JPS589673B2 - ビセイブツキンタイノセイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な微生物により菌体を製造する方法に関す
る。

さらに詳しくはシュードモナス・デンテイフオルミスあ
るいはアルカリゲネス・オートニトリフイカンスに属し
水素ガスをエネルギー源として独立栄養的に生育できる
細菌を水素ガスを主たるエネルギー源として培養し、培
養液から菌体を分離することを特徴とする菌体の製造法
に関する。

従来、菌体の製造原料としては糖蜜、亜硫酸パルプ廃液
、ｎ−パラフィンなどが取り上げられてきた。

しかしながら本発明者らはこれらの物質が廃酵原料とし
ては将来的に、供給量、価格などの点で問題があると考
え、将来安定供給のはかれる原料として水素ガスを取り
上げて、これを原料とする微生物菌体の製造法について
鋭意研究を行った。

その結果、新らたに自然界より分離したシュードモナス
属およびアルカリゲネス属に属する一菌種が、この目的
にかなうものであることを発見し、この知見に基づいて
本発明を完成した。

本発明に用いる菌株は、以下に示すように、その菌学的
性質によれば、シュードモナス属およびアルカリゲネス
属に属すると考えられるが、シュードモナス属およびア
ルカリゲネス属に属する公知の菌種と、後で詳述するよ
うに比較した場合に、種々の点で相違がある。

したがって新菌種であることが明白であり、これをシュ
ードモナス・デンテイフオルミス（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｄｅｎｔｉｆｏｒｍｉｓ ｎｏｖ−ｓｐ− ）
およびアルカリゲネス・オートニトリフイカンス（ Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ａｕｔｏｎｉｔｒｉｆｉｃａｎ
ｓ ｎｏｖ− ｓｐ− ）と命名した。

即ち、本発明はシュードモナス・デンテイフオルミスあ
るいはアルカリゲネス・オートニトリフイカンスに属し
、水素ガスをエネルギー源として生育しうる菌株を、水
素ガスを主なエネルギー源として培養し菌体を増殖させ
、該菌体を採取することを特徴とする菌体製造方法であ
る。

以下に本菌種のうち代表的な菌株であるシュードモナス
デンテイフオルミスＡＪ３９４１（微工研菌寄第３１７
９号）の菌学的性質を示す。

シュードモナス・デンテイフオルミス（ Ｐ ｓｅｕｄ
ｏｍｏ−ｎａｓ ｄｅｎｔｉｆｏｒｍｉｓ ｎｏｖ・ｓ
ｐ・） ＡＪ ３ ９ ４ １細胞形態：（無機合成培
地に独立栄養的に４８時間培養）０，４〜０．６×１．
５〜２０ミクロンの単独あるいは対になった桿菌。

運動性あり（極鞭毛）。ダラム陰性。

胞子形成せず、非抗酸性で細胞の多形性は認められない
。

コロニー形態＝（無機合成培地平板に独立栄養的に８日
間培養）不規則な形態で、平滑、周縁は鋸菌状、平板状
、半透明、灰白色で直径５〜６ｍｍカロチノイド色素二
有さない 肉汁寒天培養：良好な生育、平滑、周縁は鋸歯状、灰白
色、半透明 肉汁液体培養：良好な生育、液は白濁、色素生成なし、
沈渣有り 肉汁ゼラチン穿刺培養二上部に生育、好気的、液化する
。

リトマスミルク：変化せず。

澱粉の分解性：陽性 カタラーゼ活性：陽性 オキシダーゼ活性：陽性 脱窒反応：陰性 ＭＲテスト：陰性 ｖｐテスト：陰性 インドールの生成：なし 無機窒素源：利用する 色素の生成：無し ０−Ｆテスト：変化無し ウレアーゼ活性：陽性 硫化水素の発生二弱陽性 硝酸塩からの亜硝酸の生成二陽性 クエン酸の利用性：利用性はあるがあまり強くない。

最適温度：３０〜３７℃、４０℃で生育しない．最適ｐ
Ｈ：６．０〜７，５ 酸素に対する性質：好気性 生育因子の必要性：生育因子として有機化合物は必要と
しない。

独立栄養的生育：水素ガス、炭酸ガス、酸素ガスを含有
する気体中で独立栄 養的に生育する。

各種糖類から酸及びガスの生成の有無：マンノースから
酸及びガスを生成せず、又グリコース、フラクトース、
アラビノース、キシロース、シュークロース、トレハロ
ース、マルトースかラ酸ヲ生成せず。

炭素源の資化性：グルコース、マンノース、マルトース
、クエン酸、コハク 酸、酢酸、バラヒドロキシ安 息香酸、フェノール、グリセ ロール、エタノールは資化さ れる。

ラクトース、アラビノース、 キシロース、トレハロース、 マロン酸、蓚酸、蟻酸、メタ ノールは資化しない。

分離源：土壌 本菌株は上述の如く、グラム陰性、極鞭毛を有する好気
性桿菌であることによりシュードモナス属に属すると考
えられる。

本菌株の大きな特徴は、独立栄養的に生育すること、ゼ
ラチンの加水分解、澱粉の加水分解を行なうことなどで
ある。

独立栄養的に生育できる公知のシュードモナス属菌種の
中ではデービスらの報告（Ｄ−Ｈデービス、Ｒ．Ｙスタ
ニア、Ｍ・トードルフ：アルヒーフフユアミクロビオロ
ギー第７０巻、１−１３ １９７０年）によればシュ
ードモナスサツカロフイラ（ Ｐｓｅｕｄ一ｏｍｏｎａ
ｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ ）は澱粉の加水分解
を行なうが、ゼラチンの加水分解を行なわず、またシュ
ードモナス ファシリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆ
ａｃｉｌｉｓ ）はゼラチンの加水分解は行なうが、澱
粉の加水分解は行なわないとされており、パージエイズ
・マニュアル オブデターミナテイブ バクテリオロジ
ー（ Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔ−６ｒｉｏｌｏｇｙ 第８版にも独立栄養的に生育し澱粉の加水分解活性およ
びゼラチンの加水分解活性の両方を有している菌種は知
られていない。

またコロニー形態も特異的であり、本菌株は新菌種と断
定し、鋸歯状のコロニーを形成することからシュードモ
ナスデンテイフオノレミス（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｄｅｎｔｉｆｏｒｍｉｓｎｏｖ− ｓｐ− ）と命名
した。

次にもう一種の菌株であるアルカリゲネスオートニトリ
フイカンスの菌学的諸性質を以下に示すＡｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ ａｕｔｏｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ｎｏｖ−
ｓｐ− ａｔｒａｉｎ Ｍ１５（アルカリゲネス オ
ートニトリフイカンス分離番号Ｍ１５）微工研菌寄第３
１８０号（ＡＪ−形態的特徴 ダラム陰性、運動性を有する桿菌、０．６〜０．８×２
．５〜４．０ミクロン長い周鞭毛を有している。

細胞の多形性なし、胞子形成なし、非抗酸性。

イーストエキストラクト０．４％、マルツエキストラク
ト１．０％、グルコース０．４％の寒天培地上で生育さ
せた場合の若い細胞には、スダンブラックＢで染色され
る類粒が見られるのが特徴である。

肉汁寒天培養：生育せず 肉汁液体培養：生育せず 肉汁ゼラチン穿刺培養：生育せず コロニーの形態 水素をエネルギー源、炭酸ガスを炭素源として独立栄養
的に無機合成培地上で１４日間生育させた場合のコロニ
ー形態は、円形、直径３ｍｍ程度、表面は平滑で、半レ
ンズ状であり、周縁部は全縁であり、黄灰色で不透明で
ある。

また肉汁寒天上で１０日間生育させた場合は、花状、皺
状、円錐状、鋸歯状、類粒状で直径１ｒＩＬｍ程度の黄
色、不透明のコロニーを形成した。

生理的性質 水素を酸化するエネルギーを利用して炭酸ガスを固定し
、独立栄養的に生育する。

カタラーゼ活性：陽性 オキシダーゼ活性：陽性 ウレアーゼ：陰性 ０−Ｆテスト：変化せず デンプンの加水分解活性：陰性 ゼラチンの加水分解活性：陰性 リトマスミルク：変化せず 硫化水素の生成：陰性 硝酸塩からの亜硝酸の生成：陽性 脱窒反応：陰性 ＭＲテスト：陰性 ＶＰテスト：陰性 インドールの生成：陰性 無機窒素源の利用：利用する 色素の生成：無し。

Ｈ２をエネルギー源、炭酸ガスを炭素源として独立栄養
的に生育する場合に、窒素ガスを唯一の窒素源とするこ
とができる。

各種糖類から酸及びガスの生成は認められない。

コハク酸、酢酸、メタノール、エタノールおよびグリセ
ロールの資化性がある。

クエン酸を利用せず、又グルコン酸、マロン酸、蓚酸、
蟻酸、パラおよびメタヒドロキシ安息香酸、およびフェ
ノールの資化性は認められなかった。

好気性 生育至適ｐＨ範囲は５．５〜７．５ 生育適温３０〜３５℃、３７℃でも生育する。

ＤＮＡのＧＣ含量 ６４．４％ 本菌は形態的および生理的特徴より、アルカリゲネス属
に属する菌株と考えられる、アルカリゲネスに属する水
素細菌として、バージエイス・マニュアル第８版にはア
ルカリゲネス・ユートローハス（ Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ ）およびアルカリゲネス・
バラドクサス（ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｐａｒａｄ
ｏｘｕｓ ）が記載されているが、本菌は力ロチノイ
ド色素を有さない点からアルカリゲネス・バラドクサス
とはことなっており糖の資化性を有さないこと、空中窒
素の固定能を有すること メタノールの資化性を有する
ことパラおよびメタヒドロキシ安息香酸、フェノールな
どの資化性がないことからアルカリゲネス・ユートロー
ハスとは異っている。

また鞭毛の着生状態においても、アルカリゲネス・ユー
トローハスは鞭毛の本数の少ない、いわゆるｄｅｇｅｎ
ｅｒｔｅ ｐｅｒｉｔｒｉｃｈｏｕａ ｆｌａｇｅｌｌ
ａであるのに対し、本菌は通常の周鞭毛ｐｅｒｉｔｒｉ
ｃｈｏｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａである点も異なり、アル
カリゲネスに属する新菌種と考えてよい。

また、空中窒素固定能を有する犬山ら特開昭４８−３３
０８３のヒドロゲノモナス属の菌株やゴゴトフラ（アル
ヒーフ・フェア・ミクロビオロギ−９７、３５９−３６
２（１９７４））の菌株とは運動性を有すること、カロ
チンイド色素を生成しないことなど大きく異なっており
、本菌株は従来知られていない水素細菌であり、本発明
者らはアルカリゲ゛ネス・オートニトリフイカンスと命
名した。

次に本発明の実施方法について述べる。

本発明に使用する微生物は、シュードモナス・デンテイ
フオルミスあるいはアルカリゲネス・オートニトリフイ
カンスに属する微生物であり、たとえば前者はＦＥＲＭ
Ｐ−３１７９、後者はＦＥＲＭＰ−３１８０などで
ある。

培地は少なくとも炭素源、窒素源、無機塩類を含むもの
を用いる。

炭素源としては通常炭素ガスを用いるが、グルコース、
酢酸、メタノール等の有機炭素源を用いてもよく、又、
炭酸ガスと有機炭素源を併用してもよい。

炭酸ガスは水素ガス等と同様通気によって供給してもよ
く、あるいは重曹などの形で培地に添加してもよい。

窒素源はアンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物
、あるいはコーンステイープリカー、ペプトン、酵母エ
キスなどの有機窒素化合物を用いる。

無機塩類はリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、
鉄塩などを用いる。

さらに必要に応じてビタミン類などの生育促進物質を添
加してもよい。

培養温度は、２０〜３８°Ｃ、好ましくは３０〜３７℃
および培養ｐＨは５〜９、好ましくは６〜８である。

培地は密閉可能な容器に入れ、殺菌後、微生物を接種す
る。

容器内の気相には少なくとも水素ガス、酸素ガスを含む
ように、これらのガス類を導入する。

酸素ガスの代りに空気を使用してもよい。ガス中にはこ
れらの他に微生物の生育を阻害しない不純物を含んでい
ても差支えない。

培養方法としては、容器にガス類を導入後、密閉し静置
、振とうを行なってもよいが、通気撹拌により培養する
のが望ましい。

また培養形式は回分培養、または連続培養のいずれでも
よい。

生育した菌体は、遠心分離法等適当な方法で回収する。

また培養液上澄より代謝生産物を回収することも可能で
ある。

得られた菌体は粗タンパク含量８０％以上で、きわめて
良質のタンパク質を含んでいる。

このように、本発明は少なくとも水素ガスが存在すれば
、その他のエネルギー源が存在しなくとも容易に微生物
菌体を製造することを可能ならしめるものである。

以下、さらに詳細に実施例をもって説明する。

実施例 １ 培地として、（ ＮＨ４ ） ２ ｓｏ４２ ｇ／ ｌ
ＫＨ２ＰＯ４０．３ ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４ １
２Ｈ，２０ １．８ ｇ／ＩＭｇＳ０４・７Ｈ２Ｏ０．
２ｇ／ＬＦｅＳ０４・７Ｈ２０１０ｍｇ／ｌ、ＣａＣｌ
２・２Ｈ２Ｏ１０ｍｇ／ｌ、脱イオン水１ｌｐＨ７．２
の組成のものを５００ｍｌ容振量フラスコに２０ｍｌ宛
入れ、殺菌後、シュードモナス・デンテイフオルミスＡ
Ｊ３９４１を接種しフラスコ内の気相をＣＯ２１０％、
Ｈ２７０％、０２２０％の混合ガスに置換し、密閉後３
５℃で振盪培養した。

培養１５時間目まで生育速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏ
ｗｔｈ ｒａｔｅ ） ０． ２ ５ ｈｒ−１で対数
的生育がみられ，３６時間培養後にフラスコ内の培養液
１０ｍｌをとり遠心分離により菌体を回収し、乾燥して
１７．５■の乾燥菌体を得た。

この菌体の窒素含量は１３．０７％で、粗蛋白含量は８
１．７％であった。

実施例 ２ 実施例１と同様の培地４００ｍｌを１ｌ容小型ガラス製
ジャーファーメンターに入れ、殺菌後シュードモナス
デンテイフオルミスＡＪ３９４１を接種し、ＣＯ２１０
ｍｌ／ｍｉｎ、Ｈ２７０ｍｌ／ｍｉｎ、酸素２ ０ ｍ
ｌ／ ｍｉｎ ，を通気し、１ ４ ０ ０ ｒｐｍで
撹拌した。

培養温度は３５℃で行い、培養途中で、菌の生育に伴い
培地のｐＨが低下したが、窒素源の補給を兼ねてアンモ
ニアガスにてｐＨを６．５に調整しつつ培養した。

培養４８時間後の培養液１００ｍｌをとり、遠心分離に
より菌体を回収し、乾燥して９５０ｍｇの乾燥菌体を得
た。

この菌体のアミノ酸組成は表１の通りであった。

実施例 ３ 実施例２と同様に小型ジャーファーメンターにより回分
培養を行い、培養３６時間目より実施例１と同様の培地
で希釈を行い連続培養に入った。

培地による希釈率は０． １ ｂｒ−１にとったところ
、培養７２時間目より定常状態に入り、その後２週間培
養を継続した。

この間、培養液中の菌濃度は乾燥菌体で６．３ｇ／ｌに
維持することができ、菌体の対消費水素収率は１．９ｇ
菌体／．９Ｈ２、対消費炭酸ガス収率は０．５８ｇ菌体
／ｇＣＯ２、また対消費炭酸ガス収率０．４５ｇ菌体／
ｇ０２であった。

さらに菌体生産速度は０．６ ３ｇ／ｌ／ｈｒであった
。

実施例 ４ 実施例１と同様の培地を使用し、殺菌後アルカリゲネス
・オートニトリフイカンスＡＪ ３ ９ ４ ２を接種
し、実施例１と同様の方法でフラスコ内の気相をＣＯ２
１０％、Ｈ２７０％、０２２０％の混合ガスに置換し、
密閉後３５℃で振盪培養した。

培養１５時間目まで生育速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒ
ｏｗｔｈ ｒａｔｃ）０． ２ ３ ｈｒ＝で対数的生
育がみられた。

３６時間後にフラスコ内の培養液１０ｍｌをとり遠心分
離により菌体を回収し、乾燥して１６．８■の乾燥菌体
を得た。

この菌体の窒素含量は１１．７％で、粗蛋白含量は７３
．１％であった。

実施例 ５ 実施例１と同様の培地４００ｍｌを１ｌ容ガラス製ジャ
ーファーメンターに入れ、殺菌後アルカリゲネス オー
トニトリフイカンスＡＪ ３ ９ ４ ２を接種し、Ｃ
Ｏ２ １ ０ ｍｌ／ ｍｉｎ ， Ｈ２ ７ ０ ｍ
ｌ／ｍｉｎ、０ ２ ２ ０ ｍｌ／ｍｉｎを通気し、
１ ４ ０ ０ ｒｐｍで撹拌しつつ培養した。

培養温度は３５℃で行い、培養途中で菌の生育に伴い、
培地のｐＨが低下したが窒素源の補給を兼ねてアンモニ
アガスにてｐＨを６．８に調整しつつ培養した。

培養４８時間後の培養液１００ｍｌをとり遠心分離によ
り菌体を回収し乾燥して８４０ｒｎ９の乾燥菌体を得た
。

この菌体のアミノ酸組成は表２の通りであった。

実施例 ６ 実施例５と同様に小型ジャーファーメンターにより、ア
ルカリゲネス オートニトリフイカンスＡＪ３９４２の
回分培養を行い、培養４０時間目より実施例１と同様の
組成の培地で希釈を行い、連続培養に入った。

培地による希釈率を０．１ｈｒ−１にとったところ、培
養８０時間目より定常状態に入り、その後２週間培養を
継続した。

この間、培養液中の菌濃度は乾燥菌体で５．２ｇ／ｌに
維持することができ、菌体生産速度は０．５ ２ ｇ／
ｌ／ ｈｒであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 水素ガスを主なエネルギー源として少くとも炭素源
   、窒素源、無機塩類を含む栄養培地にシュードモナス・
   デンテイフオルミスあるいはアルカリゲネス・オートニ
   トリフイカンスを培養して菌体を生成せしめ、採取する
   ことを特徴とする微生物菌体の製造方法。