JPH04282301A - 生物試料の急速凍結方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は受精卵、血液細胞等の生
物試料を凍結保存しておき、これを随時解凍することで
、所要の目的に使用できるようにするため、当該生物試
料を急速に凍結する方法の改良に関する。

【０００２】

【従来の技術】既知の通り、上記生物試料を保存するた
めの凍結手段としては、次の二方法がある。

【０００３】第１の常法ともいうべき方法は、生物試料
に既知のＤＭＳＯとか、グリセロールなどの凍害防止剤
を投入すると共に、緩慢な冷却速度にて凍結させるもの
である（例えば、Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ
．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８７：４１１，１９７２）。

【０００４】しかし、上記方法によるときは、当然凍結
に長時間を要し、これを保存後、使用に際しての解凍処
理には、前記凍害防止剤を除去しなければならない。

【０００５】第２の方法では、生物試料を極めて急速に
、冷却すると生物試料の細胞内はガラス様に凍結され、
前記の凍害防止剤を用いることなしに、細胞障害の少な
い凍結が可能となるものである（酒井昭、培養細胞、癌
細胞の超急速冷却、凍結保存、９−１５、１９８９、朝
倉書店）。

【０００６】ここで、上記第２の急速凍結方法の具体的
手段としては、以下のような３つの手段が既に知られて
いる。

【０００７】第１の具体的手段は、銅などの金属ブロッ
クを液体ヘリウム等によって冷却し、当該冷却金属ブロ
ックに対して、生物試料を圧着させるようにした「金属
接触法」（Ｊ．Ｅ．Ｈｅｕｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．
Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，８１，１９７９）　である。

【０００８】しかし、この第１手段によるときは、熱交
換媒体としての上記冷却用金属は、その比熱が小さいた
め、生物試料との接触面にあって、冷却金属の温度上昇
が大きく、充分な冷却速度が得られないといった課題が
ある。また、操作性の点でも、当該金属接触法によると
きは前記の圧着時に試料の破損の問題が生じ、解凍操作
に際しても、冷却金属からの速やかな回収が困難となる
ため、生物試料の凍結保存のために実用に供することが
困難であり、このため急速な解凍を要求されることのな
い電子顕微鏡用の試料作成時に際し、その凍結固定法と
して実用化されているに過ぎないといえる。

【０００９】第２の具体的手段は、生物試料を液化プロ
パンまたはフレオン等の冷媒に浸漬する方法（Ｈ．Ｍｏ
ｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１７
，１９６３；Ｌ．Ｂａｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６８，１
９７１　）であるが、当該「冷媒浸漬法」による時は、
当該試料の表面に液冷媒の気化により生じた蒸気膜が形
成されてしまい、このために蒸気膜が伝熱達抵抗となり
、充分な冷速速度が得られない欠点がある。

【００１０】第３の具体的手段は、生物試料を微小水滴
にして噴霧し、これを冷却ガスと接触させる方法（Ｎ．
Ｓａｋａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｌｏｗ　Ｔｅｍｐ．Ｍｅｄ
．，１４，１９８８）であり、この場合には気体である
冷却ガスでは、大きな熱伝達係数が得られないことから
、やはり超急速凍結の実現は困難となり、しかも当該「
ガス接触法」によるときは生物試料が大である場合、こ
れを噴霧することができないという問題もある。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】請求項１の方法では、
熱交換媒体として固体窒素を用い、これと生物試料を接
触させることによって、冷却速度を大きくすることで高
濃度の凍害防止剤を用いることなしに生物試料の超急速
凍結を可能とし、かつ解凍速度も大きくできるようにし
て生物試料の生存率を向上させ、さらに操作性の点でも
、単に暖めるだけで、固体窒素を液化、さらに気化させ
ることができるので、試料を容易に回収することができ
、迅速にして簡易な処理を可能にしようとするのが、そ
の目的である。

【００１２】請求項２では、請求項１の上記固体窒素を
、その凝固点にあって用いるのでなく、これよりも温度
の低い液体ヘリウムによって冷却しておくことで、冷却
速度を一層高めようとしている。

【００１３】請求項３では、請求項１の固体窒素と生物
試料との接触手段につき、これを特定することにより、
請求項１の方法が、より確実に行い得るようにしている
。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は上記の目的を達
成するため、請求項１では断熱条件下で、液体窒素の凝
固点以下の温度に保持されている固体窒素の表面と、受
精卵や血液細胞等の生物試料とを、直接または間接に接
触させるようにしたことを特徴とする生物試料の急速凍
結方法を提供しようとしている。

【０００１５】請求項２では、上記固体窒素の温度が、
液体窒素の凝固点よりも低い凝固点を有する液体ヘリウ
ムによって制御されていることを内容としている。

【０００１６】請求項３は、上記固体窒素と生物試料と
の接触が、当該生物試料をもった水滴を滴下させるか、
生物試料をノズル様口から噴霧させるか、生物試料が付
着されている支持担体を落下させるか、生物試料に固体
窒素を能動的に押当させるかによりなされることを内容
としている。

【０００１７】

【作用】請求項１の方法によるときは、固体窒素に生物
試料を接触することで、当該固体窒素の比熱が、銅ブロ
ックの１４０倍であることから、生物試料との接触面に
あって、固体窒素の温度が急上昇してしまうことなく、
また、固相から液相への転移と、液相から気相への転移
に伴う潜熱（夫々２５．７５Ｊ／ｇ、１９８．９５Ｊ／
ｇ）を利用できることとなるため、この点からも試料の
接触による温度上昇が最小限に抑止される。解凍操作に
際しては、加温条件下におくだけで、固体窒素が先ず液
化し、さらに暖めることで気化してしまうので、簡易、
迅速に生物試料を単離することができ、上記の気化が完
了するまで液体窒素温度を上回ることなく、単離状態と
なった生物試料のみを所望温度まで昇温させればよいの
で、当該昇温は極めて急速に行うことができ生存率の高
い解凍が可能となる。

【００１８】請求項２では、請求項１の方法を実施する
に当たり、液体ヘリウムにより冷却された固体窒素が用
いられるので、固体窒素はその温度が、さらに低い液体
ヘリウムの温度に保持され、より低温の熱交換媒体によ
る冷却により、超急速凍結が実現される。

【００１９】請求項３によるときは、請求項１の方法を
実施するに際し、固体窒素と生物試料との接触が、これ
までも接触手段として用いられて来た、前記の４方法に
より行われることとなるので、信頼性の高い接触状態を
確保することができる。

【００２０】

【実施例】本発明につき図面を参照して以下詳記すれば
、先ず、その実施例に用いられることになる固体窒素を
得るためには、液体窒素をその凝固点（６３．１Ｋ）以
下に冷却するか、液体窒素を減圧することとなる。ここ
で、より速い冷却速度が得られるようにするには、でき
るだけ低い温度の固体窒素が要求されることとなるから
、もちろん、液体窒素を凝固点以下に冷却する方が望ま
しく、このため、上記の冷却方法としては、液体窒素の
凝固点以下の温度の冷媒で冷却するのが望ましく、上記
冷媒としては、できるだけ低い沸点のものがよいことか
ら、液体ヘリウム（４．２Ｋ）を用いるのがよい。

【０００２１】本考案を実施するためには、上記の固体
窒素を所望の極低温状態に維持しておく必要があり、こ
のような観点から図１のような急速凍結装置を用いるこ
とができる。この装置は外槽１と内槽２とからなる、真
空断熱層２ａを有する液体ヘリウム槽２ｂと、当該ヘリ
ウム槽２ｂに着脱可能なるよう内装した硝子製の導管２
ｃとを具備している。

【０００２２】導管２ｃの延出上端部２ｄに被嵌された
シールキャップ２ｅには、供給管２ｆ，２ｆが気密に貫
設されていて、その一方の上端口は直接に、他方の上端
口は開閉バルブ２ｇを介して、何れも試料注入器３と連
結パイプ３ａによって連通され、さらに、当該導管２ｃ
の下端部には、着脱自在なるよう試料受器４が被嵌され
、この試料受器４に固体窒素ＳＮ２　を収納するのであ
り、前記の液体ヘリウム槽２ｂに内装したガラス製の導
管２ｃの昇降動操作によって、液体ヘリウムＬＨｅの液
面Ｈに対し、固体窒素ＳＮ２　の上面Ｓを適度な高さに
調整できるようにしてある。

【００２３】この急速凍結装置を用意するに際しては、
固体窒素を極低温に維持するため、可能な限り室温から
断熱すべきであり、それには適切な断熱材を用いたり、
前記の真空断熱層２ａを形成するのがよく、また、固体
窒素ＳＮ２を収納保持することとなる試料受器４及び導
管２ｃは、これに室温から熱が侵入しないようにするた
め、熱伝導率の小さい材質により形成するのがよい。一
方、生物試料Ｔは、その凍結開始以前にあって、緩慢凍
結を起こすことのないように当該生物試料Ｔの凝固点以
上の温度を維持できる位置、望ましくは図示の如く室温
条件下に設置した試料注入器３内に位置させておくのが
よい。

【００２４】上記の急速凍結装置を用いて本発明を実施
するには、第１図の状態にあって試料注入器３のピスト
ン３ｂを押入することで、開閉バルブ２ｇを閉じておく
ことにより、生物試料Ｔが連結パイプ３ａから導管２ｃ
内に挿入されている一方の供給管２ｆを通り、その下端
から固体窒素ＳＮ２　の上面Ｓに落下する。これにより
、生物試料Ｔは固体窒素ＳＮ２　と接触されることとな
るが、この際固体窒素ＳＮ２　は液体ヘリウムＬＨｅに
より固体窒素ＳＮ２　の凝固点ではなく、液体ヘリウム
ＬＨｅの凝固点近くまで冷却されており、従って、当該
生物試料Ｔは瞬間的に凍結されることとなる。

【００２５】上記の凍結が終れば、この状態で保存して
も、また前記の試料受器４だけを導管２ｃから外して、
所定の冷却保存箇所に貯留しておくようにしてもよい。 上記の急速凍結装置によって凍結された生物試料を保存
しておいた場合は、これを解凍して使用するに際し、液
体ヘリウム槽２ｂから導管２ｃを抜き出し、試料受器４
を導管２ｃから外して、これを室温に放置する。このこ
とで、試料受器４内の固体窒素ＳＮ２　は液化し、さら
に、当該液化窒素の蒸発を待ち、これにより単離された
生物試料を、素早く３７℃に保温した解凍用培地に移す
といった工程で解凍操作を行うことになる。

【００２６】何れにせよ、解凍に当っては固体窒素から
生物試料を回収し、当該試料にとって必要な温度まで昇
温させるということになるが、このとき生物試料の回収
は一般に、極めて短時間に行わなければならない。本発
明では、前記実施例のように室温中に取り出すといった
簡易な手段によって加温でき、これだけで固体窒素は液
化され、次いで気化し、この間少なくとも液体窒素の温
度を維持しながら、生物試料を単離できることになる。 また、それ以降の昇温は極めて急速に行わなければなら
ないが、このためには、単離回収した生物試料を素早く
、加温した適当な培養液に投入するなどの手段をとるこ
とができる。

【００２７】本発明にあって、固体窒素と生物試料とを
接触する手段としては、上記の如き急速凍結装置による
だけでなく、（ｉ）生物試料をもった水滴を固体窒素の
上面に液化させるようにしたり（特公昭５２−４２８４
６号、点滴手段）、（ｉｉ）生物試料をノズル様の口か
ら噴霧させたり（特開昭５２−９０６１８号、噴霧手段
）、さらに生物試料を取り付けた支持担体を、固体窒素
の上面に落下させたり、（ｉｖ）固体窒素を能動的に生
物試料に対して接触させるなどの方法を採択することが
できる。

【００２８】上記（ｉ）の点滴手段によるときは、第２
図に示す如く外筒管５に、ノズル５ａと空気噴出口５ｂ
を設けておき、この空気噴出口５ｂから空気Ａを噴出し
ながら、ノズル５ａに生物試料を送液し、上記ノズル５
ａから当該試料Ｔの小さな水滴ｔ（１ｍｍ〜０．５ｍｍ
φ）を落下させることになる。

【００２９】上記（ｉｉ）の噴霧手段は、第３図のよう
に試料用ノズル６ａとキャリアーガス用ノズル６ｂとが
、同軸二層構造にて連結されてなるノズルユニット６を
用い、試料用ノズル６ａに生物試料を送液すると同時に
、キャリアーガス用ノズル６ｂに、その導入口６ｃから
キャリアーガスＣＧを圧送し、両者が交差するノズルユ
ニット６のノズル様口６ｄにて、当該試料を混合噴霧さ
せるものである。

【００３０】上記（ｉｉｉ）の支持体落下による方法で
は、生物試料を銅板、濾紙、繊維、金属メッシュ、ビー
ズ等の支持担体に取り付け、当該支持担体ごと固体窒素
の表面に落下させることとなる。

【００３１】上記（ｉｖ）の方法は、ステージに固定さ
れた前記支持担体に生物試料を取り付け、予め作成した
固体窒素を容器に入れて、この容器ごと素早く引き上げ
ることで、当該固体窒素を上記支持担体の生物試料に接
触させるものである。

【００３２】本発明にかかる方法によって、人の血液の
リンパ球・顆粒球の凍結保存を行った。人の末梢血より
採取した５０ｍｌの全血（抗凝固剤としてヘパリンナト
リウムを５−１０単位／ｍｌ含む）を２５００回転で、
３分間遠心分離を行い、上清の血小板に富む血漿層を取
り除いた後、全量５０ｍｌになるように、ＨＢＳＳ（ハ
ンクス液）を加えた。これを２層のＰｅｒｃｏｌｌ　の
分離液（比重ｄ＝１．０９２５とｄ＝１．０８００）に
重層し３５００回転で、１５分間遠心分離し、上層から
はリンパ球を、下層からは顆粒球を分取した。夫々をＨ
ＢＳＳで３回洗浄して、細胞濃度が２〜５×１０７　個
／ｍｌとなるように１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有
ＲＰＭＩ１６４０培地に再浮遊させた。上記につき生存
率をトリパン青色素排除試験によって判定したところ、
次の如き結果が得られた。すなわち、凍結用培地が、上
記の如くＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＣＳで細胞濃度２
〜５×１０７　個／ｍｌであるとき、細胞種としてのリ
ンパ球・顆粒球の生存率は夫々２７．６％、９１．５％
であった。

【００３３】

【発明の効果】以上説示の通り請求項１の方法は、生物
試料を熱交換媒体としての固体窒素に接触させるように
したから固体窒素の大きな比熱を活用して、生物試料に
よる固体窒素の温度上昇が抑止され、これにより効果的
な超急速凍結を行うことが可能となる。

【００３４】また、固体窒素の固相〜液相転移と液相〜
気相転移とにおける潜熱を利用できることとなるから、
この点からも、生物試料との接触による固体窒素の温度
上昇が抑制され、従って凍結速度を、より一層大きくす
ることができ、このことで、高濃度の凍害防止剤を用い
ることなしに、凍結保存ができる細胞種の範囲を拡大す
ることができる。

【００３５】さらに、操作性の点からも加温するだけで
固体窒素を液化そして気化させ、これだけで、簡易、迅
速に生物試料の単離が可能となり、この間生物試料の温
度変化もなく、生物試料を所望温度とするために要する
時間も大幅に短縮できて急速解凍が可能となることから
、生物試料の生存率を向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る急速凍結方法の実施に用いること
のできる急速凍結装置の一例を示した縦断正面略示図で
ある。

【図２】本発明に係る方法にあって、固体窒素と生物試
料とを接触するために用いられる生物試料の噴射箇所を
示した縦断正面図である。

【図３】図２の噴射箇所の別異例を示した縦断正面図で
ある。

【符号の説明】

６ｄ　　ノズル様口 ＬＨｅ　　液体ヘリウム ＳＮ２　　　固体窒素 ｔ　　水滴 Ｔ　　生物試料

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　断熱条件下で、液体窒素の凝固点以下
   の温度に保持されている固体窒素の表面と、受精卵や血
   液細胞等の生物試料とを、直接または間接に接触させる
   ようにしたことを特徴とする生物試料の急速凍結方法。
2. 【請求項２】　　固体窒素の温度が、液体窒素の凝固点
   よりも低い凝固点を有する液体ヘリウムによって制御さ
   れている請求項１記載の生物試料の急速凍結方法。
3. 【請求項３】　　固体窒素と生物試料との接触が、当該
   生物試料を含む水滴を滴下させるか、生物試料をノズル
   様口から噴霧させるか、生物試料が付着されている支持
   担体を落下させるか、生物試料に固体窒素を能動的に押
   当させるかによりなされる請求項２記載の生物試料の急
   速凍結方法。