を0.5ml加え、室温で１時間放置す
る。この担体をよく水洗した。最後にpH7.0のリン酸ナ
トリウム緩衝液で洗浄し、可能な限り緩衝液を除いた
（第1c図）。
のである。担体として耐火煉瓦を使用した。耐火煉瓦
（60メッシュ〜80メッシュ分級品）150mgをよく乾燥
し、γ−アミノプロピルトリエトキシシランの10％無水
トルエン溶液1mlを加え１時間放置する。このシランカ
ップリング剤をトルエンとメタノールでよく洗浄後、12
0℃で２時間乾燥する（第1b図）。放冷後、５％グルタ
ルアルデヒド水溶液を0.5ml加え、室温で１時間放置す
る。この担体をよく水洗した。最後にpH7.0のリン酸ナ
トリウム緩衝液で洗浄し、可能な限り緩衝液を除いた
（第1c図）。
このアミノシラン化した担体に、アルコールオキシダ
ーゼ（シグマ社製、Pichia pastolis由来の液状酵素標
品）50μｌをpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液で10倍に
希釈した酵素溶液を加え、氷冷下で１時間放置する。放
置後緩衝液でよく洗浄した（第1d図）。このようにして
アルコールオキシダーゼ（第1d図中にAODと示した）が
ほぼ１分子づつ固定化された単一層が形成される。この
酵素固定化担体を外径3mm、内径2mm、長さ10cmのポリテ
トラフルオロ樹脂管中に充填した。
ーゼ（シグマ社製、Pichia pastolis由来の液状酵素標
品）50μｌをpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液で10倍に
希釈した酵素溶液を加え、氷冷下で１時間放置する。放
置後緩衝液でよく洗浄した（第1d図）。このようにして
アルコールオキシダーゼ（第1d図中にAODと示した）が
ほぼ１分子づつ固定化された単一層が形成される。この
酵素固定化担体を外径3mm、内径2mm、長さ10cmのポリテ
トラフルオロ樹脂管中に充填した。
（３）測定装置 第２図に示すフロー型測定装置を使用した。このフロ
ー型測定装置は高速液体クロマトグラフィ用のインジェ
クタ（レオダイン社製7125型インジェクタ）（３）と前
記した過酸化水素電極（６）及び参照電極としてのAg/A
gCl電極（７）が取り付けられ対極（８）としてステン
レス鋼から成る配管が備えられた測定用セル（５）とを
含んで構成される。内径0.5mm、長さ0.5mのテフロン製
配管でインジェクタ（３）と固定化酵素カラム（４）、
および固定化酵素カラム（４）と測定用セル（５）とを
接続した。測定用セル（５）の内容積は40μｌであり、
過酸化水素電極（６）とAg/AgCl電極（７）とが緩衝液
の管路を介して対向して配置される。過酸化水素電極
（６）にはポテンシオスタット（９）によってAg/AgCl
電極に対して＋0.6Vの電圧が印加される。これらは、恒
温槽（12）の内部に設置される。恒温槽（12）内の温度
は37℃±0.2℃に保持される。緩衝液（１）の送液には
高速液体クロマトグラフィ用のポンプ（２）を用い1.0m
l/分の流量で送液される。緩衝液は、1mMのアジ化ナト
リウムを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で
ある。
ー型測定装置は高速液体クロマトグラフィ用のインジェ
クタ（レオダイン社製7125型インジェクタ）（３）と前
記した過酸化水素電極（６）及び参照電極としてのAg/A
gCl電極（７）が取り付けられ対極（８）としてステン
レス鋼から成る配管が備えられた測定用セル（５）とを
含んで構成される。内径0.5mm、長さ0.5mのテフロン製
配管でインジェクタ（３）と固定化酵素カラム（４）、
および固定化酵素カラム（４）と測定用セル（５）とを
接続した。測定用セル（５）の内容積は40μｌであり、
過酸化水素電極（６）とAg/AgCl電極（７）とが緩衝液
の管路を介して対向して配置される。過酸化水素電極
（６）にはポテンシオスタット（９）によってAg/AgCl
電極に対して＋0.6Vの電圧が印加される。これらは、恒
温槽（12）の内部に設置される。恒温槽（12）内の温度
は37℃±0.2℃に保持される。緩衝液（１）の送液には
高速液体クロマトグラフィ用のポンプ（２）を用い1.0m
l/分の流量で送液される。緩衝液は、1mMのアジ化ナト
リウムを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で
ある。
測定を終えた緩衝液は、廃液瓶（10）で捕捉される。
測定値は記録計（11）によって記録される。
測定値は記録計（11）によって記録される。
（４）測定方法 固定化直後の担体を有するカラムを測定装置に装着
し、恒温槽温度が平衡に達した後、100mMのエタノール
溶液10μｌを注入した。このときの感度を記録した。そ
のまま８時間の間37℃で恒温槽温度を保持し、１時間に
30検体のエタノール溶液を測定した。夜間は送液を止
め、カラム周囲環境温度を30℃に保持した。
し、恒温槽温度が平衡に達した後、100mMのエタノール
溶液10μｌを注入した。このときの感度を記録した。そ
のまま８時間の間37℃で恒温槽温度を保持し、１時間に
30検体のエタノール溶液を測定した。夜間は送液を止
め、カラム周囲環境温度を30℃に保持した。
このように昼間は37℃で連続測定を８時間続け、夜間
は30℃の環境にカラムを放置し、毎日100mMエタノール
溶液に対する感度を記録した。最初に記録した固定化直
後の感度を100％としてその後の感度変化を第３図（○
印）に示す。記録開始後、数日間は感度の上昇が見られ
以後安定する。この感度上昇は、アルコールオキシダー
ゼ標品に不純物として含まれるカタラーゼが失活するこ
とによるものである。つまり、最終検出化合物である過
酸化水素がカタラーゼにより分解されるが、やがてカタ
ラーゼ活性が失われ、アルコールの酸化と同時に生成し
た過酸化水素が、定量的にカラムから溶出するようにな
るためである。
は30℃の環境にカラムを放置し、毎日100mMエタノール
溶液に対する感度を記録した。最初に記録した固定化直
後の感度を100％としてその後の感度変化を第３図（○
印）に示す。記録開始後、数日間は感度の上昇が見られ
以後安定する。この感度上昇は、アルコールオキシダー
ゼ標品に不純物として含まれるカタラーゼが失活するこ
とによるものである。つまり、最終検出化合物である過
酸化水素がカタラーゼにより分解されるが、やがてカタ
ラーゼ活性が失われ、アルコールの酸化と同時に生成し
た過酸化水素が、定量的にカラムから溶出するようにな
るためである。
この第３図からわかるように、本実施例の方法で作成
した固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、１
ヵ月後でも活性低下は認められなかった。
した固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、１
ヵ月後でも活性低下は認められなかった。
さらにこの固定化酵素カラムを備える装置に、100mM
と1Mのエタノール溶液を交互に注入した。1M溶液の場合
は出力値は飽和し、定量することはできなかったが、直
後に注入された100mMエタノール溶液の測定値には影響
を与えなかった。
と1Mのエタノール溶液を交互に注入した。1M溶液の場合
は出力値は飽和し、定量することはできなかったが、直
後に注入された100mMエタノール溶液の測定値には影響
を与えなかった。
比較例１ （１）電極の作成方法 実施例１と同じ過酸化水素電極を作成し使用した。
（２）固定化酵素カラムの作成方法 耐火煉瓦（60メッシュ〜80メッシュ分級品）150mg
に、アルコールオキシダーゼ（シグマ社製、Pichia pa
stolis由来の液状酵素標品）50μｌと50mgの牛血清アル
ブミンにpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液0.95mlを加
え、さらに0.2％になるようにグルタルアルデヒドを加
えた液を加え、冷蔵庫中で５時間放置し乾燥する。放置
後緩衝液でよく洗浄する。この酵素固定化担体を外径3m
m、内径2mm、長さ10cmのポリテトラフルオロ樹脂管中に
充填する。この方法で固定化すると、担体表面に、固定
化酵素の比較的厚い膜が形成される。
に、アルコールオキシダーゼ（シグマ社製、Pichia pa
stolis由来の液状酵素標品）50μｌと50mgの牛血清アル
ブミンにpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液0.95mlを加
え、さらに0.2％になるようにグルタルアルデヒドを加
えた液を加え、冷蔵庫中で５時間放置し乾燥する。放置
後緩衝液でよく洗浄する。この酵素固定化担体を外径3m
m、内径2mm、長さ10cmのポリテトラフルオロ樹脂管中に
充填する。この方法で固定化すると、担体表面に、固定
化酵素の比較的厚い膜が形成される。
（３）測定装置 実施例１と同じ装置を用いた。
（４）測定方法 実施例１と同じ測定方法で固定化酵素の寿命を評価し
た。その結果を第３図（●印）に示す。
た。その結果を第３図（●印）に示す。
この第３図からわかるように、実施例１の方法で作成
した固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定である
が、比較例１で得られた固定化酵素カラムを用いた場
合、１週間後から感度低下をきたし、19日後には初期感
度の約20％まで低下してしまう。
した固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定である
が、比較例１で得られた固定化酵素カラムを用いた場
合、１週間後から感度低下をきたし、19日後には初期感
度の約20％まで低下してしまう。
なお、比較例１の固定化酵素カラムを用いた場合、実
施例１に比べて過酸化水素の検出ピークが溶出し終るま
での時間が1.5倍程度になり、過酸化水素が固定化酵素
層内に保持される時間が長くなっている。
施例１に比べて過酸化水素の検出ピークが溶出し終るま
での時間が1.5倍程度になり、過酸化水素が固定化酵素
層内に保持される時間が長くなっている。
また実施例１と同様に、この固定化酵素カラムを備え
る装置に、100mMと1Mのエタノール溶液を交互に注入し
た。1M溶液の直後に注入された100mMエタノール溶液の
測定値は約60％に減少し、1M溶液測定による大きな影響
が認められた。
る装置に、100mMと1Mのエタノール溶液を交互に注入し
た。1M溶液の直後に注入された100mMエタノール溶液の
測定値は約60％に減少し、1M溶液測定による大きな影響
が認められた。
比較例２ （１）電極の作成方法 直径2mmの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび1500番のエメリー紙で平滑
に仕上げた。この白金線を作用極、1cm角型白金板を対
極、飽和カロメル電極（以下SCEと略す）を参照極とし
て、0.1M硫酸中、＋2.0Vで10分間の電解処理を行った。
その後白金線をよく水洗した後、40℃で10分間乾燥し、
10％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トル
エン溶液に１時間浸漬後、洗浄した。
その線の一端をやすりおよび1500番のエメリー紙で平滑
に仕上げた。この白金線を作用極、1cm角型白金板を対
極、飽和カロメル電極（以下SCEと略す）を参照極とし
て、0.1M硫酸中、＋2.0Vで10分間の電解処理を行った。
その後白金線をよく水洗した後、40℃で10分間乾燥し、
10％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トル
エン溶液に１時間浸漬後、洗浄した。
牛血清アルブミン（シグマ社製、Fraction Ｖ）20mg
を蒸留水1mlに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
0.2％になるように加える。この混合液を手早く先に用
意した白金線上に５μｌのせ、40℃で15分間乾燥硬化す
る。これを過酸化水素電極とした。
を蒸留水1mlに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
0.2％になるように加える。この混合液を手早く先に用
意した白金線上に５μｌのせ、40℃で15分間乾燥硬化す
る。これを過酸化水素電極とした。
さらに、その上に、アルコールオキシダーゼ（実施例
１と同じ酵素標品）50μｌと牛血清アルブミン50mgに10
0mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）0.95mlを加え、さ
らに0.2％になるようにグルタルアルデヒドを加えた混
合溶液を、上記過酸化水素電極の上に５μｌのせ、40℃
で15分間乾燥した。この酵素電極を以下の実験に用い
た。
１と同じ酵素標品）50μｌと牛血清アルブミン50mgに10
0mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）0.95mlを加え、さ
らに0.2％になるようにグルタルアルデヒドを加えた混
合溶液を、上記過酸化水素電極の上に５μｌのせ、40℃
で15分間乾燥した。この酵素電極を以下の実験に用い
た。
（２）測定装置 過酸化水素電極の代わりに、酵素電極を用い、固定化
酵素カラムを除いた以外は、実施例１と同じ装置を用い
た。
酵素カラムを除いた以外は、実施例１と同じ装置を用い
た。
（３）測定方法 実施例１と同様に寿命を評価した。その結果を第３図
（×印）に示す。
（×印）に示す。
酵素電極形式の場合、使用開始３日目から顕著な感度
低下が認められ５日目には約35％まで感度が低下し、実
施例１に比べて性能が劣ることが明白である。
低下が認められ５日目には約35％まで感度が低下し、実
施例１に比べて性能が劣ることが明白である。
比較例３ （１）電極の作成方法 実施例１と同じ方法で、過酸化水素電極を作成した。
（２）固定化酵素カラムの作成方法 シリカゲル（80メッシュ〜100メッシュ分級品）200mg
をよく乾燥し、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン
の10％無水トルエン溶液1mlを加え１時間放置する。シ
ランカップリング剤をトルエンとメタノールでよく洗浄
後、120℃で４時間乾燥する。放冷後、５％グルタルア
ルデヒド水溶液を0.5ml加え、室温で１時間放置する。
この担体をよく水洗する。最後にpH7.0のリン酸ナトリ
ウム緩衝液で洗浄し、可能な限り緩衝液を除く。
をよく乾燥し、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン
の10％無水トルエン溶液1mlを加え１時間放置する。シ
ランカップリング剤をトルエンとメタノールでよく洗浄
後、120℃で４時間乾燥する。放冷後、５％グルタルア
ルデヒド水溶液を0.5ml加え、室温で１時間放置する。
この担体をよく水洗する。最後にpH7.0のリン酸ナトリ
ウム緩衝液で洗浄し、可能な限り緩衝液を除く。
このアミノシラン化担体に、アルコールオキシダーゼ
（シグマ社製、Pichia pastolis由来の液状酵素標品）
50μｌをpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液で10倍に希釈
した酵素溶液を加え、氷冷下で１時間放置する。放置後
緩衝液でよく洗浄する。この酵素固定化担体を外径3m
m、内径2mm、長さ10cmのポリテトラフルオロ樹脂管中に
充填する。
（シグマ社製、Pichia pastolis由来の液状酵素標品）
50μｌをpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液で10倍に希釈
した酵素溶液を加え、氷冷下で１時間放置する。放置後
緩衝液でよく洗浄する。この酵素固定化担体を外径3m
m、内径2mm、長さ10cmのポリテトラフルオロ樹脂管中に
充填する。
（３）測定装置 実施例１と同じ、測定装置を用いた。
（４）測定方法 実施例１と同じ方法で固定化酵素の寿命を検討した。
昼間は37℃で連続測定を８時間続け、夜間は30℃の環
境にカラムを放置し、毎日100mMエタノール溶液に対す
る感度を記録し、最初に記録した固定化直後の感度を10
0％としてその後の感度変化を第４図に示す。記録開始
後、実施例１と同じく、数日間は感度の上昇が見られ以
後安定した。
境にカラムを放置し、毎日100mMエタノール溶液に対す
る感度を記録し、最初に記録した固定化直後の感度を10
0％としてその後の感度変化を第４図に示す。記録開始
後、実施例１と同じく、数日間は感度の上昇が見られ以
後安定した。
第４図からわかるように、本比較例の方法で作成した
固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、約３週
間活性低下は認められなかった。これは、比較例１およ
び比較例２と比べて耐久性が改善されているが、数週間
で活性が低下しているので実用的には問題がある。
固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、約３週
間活性低下は認められなかった。これは、比較例１およ
び比較例２と比べて耐久性が改善されているが、数週間
で活性が低下しているので実用的には問題がある。
さらにこの固定化酵素カラムを備える装置に、100mM
と1Mのエタノール溶液を交互に注入した。1M溶液の場合
は出力値は飽和し、定量することはできなかったが、直
後に注入された100mMエタノール溶液の測定値には影響
を与えなかった。
と1Mのエタノール溶液を交互に注入した。1M溶液の場合
は出力値は飽和し、定量することはできなかったが、直
後に注入された100mMエタノール溶液の測定値には影響
を与えなかった。
実施例２ （１）電極の作成方法 実施例１と同じ方法で、過酸化水素電極を作成した。
（２）固定化酵素カラムの作成方法 ケイソウ土（セライト545、キシダ化学（株）製、40
メッシュ〜60メッシュ分級品）150mgをよく乾燥し、γ
−アミノプロピルトリエトキシシランの10％無水トルエ
ン溶液1mlを加え１時間放置する。シランカップリング
剤をトルエンとメタノールでよく洗浄後、120℃で４時
間乾燥する。放冷後、５％グルタルアルデヒド水溶液を
0.5ml加え、室温で１時間放置する。この担体をよく水
洗する。最後にpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄
し、可能な限り緩衝液を除く。
メッシュ〜60メッシュ分級品）150mgをよく乾燥し、γ
−アミノプロピルトリエトキシシランの10％無水トルエ
ン溶液1mlを加え１時間放置する。シランカップリング
剤をトルエンとメタノールでよく洗浄後、120℃で４時
間乾燥する。放冷後、５％グルタルアルデヒド水溶液を
0.5ml加え、室温で１時間放置する。この担体をよく水
洗する。最後にpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄
し、可能な限り緩衝液を除く。
このアミノシラン化担体に、アルコールオキシダーゼ
（シグマ社製、Pichia pastolis由来の液状酵素標品）
50μｌをpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液で10倍に希釈
した酵素溶液を加え、氷冷下で１時間放置する。放置後
緩衝液でよく洗浄する。この酵素固定化担体を外径3m
m、内径2mm、長さ10cmのポリテトラフルオロ樹脂管中に
充填する。
（シグマ社製、Pichia pastolis由来の液状酵素標品）
50μｌをpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液で10倍に希釈
した酵素溶液を加え、氷冷下で１時間放置する。放置後
緩衝液でよく洗浄する。この酵素固定化担体を外径3m
m、内径2mm、長さ10cmのポリテトラフルオロ樹脂管中に
充填する。
（３）測定装置 実施例１と同じ、測定装置を用いた。
（４）測定方法 実施例１と同じ方法で固定化酵素の寿命を検討した。
昼間は37℃で連続測定を８時間続け、夜間は30℃の環
境にカラムを放置し、毎日100mMエタノール溶液に対す
る感度を記録し、最初に記録した固定化直後の感度を10
0％としてその後の感度変化を第５図に示す。記録開始
後、実施例１と同じく、数日間は感度の上昇が見られ以
後安定した。
境にカラムを放置し、毎日100mMエタノール溶液に対す
る感度を記録し、最初に記録した固定化直後の感度を10
0％としてその後の感度変化を第５図に示す。記録開始
後、実施例１と同じく、数日間は感度の上昇が見られ以
後安定した。
この第５図からわかるように、本実施例の方法で作成
した固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、１
ヵ月後でも活性低下は認められなかった。これは、実施
例１と同様に極めて安定性が優れていることを示してい
る。
した固定化アルコールオキシダーゼは極めて安定で、１
ヵ月後でも活性低下は認められなかった。これは、実施
例１と同様に極めて安定性が優れていることを示してい
る。
さらにこの固定化酵素カラムを備える装置に、100mM
と1Mのエタノール溶液を交互に注入した。1M溶液の場合
は出力値は飽和し、定量することはできなかったが、直
後に注入された100mMエタノール溶液の測定値には影響
を与えなかった。
と1Mのエタノール溶液を交互に注入した。1M溶液の場合
は出力値は飽和し、定量することはできなかったが、直
後に注入された100mMエタノール溶液の測定値には影響
を与えなかった。
実施例３ （１）電極等の作成方法 過酸化水素電極、カラムについては実施例１と同様に
作成した。
作成した。
グルコース測定用電極は、実施例１で用いたものと同
様の過酸化水素電極の過酸化水素選択透過膜上にグルコ
ースオキシダーゼを固定化した。グルコースオキシダー
ゼ（シグマ社製、Aspergillus niger由来、Type II）
5mg/mlと牛血清アルブミン（シグマ社製、Fraction
Ｖ）5mg/mlを1:1に混合し、この混合液に0.2％になるよ
うにグルタルアルデヒドを加え、その５μｌを過酸化水
素選択透過膜上に滴下後、40℃で15分間乾燥した。
様の過酸化水素電極の過酸化水素選択透過膜上にグルコ
ースオキシダーゼを固定化した。グルコースオキシダー
ゼ（シグマ社製、Aspergillus niger由来、Type II）
5mg/mlと牛血清アルブミン（シグマ社製、Fraction
Ｖ）5mg/mlを1:1に混合し、この混合液に0.2％になるよ
うにグルタルアルデヒドを加え、その５μｌを過酸化水
素選択透過膜上に滴下後、40℃で15分間乾燥した。
（２）測定装置 第２図に示すフロー型測定装置に測定用セル（13）に
装着したグルコース測定用電極（14）を取り付けて用い
た。その配置を第６図に示す。その他の測定条件は実施
例１と同様である。
装着したグルコース測定用電極（14）を取り付けて用い
た。その配置を第６図に示す。その他の測定条件は実施
例１と同様である。
（３）測定方法 インジェクタ（３）より各種濃度のエタノール溶液お
よびグルコース溶液を５μｌ注入した場合の検量線を第
７図に示す。第７図の検量線（１）はグルコースの検量
線を示し、0.75（W/V）％までの直線範囲が得られた。
検量線（２）はエタノールに対する検量線を示し、2.0
（V/V）％までの直線範囲が得られた。またグルコース
とアルコールの混合溶液を注入した場合でも相互に妨害
はみとめられなかった。
よびグルコース溶液を５μｌ注入した場合の検量線を第
７図に示す。第７図の検量線（１）はグルコースの検量
線を示し、0.75（W/V）％までの直線範囲が得られた。
検量線（２）はエタノールに対する検量線を示し、2.0
（V/V）％までの直線範囲が得られた。またグルコース
とアルコールの混合溶液を注入した場合でも相互に妨害
はみとめられなかった。
さらにグルコース測定用電極は６カ月間感度の低下が
見られず、本発明の装置を用いることにより、高精度か
つ安定なグルコースとアルコールの同時測定装置が構成
できることが判った。
見られず、本発明の装置を用いることにより、高精度か
つ安定なグルコースとアルコールの同時測定装置が構成
できることが判った。
（効果） 本発明により、安定にアルコールオキシダーゼを固定
化することが可能となり、容易に優れたアルコール測定
装置を構成できる。
化することが可能となり、容易に優れたアルコール測定
装置を構成できる。
また、高精度かつ安定なアルコールおよびグルコース
の同時測定装置を構成できる。
の同時測定装置を構成できる。
第１図は実施例１において形成した固定化アルコールオ
キシダーゼをしめす。 第２図は実施例１〜３及び比較例で用いたフロー型測定
装置を示す。 第３図は、実施例１、比較例１、および比較例２の結果
を示している。 実施例１の結果−−○印 比較例１の結果−−●印 比較例２の結果−−×印 第４図は比較例３の測定結果を示し、第５図は実施例２
の測定結果を示す。第６図は実施例３で用いた測定装置
を示す。第７図は実施例における検量線を示す。検量線
（１）はグルコースの検量線、検量線（２）はエタノー
ルの検量線を示す。 （１）……緩衝液 （２）……ポンプ （３）……インジェクタ （４）……固定化酵素カラム （５）……測定セル （６）……過酸化水素電極 （７）……Ag/AgCl参照電極 （８）……対極 （９）……ポテンシオスタット （10）……廃液ボトル （11）……レコーダー （12）……恒温槽 （13）……測定セル （14）……グルコース測定用電極
キシダーゼをしめす。 第２図は実施例１〜３及び比較例で用いたフロー型測定
装置を示す。 第３図は、実施例１、比較例１、および比較例２の結果
を示している。 実施例１の結果−−○印 比較例１の結果−−●印 比較例２の結果−−×印 第４図は比較例３の測定結果を示し、第５図は実施例２
の測定結果を示す。第６図は実施例３で用いた測定装置
を示す。第７図は実施例における検量線を示す。検量線
（１）はグルコースの検量線、検量線（２）はエタノー
ルの検量線を示す。 （１）……緩衝液 （２）……ポンプ （３）……インジェクタ （４）……固定化酵素カラム （５）……測定セル （６）……過酸化水素電極 （７）……Ag/AgCl参照電極 （８）……対極 （９）……ポテンシオスタット （10）……廃液ボトル （11）……レコーダー （12）……恒温槽 （13）……測定セル （14）……グルコース測定用電極
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−145448（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−87700（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−181791（ＪＰ，Ａ) 「日本農芸化学会誌」社団法人日本農 芸化学会発行第64巻第３号1990年度大会 講演要旨集第230頁
Claims (2)
- 【請求項１】表面がアミノシラン化処理され、アミノ基
が形成されたケイソウ土系ケイ酸担体の、該アミノ基に
多官能性アルデヒドを結合し、アルコールオキシダーゼ
を接触させ、該アルコールオキシダーゼが結合されたケ
イソウ土系ケイ酸担体を備える固定化酵素。 - 【請求項２】請求項１記載の固定化酵素を充填したカラ
ムを上流側に備え、前記カラム下流側に過酸化水素電極
を配置したフロー型アルコール測定装置。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2061703A JP2862940B2 (ja) | 1989-08-25 | 1990-03-12 | 固定化酵素およびそれを用いる測定装置 |
| DE69023440T DE69023440T2 (de) | 1989-08-25 | 1990-08-27 | Immobilisierte Alkoholoxydase, Methode zu deren Herstellung und Messgerät. |
| EP90116383A EP0416419B1 (en) | 1989-08-25 | 1990-08-27 | Immobilized alcohol oxidase, method for its preparation and measuring apparatus |
| US07/573,066 US5190872A (en) | 1989-08-25 | 1990-08-27 | Immobilized alcohol utidase for use in an alcohol measuring apparatus |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21910489 | 1989-08-25 | ||
| JP1-219104 | 1989-08-25 | ||
| JP2061703A JP2862940B2 (ja) | 1989-08-25 | 1990-03-12 | 固定化酵素およびそれを用いる測定装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03164174A JPH03164174A (ja) | 1991-07-16 |
| JP2862940B2 true JP2862940B2 (ja) | 1999-03-03 |
Family
ID=26402765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2061703A Expired - Fee Related JP2862940B2 (ja) | 1989-08-25 | 1990-03-12 | 固定化酵素およびそれを用いる測定装置 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5190872A (ja) |
| EP (1) | EP0416419B1 (ja) |
| JP (1) | JP2862940B2 (ja) |
| DE (1) | DE69023440T2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69217461T2 (de) * | 1991-11-08 | 1997-10-23 | Nippon Electric Co | Immobilisierte Enzym-Membran, immobilisierte Protein-Membran und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| DE4214822C2 (de) * | 1992-05-05 | 1998-12-03 | Inst Bioanalytik Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur kontinuierlichen Bestimmung von Substraten von Oxidoreduktasen |
| GB9227134D0 (en) * | 1992-12-31 | 1993-02-24 | Fuller Jess P | Cell support structure |
| US5653862A (en) * | 1996-04-15 | 1997-08-05 | Dade Chemistry Systems Inc. | Biochemical sensor device and method |
| DE19833406A1 (de) * | 1998-07-24 | 2000-02-03 | Stadler Johann | Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen oder Enzymen |
| US7700305B2 (en) | 1999-09-17 | 2010-04-20 | N2Itive1 Innovations | Analyte detection |
| WO2004085640A1 (en) * | 2003-03-28 | 2004-10-07 | Council Of Scientific And Industrial Research | A process for preparation of thermostable enzyme |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3669841A (en) * | 1970-02-11 | 1972-06-13 | Monsanto Co | Attachment of enzymes to siliceous materials |
| US4619898A (en) * | 1979-06-05 | 1986-10-28 | Phillips Petroleum Company | Alcohol oxidase from Pichia-type yeasts |
| US4540668A (en) * | 1979-06-05 | 1985-09-10 | Phillips Petroleum Company | Alcohol oxidase from Pichia-type yeasts |
| US4900666A (en) * | 1983-07-12 | 1990-02-13 | Lifescan, Inc. | Colorimetric ethanol analysis method and test device |
| US4556635A (en) * | 1983-08-29 | 1985-12-03 | Phillips Petroleum Company | Determination of alcohol content in water imiscible organic systems |
| JPS6187700A (ja) * | 1984-10-05 | 1986-05-06 | Shimadzu Corp | ペプチド含有物質固定化物 |
| JPS61145448A (ja) * | 1984-12-19 | 1986-07-03 | Fuji Electric Co Ltd | 固定化酵素膜 |
| JPS63182559A (ja) * | 1987-01-24 | 1988-07-27 | Kanzaki Paper Mfg Co Ltd | 酵素電極の製造方法 |
| JPH01181790A (ja) * | 1988-01-18 | 1989-07-19 | Toray Silicone Co Ltd | 生理活性物質の固定化方法 |
| JP2685145B2 (ja) * | 1988-01-25 | 1997-12-03 | 王子製紙株式会社 | 酵素電極 |
| US5037737A (en) * | 1988-06-29 | 1991-08-06 | Apec, Inc. | Analysis by sensor placement in recprocating flow |
-
1990
- 1990-03-12 JP JP2061703A patent/JP2862940B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-27 US US07/573,066 patent/US5190872A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-27 EP EP90116383A patent/EP0416419B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-27 DE DE69023440T patent/DE69023440T2/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 「日本農芸化学会誌」社団法人日本農芸化学会発行第６４巻第３号１９９０年度大会講演要旨集第２３０頁 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69023440T2 (de) | 1996-07-04 |
| EP0416419A2 (en) | 1991-03-13 |
| EP0416419A3 (en) | 1993-04-21 |
| US5190872A (en) | 1993-03-02 |
| DE69023440D1 (de) | 1995-12-14 |
| JPH03164174A (ja) | 1991-07-16 |
| EP0416419B1 (en) | 1995-11-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kulys et al. | Mediatorless peroxidase electrode and preparation of bienzyme sensors | |
| Mizutani et al. | Amperometric determination of pyruvate, phosphate and urea using enzyme electrodes based on pyruvate oxidase-containing poly (vinyl alcohol)/polyion complex-bilayer membrane | |
| US20110042225A1 (en) | Electrochemical nanocomposite biosensor system | |
| Tvorynska et al. | Flow amperometric uric acid biosensors based on different enzymatic mini-reactors: A comparative study of uricase immobilization | |
| US5122456A (en) | Amperometric method for the quantitative determination of 1,4-dihydronicotinamide adenine dinucleotide (nadh) in solution | |
| Hlavay et al. | Fibre-optic biosensor for hypoxanthine and xanthine based on a chemiluminescence reaction | |
| Basu et al. | A biosensor based on co-immobilized L-glutamate oxidase and L-glutamate dehydrogenase for analysis of monosodium glutamate in food | |
| US5306413A (en) | Assay apparatus and assay method | |
| US5378332A (en) | Amperometric flow injection analysis biosensor for glucose based on graphite paste modified with tetracyanoquinodimethane | |
| Winartasaputra et al. | Amperometric enzymic determination of triglycerides in serum | |
| Mieliauskiene et al. | Amperometric determination of acetate with a tri-enzyme based sensor | |
| EP0416419B1 (en) | Immobilized alcohol oxidase, method for its preparation and measuring apparatus | |
| Loughran et al. | Amperometric detection of histamine at a quinoprotein dehydrogenase enzyme electrode | |
| Tang et al. | Enzyme electrode for amplification of NAD+/NADH using glycerol dehydrogenase and diaphorase with amperometric detection | |
| EP0357027A2 (en) | Alcohol oxidase enzyme electrode and its use for quantitative alcohol determination. | |
| Palleschi et al. | Amperometric probe for 3-hydroxybutyrate with immobilized 3-hydroxybutyrate dehydrogenase | |
| JP2020202825A (ja) | 酵素固定化体及びそれを備えた測定装置ならびにアスパラギン及びｌ−アスパラギン酸の測定方法 | |
| Yao et al. | Electroanalytical properties of aldehyde biosensors with a hybrid-membrane composed of an enzyme film and a redox Os-polymer film | |
| Okawa et al. | Glucose sensor carrying monomolecular layer of glucose oxidase covalently bound to tin (IV) oxide electrode | |
| JP3319008B2 (ja) | 測定装置および測定方法 | |
| Huang et al. | Determination of glutamine in mammalian cell cultures with a flow injection analysis/wall-jet electrode system | |
| JP2504812B2 (ja) | 酵素電極及びアルコ―ル濃度測定方法 | |
| US5283181A (en) | Conjugated enzyme electrode | |
| Tavakoli et al. | Mono-enzyme biosensor for the detection of organophosphorous compounds | |
| Li et al. | 1, 1′-Dimethylferrocene mediated L-glutamate electrodes modified with electropolymerized 1, 3-diaminobenzene film |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081211 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091211 Year of fee payment: 11 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |