JPH04281783A - マルトースからのエタノール製造に適した新規細菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】［発明の背景］ 【産業上の利用分野】本発明は新規グラム陰性細菌に関
し、更に詳しくはマルトースおよび澱粉加水分解物から
のアルコール製造に利用し得る新規グラム陰性細菌に関
する。 【０００２】 【従来の技術】糖質からのエタノール、特に工業用エタ
ノール、の製造には従来より酵母が用いられてきたが、
近年、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　）などの細
菌によるエタノール醗酵が注目されてきている。ザイモ
モナス属細菌は、酵母と同様に、グルコース１モルから
エタノール２モルを生成するが、エタノール生産性が酵
母よりも遥かに高くかつ醗酵速度も酵母より大きいこと
から、このザイモモナス属細菌を用いたバイオマスから
のアルコール製造が高い関心を集めている。しかしなが
ら、ザイモモナス属細菌は、醗酵性糖がグルコース、フ
ラクトースおよびスクロースに限られているなど、酵母
に比べて劣る点も存在する。従って、細菌を用いたアル
コール製造の工業的実用化のためには、ザイモモナス属
細菌と同等のエタノール生産性を有し、かつ、資化性糖
が広い菌株の取得が必須であると考えられている。 【０００３】［発明の概要］ 【発明が解決しようとする課題】本発明者は、耐塩性、
醗酵温度、糖資化性などの面で、既存のザイモモナス属
細菌を凌駕する微生物を自然界に求めて鋭意探索を続け
てきた。その結果、植物の樹液より分離した細菌が、資
化性糖において既存のザイモモナス属細菌より優れ、マ
ルトースおよび澱粉加水分解物からのエタノール産生が
可能なことを見出だして本発明を完成した。 【０００４】従って本発明は、資化性糖の面で既存のザ
イモモナス属細菌より優れ、マルトースおよび澱粉加水
分解物からのエタノールの製造に適した新規グラム陰性
細菌を提供することを目的としている。 【０００５】 【課題を解決するための手段】すなわち、本発明による
通性嫌気性グラム陰性細菌は、細胞形態が桿菌、周毛を
有し、芽胞不形成であり、キノン系がＱ−９、マルトー
ス、ソルビトールおよびマンノース資化性を有し、α−
グルコシダーゼを産生するがβーガラクトシダーゼ、ア
ルギニンジヒドラーゼを産生しないもの、である。また
、本発明によるエタノールの製造法は、前記の通性嫌気
性グラム陰性細菌と同一の属に属する細菌を、マルトー
スおよび／または澱粉加水分解物を含有する培地で培養
することを含んでなるもの、である。 【０００６】［発明の具体的説明］微生物の寄託本発明
による微生物の具体例であるＴ１０９株は、植物の樹液
から分離、採取されたものである。この菌株は後述する
菌学的性質をもとに、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏ
ｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ　８ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ　、１９７８を参考に
して同定したが、既存のいずれの属、種にも属さない細
菌であることから、新規グラム陰性細菌と判断した。こ
の菌株は受託番号「微工研条寄第３２９２号（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−３２９２）」のもとに、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。 【０００７】菌学的性質 本発明によるＴ１０９株の菌学的性質を列挙すれば次の
通りである。 Ｉ　．形態的性質 １．細胞の形および大きさ：０．７〜０．９×１．３〜
２．４ミクロンの直状桿菌（寒天培地、液体培地共に３
０℃、１夜の培養） ２．細胞の多形成の有無：なし ３．運動性の有無および鞭毛の着生状態：運動性あり、
周毛 ４．胞子の有無：なし ５．グラム染色性：陰性 ６．抗酸性：陰性 【０００８】ＩＩ．各培地における生育状態次の第１表
に示される通りである。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　第１表　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
培養　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　生育状態　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　肉汁寒天平板培地　　　　　　　
　　　　　　　集落は平滑で周縁はなめらか。　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　色素の生産は認められない。　　　　　
　　　　　　　　　肉汁寒天斜面培地　　　　　　　　
　　　　　　菌苔は平滑で周縁はなめらか。　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　色素の生産は認められない。　　　　　　
　　　　　　　　肉汁液体培地　　　　　　　　　　　
　　　　　　　培地全体に生育が認められるが、　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　沈殿は認められない。　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　肉汁ゼラチン穿刺培地　　　　
　　　　　　培地全体に生育が認められるが、　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　液化は認められない。　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　リトマス・ミルク　　　　　　　
　　　　　　　凝固は認められず、酸およびアルカリ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　の産生も認められない。　　　　　　
　　　　　　　　【０００９】ＩＩＩ　．生理学的性質
：第２表に示される通りである。 【００１０】ＩＶ．炭素源の利用性 第２表に示される通りである。 【００１１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　第２表　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　Ｔ１０９株　　　　　　
Ｚ．　ｍｏｂｉｌｉｓ　　　　　　Ｓ．　ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｔｕｓ　　　　　　形態　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　桿菌　　　　　　　　　　　　桿菌　
　　　　　　　　　　　　　桿菌　　長さμｍ　　　　
　　　　　　　　１．３−２．４　　　　　　　　　２
．０−６．０　　　　　　　　　　　　　１．０−１．
９　　　幅　　μｍ　　　　　　　　　　　　０．７−
０．９　　　　　　　　　１．０−１．４　　　　　　
　　　　　　　０．５−０．９　コロニーの形成　　　
　　　平滑　　　　　　　　　　平滑。周縁ははっき　
　平滑。周縁ははっき　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　周縁は滑らか　　りしている。光沢な　　り
している。光沢な　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　し。乳白色。　　
　　　　　　し。乳白色。 グラム染色　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　
　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　
　−芽胞　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　
　　　　　　−運動性　　　　　　　　　　　　　　　
　　　＋　　　　　　　　　　　　−又は＋　　　　　
　　　　　　　＋鞭毛　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　周毛　　　　　　　　１〜４本の極毛　　　
　　　　　周毛ウレアーゼ　　　　　　　　　　　　　
　−　　　　　　　　　　　　　　Ｎ．Ｄ．　　　　　
　　　　　　　　　−オキシダーゼ　　　　　　　　　
　　　−　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　
　　　　　　　　　　−カタラーゼ　　　　　　　　　
　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　
　　　　　　　　　　　　＋ＯＦテスト　　　　　　　
　　　　　　　Ｆ型　　　　　　　　　　　　Ｎ．Ｄ．
　　　　　　　　　　　　　　Ｎ．Ｄ．酸素に対する態
度　　　　通性嫌気性　　　　　　通性嫌気性又は　　
　　通性嫌気性　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　編性嫌気性至適
生育温度　　　　　　　　　　２１−３９　　　　　　
　　　　　２５−３０　　　　　　　　　　　　　　　
３０−４６　インドール産生　　　　　　　　　　−　
　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　
　　　　　−メチルレッド　　　　　　　　　　　　＋
　　　　　　　　　　　　　　Ｎ．Ｄ．　　　　　　　
　　　　　　　＋Ｖ−Ｐ反応　　　　　　　　　　　　
　　＋　　　　　　　　　　　　　　Ｎ．Ｄ．　　　　
　　　　　　　　　　＋クエン酸塩利用　　　　　　　
　　　−　　　　　　　　　　　　　　Ｎ．Ｄ．　　　
　　　　　　　　　　　＋グルコースからの　　　　エ
タノール　　　　　　　　エタノール　　　　エタノー
ル生産物　　　　　　　　　　　　　　炭酸ガス　　　
　　　　　　　炭酸ガス　　　　　　炭酸ガス、少量の
酸菌体内ＤＮＡ のＧＣ含量（％）　　　　　　５５−５７　　　　　　
　　　　　４７．５−４９．５　　　　　　　　　６３
．５±０．２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　第２表（つづき）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｔ１０９株　
　　　　　Ｚ．　ｍｏｂｉｌｉｓ　　　　　　Ｓ．　ｆ
ｅｒｍｅｎｔａｔｕｓ　　　　　　キノン系　　　　　
　　　　　　　　　Ｑ−９　　　　　　　　　　Ｑ−１
０食塩耐性 　　２．０％　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　
　　　　　　＋　　６．０％　　　　　　　　　　　　
　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　　　　　　　＋　　８．０％　　　　　
　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　
　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　−生育ｐＨ
下限　　　　　　　　　　　　５．１−５．６　　　　
　　　　　　　３．９−４．１　資化性 　　グルコース　　　　　　　　　　　　＋　　　　　
　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　　
　＋　　フルクトース　　　　　　　　　　＋　　　　
　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　　
　　＋　　マルトース　　　　　　　　　　　　＋　　
　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　
　　　　＋　　ソルビトール　　　　　　　　　　＋　
　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｎ．Ｄ．　　マンノース　　　　　　　　　
　　　＋　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　
　　　　　　　　　　Ｎ．Ｄ．酵素 　　α−グルコシダーゼ　　　　＋　　　　　　　　　
　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　Ｎ．Ｄ
．　　β−ガラクトシダーゼ　　−　　　　　　　　　
　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　
アルギニンジヒドロ 　　ラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　
　　　　　　　　　　　Ｎ．Ｄ．　　　　　　　　　　
　　　　＋　　　　　　　　　　　　 【００１２】菌株の同定 本発明による細菌の菌学的性状を要約すると次の通りで
ある。■集落の表面は平滑である。■グルコースからの
生産物はエタノールである。■資化性糖は、グルコース
、フルクトース、マルトース、ソルビトールおよびマン
ノースである。■鞭毛は周毛である。■キノン系はＱ−
９である。■β−ガラクトシダーゼおよびアルギニンジ
ヒドラーゼは産生しない。 【００１３】以上の性状より、前記したＢｅｒｇｅｙ’
ｓ　Ｍａｎｕａｌ　を参考に近縁な既知菌種を検索する
と、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　　
　ｍｏｂｉｌｉｓ　、ＡＴＣＣ１０９８８）が最も類似
していると思われた（この菌種の菌学的性質は第２表に
示される通りである）。しかしながら、Ｔ１０９株とこ
のザイモモナス・モビリスを比較すると、鞭毛、ＧＣ含
量、キノン系、資化性糖の種類に違いが見られた。 【００１４】また、最近報告されたサッカロバクター・
ファーメンテイタス（Ｓａｃｃｈａｒｏｂａｃｔｅｒ　
　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｕｓ　ｇｅｎ．ｎｏｖ．，　ｓｐ
．　ｎｏｖ．　：　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕ
ｒｎａｌ　　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　　　４０，　４１２−４１４
（１９９０）　、この菌株の菌学的性質は第２表に示さ
れる通りである）とＴ１０９株とを比較すると、ＧＣ含
量、β−ガラクトシダーゼ、アルギニンジヒドラーゼ産
性能について違いが認められた。 【００１５】以上の通り、Ｔ１０９株は、ザイモモナス
・モビリスおよびサッカロバクター・ファーメンテイタ
スとは異なった性質を有していることから、新属新種の
細菌であると判断される。 【００１６】培養 本発明による新規グラム陰性細菌の培養は、培地の種類
および培養条件を含めて合目的的な任意のものでありう
る（培地および培養条件の好ましい具体例については後
記実験例参照）。また、その培養によって増殖させて、
所望の菌体量を得ることができる。 【００１７】培地の炭素源としては、本発明による細菌
が同化しうるあらゆるものが利用可能である。具体的に
はグルコース、フルクトース、マルトース、ソルビトー
ル、マンノース、澱粉加水分解物などの糖の外に、該細
菌が利用し得る各種の合成または天然炭素源がある。窒
素源としても同様に、麦芽エキス、ペプトン、大豆抽出
液、肉エキス、酵母エキスなどの有機窒素含有物をはじ
め、該細菌が利用し得る各種の合成又は天然物が利用可
能である。微生物培養の常法に従って、食塩、リン酸塩
などの無機塩類、カルシウム、マグネシウム、鉄などの
金属の塩類、ビタミン、アミノ酸などの微量栄養源も必
要に応じて添加することができる。 【００１８】培養温度は２１〜３９℃、好ましくは２５
〜３７℃である。培養ｐＨは５．０〜８．５、好ましく
は５．５〜６．５であり、１日〜７日間嫌気的に攪拌又
は振とうしながら培養を行う。 【００１９】エタノールの製造 本発明による新規グラム陰性細菌を用いたエタノールの
製造法は、本発明による新規グラム陰性細菌をマルトー
スおよび／または澱粉加水分解物を含有した培地で培養
することからなるものである。さらに、本発明によるエ
タノールの製造法にあっては、本発明による新規細菌が
分類学上属することとなる属と同一の属に属する細菌で
あってエタノール産性能を有するものを用いることもそ
の一態様として本発明に包含される。 【００２０】本発明による新規グラム陰性細菌は主にグ
ルコースを資化してエタノールを産生する能力を有する
とともに、α−グルコシダーゼを産生する能力を有する
。培地中に産生されたこのα−グルコシダーゼは、マル
トースさらには澱粉加水分解物を分解してグルコースと
する。こうして分解されたグルコースもまた本発明によ
る新規グラム陰性細菌に資化されてエタノールとするこ
とが可能であることから、本発明によるエタノールの製
造法は資化性糖の範囲が広く有利である。 【００２１】エタノールの産生に好ましい培養条件とし
ては、温度が２１〜３９℃、好ましくは２５〜３７℃で
、ｐＨが５．０〜８．５、好ましくは５．５〜６．５の
範囲にあるのがよい。また、原料たるマルトースおよび
／または澱粉加水分解物の濃度は、１．０〜３０（Ｖ／
Ｖ）　％好ましくは、１０〜１５（Ｖ／Ｖ）　％の範囲
にあるのがよい。 【００２２】以上のような条件下で、本発明による新規
グラム陰性細菌は、公知のザイモモナス属に属する細菌
のそれとほぼ同等かもしくはそれ以上のエタノール産性
能を示す。例えば、本発明の具体例のひとつである前記
Ｔ１０９株は、マルトース１５．０（Ｗ／ｖ）　％、リ
ン酸一カリウム０．２（Ｗ／ｖ）　％、酵母エキス１．
０（Ｗ／ｖ）％を含んでなる液体培地中において、初菌
数１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌレベルで、ｐＨ６．０、３０
℃で静置培養したとき、少なくとも７．０（Ｗ／ｖ培養
液）　％のエタノールを生産することができる。培養液
からのエタノールの回収は、蒸留、抽出、膜分離などの
公知の手段を用いて行えばよい。 【００２３】また、本発明による新規グラム陰性細菌は
α−グルコシダーゼを産生することか、培地中でマルト
ース、澱粉加水分解物を分解してグルコースを生成する
。ここで、マルトースを資化しないがグルコースを資化
してエタノールを産生する細菌を更に培地中に存在させ
て混合培養することにより、効率のよいエタノールの製
造を行うことができる。マルトースを資化しないがグル
コースを資化してエタノールを産生する細菌の具体例と
しては、ザイモモナス属に属する細菌、例えばＺｙｍｏ
ｍｏｎａｓ　　　ｍｏｂｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ１０９８８
などが挙げられる。 【００２４】 【実施例】［実験例］実験例１　　菌株の取得植物の樹
液を下記の組成の集積培地に接種した。 集積用培地組成：ｐＨ６．５ 酵母エキス　　　　　　　　　　　　　　　　１．０（
Ｗ／Ｖ）　％（オキソイド社製） ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　０．２（Ｗ
／Ｖ）　％マルトース　　　　　　　　　　　　　　　
　２．０（Ｗ／Ｖ）　％エタノール　　　　　　　　　
　　　　　　　５．０（Ｖ／Ｖ）　％カビシジン（Ｋａ
ｂｉｓｉｄｉｎ）　　　　１００ｐｐｍ（Ｗ／Ｖ）エリ
スロマイシン　　　　　　　　　　１ｐｐｍ（Ｗ／Ｖ）
【００２５】次いで、これを３０℃で２〜３日間培養し
、生育および著量のガス産生が認められた培養液を、下
記組成の分離用寒天平板培地に塗布した。 分離用寒天平板培地：ｐＨ６．５ 酵母エキス　　　　　　　　　　　　　　　　１．０（
Ｗ／Ｖ）　％（オキソイド社製） （ＮＨ４）２・７Ｈ２Ｏ　　　　０．２（Ｗ／Ｖ）　％
ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　０．２（Ｗ
／Ｖ）　％マルトース　　　　　　　　　　　　　　　
　２．０（Ｗ／Ｖ）　％カビシジン（Ｋａｂｉｓｉｄｉ
ｎ）　　　　１００ｐｐｍ（Ｗ／Ｖ）寒天　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１．５（Ｗ／Ｖ）　
％【００２６】嫌気条件下に３０℃で２〜３日間培養し
、出現したコロニーを上記寒天平板培地に画線培養し、
純粋分離を行った。純粋分離後、再度、寒天平板培地に
塗布すると共に、顕微鏡観察を行って、純化を確認した
。 上記菌株の形態的性質、各種培地上での性状および生理
学的性質は、前記の通りであった。これを新規グラム陰
性細菌Ｔ１０９株とした。 【００２７】実験例２　　エタノールの製造前記実験例
１で得たＴ１０９株を利用して、マルトースからエタノ
ールを製造した。まず、前記集積用培地に示す組成の培
地に前記菌株を接種し、３０℃で２４時間静置培養した
。この培養液を前記分離用寒天平板培地に示す組成の培
地に１０（Ｗ／Ｖ）　％量接種して、３０℃で２４時間
静置培養し、この培養液を前培養液とした。 【００２８】この前培養液を、糖濃度１５０ｇ／リット
ルのマルトース培地に１０（Ｗ／Ｖ）　％量接種し、３
０℃あるいは３７℃で静置培養した。以上のようにして
培養した培養液を前記マルトース培地のマルトース濃度
を４、８、１２、１５および１９％とした培地に１．０
（Ｗ／Ｖ）　％量接種して、初菌数が１０５　ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌ程度となるようにして３０℃で培養し醗酵特性
を調べた。その結果は図１に示される通りである。 【００２９】また、Ｔ１０９株に換えてザイモモナス属
細菌として（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　　　ｍｏｂｉｌｉｓ
）（Ｂ６９）を用いて前記マルトース培地のマルトース
濃度を１５（Ｗ／Ｖ）　％とした培地で培養を行う実験
と、Ｔ１０９株にさらに前記ザイモモナス属細菌Ｂ６９
を加えて培養を行う実験を行った。その結果は図２に示
される通りである。図２から、ザイモモナス属細菌Ｂ６
９との混合培養によって更にエタノール生産性が向上す
ることが分かる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による新規グラム陰性細菌のマルトース
濃度に対するマルトース醗酵特性を示す図。

【図２】本発明による新規グラム陰性細菌とザイモモナ
ス属細菌Ｂ６９との混合培養によるエタノール生産の結
果を示す図。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞形態が桿菌、周毛を有し、芽胞不形成
   であり、キノン系がＱ−９、マルトース、ソルビトール
   およびマンノース資化性を有し、α−グルコシダーゼを
   産生するがβーガラクトシダーゼ、アルギニンジヒドラ
   ーゼを産生しない、通性嫌気性グラム陰性細菌。
2. 【請求項２】グルコースを資化してエタノールを産生す
   る、請求項１記載の通性嫌気性グラム陰性細菌。
3. 【請求項３】培地中にα−グルコシダーゼを分泌し、マ
   ルトースをグルコースに分解し、これを菌体内に取り込
   みエタノールを産生する、請求項１記載の通性嫌気性グ
   ラム陰性細菌。
4. 【請求項４】澱粉加水分解物からエタノールを産生する
   、請求項１記載の通性嫌気性グラム陰性細菌。
5. 【請求項５】マルトース１５．０（Ｗ／ｖ）　％、リン
   酸一カリウム０．２（Ｗ／ｖ）　％、酵母エキス１．０
   （Ｗ／ｖ）　％を含んでなる液体培地中において、初菌
   数１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌレベルで、ｐＨ６．０、３０
   ℃で静置培養したとき、少なくとも７．０（Ｗ／ｖ培養
   液）　％のエタノールを生産する、請求項１記載の通性
   嫌気性グラム陰性細菌。
6. 【請求項６】Ｔ１０９株（微工研条寄第３２９２号）で
   ある、請求項１記載の通性嫌気性グラム陰性細菌。
7. 【請求項７】請求項１〜６いずれか一項記載細菌と同一
   の属に属する細菌を、マルトースおよび／または澱粉加
   水分解物を含有する培地で培養することを含んでなる、
   エタノールの製造法。
8. 【請求項８】ザイモモナス属に属する細菌を更に存在さ
   せてなる、請求項７記載のエタノールの製造法。