JPH0428359B2 - - Google Patents
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- JPH0428359B2 JPH0428359B2 JP57165233A JP16523382A JPH0428359B2 JP H0428359 B2 JPH0428359 B2 JP H0428359B2 JP 57165233 A JP57165233 A JP 57165233A JP 16523382 A JP16523382 A JP 16523382A JP H0428359 B2 JPH0428359 B2 JP H0428359B2
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は多層分析材料に関し、特に液体試料中
の過酸化水素の定量を実施する場合、または特定
の成分をオキシダーゼ酵素反応系に導入し生成し
た過酸化水素の定量により液体試料中の特定の成
分の定量を実施する場合に有効なペルオキシダー
ゼを含む過酸化水素検出呈色指示薬系を含む多層
分析材料の改良に関するものである。 オキシダーゼ酵素を用い、被検物質又はその反
応生成物を酸化すると同時に生成されるH2O2を
適当な手段により定量する定量法は、近年ますま
す重要になつてきている。その理由はペルオキシ
ダーゼを用いて色素の生成反応に導き、比色的に
H2O2を定量する方法をはじめとして、電極反応
などの手段によりH2O2を定量する方法などH2O2
の定量は確実に実施できるからである。 このような原理に基づく、比色定量法として
は、トラインダー（P.Trinder）が導入した試薬
系を用いる方法（「Ann.Clin.Biochem.」６、24
−27（1969））がよく知られている。この方法に
は、オキシダーゼ酵素によつて生成するH2O2に
ペルオキシダーゼを作用させ、４−アミノアンチ
ピリン（またはその類縁体）とフエノール類（ま
たはナフトール類）との酸化カツプリング反応を
起させ、生成した色素を定量するものである。こ
の反応系の利点は、オキシダーゼ酵素の種類を変
えても同じ検出系を利用することができる点にあ
り、広く、各種の分析項目への応用が検討されて
いる。これらのうち、臨床化学検査上特に重要な
ものは、グルコースオキシダーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼ、ウリカーゼ、グリセロールオキ
シダーゼ、フオスフオグルコースオキシダーゼな
どである。 これらのオキシダーゼ酵素と生成するH2O2の
検出系とを一体型の多層分析フイルムや、紙片
等への含浸ストリツプスの形体とした臨床検査用
分析材料も広く実用化されている。 これらの分析材料は、被検物質の検出に直接関
与する試薬類を含有する組成物が、支持体となる
紙状物や、フイルム上の支持体に、含浸あるい
は塗布された型体をしている。 一体型の多層分析材料（フイルム）は種々の構
成をしており、必要に応じて、各種の機能層が、
積層された形で組み込まれている。これらの機能
層として公知のものとしては、液体試料の均一展
開の目的とした展開層（特公昭53−21677、特開
昭55−164356）、反射測定の白色散乱面及び、上
層にある有色成分と生成された検出用色素とを光
学的に隔離する為の光遮蔽層（特公昭53−21677、
特開昭51−40191、特開昭55−26428、特開昭55−
26429、特開昭55−164356等）、物質の選択的な拡
散を目的としたバリヤー層（特開昭52−3488）ま
たは液体遮断層（特願昭56−176274、特願昭56−
176275）、生成色素の媒染による効率的な検出を
目的とした検出層（特開昭51−40191、特開昭53
−131089）、生成色素の他層への移動の防止を目
的としたマイグレーシヨン防止層（特開昭54−
29700、層間の接着性改良を目的とした接着層
（特開昭55−164356等）などがある。 これらの多層分析フイルムの試薬層にグルコー
スオキシダーゼまたはコレステロールエステラー
ゼおよびコレステロールオキシダーゼ、ペルオキ
シダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび１、７
−ジヒドロキシナフタレンを含むH2O2検出呈色
試薬組成物を用いたグルコース定量用またはコレ
ステロール定量用多層分析フイルムにおいて、検
量線の傾き（γ）が比較的小さく、グルコースま
たはコレステロールの含有量が多い高濃度域にお
いてγが小さく、結果として定量精度が不十分で
かつ測定範囲が不十分という問題があつた。本発
明者らはこの問題点を解決するために鋭意研究を
続けたところ、意外にも、湿式の（水溶液系で実
施される）グルコースまたはコレステロールの定
量には発色光学濃度が不足で低感度という理由で
用いられなかつた水に対する溶解度が４−アミノ
アンチピリンよりも小さい４−アミノアンチピリ
ン誘導体および４−アミノアンチピリン類似の４
−アミノ−３−ピラゾリン−５−オンの１、２、
３−トリ置換体が乾式の多層分析フイルムの試薬
層に用いた場合に前述の問題点が解消されること
を見出し本発明に到達した。 本発明の目的はペルオキシダーゼを含むH2O2
検出呈色試薬組成物を含む試薬層を有する多層分
析材料において、検量線の傾き（γ）が大きく、
被検成分の高濃度領域においてもγが大きく維持
され、測定範囲が拡大された高感度かつ定量精度
がすぐれた多層分析材料を提供することである。 本発明の他の目的はオキシダーゼおよびペルオ
キシダーゼを含むH2O2検出呈色試薬組成物を含
む試薬層を有する多層分析材料において、検量線
のγが大きく、被検成分の高濃度領域においても
γが大きく維持され、測定範囲が拡大された高感
度でかつ定量精度がすぐれた多層分析材料を提供
することである。 本発明の他の目的はオキシダーゼおよびペルオ
キシダーゼを含むH2O2検出呈色試薬組成物を含
む試薬層を有する多層分析材料において、検量線
のγが大きく、被検成分の高濃度域においてもγ
が大きく維持され、測定範囲が拡大された高感度
で定量精度がすぐれており、かつ短時間に測定可
能な多層分析材料を提供することである。 本発明の他の目的はグルコースオキシダーゼお
よびペルオキシダーゼを含むH2O2検出呈色試薬
組成物を含む試薬層を有するグルコース定量用多
層分析材料において、検量線のγが大きく、グル
コース含有量の多い高濃度域においてもγが大き
く維持され、測定範囲が拡大された高感度で定量
精度がすぐれており、かつ短時間で測定可能なグ
ルコース定量用多層分析材料を提供することであ
る。 本発明は、下記の構成を有する多層分析材料に
ある。 １ 水不浸透性光透過性支持体の上に、少なくと
もペルオキシダーゼ、およびペルオキシダーゼ
と過酸化水素の存在下で検出可能な変化を生じ
うる色原体とカプラーの組合せを含む過酸化水
素検出用呈色指示薬組成物を含む試薬層、なら
びに多孔性展開層の二つの層を少なくとも有
し、この順に積層されてなる多層分析材料にお
いて、前記色原体が下記一般式［１］： ［R1は三個以下のハロゲン原子もしくは一
個の低級アルキル基で置換されていてもよいフ
エニル基を表わし、R2は、低級アルキル基を
表わし、そしてR3は低級アルキル基もしくは
フエニル基を表わす。また、ピラゾロン核に付
けた数字は位置番号を表わす。］ で表わされる４−アミノ−３−ピラゾリン−
５−オンの１、２、３−トリ置換体であること
を特徴とする多層分析材料。 本発明の主要な実施の態様を次に示す。 １ 前記カプラーがペルオキシダーゼの共存下に
前記色原体と酸化カプリング反応により色素を
形成しうる化合物である上記の多層分析材料。 ２ 前記試薬層にペルオキシダーゼとともに前記
色原体および前記カプラーが含有されている上
記の多層分析材料。 ３ 前記試薬層または他のいずれか一つの層にオ
キシダーゼが含有されている上記の多層分析材
料。 ４ 前記一般式［１］のR1がフエニル基である
上記の多層分析材料。 ５ 前記一般式［１］のR1がクロロフエニル基
である上記の多層分析材料。 本発明の多層分析材料における光透過性水不浸
透性支持体は波長約200nmから約900nmの範囲の
少なくともある範囲の波長領域の電磁波（紫外
線、近紫外線、可視光、または近赤外線）を約40
％以上、好ましくは約65％以上透過させることが
でき、実質的に水をその内部に浸透させることが
なく、かつその表面に設けられる後述の試薬層ま
たは下塗層に含有されるバインダーポリマーまた
は他の成分と実質的に化学反応を生じさせない素
材からなる。前述の規準にあうかぎり支持体とし
て用いることができる素材は何でもよい。支持体
としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフ
エノールＡのポリカルボネート、ポリメチルメタ
クリレート、ポリスチレン、セルローステステル
（例、セルロースジアセテート、セルローストリ
アセテート、セルロースアセテートプロピネー
ト）などのポリマーからなる透明シートまたはフ
イルムや透明ガラス板などで厚さ約50μｍから約
2mm、好ましくは約70μｍから約0.5mmの範囲の
ものを用いることができる。 支持体の表面には試薬層（または他の機能層）
を支持体に一体に接着することを容易にする目的
で公知の下塗層を設けるか、あるいは支持体の表
面を公知の化学的処理（例、酸処理、アルカリ処
理）または物理化学的処理（例、コロナ放電処
理、グロー放電処理、紫外線照射処理、火陥処
理）を施すことができる。 本発明の多層分析材料に用いられる少なくとも
ペルオキシダーゼを含む試薬層とは少なくともペ
ルオキシダーゼを含む過酸化水素検出用呈色指示
薬組成物（以下、H2O2呈色試薬という。）を含む
試薬組成物が親水性バインダーポリマーのマトリ
クスの中に分散または溶解されてなる試薬層であ
る。 H2O2呈色試薬はペルオキシダーゼ、およびペ
ルオキシダーゼと過酸化水素の存在下で検出可能
な色変化（一般に発色または色相の変化）を生じ
うる色原体とカプラーの組み合せを含む呈色指示
薬組成物である。 本発明に用いることができるトリ置換−４−ア
ミノ−３−ピラゾリン−５−オンの詳しい説明を
以下に示す。（ピラゾリン核に付けた数字は位置
番号を示す。） 一般式［１］のR1のフエニル基に置換されて
いてもよいハロゲン原子の例としては、塩素原
子、臭素原子およびヨウ素原子を挙げることがで
きる。特に好ましいのは塩素原子である。フエニ
ル基に置換され得るハロゲン原子は三個以内であ
る。そのようなハロゲン原子置換フエニル基の例
としては、２−クロロフエニル基、３−クロロフ
エニル基、４−クロロフエニル基、２、５−ジク
ロロフエニル基、３、４−ジクロロフエニル基、
３、５−ジクロロフエニル基、２、４、６−トリ
クロロフエニル基、４−ブロモフエニル基、４−
ヨードフエニル基などを挙げることができる。 一般式［１］のR1のフエニル基に置換されて
いてもよい低級アルキル基は、炭素数１〜５の直
鎖状もしくは分岐状のアルキル基で、その例とし
ては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ
−ブチル基、イソプロピル基、イソアミル基を挙
げることができる。そのような低級アルキル置換
フエニル基の例としては、４−メチルフエニル基
および４−エチルフエニル基を挙げることができ
る。 R2そしてR3における低級アルキル基の例も上
記と同じである。 上記に示すような一般式［１］のトリ置換−４
−アミノ−３−ピラゾリン−５−オンは、後に実
施例で示す各種の化合物とほぼ同一の発色特性を
示し、かつその水溶性も低く、本発明の多層分析
材料に用いる色原体として有利に用いることがで
きる。 一般式〔１〕で表わされるトリ置換−４−アミ
ノ−３−ピラゾリン−５−オンはいずれもその４
−位のアミノ基が酸付加塩となつた４−アンモニ
オ−３−ピラゾリン−５−オンをも包含するもの
であつて、酸付加塩を構成する酸の例としては塩
化水素酸、臭化水素酸、沃化水素酸、硝酸、過塩
素酸、硫酸などの無機酸、蟻酸、酢酸、プロピオ
ン酸、蓚酸、グルタル酸、３、３−ジメチルグル
タル酸、りんご酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホ
ン酸などの有機酸をあげることができる。好まし
い酸付加塩の例として塩化水素酸付加塩をあげる
ことができる。 一般式〔１〕で表わされるトリ置換−４−アミ
ノ−３−ピラゾリン−５−オンの具体例を第１表
にあげる。これらの化合物のうちでは化合物(1)か
ら(10)までの10種の化合物およびそれらの酸付加塩
が好ましく、化合物(6)、(7)、(10)およびそれらのモ
ノ塩酸塩が最も好ましい。 【表】 【表】 本発明においてH2O2呈色試薬に用いることが
できるカプラーはペルオキシダーゼの共存下に色
原体と酸化的カプリング反応により色素を形成し
うる化合物である。カプラーとして特開昭49−
50991、特開昭50−137192、「Clinical
Chemistry」24(8)、1335−1342（1978）、C.E.K.
Mees、T.H.James編「The Theory of the
Photographic Process」Third Edition
（Macmillan Co.、1968年発行）387−396ページ
などに記載のフエノール、ナフトール、およびハ
ロゲン原子（塩素原子、臭素原子など）、アルキ
ル基、アルコキシ基、フエニル基、フエノキシ
基、ニトロ基、またはヒドロキシ基を有するフエ
ノール誘導体およびナフトール誘導体、前記の
「The Theory of the Photographic Process」
Third Edition387−396ページ、特開昭57−
94655などに記載のバラスト基を有するフエノー
ル誘導体およびナフトール誘導体、特開昭49−
50991に記載のアルキル基を有するヒドロキシキ
ノリン類および他の置換基をもたないヒドロキシ
キノリン類、前記の「The Theory of the
Photographic Process」Third Edition387−396
などに記載の活性メチレン基含有鎖状化合物およ
び活性メチレン基含有環状化合物などがある。 これらのカプラーのうちで本発明に好ましいカ
プラーは、一般式〔２〕で表わされるフエノール
またはフエノール誘導体、および一般式〔３〕で
表わされるナフトールまたはナフトール誘導体で
ある。 一般式〔２〕においてR62ないしR66はそれぞ
れ水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アル
コキシ基、フエニル基、ベンジル基、フエネチル
基、ニトロ基またはハロゲン原子（塩素原子、臭
素原子または沃素原子）を表わし、R62ないし
R66のうち少なくとも２個は水素原子であり、残
余の置換基はいかなる組合せでもよい。 一般式〔３〕においてR71ないしR78はそれぞ
れ水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アル
コキシ基、フエニル基、ベンジル基、フエネチル
基、ニトロ基またはハロゲン原子（塩素原子、臭
素原子、または沃素原子）を表わし、R71ないし
R78のうち少なくとも１個はヒドロキシル基、少
なくとも４個は水素原子であり、残余の置換基は
いかなる組合せでもよい。 一般式〔２〕におけるR62ないしR66、一般式
〔３〕におけるR71ないしR78がアルキル基の場
合、その例として炭素原子数１ないし18の直鎖状
または分岐状アルキル基、または炭素原子数３な
いし18のシクロアルキル基があり、その具体例と
してメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、
イソブチル基、イソアミル基、シクロプロピル
基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが
ある。 R62なしいR66、R71ないしR78がアルコキシ基
の場合、その例として炭素原子数１ないし18の直
鎖状または分岐状アルキル基、または炭素原子数
３ないし18シクロアルキル基を有するアルコキシ
ル基があり、その具体例としてメトキシ基、エト
キシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオ
キシ基、イソプロポキシ基、イソブトキシ基、イ
ソアミロキシ基、シクロプロピルオキシ基、シク
ロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基な
どをあげることができる。 一般式〔２〕で表わされるフエノールまたはフ
エノール誘導体の具体例として第２表の化合物が
ある。 【表】 【表】 一般式〔３〕で表わされるナフトールまたはナ
フトール誘導体の具体例として第３表の化合物が
ある。 【表】 これらの化合物のうちでは、ナフトール誘導体
が好ましく、１、７−ジヒドロキシナフタレンお
よび４−メトキシ−１−ナフトールが最も好まし
い。 ペルオキシダーゼとして特公昭56−45599、特
公昭57−5520等に開示の植物起源および動物起源
のペルオキシダーゼ（EC1.11.7）、および特開昭
57−99192等に開示の微生物起源のペルオキシダ
ーゼ（EC1.11.7）のうちから適宜に１種または２
種以上を組合せて用いることができる。 植物起源のペルオキシダーゼの例として、西洋
わさび、じやがいも、いちじく樹液、かぶ、だい
こんから抽出されたペルオキシダーゼを、動物起
源のペルオキシダーゼの例として、牛乳から抽出
されたラクトペルオキシダーゼ、白血球から抽出
されたベルドペルオキシダーゼを、微生物起源の
ペルオキシダーゼとしてAlternaria属、
Cochliobolus属、Curvularia属、Pellicularia属
に属し非特異的ペルオキシダーゼ生産能を有する
微生物起源のペルオキシダーゼを、それぞれあげ
ることができる。 その他に特公昭56−45599、特公昭57−5520等
に開示のチオシアン酸鉄、タンニン酸鉄、フエロ
シアン化鉄（いずれも鉄（＋２）化合物）、クロ
ム硫酸カリウム、沃化ナトリウム、沃化カリウ
ム、モリブデン酸アンモニウム、モリブデン酸カ
リウム等のペルオキシダーゼ活性を有する無機化
合物を用いることもできる。 これらのうちで植物起源または微生物起源の非
特異的ペルオキシダーゼが好ましい。 本発明の多層分析材料においては、少なくとも
ペルオキシダーゼを含む試薬層はペルオキシダー
ゼ、および色原体とカプラーの組合せが親水性ポ
リマーバインダーの中に溶解または分散されてな
るものである。バインダーとして用いることがで
きる親水性ポリマーはペルオキシダーゼ、色原体
およびカプラーと実質的に相互作用を生ずること
がなく、被膜形成能を有するものであれば何でも
よい。親水性ポリマーの例としてゼラチン、酸処
理ゼラチン、脱イオン化ゼラチン、ゼラチン誘導
体（例、アシル化ゼラチン）、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルベンゼ
ンスルホン酸ナトリウム、カルボキシメチルセル
ロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロー
ス、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロ
ース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリル
アミド、アクリルアミドコポリマー（例、アクリ
ルアミド−Ｎ−ビニルピロリドンコポリマー、ア
クリルアミド−２−ヒドロキシエチルアクリルア
ミドコポリマー）、をあげることができる。試薬
層の厚さ（乾燥厚さ）は約5μmから約100μm、好
ましくは約10μmから約50μmの範囲である。 試薬層におけるペルオキシダーゼの含有量は約
５千Ｕ／m2から約10万Ｕ／m2、好ましくは約１
万Ｕ／m2から約６万Ｕ／m2の範囲である。色原
体とカプラーの組合せの含有量は液体試料に含有
されると予想される被検成分の最大含有量に対応
する化学量論による量またはそれより多い量が必
要であり、この量は当業者が実験により決めるこ
とができる。 被検物質が過酸化水素でなく、化学反応により
過酸化水素を生成する反応系に組みこむことがで
きる場合には、被検物質が酸素と相互作用して過
酸化水素を生成するための触媒としてオキシダー
ゼを試薬層または他の層に含有させておくことが
できる。オキシダーゼは被検物質に応じて選択さ
れる必要がある。オキシダーゼとしては１種のオ
キシダーゼを用いられることはもちろん、一連の
連続反応を進行させる複数種の酵素の組合せ（そ
の中の１種はオキシダーゼである。）を用いるこ
ともできる。さらに必要な場合にはオキシダーゼ
とともにそのオキシダーゼの補因子および／また
は補酵素を組合せて用いることはいうまでもな
い。 オキシダーゼ（必要に場合には補酵素もとも
に）はペルオキシダーゼ、および色原体とカプラ
ーの組合せを含む試薬層に含有させるか、あるい
は試薬層よりも上側（試薬層を基準にして支持体
から遠い側）の層に含有させるか、さらにはペル
オキシダーゼ、および色原体とカプラーの組合せ
を含む試薬とそれよりも上側の層（１層または複
数の層）の両方（または合計３層以上）に含有さ
せることができる。ここで試薬層より上側の層と
いう表現には多孔性展開層をも含めることができ
る。オキシダーゼが触媒する基質の反応には酵素
の存在が必須であり、多層分析材料においては酸
素は空気中から展開層を経て他の層内へ拡散する
ので、オキシダーゼが触媒する酸化反応の効率的
な進行にとつては酸素の層中への拡散の効率的な
達成を目的とした特願昭56−93631に開示した、
オキシダーゼをペルオキシダーゼ、および色原体
とカプラーの組合せを含む試薬層より上側の層、
ことに多孔性展開層または多孔性展開層に隣接す
る層に含有させた構成の多層分析材料とすること
が好ましい。またコレステロールエステルのよう
に親油性物質が被検物質である場合には、親水性
バインダーポリマーを有する層へは被検物質が浸
透しにくいので、ことに多孔性展開層の内部にオ
キシダーゼを含有させることが好ましい。 本発明の多層分析材料に含有させることができ
るオキシダーゼとして酵素（O2）をアクセプタ
とするオキシダーゼがあげられ、その例として次
の酵素をあげることができる。（）内はEC
Numberを表わす。 グリコレートオキシダーゼ （1.1.3.1） マレートオキシダーゼ （1.1.3.3） グルコースオキシダーゼ （1.1.3.4） ヘキソースオキシダーゼ （1.1.3.5） コレステロールオキシダーゼ （1.1.3.6） アリールアルコールオキシダーゼ （1.1.3.7） Ｌ−グルコノラクトンオキシダーゼ
（1.1.3.8） ガラクトースオキシダーゼ （1.1.3.9） アルコールオキシダーゼ （1.1.3.13） Ｌ−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ
（1.1.3.15） アルデヒドオキシダーゼ （1.2.3.1） キサンチンオキシダーゼ （1.2.3.2） ピルベートオキシダーゼ （1.2.3.3） ピルベートオキシダーゼ（CoAアセチル化）
（1.2.3.6） ラトステロールオキシダーゼ （1.3.3.2） Ｄ−アスパルテートオキシダーゼ （1.4.3.1） Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ （1.4.3.2） Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ （1.4.3.3） アミンオキシダーゼ（フラビン含有）
（1.4.3.4） ピリドキサミンホスフエートオキシダーゼ
（1.4.3.5） アミンオキシダーゼ（銅含有） （1.4.3.6） Ｄ−グルタメートオキシダーゼ （1.4.3.7） サルコシンオキシダーゼ （1.5.3.1） Ｎ−メチルアミノ酸オキシダーゼ （1.5.3.2） N6−メチル−Ｌ−リシンオキシダーゼ
（1.5.3.4） ウリカーゼ（ウレートオキシダーゼ）
（1.7.3.3） スルフイトオキシダーゼ （1.8.3.1） アスコルベートオキシダーゼ （1.10.3.3） ３−ヒドロキシアントラニレートオキシダー
ゼ （1.10.3.5） アルギニン２−モノオキシゲナーゼ
（1.13.12.1） リシン２−モノオキシゲナーゼ （1.13.12.2） トリプトフアン２−モノオキシゲナーゼ
（1.13.12.3） ラクテートオキシダーゼ（ラクテート２−モ
ノオキシゲナーゼ （1.13.12.4） ジメチルアニリンモノオキシゲナーゼ
（1.14.13.8） コレステロール7α−モノオキシゲナーゼ
（1.14.13.17） Flavoprotein−linked monooxygenate
（1.14.14.1） フエニルアラニンモノオキシゲナーゼ
（1.14.16.1） グリセロールオキシダーゼ（東洋醸造から販
売） グリシンオキシダーゼ（化学大辞典第３巻
（1960年９月発行）に記載） オキシダーゼを含む複数種の酵素の組合せの例
として以下のものがある。 グリセロールキナーゼ（2.7.1.30）およびＬ
−α−グリセロ燐酸オキシダーゼ（1.1.99.5；
または特開昭53−72892、特開昭53−24893に開
示）の組合せ（特開昭53−24893に開示） トリグリセリド加水分解活性をもつリパーゼ、
グリセロールキナーゼ（2.7.1.30）およびＬ−
α−グリセロ燐酸オキシダーゼ（1.1.99.5；ま
たは特開昭53−72892、特開昭53−24893に開
示）の組合せ（特開昭53−24893に開示） エステラーゼ作用をもつリパーゼ、プロテアー
ゼおよびコレステロールオキシダーゼ
（1.1.3.6）の組合せ（特開昭50−137192に開示） グルタミルピルベートトランスアミナーゼ（ア
ラニンアミノトランスフエラーゼと同じ。
2.6.1.2）およびピルベートオキシダーゼ
（1.2.3.3）の組合せ（特願昭56−93632に開示） グルタミルオキサロアセテートトランスアミナ
ーゼ（グルタミン−オキソ酸アミノトランスフ
エラーゼと同じ。2.6.1.15）、オキサロアセテー
トデカルボキシラーゼ（4.1.1.3）およびピルベ
ートオキシダーゼ（1.2.3.3）の組合せ（特願昭
56−93632）に開示） これらのオキシダーゼのうちで、本発明の多層
分析材料において好ましいのは、グリコレートオ
キシダーゼ、マレートオキシダーゼ、グルコース
オキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ、Ｌ−グルコノラクトンオ
キシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、キサン
チンオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ、ウ
リカーゼ、アスコルベートオキシダーゼ、ラクテ
ートオキシターゼ、グリシンオキシダーゼ、グリ
セロールオキシダーゼなど、およびオキシダーゼ
を含む複数種の酵素の組合せとして例示した組合
せがあげられる。 オキシダーゼの多層分析材料中における含有量
は、主として液体試料に含有される過酸化水素を
生成する被検物質の予想される最大量とオキシダ
ーゼおよびペルオキシダーゼの活性値の比により
決めることができ、これは当業者が実験により決
めることができるが、おおよその含有量として約
１千Ｕ／m2から約10万Ｕ／m2、好ましくは約３
千Ｕ／m2から約５万Ｕ／m2の範囲である。オキ
シダーゼがグルコースオキシダーゼの場合には、
その含有量は約２千Ｕ／m2から約４万Ｕ／m2、
好ましくは約４千Ｕ／m2から約２万Ｕ／m2の範
囲である。 ペルオキシダーゼ、およびオキシダーゼはそれ
ぞれの活性が最大になる最適PH値はーあり、さら
にはそれぞれの活性はイオン強度や近傍に共存す
る陽イオンや陰イオンの種類による影響をもうけ
る。従つて多層分析材料においては、第一にペル
オキシダーゼを含む試薬層、オキシダーゼを含む
層、またはペルオキシダーゼとオキシダーゼをと
もに含む試層それぞれのPH値を、ついで必要に応
じてイオン強度や共存するイオン種などの因子を
最適に設定することが、よい分析結果（定量精
度、くりかえし再現性などについて）を得るため
にはきわめて重要である。かかる目的の為に多孔
性展開層、試薬層、光遮蔽層その他の機能層中に
酸、アルカリ、塩、緩衝剤、解離剤、界面活性剤
などを含有させておくことは本発明の実施に当つ
て重要なことである。これら反応条件設定の為の
試薬類の種類、量などは、分析の目的その他によ
つて大きく変化するので、目的に従つて適宜、選
択する必要がある。 ペルオキシダーゼ、および色原体とカプラー組
合せを含む試薬層に酸、アルカリまたは緩衝剤を
含有させて過酸化水素の存在下で検出可能な変化
を起させるには、ペルオキシダーゼの最適PH値で
あるPH7.0を中心にしてPH約5.0から約9.0、好まし
くは約6.0から8.0の範囲のPH値範囲の下で変化を
生じさせることが好ましい。 オキシダーゼはその最適PH値は酵素の種類によ
り異なるが、例示すれば、グルコースオキシダー
ゼ：PH約5.6；ヘキソースオキシダーゼ：PH約
6.3；コレステロールオキシダーゼ：PH約5.8；ガ
ラクトースオキシダーゼ：PH約7.0；アルコール
オキシダーゼ：PH約7.5；ウリカーゼ：PH7.5〜
8.5；アスコルベートオキシダーゼ：PH約5.6；Ｌ
−α−グリセロ燐酸オキシダーゼ：PH7.5〜7.7で
ある。 オキシダーゼを含む層はオキシダーゼの種類に
よりそれぞれの最適PH値またはその近傍のPH値範
囲に調整することが好ましい。ペルオキシダーゼ
の最適PH値と異なる最適PH値をもつオキシダーゼ
はそれ故に別々の層に含有させることが好まし
い。例えばグルコースオキシダーゼを多孔性展開
層または後述する接着層に含有させる場合には、
多孔性展開層または接着層に使用条件下において
グルコースオキシダーゼの最適PH値であるPH5.6
を中心としてPH3.6からPH7.6、好ましくはPH4.0か
らPH7.0の範囲に維持することができる酸または
緩衝剤を加えることができる。 試薬層、他の層、または多孔性展開層に含有さ
せることができる酸、アルカリまたは緩衝剤とし
て脂肪族ヒドロキシカルボン酸（例、グリコール
酸、乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、グリセリン酸、
タルトロン酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸）、
脂肪族ジカルボン酸（例、マロン酸、こはく酸、
グルタル酸、α−メチルグルタル酸、β−メチル
グルタル酸、３、３−ジメチルグルタル酸、α、
α′−ジメチルグルタル酸）、脂肪族モノカルボン
酸（例、酢酸、プロピオン酸、酪酸）、水酸化リ
チウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、日
本化学会編「化学便覧 基礎編」（東京、丸善(株)、
1966年発行）1312−1320ページに記載の緩衝剤
（例、くえん酸水素カリウム−くえん酸、燐酸二
水素カリウム−燐酸水素二ナトリウム）、
「Biochemistry」、５（２）、467−477（1966）の
Norman E.Goodら著「Hydrogen Ion Buffers
for Biological Research」R.M.C.Dawson et
al編「Date for Biochemical Research」第２版
（Oxford at the Clarendon Press、1969年発行）
476−508ページ、「Analytical Biochemistry」、
104、300−310（1980）等に記載の緩衝剤（例、２
−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−２−ヒド
ロキシプロパン−３−スルホン酸（Heppso）ナ
トリウム塩またはカリウム塩、Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−N′−３−プロパンスルホ
ン酸（Epps）ナトリウム塩またはカリウム塩）、
Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−３−
アミノプロパンスルホン酸（Taps）ナトリウム
塩またはカリウム塩、その他の緩衝剤（例、マレ
イン酸モノナナトリウムまたはモノカリウム塩、
３、３−ジメチルグルタル酸モノナトリウムまた
はモノカリウム塩）、無機酸（硫酸、燐酸）があ
る。これらのうちではくえん酸、酒石酸、りんご
酸、グルタル酸、α−メチルグルタル酸、β−メ
チルグルタル酸、α、α′−ジメチルグルタル酸、
３、３−ジメチルグルタル酸、水酸化リチウム、
Heppso Na 塩またはＫ塩、Epps Na 塩また
はＫ塩、Taps Na 塩またはＫ塩が好ましい。 試薬層、試薬層より上側の他の層または多孔性
展開層のいずれか１層または複数の層には保恒剤
として全血、血漿または血清中に添加されている
NaFによる測定値の低下またはバラつきとして
現れる干渉作用を除去する目的で、Ｆ イオンと
の間に25℃における水100gに対する溶解度が0.2g
以下の水に難溶性の塩を形成しうる陽イオンを含
む化合物（難溶性Ｆ塩形成性化合物）を特願昭57
−131750明細書の記載に従つて含有させることが
できる。陽イオンとしてはMgMg2 、Ca2 、
Ba2 などがあり、対陰イオンとしては蟻酸イオ
ン、酢酸イオン、プロピオン酸イオンなどの低級
脂肪族モノカルボン酸陰イオン、マロン酸イオ
ン、グルタル酸イオン、３、３−ジメチルグルタ
ル酸イオンなどの低級脂肪族ジカルボン酸陰イオ
ン、グリコール酸イオン、乳酸イオン、りんご酸
イオン、酒石酸イオン、くえん酸イオン、サリチ
ル酸イオンなどのヒドロキシカルボン酸陰イオ
ン、塩素陰イオン、臭素陰イオンなどのハロゲン
陰イオン、硝酸イオン、燐酸イオン、硫酸イオ
ン、アジド陰イオン（N3 ）などがある。難溶
性Ｆ塩形成性化合物の層中の含有量は多層分析材
料１ｍ2につき0.1meqから1eq、好ましくは
0.2meqから0.5eqの範囲である。 試薬層、試薬層より上側の他の層または多孔性
展開層のいずれか１層または複数の層には血中カ
タラーゼによる発色光学濃度の減少、すなわち測
定値の低下として現れる干渉作用を除去する主目
的で、25℃における水100gに対する溶解度が1g
以上の水溶性モノカルボン酸またはその塩を含有
させることができる。 水溶性モノカルボン酸またはその塩としては脂
肪族モノカルボン酸およびその塩、芳香族モノカ
ルボン酸およびその塩、芳香族置換脂肪族モノカ
ルボン酸およびその塩のいずれか１種または２種
以上の組合せて用いることができる。脂肪族モノ
カルボン酸としては炭素原子数１乃至５の直鎖ま
たは分岐状の飽和脂肪族モノカルボンがあげら
れ、その具体例として、蟻酸、酢酸、プロピオン
酸、酪酸、吉草酸、イソ吉草酸があげられる。脂
肪族モノカルボン酸の塩としては炭素原子数１乃
至５の直鎖または分岐状の飽和脂肪族モノカルボ
ン酸のアルカリ金属塩（例、リチウム塩、ナトリ
ウム塩、カリウム塩）およびアンモニウム塩があ
げられ、その具体例として、蟻酸、酢酸、プロピ
オン酸、酪酸、吉草酸、イソ酪酸、イソ吉草酸の
それぞれリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩
およびアンモニウム塩があげられる。 芳香族モノカルボン酸塩の具体例として安息香
酸リチウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリ
ウム、安息香酸アンモニウム、ｏ−トルイル酸ナ
トリウム、ｏ−トルイル酸カリウム、ｍ−トルイ
ル酸ナトリウム、ｐ−トルイル酸ナトリウム、ｐ
−トルイル酸カリウム、ｐ−トルイル酸アンモニ
ウムがあげられる。 芳香族置換脂肪族モノカルボン酸およびその塩
の具体例としてフエニル酢酸、フエニル酢酸ナト
リウム、フエニル酢酸カリウム、フエニル酢酸ア
ンモニウムがあげられる。 これらの水溶性モノカルボン酸またはその塩で
好ましい化合物は酢酸、プロピオン酸、蟻酸ナト
リウム、蟻酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カ
リウム、酢酸アンモニウム、プロピオン酸ナトリ
ウム、プロピオン酸カリウム、プロピオン酸アン
モニウムである。水溶性モノカルボン酸またはそ
の塩の層中の含有量は多層分析材料1m2につき
0.1meqから1eq、好ましくは0.2meqから0.5eqの
範囲である。 本発明の多層分析材料における多孔性展開層
（以下、展開層ということがある。）は分析材料の
最外面に位置し（すなわち、分析材料において試
薬層に関して支持体と反対側の最外面に位置す
る。）て、被検体液が点着される面であり、その
作用は点着された被検体液が被検体を含んだまま
液体の容量には無関係に単位面積当りほぼ一定容
量の被検体液を試薬層に供給する機能を果すこと
である。この作用（展開作用）により少なくとも
ペルオキシダーゼを含む試薬層（以下、試薬層と
いうことがある。）に供給される被検体液の容量、
さらには被検体液に含まれる被検体の容量は単位
面積当りほぼ等しいことになり、またこの作用が
存在するゆえに、定量分析に際して被検体液を正
確に秤取しなくても定量分析が実施できることを
意味する。当然のことであるが被検体液を正確に
秤取して定量分析を実施することを排除するもの
でもないし、被検体液を正確に秤取することによ
り定量の精度が高まる場合がある。 本発明の分析材料における多孔性展開層とし
て、特開昭49−53888（特公昭53−21677）、米国特
許第3992158号に開示されている非繊維等方的多
孔性層（例、メンブランフイルターまたはブラツ
シユポリマー層、微小球体または粒子を接着剤で
結合することにより製造された球体または粒子間
の相互結合空間により当方的多孔性が形成されて
いる層）、特開昭55−90859に開示されている微小
球状ビーズが水により膨潤しない接着剤により点
接触状に接着されて形成された三次元格子構造物
からなる連続空隙含有等方的多孔性構造物層、特
開昭55−164356に開示されている水洗された織物
または親水化処理織物からなる繊維質異方性多孔
性展開層、特開昭57−66359に開示されている物
理的活性化処理された表面を有する織物からなる
繊維質異方性多孔性展開層、特願昭56−34370に
開示されている合成ポリマー繊維パルプを含む抄
造紙、抄造紙または不織布からなる繊維質異方
性多孔性展開層を用いることができ、かつこれら
の展開層はここにあげた特許明細書に開示の方法
により設けることができる。また特開昭49−
53888に開示されているごとく、二酸化チタン、
酸化亜鉛、または硫酸バリウムの微粉末を含有す
るメンブランフイルターまたはブラツシユポリマ
ー層は後述する光遮蔽層（輻射線ブロツキング
層、白色背景層または光反射層）をかねる展開層
として本発明において用いることができる。さら
にカーボンブラツクを含有するメンブランフイル
ターまたはブラツシユポリマー層を後述する光遮
蔽層をかねる展開層として用いることができる。
被検体液が全血の場合、好ましい展開層として前
述の三次元格子構造物からなる連続空隙含有等方
的多孔性構造物層および前述の繊維質異方性多孔
性展開層があげられる。 本発明の多層分析材料においては試薬層と展開
層の間に水および被検体透過性の光遮蔽層（色遮
蔽層、輻射線ブロツキング層、背景層または光反
射層ともいう。）を設けることができる。光遮蔽
層は、たとえば、赤血球を含む全血の如く、被検
体液が着色粒子を含む場合に有用な層である。即
ち光遮蔽層の片側にある着色粒子の色はこの層に
よつてさえぎられて反対側、すなわち透明支持体
側からは着色粒子の色は全く見えず、従つて比色
定量または螢光測光定量に当つて着色粒子が定量
の妨害をしない。光遮蔽層は、二酸化チタン微粉
末、硫酸バリウム微粉末、酸化亜鉛微粉末、アル
ミニウム微粉末またはカーボンブラツクの如き微
粉体を水および被検体透過性の親水性ポリマーバ
インダー中に分散した層で、5μmから100μm、好
ましくに5μmから30μmの範囲の厚さがあり、被
検体液および被検体は通過しうるものである。光
遮蔽層のポリマーバインダーとしては試薬層に用
いたのと同じ種類の親水性ポリマーの中から適宜
に選択して用いることができる。 光遮蔽層としては二酸化チタン微粉末酸化亜鉛
微粉、硫酸バリウム微粉末またはカーボンブラツ
クなどの光遮蔽能を有する微粒子を含んだメンブ
ランフイルター（ブラツシユポリマー層）を多孔
質光遮蔽層として用いることができる。多孔質光
遮蔽層は特開昭49−53888（特公昭53−21677）ま
たは特開昭54−29700に開示の方法により設ける
ことができる。 本発明の多層分析材料においては展開層を試薬
層、光遮蔽層、または必要により設けられる他の
層の上に接着し積層して一体化するための接着を
強化する目的で接着層を設けることができる。こ
とに展開層として多孔性のシート状、フイルム状
または膜状の素材を用いる場合には接着層を設け
ることが好ましい。 接着剤としては試薬層のバインダーとして用い
られている水および被検体透過性親水性ポリマー
を用いることができ、この場合には接着層の親水
性ポリマーが半乾きの状態のとき、または親水性
ポリマーを水または界面活性剤を含む水で湿潤さ
せておいて、展開層として用いる多孔性のシート
状、フイルム状または膜状の素材を適当な圧力を
かけて接着層に接着することができる。接着層の
厚さは0.5μmから15μm、好ましくは0.5μmから
5μmの範囲である。 本発明の多層分析材料には前記の諸層のほかに
必要に応じて、特開昭52−3488、特願昭56−
176274、特願昭56−176275に開示のバイヤー層ま
たは液体遮断層、特開昭51−40191、特開昭53−
131089等に開示の検出層または媒染層、特開昭54
−29700に開示のマイグレーシヨン阻止層、特開
昭54−26793（特公昭57−28277）、特開昭51−
40191等に開示の中間層、特開昭53−131089、特
開昭57−40649、特開昭57−50660、特願昭57−
61936等に開示の蛋白質を通過させることができ
る親水性バインダーポリマーを用いた層、特開昭
56−8549に開示の試薬含有微粒子分散層、実開昭
57−42951に開示の一定面積の液体試料点着供給
用ポーラス体（パツチ）、特願昭56−93632に開示
の酵素等の試薬を含む定面積多孔性層を設けるこ
とができる。 本発明の多層分析材料はここまでの説明から明
らかなとおり、透明支持体の上に順にペルオキシ
ダーゼを含む試薬層および展開層が設けられた構
成を有するが、好ましい実施態様として、透明支
持体の上に順にペルオキシダーゼを含む試薬層、
光遮蔽層および展開層が設けられた構成を有する
もの、透明支持体の上に順にペルオキシダーゼを
含む試薬層、光遮蔽層、接着層および展開層が設
けられた構成を有するもの、透明支持体の上に順
にペルオキシダーゼを含む試薬層、オキシダーゼ
を含む光遮蔽層および展開層が設けられた構成を
有するもの、透明支持体の上に順にペルオキシダ
ーゼを含む試薬層、光遮蔽層、オキシダーゼを含
む接着層、および展開層が設けられた構成を有す
るもの、透明支持体の上に順にペルオキシダーゼ
を含む試薬層、光遮蔽層、オキシダーゼを含む接
着層、およびオキシダーゼを含む展開層が設けら
れた構成を有するもの、透明支持体の上に順にペ
ルオキシダーゼを含む試薬層、オキシダーゼを含
む光遮蔽層、オキシダーゼを含む接着層、および
展開層が設けられた構成を有するもの、透明支持
体の上に順にペルオキシダーゼおよびオキシダー
ゼを含む試薬層、光遮蔽層、および展開層が設け
られた構成を有するもの、透明支持体の上に順に
ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼを含む試薬
層、オキシダーゼを含む光遮蔽層、接着層、およ
び展開層が設けられた構成を有するもの、透明支
持体の上に順にペルオキシダーゼおよびオキシダ
ーゼを含む試薬層、光遮蔽層、オキシダーゼを含
む試薬層、および展開層が設けられた構成を有す
るもの、さらにこれらの層構成のバリエーシヨ
ン、などがある。 本発明の多層分析材料は前述の特許明細書に開
示の方法に従つて製造することができ、その具体
例は後記する実施例に詳細に説明されている。ま
た本発明の多層分析材料は前述の特許明細書に開
示の操作手順と同様にして被検体液中の被検物質
を定量することができる。本発明の多層分析材料
は実開昭54−162294、特開昭54−156079、実開昭
56−142454、特願昭55−138100の開示のスライド
枠に収めて化学分析スライドまたは特願昭56−
67924に開示の液体試料展開補助材を多孔性展開
層の上に設けた構造の化学分析スライドとして用
いるのが製造、輸送、保管、測定操作などの全て
の面で好ましい。 実施例 １ ゼラチン下塗りが施されてある厚さ185μmの透
明ポリエチレンテレフタレート（PET）フイル
ム上に、下記組成から成る血中グルコース濃度定
量用の試薬層を乾燥後の膜厚がおよそ15μmにな
るように塗布、乾燥した。 ペルオキシダーゼ 25000IU １、７−ジヒドロキシナフタレン ５ｇ 化合物(6) 18ｇ ゼラチン 200ｇ ノニオンHS210（日本油脂(株)製活面活性剤；
ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル）
２ｇ この上に、0.2ｇのノニオンHS210及びグルコ
ースオキシダーゼ50000IUを含む二酸化チタン微
粉末８ｇをゼラチン１ｇに混合分散したものより
成る光遮蔽層を乾燥膜厚がおよそ15μmになるよ
うに塗布、乾燥した。 この上に水100ml中にゼラチン４ｇを溶解し、
更にこれにノニオンHS210を0.2ｇを加えて、接
着層塗布液とした。これを、光遮蔽層の上に乾燥
膜厚が4μｍとなるように塗布、乾燥し接着層を
形成させた。次に、接着層に30ｇ／m2の割合で
水を湿し水として供給、湿潤させたのち、綿100
％のブロード（東洋紡製100双 ブロード）を圧
着ラミネートし、乾燥させて多孔性展開層を設
け、グルコース定量用の多層分析材料を完成させ
た。 この材料を1.5cm×1.5cmの正方形のチツプに裁
断したのち、特開昭57−63452に開示のプラスチ
ツクマウントに収めてグルコース定量用化学分析
スライドとした。 ヘパリン採血したヒト全血およびそれにそれぞ
れ異なる量のグルコースを加えてグルコース濃度
が異なるヒト全血試料３種（グルコース含有量は
第４表に示す。）を調整し、それぞれから6μlをミ
クロピペツトで採取し、上記の分析スライドの展
開層の上に点着し、37℃で６分間インクベーシヨ
ンしたのち、波長500nmの測定光でPETフイル
ム側から反射測光して発色光学濃度を測定し検量
線を作成した。測定結果を第４表および第１図に
示す。 比較例 １ 試薬層の組成中の化合物(6)のかわりに化合物
（C1）（４−アミノアンチピリン）を18ｇ加えた
ほかは実施例１と同様にしてグルコース定量用化
学分析スライドを作製し、実施例１と同様の測定
を行ない検量線を作成した。測定結果を第４表お
よび第１図に示す。 【表】 ＊ グルコース添加したヒト全血試料
を遠心分離して血漿を分離
し、血漿をヘキソキナーゼ−G−6−
PDH法でグルコース濃度を検定
した値。
第４表および第１図から本発明のグルコース定
量用多層分析材料（フイルム）を用いた化学分析
スライドにおいては比較例１の化学分析スライド
に比べて、同じグルコース濃度に対して発色光学
濃度が大きく、γも大きく、従つてより高感度で
あり、かつグルコース濃度が大きい領域までγが
大きく保たれていて、測定範囲が拡大されている
ことがわかる。またγがより大きいことから測定
精度がよいこともわかる。 実施例 ２ ゼラチン下塗りが施されてある厚さ185μmの透
明PETフイルム上に、下記組成から成る血中グ
ルコース濃度定量用の試薬層を乾燥後の膜厚がお
よそ15μmになるように塗布、乾燥した。 ペルオキシダーゼ 25000IU グルコースオキシダーゼ 40000IU １、７−ジヒドロキシナフタレン ５ｇ 化合物(6)モノ塩酸塩 20ｇ ゼラチン 200ｇ ノニオンHS210 ２ｇ この上に、0.2ｇのノニオンHS210を含む二酸
化チタン微粉末８ｇをゼラチン１ｇに混合分散し
たものより成る光遮蔽層を乾燥膜厚がおよそ
15μmになるように塗布、乾燥した。この上に水
100ml中にゼラチン４ｇとノニオンHS210の0.5ｇ
を加えて、接着層塗布液とした。これを光遮蔽層
の上に乾燥膜厚が4μmになるように塗布、乾燥し
接着層を形成させた。 次に、接着層に30ｇ／m2の割合で水を湿し水
として供給、湿潤させたのち、綿100％のブロー
ド（東洋紡製100双 ブロード）を圧着ラミネー
トし、乾燥させて多孔性展開層を設け、グルコー
ス定量用の多層分析材料を完成させた。 この材料を1.5cm×1.5cmの正方形のチツプに裁
断したのち、特開昭57−63452に開示のプラスチ
ツクマウントに収めてグルコース定量用化学分析
スライドとした。 ヘパリン採血したヒト全血およびそれにそれぞ
れ異なる量のグルコースを加えてグルコース濃度
が異なるヒト全血試料３種類（グルコース濃度は
第５表に示す。）を調整し、それぞれから6μlをミ
クロピペツトで採取し、上記の分析スライドの展
開層の上に点着し、37℃で６分インクベーシヨン
したのち波長500nmの測定光でPETフイルム側
から反射光学濃度を測定し、検量線を作成した。
測定結果を第５表および第２図に示す。 比較例 ２ 試薬層の組成中の化合物(6)モノ塩酸塩のかわり
に化合物（C1）モノ塩酸塩20ｇ配合したほかは
実施例２と同様にしてグルコース定量用化学分析
スライドを作製し、実施例２と同様の測定を行な
い、検量線を作成した。測定結果を第５表および
第２図に示す。 【表】 ＊ 第４表下部の記載と同様にして検
定した値。
第５表および第２図から本発明のグルコース定
量用多層分析材料（フイルム）を用いた化学分析
スライドにおいては比較例２の化学分析スライド
に比べて、同じグルコース濃度に対して発色光学
濃度が大きく、ｒも大きく、従つてより高感度で
あり、かつグルコース濃度が大きい領域までｒが
大きく保たれていて、測定範囲が拡大されている
ことがわかる。またｒがより大きいことから測定
精度がよいこともわかる。 実施例 ３ 化合物(6)モノ塩酸塩のかわりに化合物(1)，(6)，
(7)，(10)をそれぞれ18g配合したほかは実施例２と
同様にして４種のグルコース定量用化学分析スラ
イドを作製した。 比較例 ３ 化合物(6)モノ塩酸塩のかわりに化合物C2（４−
アミノ−１，２−ジメチル−３−フエニル−３−
ピラゾリン−５−オン）を18g配合したほかは実
施例２と同様にしてグルコース定量用化学分析ス
ライドを作製した。 化学分析スライド（多層分析材料）の相対感度 実施例３の４種の化学分析スライド、比較例２
および３の２種の化学分析スライドの合計６種に
ついてグルコース添加ヒト全血（血漿分離後ヘキ
ソキナーゼ−Ｇ−６−DPH法による検定値：グ
ルコース濃度100mg／ｄ）および蒸留水をそれ
ぞれ6μ展開層に点着し、37℃で６分インクベ
ーシヨンした後波長500nmの測定光でPETフイ
ルム側から反射測光して発色光学濃度を測定し
た。ついで次式により化学分析スライド（多層分
析材料）の相対感度を算出した。 化学分析スライドにおける相対感度＝OD（スライドｎ：
ヒト全血）−OD（スライドｎ：蒸留水）／OD（スライド
５：ヒト全血）−OD（スライド５：蒸留水） 但し、OD（スライドｎ：ヒト全血）は化学分
析スライドｎ（ｎは１から６までの番号数字を表
す。この数字は６種の化学分析スライドに第６表
のとおりわりふつた。）を用いて上記のヒト全血
について測定した発色光学濃度値を表す。他も同
様の意味を表わす。 冷水に対する溶解量 化合物(1)，(6)，(7)，(10)，C1，C2それぞれにつ
いて冷水（25℃の蒸留水）10mlに対する溶解量を
テストした。テストは10ｇ以上の溶解量、0.2を
こえ5g以下の溶解量、および0.2gまたは0.2g以下
の溶解量の３レベルにわけて判定した。判定結果
は第６表に示す。 水溶液系における相対感度 色原体として化合物(1)，(6)，(7)，(10)，C1，C2
をそれぞれ用い、カプラーとして１，７−ヒドロ
キシナフタレンを用いて次の組成の発色液を調整
した。 色原体 10μmole １，７−ヒドロキシナフタレン 50μmole ペルオキシダーゼ 50IU 燐酸緩衝液で PH6.0に緩衝 上記組成の発色液５mlをとり37℃で３分インク
ベーシヨンし、その時点でH2O2水溶液（1m
moleから6m moleの範囲内の４レベルおよびブ
ランク）50μを滴下し、さらに37℃で10分イン
クベーシヨンし、直ちに波長515nmの測定光で透
過測光法により発色光学濃度値を判定した。H2
O2濃度と発色光学濃度値（H2O2水溶液での発色
光学濃度値からブランクの発色光学濃度値をさし
ひいた値）との関係を直交軸グラフにプロツトし
て検量線の勾配を定め、化合物C1の場合の検量
線の勾配に対する他の化合物の場合の検量線の勾
配の比を求めて、化合物C1を基準値１とする他
の化合物の相対感度を求めた。相対感度値を第６
表に示す。 【表】 第６表から、本発明に用いた化合物は比較例と
して用いた化合物に比べて水溶液系における感度
はおおむね低く、冷水に対する溶解量は小さい
が、化学分析スライド（多層分析材料）における
感度は著しく高いことから明らかである。 実施例 ４ ゼラチン下塗りが施されてある厚さ185μmの透
明PETフイルム上に、下記組成から成る血中グ
ルコース濃度定量用の試薬層を乾燥後の膜厚がお
よそ15μmになるように塗布、乾燥した。 ペルオキシダーゼ 25000IU １，７−ジヒドロキシナフタレン 5g 化合物(6) 18g ゼラチン 200g ノニオンHS210 2g この上に、0.2ｇのノニオンHS210及びグルコ
ースオキシダーゼ50000IUを含む二酸化チタン微
粉末８ｇをゼラチン１ｇに混合分散したものより
成る光遮蔽層を乾燥膜厚がおよそ15μmになるよ
うに塗布、乾燥した。 この上に水100ml中にゼラチン４ｇ、3.3−ジメ
チルグルタール酸0.5ｇ、およびノニオンHS210
の0.5ｇを加えて接着層塗布液を調整した。これ
を光遮蔽層の上に乾燥膜厚が4μmとなるように塗
布、乾燥し接着層を形成させた。次に、接着層に
30ｇ／m2の割合で水を湿し水として供給、湿潤さ
せたのち、綿100％のブロード（東洋紡製100双
ブロード）を圧着ラミネートし、乾燥させて多孔
性展開層を設け、グルコース定量用の多層分析材
料を完成させた。 この材料を1.5cm×1.5cmの正方形のチツプに裁
断したのち、特開昭57−63452に開示のプラツチ
ツクマウントに収めてグルコース定量用化学分析
スライドとした。 ヒト血漿、およびヒト血漿にそれぞれ異なる量
のグルコースを加えてグルコース濃度が異なるヒ
ト血漿試料３種（グルコース含有量は第７表に示
す。）を調整し、それぞれから6μをミクロピペ
ツトで採取し、上記の化学分析スライドの展開層
の上に点着し、37℃で６分インクベーシヨンした
のち波長500nmの測定光でPETフイルム側から
反射測光として発色光学濃度を測定し、検量線を
作成した。測定結果を第７表および第３図に示
す。 比較例 ４ 化合物(6)のかわりに化合物C1（４−アミノアン
チピリン）を18ｇ用いたほかは実施例４と同様に
して比較用のグルコース定量用化学分析スライド
を作製し、実施例４と同様にして発色光学濃度を
測定し、検量線を作成した。測定結果を第７表お
よび第３図に示す。 【表】 ＊ ヒト血漿およびグルコース添加ヒ
ト血漿について第４表下部の
記載と同様にして検定した値。
第７表および第３図から弱酸３，３−ジメチル
グルタル酸を加えて低PH値に調整した接着層を有
し、使用時においては低PH値に維持されている試
薬層を有する本発明のグルコース定量用多層分析
材料（フイルム）においては、同様に使用時にお
いて低PHに維持されている比較例４の多層分析材
料（フイルム）に比べて同じグルコース濃度に対
して発色光学濃度が大きく、ｒも大きく、従つて
より高感度であり、かつグルコース濃度が大きい
領域までｒが大きく保たれていて測定範囲が拡大
されていることがわかる。またｒがより大きいこ
とから測定精度がよいこともわかる。 実施例 ５ 化合物(10)18ｇを用いたほかは実施例４と同様に
してグルコース定量用化学分析スライドを作製
し、実施例４と同様にして発色光学濃度を測定し
たところ、ほぼ実施例４と同じ結果がえられた。 実施例 ６ 光遮蔽層の組成 二酸化チタンの微粉末 ８ｇ ゼラチン １ｇ コレステロールオキシダーゼ 50000IU ノニオンHS210 0.2ｇ 接着層塗布液の組成 ゼラチン ４ｇ 酢酸ナトリウム ２ｇ コレステロールエステラーゼ 25000IU ノニオンHS210 0.2ｇ 水 100ml 上記の光遮蔽層および接着層にかえたほかは実
施例１と同様にしてコレステロール分析スライド
を作製した。 このスライドについて、遊離コレステロールお
よびエステル型コレステロールを遊離コレステロ
ール換算375mg／ｄ含有する非溶血ヒト血清お
よび部分溶血ヒト血清を用いそれぞれから10μ
をミクロピペツトで取り、展開層に点着して発色
テストを行つた。37℃６分のインクベーシヨン後
の波長500nmでのPETフイルム側からの反射測
光による発色光学濃度はそれぞれ0.53及び0.51で
あつた。 比較例 ５ 試薬層の組成 ペルオキシダーゼ 25000IU １，７−ジヒドロキシナフタレン ５ｇ 化合物（C1） 18ｇ ゼラチン 200ｇ ノニオンHS210 0.2ｇ 上記の試薬層にかえたほかは実施例６と同様に
してコレステロール分析用スライドを作製した。
このスライドについて、実施例６と同じ試料を用
いて実施例６と同様にして発色テストを行なつ
た。37℃６分のインクベーシヨン後の波長500nm
での反射測光による発色光学濃度は非溶血血清で
0.48溶血血清で0.46であつた。
の過酸化水素の定量を実施する場合、または特定
の成分をオキシダーゼ酵素反応系に導入し生成し
た過酸化水素の定量により液体試料中の特定の成
分の定量を実施する場合に有効なペルオキシダー
ゼを含む過酸化水素検出呈色指示薬系を含む多層
分析材料の改良に関するものである。 オキシダーゼ酵素を用い、被検物質又はその反
応生成物を酸化すると同時に生成されるH2O2を
適当な手段により定量する定量法は、近年ますま
す重要になつてきている。その理由はペルオキシ
ダーゼを用いて色素の生成反応に導き、比色的に
H2O2を定量する方法をはじめとして、電極反応
などの手段によりH2O2を定量する方法などH2O2
の定量は確実に実施できるからである。 このような原理に基づく、比色定量法として
は、トラインダー（P.Trinder）が導入した試薬
系を用いる方法（「Ann.Clin.Biochem.」６、24
−27（1969））がよく知られている。この方法に
は、オキシダーゼ酵素によつて生成するH2O2に
ペルオキシダーゼを作用させ、４−アミノアンチ
ピリン（またはその類縁体）とフエノール類（ま
たはナフトール類）との酸化カツプリング反応を
起させ、生成した色素を定量するものである。こ
の反応系の利点は、オキシダーゼ酵素の種類を変
えても同じ検出系を利用することができる点にあ
り、広く、各種の分析項目への応用が検討されて
いる。これらのうち、臨床化学検査上特に重要な
ものは、グルコースオキシダーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼ、ウリカーゼ、グリセロールオキ
シダーゼ、フオスフオグルコースオキシダーゼな
どである。 これらのオキシダーゼ酵素と生成するH2O2の
検出系とを一体型の多層分析フイルムや、紙片
等への含浸ストリツプスの形体とした臨床検査用
分析材料も広く実用化されている。 これらの分析材料は、被検物質の検出に直接関
与する試薬類を含有する組成物が、支持体となる
紙状物や、フイルム上の支持体に、含浸あるい
は塗布された型体をしている。 一体型の多層分析材料（フイルム）は種々の構
成をしており、必要に応じて、各種の機能層が、
積層された形で組み込まれている。これらの機能
層として公知のものとしては、液体試料の均一展
開の目的とした展開層（特公昭53−21677、特開
昭55−164356）、反射測定の白色散乱面及び、上
層にある有色成分と生成された検出用色素とを光
学的に隔離する為の光遮蔽層（特公昭53−21677、
特開昭51−40191、特開昭55−26428、特開昭55−
26429、特開昭55−164356等）、物質の選択的な拡
散を目的としたバリヤー層（特開昭52−3488）ま
たは液体遮断層（特願昭56−176274、特願昭56−
176275）、生成色素の媒染による効率的な検出を
目的とした検出層（特開昭51−40191、特開昭53
−131089）、生成色素の他層への移動の防止を目
的としたマイグレーシヨン防止層（特開昭54−
29700、層間の接着性改良を目的とした接着層
（特開昭55−164356等）などがある。 これらの多層分析フイルムの試薬層にグルコー
スオキシダーゼまたはコレステロールエステラー
ゼおよびコレステロールオキシダーゼ、ペルオキ
シダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび１、７
−ジヒドロキシナフタレンを含むH2O2検出呈色
試薬組成物を用いたグルコース定量用またはコレ
ステロール定量用多層分析フイルムにおいて、検
量線の傾き（γ）が比較的小さく、グルコースま
たはコレステロールの含有量が多い高濃度域にお
いてγが小さく、結果として定量精度が不十分で
かつ測定範囲が不十分という問題があつた。本発
明者らはこの問題点を解決するために鋭意研究を
続けたところ、意外にも、湿式の（水溶液系で実
施される）グルコースまたはコレステロールの定
量には発色光学濃度が不足で低感度という理由で
用いられなかつた水に対する溶解度が４−アミノ
アンチピリンよりも小さい４−アミノアンチピリ
ン誘導体および４−アミノアンチピリン類似の４
−アミノ−３−ピラゾリン−５−オンの１、２、
３−トリ置換体が乾式の多層分析フイルムの試薬
層に用いた場合に前述の問題点が解消されること
を見出し本発明に到達した。 本発明の目的はペルオキシダーゼを含むH2O2
検出呈色試薬組成物を含む試薬層を有する多層分
析材料において、検量線の傾き（γ）が大きく、
被検成分の高濃度領域においてもγが大きく維持
され、測定範囲が拡大された高感度かつ定量精度
がすぐれた多層分析材料を提供することである。 本発明の他の目的はオキシダーゼおよびペルオ
キシダーゼを含むH2O2検出呈色試薬組成物を含
む試薬層を有する多層分析材料において、検量線
のγが大きく、被検成分の高濃度領域においても
γが大きく維持され、測定範囲が拡大された高感
度でかつ定量精度がすぐれた多層分析材料を提供
することである。 本発明の他の目的はオキシダーゼおよびペルオ
キシダーゼを含むH2O2検出呈色試薬組成物を含
む試薬層を有する多層分析材料において、検量線
のγが大きく、被検成分の高濃度域においてもγ
が大きく維持され、測定範囲が拡大された高感度
で定量精度がすぐれており、かつ短時間に測定可
能な多層分析材料を提供することである。 本発明の他の目的はグルコースオキシダーゼお
よびペルオキシダーゼを含むH2O2検出呈色試薬
組成物を含む試薬層を有するグルコース定量用多
層分析材料において、検量線のγが大きく、グル
コース含有量の多い高濃度域においてもγが大き
く維持され、測定範囲が拡大された高感度で定量
精度がすぐれており、かつ短時間で測定可能なグ
ルコース定量用多層分析材料を提供することであ
る。 本発明は、下記の構成を有する多層分析材料に
ある。 １ 水不浸透性光透過性支持体の上に、少なくと
もペルオキシダーゼ、およびペルオキシダーゼ
と過酸化水素の存在下で検出可能な変化を生じ
うる色原体とカプラーの組合せを含む過酸化水
素検出用呈色指示薬組成物を含む試薬層、なら
びに多孔性展開層の二つの層を少なくとも有
し、この順に積層されてなる多層分析材料にお
いて、前記色原体が下記一般式［１］： ［R1は三個以下のハロゲン原子もしくは一
個の低級アルキル基で置換されていてもよいフ
エニル基を表わし、R2は、低級アルキル基を
表わし、そしてR3は低級アルキル基もしくは
フエニル基を表わす。また、ピラゾロン核に付
けた数字は位置番号を表わす。］ で表わされる４−アミノ−３−ピラゾリン−
５−オンの１、２、３−トリ置換体であること
を特徴とする多層分析材料。 本発明の主要な実施の態様を次に示す。 １ 前記カプラーがペルオキシダーゼの共存下に
前記色原体と酸化カプリング反応により色素を
形成しうる化合物である上記の多層分析材料。 ２ 前記試薬層にペルオキシダーゼとともに前記
色原体および前記カプラーが含有されている上
記の多層分析材料。 ３ 前記試薬層または他のいずれか一つの層にオ
キシダーゼが含有されている上記の多層分析材
料。 ４ 前記一般式［１］のR1がフエニル基である
上記の多層分析材料。 ５ 前記一般式［１］のR1がクロロフエニル基
である上記の多層分析材料。 本発明の多層分析材料における光透過性水不浸
透性支持体は波長約200nmから約900nmの範囲の
少なくともある範囲の波長領域の電磁波（紫外
線、近紫外線、可視光、または近赤外線）を約40
％以上、好ましくは約65％以上透過させることが
でき、実質的に水をその内部に浸透させることが
なく、かつその表面に設けられる後述の試薬層ま
たは下塗層に含有されるバインダーポリマーまた
は他の成分と実質的に化学反応を生じさせない素
材からなる。前述の規準にあうかぎり支持体とし
て用いることができる素材は何でもよい。支持体
としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフ
エノールＡのポリカルボネート、ポリメチルメタ
クリレート、ポリスチレン、セルローステステル
（例、セルロースジアセテート、セルローストリ
アセテート、セルロースアセテートプロピネー
ト）などのポリマーからなる透明シートまたはフ
イルムや透明ガラス板などで厚さ約50μｍから約
2mm、好ましくは約70μｍから約0.5mmの範囲の
ものを用いることができる。 支持体の表面には試薬層（または他の機能層）
を支持体に一体に接着することを容易にする目的
で公知の下塗層を設けるか、あるいは支持体の表
面を公知の化学的処理（例、酸処理、アルカリ処
理）または物理化学的処理（例、コロナ放電処
理、グロー放電処理、紫外線照射処理、火陥処
理）を施すことができる。 本発明の多層分析材料に用いられる少なくとも
ペルオキシダーゼを含む試薬層とは少なくともペ
ルオキシダーゼを含む過酸化水素検出用呈色指示
薬組成物（以下、H2O2呈色試薬という。）を含む
試薬組成物が親水性バインダーポリマーのマトリ
クスの中に分散または溶解されてなる試薬層であ
る。 H2O2呈色試薬はペルオキシダーゼ、およびペ
ルオキシダーゼと過酸化水素の存在下で検出可能
な色変化（一般に発色または色相の変化）を生じ
うる色原体とカプラーの組み合せを含む呈色指示
薬組成物である。 本発明に用いることができるトリ置換−４−ア
ミノ−３−ピラゾリン−５−オンの詳しい説明を
以下に示す。（ピラゾリン核に付けた数字は位置
番号を示す。） 一般式［１］のR1のフエニル基に置換されて
いてもよいハロゲン原子の例としては、塩素原
子、臭素原子およびヨウ素原子を挙げることがで
きる。特に好ましいのは塩素原子である。フエニ
ル基に置換され得るハロゲン原子は三個以内であ
る。そのようなハロゲン原子置換フエニル基の例
としては、２−クロロフエニル基、３−クロロフ
エニル基、４−クロロフエニル基、２、５−ジク
ロロフエニル基、３、４−ジクロロフエニル基、
３、５−ジクロロフエニル基、２、４、６−トリ
クロロフエニル基、４−ブロモフエニル基、４−
ヨードフエニル基などを挙げることができる。 一般式［１］のR1のフエニル基に置換されて
いてもよい低級アルキル基は、炭素数１〜５の直
鎖状もしくは分岐状のアルキル基で、その例とし
ては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ
−ブチル基、イソプロピル基、イソアミル基を挙
げることができる。そのような低級アルキル置換
フエニル基の例としては、４−メチルフエニル基
および４−エチルフエニル基を挙げることができ
る。 R2そしてR3における低級アルキル基の例も上
記と同じである。 上記に示すような一般式［１］のトリ置換−４
−アミノ−３−ピラゾリン−５−オンは、後に実
施例で示す各種の化合物とほぼ同一の発色特性を
示し、かつその水溶性も低く、本発明の多層分析
材料に用いる色原体として有利に用いることがで
きる。 一般式〔１〕で表わされるトリ置換−４−アミ
ノ−３−ピラゾリン−５−オンはいずれもその４
−位のアミノ基が酸付加塩となつた４−アンモニ
オ−３−ピラゾリン−５−オンをも包含するもの
であつて、酸付加塩を構成する酸の例としては塩
化水素酸、臭化水素酸、沃化水素酸、硝酸、過塩
素酸、硫酸などの無機酸、蟻酸、酢酸、プロピオ
ン酸、蓚酸、グルタル酸、３、３−ジメチルグル
タル酸、りんご酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホ
ン酸などの有機酸をあげることができる。好まし
い酸付加塩の例として塩化水素酸付加塩をあげる
ことができる。 一般式〔１〕で表わされるトリ置換−４−アミ
ノ−３−ピラゾリン−５−オンの具体例を第１表
にあげる。これらの化合物のうちでは化合物(1)か
ら(10)までの10種の化合物およびそれらの酸付加塩
が好ましく、化合物(6)、(7)、(10)およびそれらのモ
ノ塩酸塩が最も好ましい。 【表】 【表】 本発明においてH2O2呈色試薬に用いることが
できるカプラーはペルオキシダーゼの共存下に色
原体と酸化的カプリング反応により色素を形成し
うる化合物である。カプラーとして特開昭49−
50991、特開昭50−137192、「Clinical
Chemistry」24(8)、1335−1342（1978）、C.E.K.
Mees、T.H.James編「The Theory of the
Photographic Process」Third Edition
（Macmillan Co.、1968年発行）387−396ページ
などに記載のフエノール、ナフトール、およびハ
ロゲン原子（塩素原子、臭素原子など）、アルキ
ル基、アルコキシ基、フエニル基、フエノキシ
基、ニトロ基、またはヒドロキシ基を有するフエ
ノール誘導体およびナフトール誘導体、前記の
「The Theory of the Photographic Process」
Third Edition387−396ページ、特開昭57−
94655などに記載のバラスト基を有するフエノー
ル誘導体およびナフトール誘導体、特開昭49−
50991に記載のアルキル基を有するヒドロキシキ
ノリン類および他の置換基をもたないヒドロキシ
キノリン類、前記の「The Theory of the
Photographic Process」Third Edition387−396
などに記載の活性メチレン基含有鎖状化合物およ
び活性メチレン基含有環状化合物などがある。 これらのカプラーのうちで本発明に好ましいカ
プラーは、一般式〔２〕で表わされるフエノール
またはフエノール誘導体、および一般式〔３〕で
表わされるナフトールまたはナフトール誘導体で
ある。 一般式〔２〕においてR62ないしR66はそれぞ
れ水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アル
コキシ基、フエニル基、ベンジル基、フエネチル
基、ニトロ基またはハロゲン原子（塩素原子、臭
素原子または沃素原子）を表わし、R62ないし
R66のうち少なくとも２個は水素原子であり、残
余の置換基はいかなる組合せでもよい。 一般式〔３〕においてR71ないしR78はそれぞ
れ水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アル
コキシ基、フエニル基、ベンジル基、フエネチル
基、ニトロ基またはハロゲン原子（塩素原子、臭
素原子、または沃素原子）を表わし、R71ないし
R78のうち少なくとも１個はヒドロキシル基、少
なくとも４個は水素原子であり、残余の置換基は
いかなる組合せでもよい。 一般式〔２〕におけるR62ないしR66、一般式
〔３〕におけるR71ないしR78がアルキル基の場
合、その例として炭素原子数１ないし18の直鎖状
または分岐状アルキル基、または炭素原子数３な
いし18のシクロアルキル基があり、その具体例と
してメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、ペンチル基、ヘキシル基、イソプロピル基、
イソブチル基、イソアミル基、シクロプロピル
基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが
ある。 R62なしいR66、R71ないしR78がアルコキシ基
の場合、その例として炭素原子数１ないし18の直
鎖状または分岐状アルキル基、または炭素原子数
３ないし18シクロアルキル基を有するアルコキシ
ル基があり、その具体例としてメトキシ基、エト
キシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオ
キシ基、イソプロポキシ基、イソブトキシ基、イ
ソアミロキシ基、シクロプロピルオキシ基、シク
ロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基な
どをあげることができる。 一般式〔２〕で表わされるフエノールまたはフ
エノール誘導体の具体例として第２表の化合物が
ある。 【表】 【表】 一般式〔３〕で表わされるナフトールまたはナ
フトール誘導体の具体例として第３表の化合物が
ある。 【表】 これらの化合物のうちでは、ナフトール誘導体
が好ましく、１、７−ジヒドロキシナフタレンお
よび４−メトキシ−１−ナフトールが最も好まし
い。 ペルオキシダーゼとして特公昭56−45599、特
公昭57−5520等に開示の植物起源および動物起源
のペルオキシダーゼ（EC1.11.7）、および特開昭
57−99192等に開示の微生物起源のペルオキシダ
ーゼ（EC1.11.7）のうちから適宜に１種または２
種以上を組合せて用いることができる。 植物起源のペルオキシダーゼの例として、西洋
わさび、じやがいも、いちじく樹液、かぶ、だい
こんから抽出されたペルオキシダーゼを、動物起
源のペルオキシダーゼの例として、牛乳から抽出
されたラクトペルオキシダーゼ、白血球から抽出
されたベルドペルオキシダーゼを、微生物起源の
ペルオキシダーゼとしてAlternaria属、
Cochliobolus属、Curvularia属、Pellicularia属
に属し非特異的ペルオキシダーゼ生産能を有する
微生物起源のペルオキシダーゼを、それぞれあげ
ることができる。 その他に特公昭56−45599、特公昭57−5520等
に開示のチオシアン酸鉄、タンニン酸鉄、フエロ
シアン化鉄（いずれも鉄（＋２）化合物）、クロ
ム硫酸カリウム、沃化ナトリウム、沃化カリウ
ム、モリブデン酸アンモニウム、モリブデン酸カ
リウム等のペルオキシダーゼ活性を有する無機化
合物を用いることもできる。 これらのうちで植物起源または微生物起源の非
特異的ペルオキシダーゼが好ましい。 本発明の多層分析材料においては、少なくとも
ペルオキシダーゼを含む試薬層はペルオキシダー
ゼ、および色原体とカプラーの組合せが親水性ポ
リマーバインダーの中に溶解または分散されてな
るものである。バインダーとして用いることがで
きる親水性ポリマーはペルオキシダーゼ、色原体
およびカプラーと実質的に相互作用を生ずること
がなく、被膜形成能を有するものであれば何でも
よい。親水性ポリマーの例としてゼラチン、酸処
理ゼラチン、脱イオン化ゼラチン、ゼラチン誘導
体（例、アシル化ゼラチン）、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルベンゼ
ンスルホン酸ナトリウム、カルボキシメチルセル
ロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロー
ス、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロ
ース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリル
アミド、アクリルアミドコポリマー（例、アクリ
ルアミド−Ｎ−ビニルピロリドンコポリマー、ア
クリルアミド−２−ヒドロキシエチルアクリルア
ミドコポリマー）、をあげることができる。試薬
層の厚さ（乾燥厚さ）は約5μmから約100μm、好
ましくは約10μmから約50μmの範囲である。 試薬層におけるペルオキシダーゼの含有量は約
５千Ｕ／m2から約10万Ｕ／m2、好ましくは約１
万Ｕ／m2から約６万Ｕ／m2の範囲である。色原
体とカプラーの組合せの含有量は液体試料に含有
されると予想される被検成分の最大含有量に対応
する化学量論による量またはそれより多い量が必
要であり、この量は当業者が実験により決めるこ
とができる。 被検物質が過酸化水素でなく、化学反応により
過酸化水素を生成する反応系に組みこむことがで
きる場合には、被検物質が酸素と相互作用して過
酸化水素を生成するための触媒としてオキシダー
ゼを試薬層または他の層に含有させておくことが
できる。オキシダーゼは被検物質に応じて選択さ
れる必要がある。オキシダーゼとしては１種のオ
キシダーゼを用いられることはもちろん、一連の
連続反応を進行させる複数種の酵素の組合せ（そ
の中の１種はオキシダーゼである。）を用いるこ
ともできる。さらに必要な場合にはオキシダーゼ
とともにそのオキシダーゼの補因子および／また
は補酵素を組合せて用いることはいうまでもな
い。 オキシダーゼ（必要に場合には補酵素もとも
に）はペルオキシダーゼ、および色原体とカプラ
ーの組合せを含む試薬層に含有させるか、あるい
は試薬層よりも上側（試薬層を基準にして支持体
から遠い側）の層に含有させるか、さらにはペル
オキシダーゼ、および色原体とカプラーの組合せ
を含む試薬とそれよりも上側の層（１層または複
数の層）の両方（または合計３層以上）に含有さ
せることができる。ここで試薬層より上側の層と
いう表現には多孔性展開層をも含めることができ
る。オキシダーゼが触媒する基質の反応には酵素
の存在が必須であり、多層分析材料においては酸
素は空気中から展開層を経て他の層内へ拡散する
ので、オキシダーゼが触媒する酸化反応の効率的
な進行にとつては酸素の層中への拡散の効率的な
達成を目的とした特願昭56−93631に開示した、
オキシダーゼをペルオキシダーゼ、および色原体
とカプラーの組合せを含む試薬層より上側の層、
ことに多孔性展開層または多孔性展開層に隣接す
る層に含有させた構成の多層分析材料とすること
が好ましい。またコレステロールエステルのよう
に親油性物質が被検物質である場合には、親水性
バインダーポリマーを有する層へは被検物質が浸
透しにくいので、ことに多孔性展開層の内部にオ
キシダーゼを含有させることが好ましい。 本発明の多層分析材料に含有させることができ
るオキシダーゼとして酵素（O2）をアクセプタ
とするオキシダーゼがあげられ、その例として次
の酵素をあげることができる。（）内はEC
Numberを表わす。 グリコレートオキシダーゼ （1.1.3.1） マレートオキシダーゼ （1.1.3.3） グルコースオキシダーゼ （1.1.3.4） ヘキソースオキシダーゼ （1.1.3.5） コレステロールオキシダーゼ （1.1.3.6） アリールアルコールオキシダーゼ （1.1.3.7） Ｌ−グルコノラクトンオキシダーゼ
（1.1.3.8） ガラクトースオキシダーゼ （1.1.3.9） アルコールオキシダーゼ （1.1.3.13） Ｌ−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ
（1.1.3.15） アルデヒドオキシダーゼ （1.2.3.1） キサンチンオキシダーゼ （1.2.3.2） ピルベートオキシダーゼ （1.2.3.3） ピルベートオキシダーゼ（CoAアセチル化）
（1.2.3.6） ラトステロールオキシダーゼ （1.3.3.2） Ｄ−アスパルテートオキシダーゼ （1.4.3.1） Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ （1.4.3.2） Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ （1.4.3.3） アミンオキシダーゼ（フラビン含有）
（1.4.3.4） ピリドキサミンホスフエートオキシダーゼ
（1.4.3.5） アミンオキシダーゼ（銅含有） （1.4.3.6） Ｄ−グルタメートオキシダーゼ （1.4.3.7） サルコシンオキシダーゼ （1.5.3.1） Ｎ−メチルアミノ酸オキシダーゼ （1.5.3.2） N6−メチル−Ｌ−リシンオキシダーゼ
（1.5.3.4） ウリカーゼ（ウレートオキシダーゼ）
（1.7.3.3） スルフイトオキシダーゼ （1.8.3.1） アスコルベートオキシダーゼ （1.10.3.3） ３−ヒドロキシアントラニレートオキシダー
ゼ （1.10.3.5） アルギニン２−モノオキシゲナーゼ
（1.13.12.1） リシン２−モノオキシゲナーゼ （1.13.12.2） トリプトフアン２−モノオキシゲナーゼ
（1.13.12.3） ラクテートオキシダーゼ（ラクテート２−モ
ノオキシゲナーゼ （1.13.12.4） ジメチルアニリンモノオキシゲナーゼ
（1.14.13.8） コレステロール7α−モノオキシゲナーゼ
（1.14.13.17） Flavoprotein−linked monooxygenate
（1.14.14.1） フエニルアラニンモノオキシゲナーゼ
（1.14.16.1） グリセロールオキシダーゼ（東洋醸造から販
売） グリシンオキシダーゼ（化学大辞典第３巻
（1960年９月発行）に記載） オキシダーゼを含む複数種の酵素の組合せの例
として以下のものがある。 グリセロールキナーゼ（2.7.1.30）およびＬ
−α−グリセロ燐酸オキシダーゼ（1.1.99.5；
または特開昭53−72892、特開昭53−24893に開
示）の組合せ（特開昭53−24893に開示） トリグリセリド加水分解活性をもつリパーゼ、
グリセロールキナーゼ（2.7.1.30）およびＬ−
α−グリセロ燐酸オキシダーゼ（1.1.99.5；ま
たは特開昭53−72892、特開昭53−24893に開
示）の組合せ（特開昭53−24893に開示） エステラーゼ作用をもつリパーゼ、プロテアー
ゼおよびコレステロールオキシダーゼ
（1.1.3.6）の組合せ（特開昭50−137192に開示） グルタミルピルベートトランスアミナーゼ（ア
ラニンアミノトランスフエラーゼと同じ。
2.6.1.2）およびピルベートオキシダーゼ
（1.2.3.3）の組合せ（特願昭56−93632に開示） グルタミルオキサロアセテートトランスアミナ
ーゼ（グルタミン−オキソ酸アミノトランスフ
エラーゼと同じ。2.6.1.15）、オキサロアセテー
トデカルボキシラーゼ（4.1.1.3）およびピルベ
ートオキシダーゼ（1.2.3.3）の組合せ（特願昭
56−93632）に開示） これらのオキシダーゼのうちで、本発明の多層
分析材料において好ましいのは、グリコレートオ
キシダーゼ、マレートオキシダーゼ、グルコース
オキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ、Ｌ−グルコノラクトンオ
キシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、キサン
チンオキシダーゼ、ピルベートオキシダーゼ、ウ
リカーゼ、アスコルベートオキシダーゼ、ラクテ
ートオキシターゼ、グリシンオキシダーゼ、グリ
セロールオキシダーゼなど、およびオキシダーゼ
を含む複数種の酵素の組合せとして例示した組合
せがあげられる。 オキシダーゼの多層分析材料中における含有量
は、主として液体試料に含有される過酸化水素を
生成する被検物質の予想される最大量とオキシダ
ーゼおよびペルオキシダーゼの活性値の比により
決めることができ、これは当業者が実験により決
めることができるが、おおよその含有量として約
１千Ｕ／m2から約10万Ｕ／m2、好ましくは約３
千Ｕ／m2から約５万Ｕ／m2の範囲である。オキ
シダーゼがグルコースオキシダーゼの場合には、
その含有量は約２千Ｕ／m2から約４万Ｕ／m2、
好ましくは約４千Ｕ／m2から約２万Ｕ／m2の範
囲である。 ペルオキシダーゼ、およびオキシダーゼはそれ
ぞれの活性が最大になる最適PH値はーあり、さら
にはそれぞれの活性はイオン強度や近傍に共存す
る陽イオンや陰イオンの種類による影響をもうけ
る。従つて多層分析材料においては、第一にペル
オキシダーゼを含む試薬層、オキシダーゼを含む
層、またはペルオキシダーゼとオキシダーゼをと
もに含む試層それぞれのPH値を、ついで必要に応
じてイオン強度や共存するイオン種などの因子を
最適に設定することが、よい分析結果（定量精
度、くりかえし再現性などについて）を得るため
にはきわめて重要である。かかる目的の為に多孔
性展開層、試薬層、光遮蔽層その他の機能層中に
酸、アルカリ、塩、緩衝剤、解離剤、界面活性剤
などを含有させておくことは本発明の実施に当つ
て重要なことである。これら反応条件設定の為の
試薬類の種類、量などは、分析の目的その他によ
つて大きく変化するので、目的に従つて適宜、選
択する必要がある。 ペルオキシダーゼ、および色原体とカプラー組
合せを含む試薬層に酸、アルカリまたは緩衝剤を
含有させて過酸化水素の存在下で検出可能な変化
を起させるには、ペルオキシダーゼの最適PH値で
あるPH7.0を中心にしてPH約5.0から約9.0、好まし
くは約6.0から8.0の範囲のPH値範囲の下で変化を
生じさせることが好ましい。 オキシダーゼはその最適PH値は酵素の種類によ
り異なるが、例示すれば、グルコースオキシダー
ゼ：PH約5.6；ヘキソースオキシダーゼ：PH約
6.3；コレステロールオキシダーゼ：PH約5.8；ガ
ラクトースオキシダーゼ：PH約7.0；アルコール
オキシダーゼ：PH約7.5；ウリカーゼ：PH7.5〜
8.5；アスコルベートオキシダーゼ：PH約5.6；Ｌ
−α−グリセロ燐酸オキシダーゼ：PH7.5〜7.7で
ある。 オキシダーゼを含む層はオキシダーゼの種類に
よりそれぞれの最適PH値またはその近傍のPH値範
囲に調整することが好ましい。ペルオキシダーゼ
の最適PH値と異なる最適PH値をもつオキシダーゼ
はそれ故に別々の層に含有させることが好まし
い。例えばグルコースオキシダーゼを多孔性展開
層または後述する接着層に含有させる場合には、
多孔性展開層または接着層に使用条件下において
グルコースオキシダーゼの最適PH値であるPH5.6
を中心としてPH3.6からPH7.6、好ましくはPH4.0か
らPH7.0の範囲に維持することができる酸または
緩衝剤を加えることができる。 試薬層、他の層、または多孔性展開層に含有さ
せることができる酸、アルカリまたは緩衝剤とし
て脂肪族ヒドロキシカルボン酸（例、グリコール
酸、乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、グリセリン酸、
タルトロン酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸）、
脂肪族ジカルボン酸（例、マロン酸、こはく酸、
グルタル酸、α−メチルグルタル酸、β−メチル
グルタル酸、３、３−ジメチルグルタル酸、α、
α′−ジメチルグルタル酸）、脂肪族モノカルボン
酸（例、酢酸、プロピオン酸、酪酸）、水酸化リ
チウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、日
本化学会編「化学便覧 基礎編」（東京、丸善(株)、
1966年発行）1312−1320ページに記載の緩衝剤
（例、くえん酸水素カリウム−くえん酸、燐酸二
水素カリウム−燐酸水素二ナトリウム）、
「Biochemistry」、５（２）、467−477（1966）の
Norman E.Goodら著「Hydrogen Ion Buffers
for Biological Research」R.M.C.Dawson et
al編「Date for Biochemical Research」第２版
（Oxford at the Clarendon Press、1969年発行）
476−508ページ、「Analytical Biochemistry」、
104、300−310（1980）等に記載の緩衝剤（例、２
−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−２−ヒド
ロキシプロパン−３−スルホン酸（Heppso）ナ
トリウム塩またはカリウム塩、Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−N′−３−プロパンスルホ
ン酸（Epps）ナトリウム塩またはカリウム塩）、
Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−３−
アミノプロパンスルホン酸（Taps）ナトリウム
塩またはカリウム塩、その他の緩衝剤（例、マレ
イン酸モノナナトリウムまたはモノカリウム塩、
３、３−ジメチルグルタル酸モノナトリウムまた
はモノカリウム塩）、無機酸（硫酸、燐酸）があ
る。これらのうちではくえん酸、酒石酸、りんご
酸、グルタル酸、α−メチルグルタル酸、β−メ
チルグルタル酸、α、α′−ジメチルグルタル酸、
３、３−ジメチルグルタル酸、水酸化リチウム、
Heppso Na 塩またはＫ塩、Epps Na 塩また
はＫ塩、Taps Na 塩またはＫ塩が好ましい。 試薬層、試薬層より上側の他の層または多孔性
展開層のいずれか１層または複数の層には保恒剤
として全血、血漿または血清中に添加されている
NaFによる測定値の低下またはバラつきとして
現れる干渉作用を除去する目的で、Ｆ イオンと
の間に25℃における水100gに対する溶解度が0.2g
以下の水に難溶性の塩を形成しうる陽イオンを含
む化合物（難溶性Ｆ塩形成性化合物）を特願昭57
−131750明細書の記載に従つて含有させることが
できる。陽イオンとしてはMgMg2 、Ca2 、
Ba2 などがあり、対陰イオンとしては蟻酸イオ
ン、酢酸イオン、プロピオン酸イオンなどの低級
脂肪族モノカルボン酸陰イオン、マロン酸イオ
ン、グルタル酸イオン、３、３−ジメチルグルタ
ル酸イオンなどの低級脂肪族ジカルボン酸陰イオ
ン、グリコール酸イオン、乳酸イオン、りんご酸
イオン、酒石酸イオン、くえん酸イオン、サリチ
ル酸イオンなどのヒドロキシカルボン酸陰イオ
ン、塩素陰イオン、臭素陰イオンなどのハロゲン
陰イオン、硝酸イオン、燐酸イオン、硫酸イオ
ン、アジド陰イオン（N3 ）などがある。難溶
性Ｆ塩形成性化合物の層中の含有量は多層分析材
料１ｍ2につき0.1meqから1eq、好ましくは
0.2meqから0.5eqの範囲である。 試薬層、試薬層より上側の他の層または多孔性
展開層のいずれか１層または複数の層には血中カ
タラーゼによる発色光学濃度の減少、すなわち測
定値の低下として現れる干渉作用を除去する主目
的で、25℃における水100gに対する溶解度が1g
以上の水溶性モノカルボン酸またはその塩を含有
させることができる。 水溶性モノカルボン酸またはその塩としては脂
肪族モノカルボン酸およびその塩、芳香族モノカ
ルボン酸およびその塩、芳香族置換脂肪族モノカ
ルボン酸およびその塩のいずれか１種または２種
以上の組合せて用いることができる。脂肪族モノ
カルボン酸としては炭素原子数１乃至５の直鎖ま
たは分岐状の飽和脂肪族モノカルボンがあげら
れ、その具体例として、蟻酸、酢酸、プロピオン
酸、酪酸、吉草酸、イソ吉草酸があげられる。脂
肪族モノカルボン酸の塩としては炭素原子数１乃
至５の直鎖または分岐状の飽和脂肪族モノカルボ
ン酸のアルカリ金属塩（例、リチウム塩、ナトリ
ウム塩、カリウム塩）およびアンモニウム塩があ
げられ、その具体例として、蟻酸、酢酸、プロピ
オン酸、酪酸、吉草酸、イソ酪酸、イソ吉草酸の
それぞれリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩
およびアンモニウム塩があげられる。 芳香族モノカルボン酸塩の具体例として安息香
酸リチウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリ
ウム、安息香酸アンモニウム、ｏ−トルイル酸ナ
トリウム、ｏ−トルイル酸カリウム、ｍ−トルイ
ル酸ナトリウム、ｐ−トルイル酸ナトリウム、ｐ
−トルイル酸カリウム、ｐ−トルイル酸アンモニ
ウムがあげられる。 芳香族置換脂肪族モノカルボン酸およびその塩
の具体例としてフエニル酢酸、フエニル酢酸ナト
リウム、フエニル酢酸カリウム、フエニル酢酸ア
ンモニウムがあげられる。 これらの水溶性モノカルボン酸またはその塩で
好ましい化合物は酢酸、プロピオン酸、蟻酸ナト
リウム、蟻酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カ
リウム、酢酸アンモニウム、プロピオン酸ナトリ
ウム、プロピオン酸カリウム、プロピオン酸アン
モニウムである。水溶性モノカルボン酸またはそ
の塩の層中の含有量は多層分析材料1m2につき
0.1meqから1eq、好ましくは0.2meqから0.5eqの
範囲である。 本発明の多層分析材料における多孔性展開層
（以下、展開層ということがある。）は分析材料の
最外面に位置し（すなわち、分析材料において試
薬層に関して支持体と反対側の最外面に位置す
る。）て、被検体液が点着される面であり、その
作用は点着された被検体液が被検体を含んだまま
液体の容量には無関係に単位面積当りほぼ一定容
量の被検体液を試薬層に供給する機能を果すこと
である。この作用（展開作用）により少なくとも
ペルオキシダーゼを含む試薬層（以下、試薬層と
いうことがある。）に供給される被検体液の容量、
さらには被検体液に含まれる被検体の容量は単位
面積当りほぼ等しいことになり、またこの作用が
存在するゆえに、定量分析に際して被検体液を正
確に秤取しなくても定量分析が実施できることを
意味する。当然のことであるが被検体液を正確に
秤取して定量分析を実施することを排除するもの
でもないし、被検体液を正確に秤取することによ
り定量の精度が高まる場合がある。 本発明の分析材料における多孔性展開層とし
て、特開昭49−53888（特公昭53−21677）、米国特
許第3992158号に開示されている非繊維等方的多
孔性層（例、メンブランフイルターまたはブラツ
シユポリマー層、微小球体または粒子を接着剤で
結合することにより製造された球体または粒子間
の相互結合空間により当方的多孔性が形成されて
いる層）、特開昭55−90859に開示されている微小
球状ビーズが水により膨潤しない接着剤により点
接触状に接着されて形成された三次元格子構造物
からなる連続空隙含有等方的多孔性構造物層、特
開昭55−164356に開示されている水洗された織物
または親水化処理織物からなる繊維質異方性多孔
性展開層、特開昭57−66359に開示されている物
理的活性化処理された表面を有する織物からなる
繊維質異方性多孔性展開層、特願昭56−34370に
開示されている合成ポリマー繊維パルプを含む抄
造紙、抄造紙または不織布からなる繊維質異方
性多孔性展開層を用いることができ、かつこれら
の展開層はここにあげた特許明細書に開示の方法
により設けることができる。また特開昭49−
53888に開示されているごとく、二酸化チタン、
酸化亜鉛、または硫酸バリウムの微粉末を含有す
るメンブランフイルターまたはブラツシユポリマ
ー層は後述する光遮蔽層（輻射線ブロツキング
層、白色背景層または光反射層）をかねる展開層
として本発明において用いることができる。さら
にカーボンブラツクを含有するメンブランフイル
ターまたはブラツシユポリマー層を後述する光遮
蔽層をかねる展開層として用いることができる。
被検体液が全血の場合、好ましい展開層として前
述の三次元格子構造物からなる連続空隙含有等方
的多孔性構造物層および前述の繊維質異方性多孔
性展開層があげられる。 本発明の多層分析材料においては試薬層と展開
層の間に水および被検体透過性の光遮蔽層（色遮
蔽層、輻射線ブロツキング層、背景層または光反
射層ともいう。）を設けることができる。光遮蔽
層は、たとえば、赤血球を含む全血の如く、被検
体液が着色粒子を含む場合に有用な層である。即
ち光遮蔽層の片側にある着色粒子の色はこの層に
よつてさえぎられて反対側、すなわち透明支持体
側からは着色粒子の色は全く見えず、従つて比色
定量または螢光測光定量に当つて着色粒子が定量
の妨害をしない。光遮蔽層は、二酸化チタン微粉
末、硫酸バリウム微粉末、酸化亜鉛微粉末、アル
ミニウム微粉末またはカーボンブラツクの如き微
粉体を水および被検体透過性の親水性ポリマーバ
インダー中に分散した層で、5μmから100μm、好
ましくに5μmから30μmの範囲の厚さがあり、被
検体液および被検体は通過しうるものである。光
遮蔽層のポリマーバインダーとしては試薬層に用
いたのと同じ種類の親水性ポリマーの中から適宜
に選択して用いることができる。 光遮蔽層としては二酸化チタン微粉末酸化亜鉛
微粉、硫酸バリウム微粉末またはカーボンブラツ
クなどの光遮蔽能を有する微粒子を含んだメンブ
ランフイルター（ブラツシユポリマー層）を多孔
質光遮蔽層として用いることができる。多孔質光
遮蔽層は特開昭49−53888（特公昭53−21677）ま
たは特開昭54−29700に開示の方法により設ける
ことができる。 本発明の多層分析材料においては展開層を試薬
層、光遮蔽層、または必要により設けられる他の
層の上に接着し積層して一体化するための接着を
強化する目的で接着層を設けることができる。こ
とに展開層として多孔性のシート状、フイルム状
または膜状の素材を用いる場合には接着層を設け
ることが好ましい。 接着剤としては試薬層のバインダーとして用い
られている水および被検体透過性親水性ポリマー
を用いることができ、この場合には接着層の親水
性ポリマーが半乾きの状態のとき、または親水性
ポリマーを水または界面活性剤を含む水で湿潤さ
せておいて、展開層として用いる多孔性のシート
状、フイルム状または膜状の素材を適当な圧力を
かけて接着層に接着することができる。接着層の
厚さは0.5μmから15μm、好ましくは0.5μmから
5μmの範囲である。 本発明の多層分析材料には前記の諸層のほかに
必要に応じて、特開昭52−3488、特願昭56−
176274、特願昭56−176275に開示のバイヤー層ま
たは液体遮断層、特開昭51−40191、特開昭53−
131089等に開示の検出層または媒染層、特開昭54
−29700に開示のマイグレーシヨン阻止層、特開
昭54−26793（特公昭57−28277）、特開昭51−
40191等に開示の中間層、特開昭53−131089、特
開昭57−40649、特開昭57−50660、特願昭57−
61936等に開示の蛋白質を通過させることができ
る親水性バインダーポリマーを用いた層、特開昭
56−8549に開示の試薬含有微粒子分散層、実開昭
57−42951に開示の一定面積の液体試料点着供給
用ポーラス体（パツチ）、特願昭56−93632に開示
の酵素等の試薬を含む定面積多孔性層を設けるこ
とができる。 本発明の多層分析材料はここまでの説明から明
らかなとおり、透明支持体の上に順にペルオキシ
ダーゼを含む試薬層および展開層が設けられた構
成を有するが、好ましい実施態様として、透明支
持体の上に順にペルオキシダーゼを含む試薬層、
光遮蔽層および展開層が設けられた構成を有する
もの、透明支持体の上に順にペルオキシダーゼを
含む試薬層、光遮蔽層、接着層および展開層が設
けられた構成を有するもの、透明支持体の上に順
にペルオキシダーゼを含む試薬層、オキシダーゼ
を含む光遮蔽層および展開層が設けられた構成を
有するもの、透明支持体の上に順にペルオキシダ
ーゼを含む試薬層、光遮蔽層、オキシダーゼを含
む接着層、および展開層が設けられた構成を有す
るもの、透明支持体の上に順にペルオキシダーゼ
を含む試薬層、光遮蔽層、オキシダーゼを含む接
着層、およびオキシダーゼを含む展開層が設けら
れた構成を有するもの、透明支持体の上に順にペ
ルオキシダーゼを含む試薬層、オキシダーゼを含
む光遮蔽層、オキシダーゼを含む接着層、および
展開層が設けられた構成を有するもの、透明支持
体の上に順にペルオキシダーゼおよびオキシダー
ゼを含む試薬層、光遮蔽層、および展開層が設け
られた構成を有するもの、透明支持体の上に順に
ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼを含む試薬
層、オキシダーゼを含む光遮蔽層、接着層、およ
び展開層が設けられた構成を有するもの、透明支
持体の上に順にペルオキシダーゼおよびオキシダ
ーゼを含む試薬層、光遮蔽層、オキシダーゼを含
む試薬層、および展開層が設けられた構成を有す
るもの、さらにこれらの層構成のバリエーシヨ
ン、などがある。 本発明の多層分析材料は前述の特許明細書に開
示の方法に従つて製造することができ、その具体
例は後記する実施例に詳細に説明されている。ま
た本発明の多層分析材料は前述の特許明細書に開
示の操作手順と同様にして被検体液中の被検物質
を定量することができる。本発明の多層分析材料
は実開昭54−162294、特開昭54−156079、実開昭
56−142454、特願昭55−138100の開示のスライド
枠に収めて化学分析スライドまたは特願昭56−
67924に開示の液体試料展開補助材を多孔性展開
層の上に設けた構造の化学分析スライドとして用
いるのが製造、輸送、保管、測定操作などの全て
の面で好ましい。 実施例 １ ゼラチン下塗りが施されてある厚さ185μmの透
明ポリエチレンテレフタレート（PET）フイル
ム上に、下記組成から成る血中グルコース濃度定
量用の試薬層を乾燥後の膜厚がおよそ15μmにな
るように塗布、乾燥した。 ペルオキシダーゼ 25000IU １、７−ジヒドロキシナフタレン ５ｇ 化合物(6) 18ｇ ゼラチン 200ｇ ノニオンHS210（日本油脂(株)製活面活性剤；
ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル）
２ｇ この上に、0.2ｇのノニオンHS210及びグルコ
ースオキシダーゼ50000IUを含む二酸化チタン微
粉末８ｇをゼラチン１ｇに混合分散したものより
成る光遮蔽層を乾燥膜厚がおよそ15μmになるよ
うに塗布、乾燥した。 この上に水100ml中にゼラチン４ｇを溶解し、
更にこれにノニオンHS210を0.2ｇを加えて、接
着層塗布液とした。これを、光遮蔽層の上に乾燥
膜厚が4μｍとなるように塗布、乾燥し接着層を
形成させた。次に、接着層に30ｇ／m2の割合で
水を湿し水として供給、湿潤させたのち、綿100
％のブロード（東洋紡製100双 ブロード）を圧
着ラミネートし、乾燥させて多孔性展開層を設
け、グルコース定量用の多層分析材料を完成させ
た。 この材料を1.5cm×1.5cmの正方形のチツプに裁
断したのち、特開昭57−63452に開示のプラスチ
ツクマウントに収めてグルコース定量用化学分析
スライドとした。 ヘパリン採血したヒト全血およびそれにそれぞ
れ異なる量のグルコースを加えてグルコース濃度
が異なるヒト全血試料３種（グルコース含有量は
第４表に示す。）を調整し、それぞれから6μlをミ
クロピペツトで採取し、上記の分析スライドの展
開層の上に点着し、37℃で６分間インクベーシヨ
ンしたのち、波長500nmの測定光でPETフイル
ム側から反射測光して発色光学濃度を測定し検量
線を作成した。測定結果を第４表および第１図に
示す。 比較例 １ 試薬層の組成中の化合物(6)のかわりに化合物
（C1）（４−アミノアンチピリン）を18ｇ加えた
ほかは実施例１と同様にしてグルコース定量用化
学分析スライドを作製し、実施例１と同様の測定
を行ない検量線を作成した。測定結果を第４表お
よび第１図に示す。 【表】 ＊ グルコース添加したヒト全血試料
を遠心分離して血漿を分離
し、血漿をヘキソキナーゼ−G−6−
PDH法でグルコース濃度を検定
した値。
第４表および第１図から本発明のグルコース定
量用多層分析材料（フイルム）を用いた化学分析
スライドにおいては比較例１の化学分析スライド
に比べて、同じグルコース濃度に対して発色光学
濃度が大きく、γも大きく、従つてより高感度で
あり、かつグルコース濃度が大きい領域までγが
大きく保たれていて、測定範囲が拡大されている
ことがわかる。またγがより大きいことから測定
精度がよいこともわかる。 実施例 ２ ゼラチン下塗りが施されてある厚さ185μmの透
明PETフイルム上に、下記組成から成る血中グ
ルコース濃度定量用の試薬層を乾燥後の膜厚がお
よそ15μmになるように塗布、乾燥した。 ペルオキシダーゼ 25000IU グルコースオキシダーゼ 40000IU １、７−ジヒドロキシナフタレン ５ｇ 化合物(6)モノ塩酸塩 20ｇ ゼラチン 200ｇ ノニオンHS210 ２ｇ この上に、0.2ｇのノニオンHS210を含む二酸
化チタン微粉末８ｇをゼラチン１ｇに混合分散し
たものより成る光遮蔽層を乾燥膜厚がおよそ
15μmになるように塗布、乾燥した。この上に水
100ml中にゼラチン４ｇとノニオンHS210の0.5ｇ
を加えて、接着層塗布液とした。これを光遮蔽層
の上に乾燥膜厚が4μmになるように塗布、乾燥し
接着層を形成させた。 次に、接着層に30ｇ／m2の割合で水を湿し水
として供給、湿潤させたのち、綿100％のブロー
ド（東洋紡製100双 ブロード）を圧着ラミネー
トし、乾燥させて多孔性展開層を設け、グルコー
ス定量用の多層分析材料を完成させた。 この材料を1.5cm×1.5cmの正方形のチツプに裁
断したのち、特開昭57−63452に開示のプラスチ
ツクマウントに収めてグルコース定量用化学分析
スライドとした。 ヘパリン採血したヒト全血およびそれにそれぞ
れ異なる量のグルコースを加えてグルコース濃度
が異なるヒト全血試料３種類（グルコース濃度は
第５表に示す。）を調整し、それぞれから6μlをミ
クロピペツトで採取し、上記の分析スライドの展
開層の上に点着し、37℃で６分インクベーシヨン
したのち波長500nmの測定光でPETフイルム側
から反射光学濃度を測定し、検量線を作成した。
測定結果を第５表および第２図に示す。 比較例 ２ 試薬層の組成中の化合物(6)モノ塩酸塩のかわり
に化合物（C1）モノ塩酸塩20ｇ配合したほかは
実施例２と同様にしてグルコース定量用化学分析
スライドを作製し、実施例２と同様の測定を行な
い、検量線を作成した。測定結果を第５表および
第２図に示す。 【表】 ＊ 第４表下部の記載と同様にして検
定した値。
第５表および第２図から本発明のグルコース定
量用多層分析材料（フイルム）を用いた化学分析
スライドにおいては比較例２の化学分析スライド
に比べて、同じグルコース濃度に対して発色光学
濃度が大きく、ｒも大きく、従つてより高感度で
あり、かつグルコース濃度が大きい領域までｒが
大きく保たれていて、測定範囲が拡大されている
ことがわかる。またｒがより大きいことから測定
精度がよいこともわかる。 実施例 ３ 化合物(6)モノ塩酸塩のかわりに化合物(1)，(6)，
(7)，(10)をそれぞれ18g配合したほかは実施例２と
同様にして４種のグルコース定量用化学分析スラ
イドを作製した。 比較例 ３ 化合物(6)モノ塩酸塩のかわりに化合物C2（４−
アミノ−１，２−ジメチル−３−フエニル−３−
ピラゾリン−５−オン）を18g配合したほかは実
施例２と同様にしてグルコース定量用化学分析ス
ライドを作製した。 化学分析スライド（多層分析材料）の相対感度 実施例３の４種の化学分析スライド、比較例２
および３の２種の化学分析スライドの合計６種に
ついてグルコース添加ヒト全血（血漿分離後ヘキ
ソキナーゼ−Ｇ−６−DPH法による検定値：グ
ルコース濃度100mg／ｄ）および蒸留水をそれ
ぞれ6μ展開層に点着し、37℃で６分インクベ
ーシヨンした後波長500nmの測定光でPETフイ
ルム側から反射測光して発色光学濃度を測定し
た。ついで次式により化学分析スライド（多層分
析材料）の相対感度を算出した。 化学分析スライドにおける相対感度＝OD（スライドｎ：
ヒト全血）−OD（スライドｎ：蒸留水）／OD（スライド
５：ヒト全血）−OD（スライド５：蒸留水） 但し、OD（スライドｎ：ヒト全血）は化学分
析スライドｎ（ｎは１から６までの番号数字を表
す。この数字は６種の化学分析スライドに第６表
のとおりわりふつた。）を用いて上記のヒト全血
について測定した発色光学濃度値を表す。他も同
様の意味を表わす。 冷水に対する溶解量 化合物(1)，(6)，(7)，(10)，C1，C2それぞれにつ
いて冷水（25℃の蒸留水）10mlに対する溶解量を
テストした。テストは10ｇ以上の溶解量、0.2を
こえ5g以下の溶解量、および0.2gまたは0.2g以下
の溶解量の３レベルにわけて判定した。判定結果
は第６表に示す。 水溶液系における相対感度 色原体として化合物(1)，(6)，(7)，(10)，C1，C2
をそれぞれ用い、カプラーとして１，７−ヒドロ
キシナフタレンを用いて次の組成の発色液を調整
した。 色原体 10μmole １，７−ヒドロキシナフタレン 50μmole ペルオキシダーゼ 50IU 燐酸緩衝液で PH6.0に緩衝 上記組成の発色液５mlをとり37℃で３分インク
ベーシヨンし、その時点でH2O2水溶液（1m
moleから6m moleの範囲内の４レベルおよびブ
ランク）50μを滴下し、さらに37℃で10分イン
クベーシヨンし、直ちに波長515nmの測定光で透
過測光法により発色光学濃度値を判定した。H2
O2濃度と発色光学濃度値（H2O2水溶液での発色
光学濃度値からブランクの発色光学濃度値をさし
ひいた値）との関係を直交軸グラフにプロツトし
て検量線の勾配を定め、化合物C1の場合の検量
線の勾配に対する他の化合物の場合の検量線の勾
配の比を求めて、化合物C1を基準値１とする他
の化合物の相対感度を求めた。相対感度値を第６
表に示す。 【表】 第６表から、本発明に用いた化合物は比較例と
して用いた化合物に比べて水溶液系における感度
はおおむね低く、冷水に対する溶解量は小さい
が、化学分析スライド（多層分析材料）における
感度は著しく高いことから明らかである。 実施例 ４ ゼラチン下塗りが施されてある厚さ185μmの透
明PETフイルム上に、下記組成から成る血中グ
ルコース濃度定量用の試薬層を乾燥後の膜厚がお
よそ15μmになるように塗布、乾燥した。 ペルオキシダーゼ 25000IU １，７−ジヒドロキシナフタレン 5g 化合物(6) 18g ゼラチン 200g ノニオンHS210 2g この上に、0.2ｇのノニオンHS210及びグルコ
ースオキシダーゼ50000IUを含む二酸化チタン微
粉末８ｇをゼラチン１ｇに混合分散したものより
成る光遮蔽層を乾燥膜厚がおよそ15μmになるよ
うに塗布、乾燥した。 この上に水100ml中にゼラチン４ｇ、3.3−ジメ
チルグルタール酸0.5ｇ、およびノニオンHS210
の0.5ｇを加えて接着層塗布液を調整した。これ
を光遮蔽層の上に乾燥膜厚が4μmとなるように塗
布、乾燥し接着層を形成させた。次に、接着層に
30ｇ／m2の割合で水を湿し水として供給、湿潤さ
せたのち、綿100％のブロード（東洋紡製100双
ブロード）を圧着ラミネートし、乾燥させて多孔
性展開層を設け、グルコース定量用の多層分析材
料を完成させた。 この材料を1.5cm×1.5cmの正方形のチツプに裁
断したのち、特開昭57−63452に開示のプラツチ
ツクマウントに収めてグルコース定量用化学分析
スライドとした。 ヒト血漿、およびヒト血漿にそれぞれ異なる量
のグルコースを加えてグルコース濃度が異なるヒ
ト血漿試料３種（グルコース含有量は第７表に示
す。）を調整し、それぞれから6μをミクロピペ
ツトで採取し、上記の化学分析スライドの展開層
の上に点着し、37℃で６分インクベーシヨンした
のち波長500nmの測定光でPETフイルム側から
反射測光として発色光学濃度を測定し、検量線を
作成した。測定結果を第７表および第３図に示
す。 比較例 ４ 化合物(6)のかわりに化合物C1（４−アミノアン
チピリン）を18ｇ用いたほかは実施例４と同様に
して比較用のグルコース定量用化学分析スライド
を作製し、実施例４と同様にして発色光学濃度を
測定し、検量線を作成した。測定結果を第７表お
よび第３図に示す。 【表】 ＊ ヒト血漿およびグルコース添加ヒ
ト血漿について第４表下部の
記載と同様にして検定した値。
第７表および第３図から弱酸３，３−ジメチル
グルタル酸を加えて低PH値に調整した接着層を有
し、使用時においては低PH値に維持されている試
薬層を有する本発明のグルコース定量用多層分析
材料（フイルム）においては、同様に使用時にお
いて低PHに維持されている比較例４の多層分析材
料（フイルム）に比べて同じグルコース濃度に対
して発色光学濃度が大きく、ｒも大きく、従つて
より高感度であり、かつグルコース濃度が大きい
領域までｒが大きく保たれていて測定範囲が拡大
されていることがわかる。またｒがより大きいこ
とから測定精度がよいこともわかる。 実施例 ５ 化合物(10)18ｇを用いたほかは実施例４と同様に
してグルコース定量用化学分析スライドを作製
し、実施例４と同様にして発色光学濃度を測定し
たところ、ほぼ実施例４と同じ結果がえられた。 実施例 ６ 光遮蔽層の組成 二酸化チタンの微粉末 ８ｇ ゼラチン １ｇ コレステロールオキシダーゼ 50000IU ノニオンHS210 0.2ｇ 接着層塗布液の組成 ゼラチン ４ｇ 酢酸ナトリウム ２ｇ コレステロールエステラーゼ 25000IU ノニオンHS210 0.2ｇ 水 100ml 上記の光遮蔽層および接着層にかえたほかは実
施例１と同様にしてコレステロール分析スライド
を作製した。 このスライドについて、遊離コレステロールお
よびエステル型コレステロールを遊離コレステロ
ール換算375mg／ｄ含有する非溶血ヒト血清お
よび部分溶血ヒト血清を用いそれぞれから10μ
をミクロピペツトで取り、展開層に点着して発色
テストを行つた。37℃６分のインクベーシヨン後
の波長500nmでのPETフイルム側からの反射測
光による発色光学濃度はそれぞれ0.53及び0.51で
あつた。 比較例 ５ 試薬層の組成 ペルオキシダーゼ 25000IU １，７−ジヒドロキシナフタレン ５ｇ 化合物（C1） 18ｇ ゼラチン 200ｇ ノニオンHS210 0.2ｇ 上記の試薬層にかえたほかは実施例６と同様に
してコレステロール分析用スライドを作製した。
このスライドについて、実施例６と同じ試料を用
いて実施例６と同様にして発色テストを行なつ
た。37℃６分のインクベーシヨン後の波長500nm
での反射測光による発色光学濃度は非溶血血清で
0.48溶血血清で0.46であつた。
第１図ないし第３図は本発明の多層分析材料お
よび比較例の多層分析材料を用いて、グルコース
含有量が異なるレベルのヒト全血試料およびヒト
血漿試料を用いて求めた試料中のグルコース含有
量と反射測光法により測定した発色光学濃度との
関係に基いて作製した検量線である。図におい
て、黒丸（・）および白ぬき三角形（△）をプロ
ツトした曲線はそれぞれ本発明および比較例のグ
ルコース定量用多層分析材料（フイルム）につい
ての検量線を表わす。
よび比較例の多層分析材料を用いて、グルコース
含有量が異なるレベルのヒト全血試料およびヒト
血漿試料を用いて求めた試料中のグルコース含有
量と反射測光法により測定した発色光学濃度との
関係に基いて作製した検量線である。図におい
て、黒丸（・）および白ぬき三角形（△）をプロ
ツトした曲線はそれぞれ本発明および比較例のグ
ルコース定量用多層分析材料（フイルム）につい
ての検量線を表わす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 水不浸透性光透過性支持体の上に、少なくと
もペルオキシダーゼ、およびペルオキシダーゼと
過酸化水素の存在下で検出可能な変化を生じうる
色原体とカプラーの組合せを含む過酸化水素検出
用呈色指示薬組成物を含む試薬層、ならびに多孔
性展開層の二つの層を少なくとも有し、この順に
積層されてなる多層分析材料において、前記色原
体が下記一般式［１］： ［R1は三個以下のハロゲン原子もしくは一個
の低級アルキル基で置換されていてもよいフエニ
ル基を表わし、R2は、低級アルキル基を表わし、
そしてR3は低級アルキル基もしくはフエニル基
を表わす。］ で表わされる４−アミノ−３−ピラゾリン−５−
オンの１、２、３−トリ置換体であることを特徴
とする多層分析材料。 ２ 前記カプラーがペルオキシダーゼの共存下に
前記色原体と酸化カプリング反応により色素を形
成しうる化合物である請求項１に記載の多層分析
材料。 ３ 前記試薬層にペルオキシダーゼとともに前記
色原体および前記カプラーが含有されている請求
項１に記載の多層分析材料。 ４ 前記試薬層または他のいずれか一つの層にオ
キシダーゼが含有されている請求項１に記載の多
層分析材料。 ５ 前記一般式［１］のR1がクロロフエニル基
である請求項１に記載の多層分析材料。 ６ 前記一般式［１］のR1が無置換のフエニル
基である請求項１に記載の多層分析材料。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57165233A JPS5954962A (ja) | 1982-09-22 | 1982-09-22 | 多層分析材料 |
| US06/534,085 US4578245A (en) | 1982-09-22 | 1983-09-20 | Multilayer analytical element |
| EP83109412A EP0103901B1 (en) | 1982-09-22 | 1983-09-21 | Multilayer analytical element |
| DE8383109412T DE3382473D1 (de) | 1982-09-22 | 1983-09-21 | Mehrschichtiges analytisches element. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57165233A JPS5954962A (ja) | 1982-09-22 | 1982-09-22 | 多層分析材料 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5954962A JPS5954962A (ja) | 1984-03-29 |
| JPH0428359B2 true JPH0428359B2 (ja) | 1992-05-14 |
Family
ID=15808384
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57165233A Granted JPS5954962A (ja) | 1982-09-22 | 1982-09-22 | 多層分析材料 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4578245A (ja) |
| EP (1) | EP0103901B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5954962A (ja) |
| DE (1) | DE3382473D1 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7110594B2 (en) | 1998-06-19 | 2006-09-19 | Align Technology, Inc. | Manipulating a digital dentition model to form models of individual dentition components |
| US8930219B2 (en) | 2000-04-25 | 2015-01-06 | Andrew Trosien | Treatment analysis systems and methods |
| US9060829B2 (en) | 2007-06-08 | 2015-06-23 | Align Technology, Inc. | Systems and method for management and delivery of orthodontic treatment |
| US9119691B2 (en) | 2008-05-23 | 2015-09-01 | Align Technology, Inc. | Orthodontic tooth movement device, systems and methods |
| US9433477B2 (en) | 2011-10-10 | 2016-09-06 | Align Technology, Inc. | Automatic placement of precision cuts |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6082859A (ja) * | 1983-10-13 | 1985-05-11 | Fuji Photo Film Co Ltd | 一体型多層化学分析要素 |
| US5183741A (en) * | 1983-10-13 | 1993-02-02 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Integral multilayer element for glucose analysis |
| JPS60108753A (ja) * | 1983-11-18 | 1985-06-14 | Fuji Photo Film Co Ltd | 多層化学分析要素 |
| JPS60222770A (ja) * | 1984-04-19 | 1985-11-07 | Fuji Photo Film Co Ltd | 一体型多層分析要素 |
| JPS60222769A (ja) * | 1984-04-19 | 1985-11-07 | Fuji Photo Film Co Ltd | 一体型多層分析要素 |
| JPH0673472B2 (ja) * | 1985-02-05 | 1994-09-21 | コニカ株式会社 | 分析素子 |
| US4828983A (en) * | 1986-07-10 | 1989-05-09 | Eastman Kodak Company | Use of phenols and anilines to increase the rate of peroxidase catalyzed oxidation of leuco dyes |
| US4935346A (en) | 1986-08-13 | 1990-06-19 | Lifescan, Inc. | Minimum procedure system for the determination of analytes |
| US4876207A (en) * | 1988-02-16 | 1989-10-24 | Eastman Kodak Company | Compositions for the detection of high levels of hydrogen peroxide |
| DE68924098T2 (de) * | 1988-06-09 | 1996-04-18 | Abbott Lab | Verfahren und Gerät mit Anwendung kovalent immobilisierter Farbstoffe. |
| JP2864035B2 (ja) * | 1989-02-09 | 1999-03-03 | 富士写真フイルム株式会社 | 全血分析要素 |
| TW235237B (ja) * | 1992-12-18 | 1994-12-01 | Eiken Chemical | |
| US20010051352A1 (en) * | 1993-04-15 | 2001-12-13 | Gary Krantz | Multilayer test strip |
| US5462858A (en) * | 1993-12-29 | 1995-10-31 | Eastman Kodak Company | Dry multilayer analytical elements for assaying transaminases |
| EP0675362B1 (en) * | 1994-03-30 | 2000-09-27 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Minimizing interferences in chemiluminescent thin-film immunoassays |
| US5958714A (en) * | 1996-10-02 | 1999-09-28 | Safety Associates, Inc. | Test kits for determining at least two specific analytes in foods and other complex matrices |
| US6096270A (en) * | 1998-05-04 | 2000-08-01 | Hapak Enterprises | Apparatus and methods useful in determining disinfectant effective concentration of hypochlorite ions |
| US6299842B1 (en) | 1999-03-05 | 2001-10-09 | Meridian Bioscience, Inc. | Biological sampling and storage container utilizing a desiccant |
| US6458326B1 (en) | 1999-11-24 | 2002-10-01 | Home Diagnostics, Inc. | Protective test strip platform |
| US6562625B2 (en) | 2001-02-28 | 2003-05-13 | Home Diagnostics, Inc. | Distinguishing test types through spectral analysis |
| US6525330B2 (en) | 2001-02-28 | 2003-02-25 | Home Diagnostics, Inc. | Method of strip insertion detection |
| US6541266B2 (en) | 2001-02-28 | 2003-04-01 | Home Diagnostics, Inc. | Method for determining concentration of an analyte in a test strip |
| JP4272516B2 (ja) * | 2001-08-02 | 2009-06-03 | 協和メデックス株式会社 | 過酸化水素定量用試薬 |
| CN100483205C (zh) * | 2004-02-06 | 2009-04-29 | 富士胶片株式会社 | 显示装置用遮光膜、其制作方法、含金属微粒的组合物 |
| US20090061524A1 (en) * | 2005-04-15 | 2009-03-05 | Judith Rishpon | Enzyme-Channeling Based Electrochemical Biosensors |
| GB201021509D0 (en) * | 2010-12-20 | 2011-02-02 | Reactivlab Ltd | Assay method |
| CN110296946A (zh) * | 2019-07-14 | 2019-10-01 | 南京工业大学 | 透明纸基紫外-可见光吸收测定装置及纸基分析方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS49131197A (ja) * | 1973-04-19 | 1974-12-16 | ||
| US3992158A (en) * | 1973-08-16 | 1976-11-16 | Eastman Kodak Company | Integral analytical element |
| US3983005A (en) * | 1974-03-25 | 1976-09-28 | Eastman Kodak Company | Integral element for the analysis of cholesterol |
| US4050898A (en) * | 1976-04-26 | 1977-09-27 | Eastman Kodak Company | Integral analytical element |
| US4247631A (en) * | 1979-01-31 | 1981-01-27 | Millipore Corporation | Reagent and method for the analytic determination of hydrogen peroxide |
| JPS55164356A (en) * | 1979-06-08 | 1980-12-22 | Fuji Photo Film Co Ltd | Multi-layer analysis sheet for liquid sample analysis |
| US4394512A (en) * | 1980-02-05 | 1983-07-19 | Boehringer Mannheim Gmbh | 1-(Substituted phenyl) aminoantipyrin compounds |
| JPS6033479B2 (ja) * | 1980-07-30 | 1985-08-02 | 協和醗酵工業株式会社 | 過酸化水素の定量方法 |
| DE3032421A1 (de) * | 1980-08-28 | 1982-04-01 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur bestimmung von peroxiden und mittel dafuer |
| JPS57144996A (en) * | 1981-02-27 | 1982-09-07 | Fuji Photo Film Co Ltd | Film for quantitative analysis |
| JPS57208997A (en) * | 1981-06-17 | 1982-12-22 | Fuji Photo Film Co Ltd | Liquid analyzing material for oxidase enzyme reaction system |
| JPS5920853A (ja) * | 1982-07-28 | 1984-02-02 | Fuji Photo Film Co Ltd | 多層分析材料 |
| JPS5946854A (ja) * | 1982-09-10 | 1984-03-16 | Fuji Photo Film Co Ltd | 多層分析材料 |
-
1982
- 1982-09-22 JP JP57165233A patent/JPS5954962A/ja active Granted
-
1983
- 1983-09-20 US US06/534,085 patent/US4578245A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-09-21 DE DE8383109412T patent/DE3382473D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-09-21 EP EP83109412A patent/EP0103901B1/en not_active Expired
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7110594B2 (en) | 1998-06-19 | 2006-09-19 | Align Technology, Inc. | Manipulating a digital dentition model to form models of individual dentition components |
| US8930219B2 (en) | 2000-04-25 | 2015-01-06 | Andrew Trosien | Treatment analysis systems and methods |
| US9060829B2 (en) | 2007-06-08 | 2015-06-23 | Align Technology, Inc. | Systems and method for management and delivery of orthodontic treatment |
| US9119691B2 (en) | 2008-05-23 | 2015-09-01 | Align Technology, Inc. | Orthodontic tooth movement device, systems and methods |
| US9433477B2 (en) | 2011-10-10 | 2016-09-06 | Align Technology, Inc. | Automatic placement of precision cuts |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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