JPH0484898A - 試験具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、検体中のシュウ酸またはその塩類を検圧する
ための試験具に関する。

〈従来の技術〉 尿路結石症のうち上部尿路結石の約８０％、下部尿路結
石の約５０％はカルシウム含有結石であり、そのうちの
大部分はシュウ酸カルシウム結石が占めているといわれ
ている（百出、「日本における尿路結石症の疫学」日泌
尿会誌、７０．９７５　（１９７０））。

シュウ酸カルシウム結石の発症と尿中カルシウム濃度ま
たは尿中シュウ酸濃度との関係は、古くから注目されて
きたが、従来、尿中シュウ酸測定の難しさから、尿中シ
ュウ酸より、尿中カルシウムが重要視されてきた。

しかしながら、近年、結石患者の尿中シュウ酸濃度は、
正常人のそれに比べ軽度の上昇があることか認められる
に至り、尿中シュウ酸濃度が尿路結石発症の危険因子と
して重要視されるようになった。

従来、尿中のシュウ酸を検出する方法としては、過マン
ガンＭ？ｉ！ｉ定法、蛍光法、比色法等が知られている
が、これらの方法では、いずれも尿中の他成分による影
響を排除するため、沈澱生成や溶媒抽出、イオン交換樹
脂の透過等のシュウ酸を分離する前処理工程が不可欠で
あった。

また、機器を用いた分離分析法として、ガスクロマトグ
ラフ法（ＧＣ法）、高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬ
Ｃ法）およびイオンクロマトグラフ法（ＩＣ法）等が知
られているが、ＧＣ法やＨＰＬＣ法では分離向上や高感
度検出を目的とした誘導化が必要であり、また、ＩＣ法
では１検体毎のカラムの洗浄操作が必要であった。

このように、従来の尿中シュウ酸の検出法は、いずれも
、操作ステップが多く、複雑であり、しかも熟練を要し
、測定、分析時間も長時間を要するという欠点がある。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明は、上述した従来技術の欠点に鑑みてなされたも
ので、その目的は、検体中のシュウ酸を簡易な操作で迅
速に検出、定量しつる試験具を提供することにある。

く課題を解決するための手段〉 このような目的は、下記（１）〜（４）の本発明により
達成される。

（１）支持体上に、試薬を担持した試薬層を有する試験
具であって、 前記試薬は、シュウ酸酸化酵素、過酸化水素分解酵素お
よび発色剤を含むものであることを特徴とする試験具。

（２）前記試薬層には、反応促進剤としてリボフラビン
を含む上記（１）に記載の試験具。

（３）前記試薬層には、増感剤としてキノリンまたはそ
の誘導体を含む上記（１）または（２）に記載の試験具
。

（４）結石の診断に用いられる上記（１）〜（３）のい
ずれかに記載の試験具。

酸素原子とに分解され、この酸素原子かの作用により色
原体が発色する。

〈作用〉 本発明では、試験具を検体中に浸漬するか、または試験
具に検体を滴下するだけで、検体中のシュウ酸を検出す
ることができる。　すなわち、検体中のシュウ酸が試薬
層に担持された試薬と反応し、これにより試薬層が呈色
し、この呈色の度合を肉眼で判定するかまたは光学的に
測定することにより、検体中のシュウ酸を検出、定量す
ることができる。

この場合、試薬層の発色原理の代表的なものとしては、
下記式に示すように、検体中のシュウ酸と外気より取り
込まれる酸素とがシュウ酸酸化酵素により二酸化炭素と
過酸化水素とに分解され、この過酸化水素が過酸化水素
分解酵素であるペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により水と
〈実施例〉 以下、本発明の試験具を、添付図面に示す好適実施例に
基づいて詳細に説明する。

第１図は、本発明の試験具の構成例を示す断面正面図で
ある。　同図に示すように、試験具１は、支持体２の片
面上に試薬層３を設置したものである。

支持体２は、例えば厚さが２０〜５００−程度の板状を
なし、ており、検体に対して不活性な材料で構成されて
いる。

支持体２の具体的な構成材料としては、ボリエチレンテ
レフタレート、セルロースエステル（セルロースジアセ
テート、セルローストリアセテート、セルロースアセテ
ートプロピオネート等）、ビスフェノールＡのポリカー
ボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル
、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルアルコー
ル等の各種樹脂、またはガラス等が挙げられる。　また
、支持体２は、上記のうち、２種以上の材料によるシー
トを積層したものでもよい。

試薬層３は、担体に後述する試薬を担持したもので構成
される。

この担体としては、非繊維性または繊維性の多孔質材で
構成されたものが好ましい。

非繊維性多孔質材としては、濾紙やメンブランフィルタ
−が代表的であり、その他、珪藻土、微結晶材料等の多
孔体を結合剤中に分散した分散物、ガラスや樹脂の微小
球形ビーズを互いに点接着させた多孔質の集合体等が挙
げられる。

また、繊維性多孔質材としては、織物または編物、不織
布、短繊維の集合体等が挙げられる。

繊維の素材としては、木綿、絹、ウール等の天然繊維ま
たは、ガラス、ナイロン等の樹脂等が挙げられる。

担体の厚さ、すなわち試薬層３の厚さは、特に限定され
ないが、０．１〜２ｍｍ程度、特に０．５〜１ｍｍ程度
とするのが好ましい。

試薬を構成する主な薬剤としては、シュウ酸酸化酵素、
過酸化水素分解酵素および発色剤（色原体）が挙げらる
。

シュウ酸酸化酵素としては、例えば大麦苗木由来のもの
あるいは苔類（Ｍｎｉｕｍ　ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ。

Ｍｎｉｕｍ　ｉｎｓｉｇｎｅ、　Ｍｎｉｕｍ　ｏｖａｌ
ｅ、　Ｈｙｌｏｃｏｍｉｕｍｓｐｌｅｎｄｅｎｓ、　Ｅ
ｕｒｏｈｙｎｃｈｉｕｍ　５ｔｏｋｅｓｉｉ。

Ｒｈｙｔｉｄｉａｄｅｌｐｈｎｓ　ｔｒｉｑｕｅｔｒｕ
ｓ）白米のもの等が挙げられる。

シュウ酸酸化酵素の試薬層３への担持量は、特に限定さ
れないが、試薬層の面積１゜ｆｆ１２当た９０．１〜３
．Ｏｕ　（ユニット）程度、特に０．３〜１．Ｏｕ程度
とするのが好ましい。

過酸化水素分解酵素としては、ペルオキシダーゼ、カフ
ラーゼ等が挙げられる。

ペルオキシダーゼとしては、例えば西洋ワサビ由来、イ
チジク由来、白血球由来、牛乳由来等、各種動物性、植
物性由来のものを用いることができる。

過酸化水素分解酵素の試薬層３への担持量は、特に限定
されないが、試薬層の面積１ｃＩＩ１２当たり０．５〜
１５ｕ（ユニット）程度、特に１．５〜５．Ｏｕ程度と
するのが好ましい。

発色剤としては、ｏ−トリジン、ｍ−）−リジン、ベン
ジジン、テトラメチルベンジジン、０−メチルベンジジ
ン、０−ジアニシジン等のベンジジンまたはその化合物
、２．７−ジアミツフルオレン、または４−アミノアン
チピリン（４−ＡＡＰ）と該４−ＡＡＰとカップリング
を生じるカップリング剤との組み合わせ、３−メチル−
ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）と該ＭＢＴ
Ｈとカップリングを生じるカップリング剤との組み合わ
せ等が挙げられる。

上記カップリング剤としては、ｐ−クロロフェノール、
２．４−ジクロロフェノール、２．４−ジブロモフェノ
ール、２，４．６−トリクロロフエノール等のフェノー
ル誘導体、４−クロロ−１−ナフタレン、１，７−シヒ
ドロナフタレン等のナフタレン誘導体、またはＮ、Ｎ−
ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン
、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）　　５，６，７゜８−
テトラヒドロ−１−ナフチルアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジ
メトキシアニリン等のアニリン誘導体等が挙げられる。

また、試薬層３には、必要に応じ、ｐＨ調整剤、界面活
性剤（湿潤剤）、光反射性物質、反応促進剤、安定剤、
増感剤、酸化剤、粘稠剤等が添加されていてもよい。

ｐＨ調整剤としては、リン酸（リン酸緩衝液）、クエン
酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グツド緩衝液
等が挙げられる。

界面活性剤（湿潤剤）は、試薬層３と検体とが接触した
とき、検体液が均一に湿潤（浸透）するためのものであ
り、ポリビニルピロリドン、コール酸ナトリウム、ラウ
リル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、テトラ
デシル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩、ドデシルベ
ンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスル
ホン酸塩、ジオクチルスルホコへり酸ナトリウム、ジブ
チルスルホコハク酸ナトリウム、ジー２−エチルへキシ
ルスルホコハク酸ナトリウム（Ａｅｒｏｓｏｌ−ＯＴ）
等のジアルキルスルホコハク駿塩等が挙げられる。

光反射物質は、検体が全血である場合に、赤血球による
色濃度測定への影響を排除するためのものであり、酸化
チタン、硫酸バリウム、アルミニウム、各種セラミック
ス等の微粒子が挙げられる。

反応促進剤は、シュウ酸酸化酵素によるシュウ酸分解の
反応を促進し、検出時間をより短縮するためのものであ
り、例えば、リボフラビンが挙げられる。

この反応促進剤の添加量は、特に限定されないが、浸漬
液中の濃度が０．５〜１０　ｍｇ／ｍｊ程度、特に１．
０〜５．０ｍｇ／＋ｎｊ程度とするのが好ましい。

安定剤のうち、呈色後の呈色安定性を向上するためのも
のとしては、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸の
共重合体、あるいはそのハーフエチルエステル等が挙げ
られる。

また、試験具保存中の経時変化を防止するための安定剤
としては、特公昭５６−４３２３８号公報、特願平０１
−２３８１４８号（特に、２−メルカプトベンズイミダ
ゾール）等に記載のものが挙げられる。

増感剤は、過酸化水素分解酵素による色原体の発色反応
の活性等を増強させるものであり、キノリンおよびその
誘導体、例えば、キニネ、シンコニン、６−メドキシキ
ノリン、キナルジン、８−アミノ−６−メドキシキノリ
ン、２−キノリツール、イソキノリン、ベンゾ（ｆ）キ
ノリン、３−アミノキノリン等が挙げられる。　このよ
うな増感剤が存在すると、通常酸化反応が促進され、か
つ酸化された色原体の呈色強度が増大し、試験具の感度
は高められる。

増感剤の添加量は、特に限定されないが、浸漬液中の濃
度力１　、０〜２０　ｍｇ／ｍｊ　程度、特ニ１０〜１
５　ｍｇ／ｍｌ程度とするのが好ましい。

粘稠剤は、試薬層３の担体がらの薬剤の流出を防止する
ためのものであり、ポリビニルアルコール、ポリビニル
ピロリドン、ポリエチレングリコール、アクリル酸塩、
ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリ
レート）、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、カ
ルボキシメチルセルロース等の重合体、ゼラチン、アラ
ビアゴム等が挙げられる。

上記試薬（添加剤を含む）の担体への担持方法としては
、試薬を含有する液体な担体に含浸（例えば、担体を浸
漬液に浸漬）させ、その後、これを乾燥することにより
行えばよい。

液体が２種以上の場合には、含浸、乾燥を繰り返し行う
。

なお、このような試薬層３は、支持体２の表面に、例え
ば両面粘着テープ（図示せず）、接着剤またはその他挟
持器具（例えば、特願昭６３−３３４１９８号に記載の
保持部材）等により固定される。

また、試薬層３は、試薬等を含有する液体を支持体２の
表面に塗布、乾燥して得られたものでもよい。

この場合、試薬層３は、例えばゼラチン、ポリビニルア
ルコール、ポリビニルピロリドン、アガロース、ポリビ
ニルベンゼンスルポン酸ナトリウム、ポリウレタン、ポ
リビニルブロビオネート等の親水性結合剤（バインダー
）中に所定の試薬等を含有（分散）せしめた組成物で構
成される。

このような塗布型の試薬層３には、前記各種添加剤の他
に、硬膜剤（架橋剤）が添加されていてもよい。

硬膜剤としては、ゼラチン等を架橋させるものであり、
例えば、Ｎ、Ｎ’　−へキサメチレン−１，６−ビス（
１−アジリジンカルボキサミド）　　（ＨＤＬＩ）、ト
リメチクルプロパン−トリーβ−アジリジニルプロピオ
ネート（ＴＡＺＭ）、テトラメチロルメタンートリーβ
−アジリジニルプロピオネート（ＴＡＺＯ）等のアジリ
ジンの銹導体が挙げられる。

このような塗布型の試薬層の厚さ（乾燥膜厚）は１、特
に限定されないが、１〜１ｏｏ−程度、特に５〜３０／
７Ｊ１１程度とするのが好ましい。

なお、図示の例では、試薬層３は１層のみであるが、各
々組成の異なる試薬の成分を含む複数の試薬層を積層し
たものでもよい。　特に、前配光反射性物質を分散した
層（光反射層）を試薬層３の表面に別途設けてもよい。

以上、本発明の試験具を図示の構成例について説明した
が、本発明は、これらに限定されるものではない。　特
に、試験具の層構成については、任意のものが可能であ
り、展開層、光反射層、吸収層（検体量調整層）、保護
層、酸化剤含有層、その他種々の目的で設けられた層が
あってもよい。

なお、本発明の試験具は、検体（例えば、全血、血漿、
血清、尿、糞便、唾液、リンパ液、髄液等の体液または
その他の被検液）中のシュウ酸の検出に用いられるが、
そのなかでも特に、尿中のシュウ酸を検出するものとし
て用いるのが好ましい。

すなわち、尿中のシュウ酸濃度は、尿路結石や腎結石の
発症と密接な関連を有するため、本発明の試験具にて尿
中のシュウ酸濃度を測定することにより、尿路結石等の
予防、診断を簡易、迅速に行なうことができる。　この
意味で、本発明の試験具は、結石、特に尿路結石や腎結
石の検査、診断に用いられるものであるのが好ましい。

この場合、試験具は、尿１ｄｊ当たり０．１〜５０ｍｇ
、特に０．５〜１０ｍｇのシュウ酸を定量可能なもので
あるのが好ましい。

なお、本発明の試験具は、医療用に適するが、これに限
らず、食品や環境試料の分析のような他の分野への応用
も可能である。

特に、シュウ酸は有毒であるため、食品衛生法において
、食品中の許容量が定められており、食品中のシュウ酸
量が許容範囲内が否かを判定するために用いることがで
きる。　さらに、ビールなどにおいては、原料由来のシ
ュウ酸が析出沈殿してその商品価値を低下させることが
あり、よってビールの品質管理を行なうために用いるこ
ともできる。

〈実験例〉 以下、本発明の実験例について説明する。

（実験例１） 下記に示す組成の溶液ｌ右よび２を調製し、厚さ約１　
ｍｍの濾紙（東洋社製Ｎｏ、１６５０）に、まず溶液１
を含浸、乾燥（４０”Ｃ１６０分）し、次いで溶液２を
含浸、乾燥（４０’Ｃ１１０分）した。

その後、これを５１１ＩＩｌ×５■のサイズに裁断し、
厚さ０．３ｍｍのポリスチレン製シートの支持体に両面
粘着テープを用いて貼着し、尿中シュウ酸検出用試験具
を得た。

なお、この試験具は、尿１ｄｊ当りｌ、ｏ〜５０＋ａｇ
のシュウ酸を定量可能なものである。

溶」Ｌエ シュウ酸酸化酵素 （大麦由来）　　　　　　　　　５０００ｕペルオキシ
ダーゼ （西洋ワサビ由来）　　　　　　２４０００　ｕリボフ
ラビン（反応促進剤）　　　　５０ｍｇ０．２Ｍクエン
酸緩衝液　　　　　１０ｍｊＯ，１％アルギン酸 ナトリウム　　　　　　　　　　１０ｍｊに溶解１蓋ユ テトラメチルベンジジン （発色剤）　　　　　　　　　　　５００＋ｍｇ３−ア
ミノキノリン （増感剤）　　　　　　　　　　　２５０ｍｇベンゼン
　　　　　　　　　　　　２０ｍｇに溶解法に、検体と
して、シュウ酸濃度が既知の標準尿を調製した。

標準尿は、正常人のヒト尿を採取し、このヒト尿中のシ
ュウ酸濃度なシュウ酸測定キット（シグマ社製）により
測定し、これにシュウ酸濃度がそれぞれ３．５．１０．
２０および５０１１１ｇ／ｄｊとなるようにシュウ酸水
溶液を添加し、標準尿を調製した。　また、前記ヒト尿
を蒸留水で希釈し、シュウ酸濃度がそれぞれ１および２
　ｆｆ１ｇ／ｄｊである標準尿を調製した。

各標準尿に前記試験具を約１秒間浸し、引き上げて３分
経過後の試験具の呈色強度を反射型分光光度計（天場電
子社製ＭＣＰＤ−２００）により測定した。

その結果を第２図に示す。

この第２図は、反射光スペクトルの極大吸収波長６７０
　ｎｍでの相対反射光強度の対数変換値を尿中シュウ酸
濃度毎にプロットしたものである。

（実験例２） 実験例１における溶液２中の発色剤を４−ＡＡＰ：３０
０ｍｇおよびＴＯＯ５：３５０ｍｇに代えた以外は実験
例１と同様にして尿中シュウ酸濃度を測定したところ、
第２図と同様の検量線（スペクトルの極大吸収波長５６
５　ｎｍ）が得られな。

（実験例３） 実験例１における溶液２中の発色剤をｏ−トリジン：５
００ｍｇに代えた以外は実験例１と同様にして尿中シュ
ウ酸濃度を測定したところ、第２図と同様の検量線（ス
ペクトルの極大吸収波長６３０　ｎａｐ）が得られた。

〈発明の効果〉 以上述べたように、本発明によれば、尿等の検体中のシ
ュウ酸を簡単な操作で迅速に検出、または定量すること
ができ、また、その精度も高い。

符号の説明 １・・・試験具 ２・・・支持体 ３・・・試薬層 出　　願　　人 代　　理　　人 同 テルモ株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）支持体上に、試薬を担持した試薬層を有する試験
   具であって、 前記試薬は、シュウ酸酸化酵素、過酸化水素分解酵素お
   よび発色剤を含むものであることを特徴とする試験具。 （２）前記試薬層には、反応促進剤としてリボフラビン
   を含む請求項１に記載の試験具。（３）前記試薬層には
   、増感剤としてキノリンまたはその誘導体を含む請求項
   １または２に記載の試験具。 （４）結石の診断に用いられる請求項１〜３のいずれか
   に記載の試験具。