JPH04287688A - 繊維芽細胞増殖因子の活性フラグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】本発明は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（
ｂＦＧＦ）の新規な活性フラグメントに関する。この繊
維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、幅広い標的細胞特異性
を示す多機能ポリペプチド分裂促進因子である（１）。 これらの因子の研究過程において、種々の組織、例えば
脳、下垂体および視床下部からの抽出物が有するところ
の、培養細胞の有糸分裂を刺激する能力を基にして数多
くのものが同定されてきた。これらの抽出物中の活性因
子に対して、数多くの短縮名が適用され、それらには、
表皮増殖因子、血小板誘導増殖因子、神経成長因子、造
血増殖因子、および繊維芽細胞増殖因子が含まれる。

【０００２】繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、最初に
、ウシの脳、或は繊維芽細胞および内皮細胞に対する分
裂促進性を示す下垂体組織、から誘導されたものとして
、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚにより１９７４年に記述
された（２）。 脳からの主要な分裂促進因子は下垂体から単離されたも
のとは異なることが、後になって付け加えられた。これ
らの２つの因子は、それぞれ酸性および塩基性ＦＧＦと
命名された、と言うのは、それらは、同一でないにして
も類似した生物学的活性を有していたが、それらはイソ
レクトリック（ｉｓｏｌｅｃｔｒｉｃ）な点で異なって
いたからである。酸性および塩基性の繊維芽細胞増殖因
子（最近、Ｂｕｒｇｅｓｓ，　Ｗ．Ｈ．およびＭａｃｉ
ａｇによって再調査された（３））は、内皮細胞、平滑
筋細胞、副腎皮質細胞、前立腺および網膜の上皮細胞、
乏突起神経こう細胞、神経こう星状細胞、クロンドサイ
ト（ｃｈｒｏｎｄｏｃｙｔｅｓ）、筋芽細胞および骨芽
細胞を含むところの、大部分の中胚葉および神経外胚葉
誘導細胞（４）の一般的増殖能力に影響を与えるヘパリ
ン結合増殖因子の一族の正常な一員であると見られてい
る（ＢｕｒｇｅｓｓおよびＭａｃｉａｇ、　上に引用、
５８４頁）（３）。ヒトのメラミン形成細胞は、塩基性
繊維芽細胞増殖因子の分裂促進因子の影響に応答しそし
て酸性ＦＧＦには応答しないが、大部分の鳥類および哺
乳動物細胞の種類は、両方のポリペプチド類に応答する
（上記文献）（３）。

【０００３】細胞増殖を刺激する分裂促進応答を引き出
すことに加えて、繊維芽細胞増殖因子は非分裂促進様式
で応答する多数の細胞種を刺激することができる。これ
らの活性には、創傷領域への細胞遊走の促進（化学走性
）、新しい血管形成の開始（脈管形成）、神経再生の修
飾（神経親和性）、並びに特定の細胞蛋白質発現、細胞
外マトリックス生産、そして治癒過程中に重要な細胞生
存に関する刺激または抑制が含まれる（Ｂｕｒｇｅｓｓ
およびＭａｃｉａｇ、　上に引用、５８４−５８８頁）
（３）。

【０００４】細胞増殖促進作用と共にこれらの特性は、
創傷治癒を促進するための治療学的方法、そして血栓症
、動脈硬化症などのための予防および治療用途における
、繊維芽細胞増殖因子の使用のための基盤を与えるもの
である。このように、繊維芽細胞増殖因子は、損傷を受
けた組織治癒の促進（５）、心臓病および手術における
心筋層損傷の低減（６および７）、そして神経単位の生
存および神経拡張の増大（８）、を行うと提案されてい
る。

【０００５】ヒトの酸性そしてヒトおよびウシの塩基性
繊維芽細胞増殖因子をコード化する相補ＤＮＡクローン
体が単離された後、配列決定され、そしてこの相補ＤＮ
Ａから派生した断定アミノ酸配列は、蛋白質配列分析に
よって測定された構造と一致している（Ｂｕｒｇｅｓｓ
およびＭａｃｉａｇにより要約、上に引用、５８０−５
８１頁）（３）。このデータは、酸性繊維芽細胞増殖因
子（以後ａＦＧＦと呼ぶ）が１５５個のアミノ酸を有す
ることを予測している（上記文献）（３）。塩基性繊維
芽細胞増殖因子（以後ｂＦＧＦと呼ぶ）のための遺伝子
もまた、１５５個の残基から成る蛋白質に関する遺伝情
報を指定する。ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ両方に関して、
完全な生物学的活性を示すところの、Ｎ末端が切り取ら
れた形態のものが存在しており、これらには、当初単離
されそして配列決定された１４６個のアミノ酸から成る
ｂＦＧＦ（９）および１３１個のアミノ酸から成る形態
が含まれる。構造分析の結果、ａＦＧＦとｂＦＧＦとの
間に５５％の同一性があることが示されている（Ｂｕｒ
ｇｅｓｓおよびＭａｃｉａｇ、上に引用、５８１頁）（
３）。

【０００６】塩基性繊維芽細胞増殖因子は、哺乳動物の
組織から抽出できるが、しかしこれには、ヘパリンを結
合させたアフィニティークロマトグラフィーを用いたと
しても、数段階が必要であり（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉ
ｃｚ他の米国特許番号４，７８５，０７９および４，９
０２，７８２）（１０および１１）、そしてこの１４６
個のアミノ酸から成る種は、一般に、プロテアーゼ阻害
剤を存在させないで抽出を行った場合に得られる（上記
文献、コラム９、　２９−３２行）。ウシおよびヒトの
塩基性繊維芽細胞増殖因子のｃＤＮＡは、大腸菌（Ｅ．
　ｃｏｌｉ）（１２および１３）およびビール酵母菌（
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（３６）中で発現した。し
かしながら、報告された生産物の収率は低く（１５）、
そして組換え型因子は、蛋白質中の遊離チオール基によ
って促進されたチオール−ジスルフィド交換を進行する
著しい傾向を示し、その結果、ジスルフィドが混ぜ込ま
れた種が生じた（１２）。

【０００７】数多くの塩基性繊維芽細胞増殖因子類似物
が提案されてきた。アミノ酸を欠失させたか、アミノ酸
を添加したか、システインをセリンの如き中性アミノ酸
で置換したか、或はアスパラギン酸、アルギニン、グリ
シン、セリンまたはバリンを他の酸で置換したところの
、アミノもしくはカルボキシル末端を有するｂＦＧＦの
ミューテイン（ｍｕｔｅｉｎ）は増強された安定性を有
することが提案された（１６）。これらのミューテイン
は、２つまたは３つの添加、欠失または置換から成り、
そしてシステインの代わりにセリンを用いたものが最も
好適な置換である（１６）。ＡｒａｋａｗａおよびＦｏ
ｘ（１７）は、天然のｂＦＧＦ中に見いだされるシステ
インの少なくとも１つ、より好適には２つを異なるアミ
ノ酸残基で置き換えることで、より安定な類似物を生じ
させることを提案し（４頁、　４４−４７行）、そして
その実施例中にセリンが説明されている（１３頁、　２
２−２３行）。同様に、異質の結合形成を行うシステイ
ンをセリンに置き換えたところの組換え型ａＦＧＦ、そ
して酸化傾向を示すシステイン、メチオニンおよびトリ
プトファンをアラニン、バリン、ロイシンまたはイソロ
イシンで置き換えることで、増強されたか或は改良され
た生物学的活性を有する因子を生じさせることも提案さ
れている（１８）。

【０００８】カルボキシル末端から７〜４６個のアミノ
酸を欠失させ、そして任意に、アミノ酸置換を有するｂ
ＦＧＦミューテインは、改良された安定性を有すると共
に活性を維持することが、Ｓｅｎｏ他のヨーロッパ特許
出願公開番号３２６，９０７（２頁の５０行〜３頁の４
行）中で提案された（１９）。Ｆｉｄｄｅｓ他（ヨーロ
ッパ特許出願公開番号２９８７２３）（２０）は、残基
１２８〜１３８を含むヘパリン結合ドメイン中の塩基性
もしくは正に電荷した残基を中性もしくは負に電荷した
アミノ酸で置き換えることで、低下したヘパリン結合能
力および増強した効力を有する形態のＦＧＦを生じさせ
ることを提案している（５頁の４５行、　および５頁の
５４行〜６頁の１６行）。Ｂｅｒｇｏｎｚｏｎｉ他（２
１）は次に示す６個の類似体を提案している：１）残基
２７〜３２が欠失しているＭ１−ｂＦＧＦ；残基５４〜
５８が欠失しているＭ２−ｂＦＧＦ；残基７０〜７５が
欠失しているＭ３−ｂＦＧＦ；残基７８〜８３が欠失し
ているＭ４−ｂＦＧＦ；残基１１０〜１２０が欠失して
いるＭ５−ｂＦＧＦ；位置１２８のリジンと位置１２９
のアルギニンがグルタミン残基で置換されているＭ５ａ
−ｂＦＧＦ；位置１１９と１２８のリジンおよび位置１
１８と１２９のアルギニンがグルタミン残基で置換され
ているＭ６ｂ−ｂＦＧＦ。

【０００９】幸いなことに、ヘパリンに対する親和性は
また、２つの形態のＦＧＦ、即ち酸性および塩基性、の
単離および精製に対する選択的方法を提供する（２２）
。ＦＧＦは、構造的に不安定であるが、熱による不活性
化か、或はヘパリンと会合させることによる低ｐＨによ
り保護できる（２３）。ヘパリン−ＦＧＦ複合体もまた
、蛋白分解劣化に対して非常に抵抗力を示す（２４）。 ヘパリンは、該繊維芽細胞増殖因子の増強された安定性
に恐らくは関係していると考えられるメカニズムを通し
て、酸性および塩基性の両方のＦＧＦの生物学的特性を
強化する（２３および２５）。ＦＧＦには、細胞外空間
にこのＦＧＦを直接分泌させ得るところの古典的なシグ
ナルペプチド配列が不足している（２６）。しかしなが
ら、かなりの量のｂＦＧＦが、インビトロ（２７）およ
びインビボ（２８）の両方で、細胞外マトリックス（Ｅ
ＣＭ）中で検出されそして単離された。従って、このこ
とは、ＦＧＦの分泌がどのように生じるかという問題を
提起し、そして担体蛋白質もしくはプロテオグリカン使
用の可能性を提案している。ＥＣＭと会合したｂＦＧＦ
が硫酸ヘパリン（ＨＳ）プロテオグリカンと結合し（２
９および３１）、そしてＦＧＦ−ＨＳ複合体として制御
された様式で放出される可能性がある（３１）。従って
、ＦＧＦの分裂促進活性調整のメカニズムに関する現在
の仮定（１）は、生物学的に不活性なＦＧＦ−硫酸ヘパ
リンプロテオグリカンの複合体としてＦＧＦが該ＥＣＭ
中で分離されるであろうということである。次に、例え
ばプラスミノーゲン活性カスケード（３１）および硫酸
ヘパリンに特異的なエンド−ベータ−Ｄ−グルクロニダ
ーゼ（３２および３３）の如きマトリックス劣化酵素シ
ステムを活性化させる特定の細胞シグナルによって、Ｅ
ＣＭと結合したＦＧＦが動員されてもよい。

【００１０】このように、ｂＦＧＦ上に機能ドメインを
存在させるためには、このヘパリンとの構造機能相互作
用およびＦＧＦのためのレセプタを見直すべきであると
思われる。実際、ｂＦＧＦの合成ペプチドフラグメント
を用いた構造機能の研究は、残基３３〜７７および１１
２〜１５５に相当する２つの機能的ドメインの存在を示
唆している。（ここで採用するｂＦＧＦのための番号付
けは、（２６）中に記述されているように、１５５個の
アミノ酸から成る形態に対してであり、そして位置１と
してメチオニン開始コドンを表す。このシステムを用い
て、配列決定された１４６個のアミノ酸から成る組織か
ら誘導された形態のｂＦＧＦのＮ末端プロリル残基は、
コドンの位置１０に相当しており、従ってｂＦＧＦ（１
０〜１５５）として同定される。）ヘパリンおよびレセ
プタ結合ドメインは、ＦＧＦ配列に関係した合成ペプチ
ド類が有するところの、ｂＦＧＦとそのレセプタに関し
て競争する能力、放射能標識したヘパリンと結合する能
力、そしてＦＧＦの分裂促進応答を調節する能力、によ
って同定された（３４）。機能ドメイン１１２〜１５５
を有するこれらの領域の１つから、活性を示すコアのデ
カペプチド（１１５〜１２４）が生産された。しかしな
がら、このペプチド（１１５〜１２４）は、ペプチド１
１２〜１５５に比較して、それぞれ、１０倍と１００倍
、ヘパリンに対する低下した親和力と、低下した生物学
的効力と、を有していた（３４）。

【００１１】Ｓｅｎｏ他（３５）は、大腸菌中で生産さ
れたところの、一連のＣ末端が切り取られたｂＦＧＦ（
１０〜１５５）に関する分裂促進およびヘパリン結合特
性を研究するため、別の組のフラグメントを提供した。 Ｃ末端の切り取り度合が６個以上から成る残基であった
ため、ヘパリンに対する親和力が著しく低下した。同じ
研究において、Ｎ末端が切り取られた２つの形態のｂＦ
ＧＦ、即ち２３〜１５５および５０〜１５５もまた研究
された。未変性のｂＦＧＦ（１０〜１５５）と比較して
、ｂＦＧＦ（２３〜１５５）および（５０〜１５５）は
、ヘパリンに対する親和力に関していかなる変化も示さ
なかったが、分裂促進活性に関してはそれぞれ約２倍お
よび５０倍の減少を示した。

【００１２】本発明は、ヘパリンとｂＦＧＦとの間の有
意な特定相互作用に関して、ヘパリンと相互作用する増
殖因子の構造ドメイン、そして分裂促進応答を生じさせ
るｂＦＧＦのためのレセプタ、をより厳密に限定する利
点を有する。下記の理由で、これらの研究にヒトｂＦＧ
Ｆの変異体ｇｌｕ３・５，ｓｅｒ７８・９６ｂＦＧＦを
用いる：（ａ）ｂＦＧＦとこれらの変異体は等効力であ
ること；（ｂ）残基３および５の変異は、本発明の発現
システム中で、親蛋白質よりもかなり高い発現を与える
こと；および（ｃ）残基７８と９６のシステインをセリ
ンに変異させると、特に高収率で発現させたとき、親の
ｂＦＧＦの組換え型製造で生じるところの、ジスルフィ
ドが混ざり込む安定性に関する問題を、減少させること
。 これらのｂＦＧＦ類似体は、限定した記述文書に関する
共出願であるところの、同時出願の米国特許連続番号０
７／６１５，２０７（１９９０年１１月２３日出願）中
により詳細に記述されている。

【００１３】ヘパリンセファロースと結合したｇｌｕ３
・５，ｓｅｒ７８・９６ｈｂＦＧＦ（１〜１５５）を蛋
白質分解消化させて、損傷を受けていないｂＦＧＦを溶
離させるために用いたのと同じ条件下、ヘパリンセファ
ロースから溶離してくる２つのペプチドフラグメントが
得られた。従って、これらのｂＦＧＦペプチド生産物は
ヘパリン結合フラグメント（ＨＢＦ）である、何故なら
ば、それらはヘパリンとの特異的相互作用のおかげで蛋
白質分解劣化から保護されるからである。これらの２つ
のペプチドフラグメントに、ＨＢＦ−１（ｂＦＧＦ２７
〜６９）とＨＢＦ−２（ｓｅｒ７８・９６ｂＦＧＦ（７
０〜１５５））の標識を付ける。ヘパリンアフィニティ
ーＨＰＬＣを用いたとき、ＨＢＦ−１とＨＢＦ−２との
混合物は分解することなく、そしてこれらの２つのフラ
グメントは、損傷を受けていないｂＦＧＦのそれと同じ
保持時間で共溶離してくる。従って、両方のフラグメン
トはヘパリンに対して同等な親和力を有していると考え
られるが、それらが共有結合的に結合しているか、或は
非共有結合的に会合して複合体を形成している可能性も
ある。 興味の持たれることに、ＨＢＦ−１とＨＢＦ−２の各々
は、未変性の構造中でジスルフィド結合していると考え
られているところの（３５）、ｇｌｕ３・５，ｓｅｒ７
８・９６ｈｂＦＧＦ（１〜１５５）中の位置３４および
１０１に相当している単一システイン残基を含有してい
る。しかしながら、ＨＢＦ−１およびＨＢＦ−２は、チ
オール還元剤が存在していない場合、ＲＰＬＣで効率良
く分解される。ＲＰＬＣ精製したＨＢＦに関するＮ末端
配列決定分析がいかなる第二配列も示さない事実は、Ｈ
ＢＦ−１とＨＢＦ−２が共有結合的に結合しているとす
ることに対する反論を示している。

【００１４】従って、ＨＢＦ−１に対して、非還元条件
下でＳ−ピリジルエチル化を行った後（３７）、Ｎ末端
配列決定分析を行う。この操作によって、ビニルピリジ
ンとの定量的反応が得られ、そして８番目の配列決定サ
イクルでフェニルヒダントインＳ−ピリジルエチルシス
テイン誘導体の放出が生じる一方、同様に処理した対照
であるところのソマトスタチン−２８（Ｂａｃｈｅｍ　
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（ここでは、システイン１７お
よび２８がジスルフィド結合している）は、配列決定サ
イクル１７でいかなる検出可能なフェニルヒダントイン
−システイン誘導体も与えない。このように、このデー
タは、ＨＢＦ−１中に遊離のスルフヒドリル基が存在し
ていることを支持しており、そしてＨＢＦ−２において
も同様であると類推される。このことは、ｇｌｕ３・５
，ｓｅｒ−７６・９６−ｂＦＧＦ中でシステイン３４お
よび１０１が安定なジスルフィド結合を有していないこ
とを意味している。

【００１５】二者択一的に、これらの２つのペプチド類
の間に非共有結合相互作用が存在している可能性がある
。ＨＢＦ−１と−２との間の会合に対する間接的証拠は
、これらのペプチド類の正味電荷が著しく異なっており
そしてジスルフィド結合が不足しているにも拘らず、カ
チオン交換クロマトグラフィーでこれらの２つのフラグ
メントを分解できなかったことからきている。また、ヘ
パリンとカチオンイオン交換クロマトグラフィーの両方
に関するそれらの挙動は、ｂＦＧＦのそれとは区別でき
ない。このことは、未変性の状態のとき、或はヘパリン
と結合したとき、配列２７〜６９および７０〜１５５中
に含有されているｂＦＧＦの領域が相互作用を生じて、
ヘパリンとの高い親和力結合に必要なところのユニーク
な三次元構造を生じさせることを意味している可能性が
ある。このことに対する追加的支持は、ＨＰＬＣ溶媒を
除去した後でさえも、ＲＰＬＣ精製したｂＦＧＦ、ＨＢ
Ｆ−１およびＨＢＦ−２はヘパリンに対するそれらの親
和力を維持していないが、ＲＰＬＣ精製したｂＦＧＦお
よびＨＢＦ−２は生物学的活性を示すことの観察からき
ている。

【００１６】Ｂａｉｒｄ他（３４）は、合成ｂＦＧＦフ
ラグメントを用いて、ヘパリンと結合しそして生物学的
定量において弱い部分的主動もしくは拮抗活性を示すと
ころの、ｂＦＧＦ中の２つのペプチド領域、即ち残基３
３〜７７および１０９〜１２９を同定した。ＨＢＦ−２
（ｓｅｒ７８・９６ｂＦＧＦ（７０〜１５５））は、ｂ
ＦＧＦ配列１０９〜１２９を有している。効力に関して
、損傷を受けていないｂＦＧＦとＦＧＦ配列との比較を
行った結果（表２）、ＨＢＦ−２の活性は、公知の最も
高い活性を示す合成ペプチド（ｂＦＧＦ（１１２〜１５
５））（３４）よりも少なくとも１０３〜１０４倍大き
いことが示されている。最近、Ｓｅｎｏ他（３５）は、
一連の、ｂＦＧＦのＣ末端が切り取られた型の特性を発
表しそして調査した。これらの研究は、レセプタ結合の
ために必要な要素は配列５０〜１０９中に含まれており
、そしてヘパリン結合に関しては配列１１０〜１５０中
に含まれていると結論づけている、しかしながら、他の
解釈も可能である。Ｓｅｎｏ他はまた、ヘパリンに対す
る充分な親和性を維持しておりそしてｂＦＧＦ（１０〜
１５５）の約２％の分裂促進活性を示すところの、Ｎ末
端が切り取られた形態のｂＦＧＦ（５０〜１５５）を記
述した。ｂＦＧＦ（５０〜１５５）およびＨＢＦ−２（
７０〜１５５）は等効力を有すると考えられており（表
２）、従って、レセプタ認識および該分裂促進応答に対
して有意に貢献させるためにＦＧＦ配列５０〜６９を除
去することができる。

【００１７】本発明は、ヘパリンまたはヘパリンセファ
ロースと結合したｂＦＧＦの蛋白分解劣化を行ったとき
得られるＦＧＦフラグメントを提供するものであり、そ
してこれには、分裂促進活性を有するものを含むヘパリ
ンセファロース類似物またはヘパリン類似物を固定化す
るフラグメントが含まれる。本発明はまた、位置７８お
よび９６のシステイン残基が他のアミノ酸、例えばアラ
ニン、グリシン、アルギニン、トリプトファン、リジン
、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グル
タミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン
、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、セリン、
トレオニンまたはプロリンなどで置換されている類似物
を包含するものである。更に、本発明のｂＦＧＦフラグ
メントは特定の種ではなく、そしてこれには、実例を示
したもの、ウシ、ヒツジ、ブタ、そしてヒトのｂＦＧＦ
と同様な配列相同性を共有する他のものが含まれる。

【００１８】本発明の新規なｂＦＧＦフラグメントはま
た、ｂＦＧＦフラグメントをコード化するＤＮＡの製造
を伴う組換え型蛋白質合成、ベクターへのＤＮＡの挿入
、宿主細胞中でのベクターの発現、並びにそれによって
生産される組換え型ｂＦＧＦフラグメントの単離、によ
り製造されてもよい。

【００１９】遺伝コード縮重のため、本発明のｂＦＧＦ
フラグメントをコード化するＤＮＡを生じさせる種々の
コドン変化組換え物が選択でき、その結果、本文中の該
ｂＦＧＦフラグメントをコード化するＤＮＡを生じさせ
るいかなるヌクレオチド欠失（類）、添加（類）、或は
点変異（類）も、本発明に包含される。特定のコドン類
は特定の種類の有機体中でのポリペプチド発現に対して
より有効であるため、本発明のｂＦＧＦフラグメントに
関する遺伝情報を指定するＤＮＡ材料を生産させるため
に選択された遺伝変性体は、好適には、組換え型ベクタ
ーの宿主として生存させるべき種類の有機体中で最も有
効に発現を生じるものである。変更されたコドンの選択
もまた、ベクター構造に対する考慮に依存し得る。

【００２０】本発明のＤＮＡを生じさせるために変性さ
れ得るＤＮＡ出発材料は、天然の（組織から単離された
）、組換え型、或は合成されたものであってもよい。 従って、ＤＮＡ出発材料は、組織或は組織培養物から単
離されるか、通常の方法を用いてオリゴヌクレオチド類
から構成されるか、商業的に入手するか、或はｂＦＧＦ
に関する遺伝情報を指定するＲＮＡを繊維芽細胞から単
離した後、このＲＮＡを用いて、相当する二重ストラン
ドＤＮＡを合成する鋳型として使用できる単一ストラン
ドｃＤＮＡを合成させること、によって得られてもよい
。ここに指摘したように、ヘパリン或は固定化されたヘ
パリンと結合した未変性のｂＦＧＦを蛋白分解劣化させ
ることによって、同様に、該フラグメントを生じさせる
ことができる。

【００２１】ここに記述した相補ＤＮＡに相同か或は密
接に関係しているＤＮＡ配列、即ちここに記述したｃＤ
ＮＡおよびそれに相当するＲＮＡに対して、特に厳格な
条件下、雑種形成するＤＮＡ配列もまた、包含される。

【００２２】本発明のｂＦＧＦフラグメントをコード化
するＤＮＡ、或はそれに相当するＲＮＡはまた、ベクタ
ー、例えばｐＢＲ、ｐＵＣ、ｐＵＢ、またはｐＥＴ系の
プラスミド、そして微生物の宿主有機体を形質転換させ
るために用いられる組換え型ベクター、中に挿入され得
る。宿主の有機体は、バクテリア（例えば大腸菌または
枯草菌（Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）、酵母（例えばＳ
．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））または哺乳動物（例えば
マウスの繊維芽細胞）のものであってもよい。促進条件
下の上記ベクターを用いて安定に形質転換させたかもし
くは移入させた宿主有機体の培養、或は外因性のベクタ
ー生産ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の大規模発現、そして
該増殖媒体、細胞溶解産物または細胞膜画分からの所望
ポリペプチド類の単離により、所望の生産物が得られる
。

【００２３】

【発明の要約】本発明は、ｂＦＧＦの新規なフラグメン
トに関する。このｂＦＧＦフラグメント類は、未変性の
ｂＦＧＦまたはそれらの類似物の蛋白分解劣化を行い、
そして単独か、或はヘパリンまたはヘパリンセファロー
スと結合するｂＦＧＦの他のフラグメントとの組み合わ
せで、ヘパリンまたはヘパリンセファロースと結合する
フラグメントを生じさせることで得られる。より詳細に
は、本発明のフラグメントは、未変性のｂＦＧＦのおお
よそアミノ酸２７〜６９およびおおよそアミノ酸７０〜
１５５を有するか、或はヘパリンと結合するかもしくは
ヘパリンまたはヘパリンセファロースを固定化するそれ
らの類似物を有する。予想外に、本発明のポリペプチド
類、即ちおおよそアミノ酸７０〜１５５を有するものは
、前に得られたペプチド類（３４および３５）よりもず
っと高い分裂促進活性を示す。

【００２４】このように、本発明の目的は、単独かもし
くは他のフラグメントとの組み合わせでヘパリンと結合
するところの、生物学的活性を示すｂＦＧＦフラグメン
トを提供することにある。更に、このフラグメント７０
〜１５５はまた、分裂促進活性を示す。本発明の更に一
層の目的は、上記ペプチドフラグメントを生じさせる方
法を提供することにある。また、これらのフラグメント
は、前に考察したように、損傷を受けそして／または破
壊された組織をより迅速に再生させるための、動物およ
び患者の治療に有益である。本発明のこれらのそして他
の目的は、以下に示す本発明のより詳細な記述によって
更に明らかになるであろう。

【００２５】

【発明の詳細な記述】以下に示す実施例によって本発明
を説明するが、これは説明的であり本発明を限定するも
のではない。

【００２６】

【実施例】実施例１ 発現プラスミドの組み立て ｐＵＣ１８にクローン化された１５５個のアミノ酸から
成る型の、ヒトの塩基性ＧＦＧ（２６）をコード化する
合成遺伝子を、Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、　Ｏｘｆｏｒｄ、　ＵＫから購入した。操作
を容易にする目的で、ｂＦＧＦのｃＤＮＡのＮ末端メチ
オニンコドンを含む内部Ｎｃｏｌ制限部位を崩壊させた
後、ユニークなＮｄｅｌ部位で置き換える。これは、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｐＭＩＩを用いてヌクレオチド
配列（−１２〜３６）を切除した後、内部Ｎｄｅｌ部位
含有合成フラグメントをｐＵＣ１８にクローン化するこ
とによって達成される。次に、ｂＦＧＦをコード化する
ｃＤＮＡを、ＮｄｅｌおよびＢａｍ　Ｈ１によりｐＵＣ
１８から切除した後、発現ベクターｐＴ７Ｋａｎ５のＮ
ｄｅｌおよびＢａｍ　Ｈ１部位、即ちＲＮＡポリメラー
ゼからのＴ７プロモーターを含有しているｐＥＴ−３ａ
の誘導体、にクローン化する（３８）。

【００２７】実施例２ ヒトのｂＧＦＧ類似物ｇｌｕ３・５，ｓｅｒ７８・９６
ｂＦＧＦに相当する合成遺伝子の組み立て 第一段階で、それぞれ、位置３および５のアラニンとセ
リンに関するコドン（ａ）を、グルタミン酸（ｂ）をコ
ード化するように変化させる以外は、Ｎｄｅｌ制限部位
の導入に関して上述したのと同様なプロトコルを用い、
ｇｌｕ３・５−ｂＧＦＧ、即ちキメラのＦＧＦを組み立
てる。

【００２８】

【化１】

【００２９】センスストランドのみを、それぞれ、オリ
ジナル（ａ）および修飾（ｂ）フラグメントに関して示
す。アンダーラインを引いたコドンは、位置３および５
のグルタミン酸をコード化するように変化させたコドン
を示している。

【００３０】次に、発現プラスミドｐＴ７　ｇｌｕ３・
５−ｈｂＦＧＦを、オリゴヌクレオチド部位に向かう変
異誘発のための鋳型として用いた。２つの変異オリゴヌ
クレオチドプライマーを、位置７８と９６のシステイン
に関するコドンをセリンコドンに変化させるように設計
する。位置９６のセリンのためのプライマーは、該セン
スストランド（６０−ｍｅｒ；２３８−２９７）に対す
るものである一方、位置９６のセリンはアンチセンスス
トランド（３０−ｍｅｒ；２５１−２２２）に対するも
のである。これらの分裂促進プライマーに加えて、Ｔ７
プロモーター（ヌクレオチド−１２〜＋１３）およびタ
ーミネーター領域（ヌクレオチド−７５〜−５１）に対
するプライマーも設計する（３８）。修飾されたＦＧＦ
遺伝子の変異は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用
いて行う。ＨｉｎｄＩＩＩ切断プラスミドＤＮＡを有す
るところの、次に示す２つの反応混合物を製造する：（
ｉ）予想された３１９ｂｐ生産物を得るための、Ｔ７セ
ンスとＳｅｒ７８アンチセンスのプライマー、および（
ｉｉ）予想された２９４ｂｐ生産物を生じさせるための
、Ｔ７アンチセンスとＳｅｒ９６センスのプライマー。 ＰＣＲ混合物を、標準的教示に従って製造する。各々、
９２℃で１分間、５０℃で５秒間、７２℃で１分間から
成る３０回の増幅サイクルで、Ｔａｑポリメラーゼを用
いたＰＣＲを行った後、これらの生成物を、アガロース
ゲル電気泳動で分析する。連続した３回の濃縮そして３
０，０００ＭＷカット・オブ（ｃｕｔ−ｏｆ）ミクロ濃
縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた透析により、こ
の増幅したＤＮＡフラグメントから、過剰のプライマー
を分離する。保持物の部分を一緒にした後、用いるプラ
イマー類が該Ｔ７プロモーター（センス）およびＴ７タ
ーミネーター（アンチセンス）領域に相当する以外は上
述したのと同様なＰＣＲを用いて、増幅する。次に、こ
の５９９　ｂｐ　ＰＣＲ生成物を、ＮｄｅｌおよびＢａ
ｍＨｌで処理した後、アガロースゲル電気泳動により精
製する。その後、この精製したフラグメントを、該Ｔ７
発現ベクターｐＥＴ−３ａ（Ｍ−１３）、即ちｐＥＴ−
３ａの誘導体、にクローン化する。

【００３１】実施例３ ｇｌｕ３・５，ｓｅｒ７８・９６ｂＦＧＦの発現配列決
定立証（３９）の後、該ｂＦＧＦ変異体をコード化する
遺伝子を、受容能力のあるＢＬ２１　ｐｌｙｓ　Ｓ細胞
に形質転換する。プラスミドを有する大腸菌（リゾチー
ム”ｓ”プラスミドを有する大腸菌株）細胞を、アンピ
シリン（１００μｇ／ｍＬ）およびクロロアンフェニコ
ール（３４μｇ／ｍＬ）が入っているＬｕｒｉａブロス
中、３７℃で増殖させて、６００ｎｍの吸収が約０．６
単位になるようにした後、イソプロピル−ベータ−チオ
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、１ｍＭ）を添加するこ
とで、ｂＦＧＦ合成を誘発させる。次に、誘発２時間後
、４℃で遠心分離して細胞を収穫する。

【００３２】実施例４ ｇｌｕ３・５，ｓｅｒ７８・９６ｂＦＧＦの精製１リッ
トルの培養物から得られた細胞のペレットを、５０ｍＭ
のトリス、０．１ｍＭのＥＤＴＡ緩衝剤（ｐＨ７．６、
３０ｍＬ）中に再び懸濁させた後、３回の迅速冷凍／解
凍サイクルにより溶解させる。次に、この溶解産物を、
５ｍＭのＭｇＣｌ２存在下、ＤＮアーゼ１（２０μｇ／
ｍＬ）を用いて４℃で２０分間処理した後、遠心分離し
て細胞断片を除去する（１０，０００ｘｇ、２０分間）
。０．６〜３．０ＭのＮａＣｌの一次塩勾配を用いて、
本質的に記述されている（２２）ヘパリンセファロース
のアフィニティークロマトグラフィーにより、その上澄
み溶液からｂＦＧＦを精製する。増殖因子を含有してい
る画分をプールし、トリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．
６）で希釈して、約０．６Ｍの最終ＮａＣｌ濃度にした
後、１０ｍＭのトリス、０．６ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．
６）で平衡にしたＴＳＫヘパリン−５ＰＷカラム（０．
７５ｘ７．５ｃｍ；ＴｏｓｏＨａａｓ、　Ｐｈｉｌａｄ
ｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ）上に乗せた。結合した材料の溶
離を２８０ｎｍで監視し、そしてこれを、０．７ｍＬ／
分の流速の一次塩勾配（６０分で０．６〜３．０ＭのＮ
ａＣｌ）で行う。

【００３３】上記方法で精製した増殖因子に関する相同
性を、０．７ｍＬ／分の流速の、０．１％のトリフルオ
ロ酢酸中のアセトニトリル勾配（１５分間で０〜２８％
のＣＨ３ＣＮ；９０分間で２８〜６０％のＣＨ３ＣＮ）
中、溶離を２１０ｎｍで監視（Ｃ４，Ｖｙｄａｃ；Ｔｈ
ｅ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｈｅｓｐ
ｅｒｉａ、　ＣＡ）することによる逆相ＨＰＬＣ、Ｎ末
端配列分析、そして銀染色検出システム（Ｐｈａｓｔｇ
ｅｌ　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）
を用いた１０〜１５％勾配および２０％均一ゲル上のド
デシル硫酸ナトリウムのポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、により分析する。

【００３４】実施例５ ｇｌｕ３・５，ｓｅｒ７８・９６ｂＦＧＦの蛋白分解消
化トリス−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６）で予
め平衡にしたヘパリン−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ／ＬＫＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）の
排出スラリー（０．２ｍＬ）に、ｇｌｕ３・５，ｓｅｒ
７８・９６ｂＦＧＦ含有溶液（０．４７５ｍＬ中７１２
μｇ）を加え、混合した後、４℃で培養する。６０分後
、この上澄み液を取り出した後、ゲルを５０ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ　ｐＨ７．６（０．４ｍＬ）で洗浄する。こ
のゲルのスラリーをトリス−ＨＣｌ緩衝液（０．２ｍＬ
）に再び懸濁させた後、プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｌ．、　Ｔｙｐｅ　ＸＸＶ）を加え
て、ｂＦＧＦとプロナーゼとの比率を０．７５：１．０
（ｗ／ｗ）にする。次に、この混合物を撹拌しながら３
７℃で培養する。２４時間後、このゲル混合物を遠心分
離し、上澄み溶液を取り出した後、排出させたゲルを１
０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．６、３ｘ０．４ｍＬ）
そして０．６ＭのＮａＣｌ含有トリス緩衝液（２ｘ０．
４ｍＬ）で洗浄して、非特異的に結合している蛋白分解
生成物を除去する。３ＭのＮａＣｌが入っているトリス
緩衝液で２回、そのヘパリン−セファロースゲルを洗浄
することで、結合した材料の溶離を行う。

【００３５】実施例６ ｇｌｕ３・５，ｓｅｒ７８・９６ｂＦＧＦの蛋白分解フ
ラグメントの分析 銀染色検出システム（Ｐｈａｓｔｇｅｌ　Ｓｙｓｔｅｍ
、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）を用い、ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）存在下の２０％のポ
リアクリルアミドゲルを用いた還元条件下で、ｂＦＧＦ
のヘパリン結合蛋白分解フラグメントを分析する。０．
７ｍＬ／分の流速で、０．１％のトリフルオロ酢酸中の
アセトニトリル勾配を用いた逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４，Ｖｙ
ｄａｃ、　Ｈｅｓｐｅｒｉａ、　ＣＡ）によりペプチド
フラグメントを分解する。結合した材料の溶離を２１０
ｎｍで監視する。逆相精製したペプチドのＮ末端配列決
定分析を、オンラインのＰＴＨ誘導体分析物（Ｍｏｄｅ
　１２０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
が備わっているモデル４７７Ａの脈動−液相配列決定（
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　ＣＡ）を用
いて行う。ＨＣｌガス相での加水分解（５．７ＭのＨＣ
ｌ、１０．１％のフェノール；１１０℃で２４時間）を
行った後、オンラインのモデル１３０Ａ分離システム（
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が備わってい
るモデル４２０Ａフェニルイソチオシアネート−誘導化
装置を用いて、アミノ酸組成を測定する。特に明記され
ていない限り、製造業者のプロトコルに従って操作を行
う。

【００３６】ｈｂＦＧＦのヘパリン結合蛋白分解フラグ
メントに関するＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果は、ｇ
ｌｕ３・５，ｓｅｒ７８・９６−ｂＦＧＦに相当する１
８ｋＤ帯の完全な消化を示しており、そして１１ｋＤお
よび９ｋＤ種として移動するところの、分子量が２少な
いペプチド類が発生したことを示している。３ＭのＮａ
Ｃｌを用いたヘパリン−セファロースから溶離した増殖
因子消化物に関するＲＰＬＣの結果、ヘパリン結合フラ
グメント−１および−２（ＨＢＦ−１およびＨＢＦ−２
）と名づけた２つの主要ピークが得られる（図１）。早
く溶離するフラグメント、即ちＨＢＦ−１は、ヘパリン
セファロースから溶離してきた材料中に存在する９ｋＤ
種として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定される一方、遅
れて出てくるフラグメントＨＢＦ−２は、その１１ｋＤ
フラグメントのそれと同じ位置に移動する。この２つの
ＲＰＬＣ精製したフラグメントのＮ末端配列決定分析は
、ＨＢＦ−１およびＨＢＦ−２に対して、それぞれ、ｇ
ｌｕ３・５，ｓｅｒ７８・９６ｂＦＧＦの残基２７およ
び残基７０で開始するペプチド領域に一致している単一
配列を与える。ＨＢＦ−１およびＨＢＦ−２のアミノ酸
組成（表１）は、実験誤差の範囲内で、それぞれ、残基
２７〜６９および７０〜１５５のｇｌｕ３・５，ｓｅｒ
７８・９６−ｂＦＧＦ配列領域に相当している。

【００３７】

【表１】

【００３８】ＨＢＦ−１およびＨＢＦ−２のアミノ酸組
成　　ＨＢＦ−１（４５ｐｍｏｌ）およびＨＢＦ−２（
２５ｐｍｏｌ）のアミノ酸分析を３回行う。相対標準偏
差は１０％未満である（Ｎ．Ｄ．は測定せず）。

【００３９】実施例７ バイオアッセイ 逆相ＨＰＬＣ精製したサンプルを、直ちに、１％のウシ
の血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有しているＤｕｌｂｅ
ｃｃｏ修飾したＥａｇｌｅ媒体（ＤＭＥＭ）中で希釈す
る（１：５）。記述されているように（２２）、成人の
大動脈弓から誘導されたウシの血管内皮細胞を用いて、
ｂＦＧＦおよびｂＦＧＦペプチドフラグメントの分裂促
進活性を測定する。簡単に示すと、０．５ｍＬのＤＭＥ
Ｍ／１０％の子牛の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、　Ｌｏｇａ
ｎ、　ＵＴ）、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、スト
レプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびＬ−グル
タミン（２ｍＭ）中に、初期密度が、２４個のウエルを
有するプレート当たり０．８ｘ１０４個の細胞になるよ
うに、細胞を接種する。入れてから２時間後、０．５％
のＢＳＡが入っているＤＭＥＭ中の適当な希釈率のｂＦ
ＧＦを、一定量２０μＬ加える。培養５日後、２つのプ
レートをトリプシン処理し、そしてＣｏｕｌｔｅｒカウ
ンター中で細胞数を数えることにより細胞密度を測定す
る。二者択一的に、ｂＦＧＦが存在している場合と存在
していない場合の増殖曲線を、細胞溶解した後の酸性ホ
スファターゼレベルを測定することによって決定する（
４０）。抗生物質およびＬ−グルタミンが入っているＤ
ＭＥＭ／１０％子牛血清０．２５ｍＬ（上を参照）に、
初期細胞濃度が１ウエル（０．３２ｃｍ２の平底の９６
個ウエルプレート）当たり１０００〜１２００個の細胞
になるように細胞を接種する。 細胞を入れた後、ＤＭＥＭ／０．５％ＢＳＡ中適当な希
釈率の増殖因子およびペプチドフラグメントを、一定量
１０μＬ加える。４〜５日後、基質としてｐ−ニトロフ
ェニルホスフェートを用いて細胞溶解後の酸性ホスファ
ターゼレベルを測定することにより、各々のウエル中の
細胞増殖を評価する（４０）。ＵＶ最大動力ミクロプレ
ート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ
ｓ）を用い、各々のサンプルに関して４０５ｎｍの吸収
を測定する。測定は３回行う。細胞増殖を両方の方法で
測定したとき、用量応答曲線の形、或は細胞増殖の最大
の半分および最大の刺激に必要なｂＦＧＦの濃度に関し
て、いかなる有意な差も観察されない。

【００４０】実施例８ ＨＢＦ−１とＨＢＦ−２とから成る約等モルの混合物を
含有しているヘパリン−セファロースからの３Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ溶離物の分裂促進活性を測定する。この混合物は、
ウシの内皮細胞の用量依存増殖を誘発し、最大の１／２
増殖刺激の用量は、損傷を受けていないｂＦＧＦに比較
して約１０倍高い（図２）。各々の成分に関する分裂促
進特性を測定する目的で、この２つの変異ＦＧＦフラグ
メントを分解する試みを行う。予想外に、種々の条件下
のＭｏｎｏ−Ｓカチオン交換およびＴＳＫヘパリンＨＰ
ＬＣで、ＨＢＦ−１およびＨＢＦ−２のクロマトグラフ
ィー挙動は、損傷を受けていないｂＦＧＦの挙動と同じ
であり、そしてこれらは、ＨＢＦ−１とＨＢＦ−２との
いかなる分解も与えない。しかしながら、この２つの成
分に関する有効な分離をＲＰＬＣが与えたため（図１）
、ＲＰＬＣ精製したＨＢＦ−１およびＨＢＦ−２の分裂
促進特性を、ＲＰＬＣ精製したｂＦＧＦの特性と比較す
る。 これらの条件はｂＦＧＦの分裂促進活性を１０〜２０倍
まで低下させることが知られており、これは恐らく蛋白
質が変性するためであろう。本実験において、ＲＰＬＣ
精製したｂＦＧＦは、損傷を受けていないｂＦＧＦの活
性の１／１０である。ＲＰＬＣ精製したＨＢＦ−１は細
胞増殖に影響を与えないように見えるが、一方、ＨＢＦ
−２は用量依存刺激応答を示し（図３）、この効力はＲ
ＰＬＣ精製したｇｌｕ３・５，ｓｅｒ−７８・９６−ｂ
ＦＧＦのそれよりも２５〜５０倍低い（ＲＰＬＣ精製し
たＨＢＦ−２およびｇｌｕ３・５，ｓｅｒ７８・９６−
ｂＦＧＦのＥＤ５０は、それぞれ、約３と０．１ｐｍｏ
ｌ／ｍＬである）。ＲＰＬＣ条件下、ｂＦＧＦと同じ割
合でＨＢＦ−２の分裂促進活性が低下すると仮定した場
合、未変性のＨＢＦ−２に関するＥＤ５０は約１５０〜
３００ｆｍｏｌ／ｍＬであると予測され得る。この見積
もりは、ヘパリン−セファロースから溶離されたＨＢＦ
−１とＨＢＦ−２とを有する混合物に関する図２中に示
したデータから得られるところの、約１５０ｆｍｏｌ／
ｍＬのＥＤ５０と一致している。我々の分析において、
損傷を受けていないｂＦＧＦもしくはｇｌｕ３・５，ｓ
ｅｒ７８・９６−ｂＦＧＦの効力は約１７ｆｍｏｌ／ｍ
Ｌである。従って、損傷を受けていない構造を有するＨ
ＢＦ−２は、損傷受けていないｂＦＧＦよりも約１０倍
低い効力を有する。

【００４１】

【表２】

【００４２】ｂＦＧＦペプチドフラグメントの相対的分
裂促進活性 示されている公開データから、各々のペプチドの分裂促
進活性を見積もり、そしてｂＦＧＦ（２〜１５５）また
はｂＦＧＦ（１０〜１５５）に関するＥＤ５０値との比
較で表示する。（３４）から引用される相対的分裂促進
効力を不完全データから見積もる。ＨＢＦ−２に関して
報告されている値を、ＲＰＬＣ精製したｂＦＧＦに関し
て測定されたＥＤ５０値と比較する。ヘパリンセファロ
ースから溶離されたＨＢＦ−１およびＨＢＦ−２を有す
る混合物のＥＤ５０値に対して、ｂＦＧＦのＥＤ５０値
を比較することによって、同様の値を得ることができる
。

【００４３】相反する事実に対して記述したものを除き
、本特許出願に関連して寄託したＤＮＡ配列、プラスミ
ド類および／または微生物は、Ｐｅａｒｌ　Ｒｉｖｅｒ
、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに維持されているＡｍｅｒｉｃａｎ
　Ｃｙａｎａｍｉｄ　Ｃｏｍｐａｎｙの培養収集中に保
存されており、合法的に適合する場合、公に利用できる
。更に、示したＡＴＣＣ取得番号に表示されている日付
で、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０９５２、　Ｕ．Ｓ．Ａ．に
下記のものが寄託されている：ＡＴＣＣ番号６８４７８
で、１９９０年１１月１３日に寄託したＢＬ２１　ｌｙ
ｓＳ／ｐＥＴ　ｇｌｕ３・５ｓｅｒ７８・９６。

【００４４】ＡＴＣＣ番号６８４７７で、１９９０年１
１月１３日に寄託したＢＬ２１　ｌｙｓ−Ｓ／ｐＥＴ　
ｇｌｕ３・５ｈｂＦＧＦ。

【００４５】上記２つは、本文中に記述したように、ｇ
ｌｕ３・５ｓｅｒ７８・９６ｈｂＦＧＦおよびｇｌｕ３
・５ｈｂＦＧＦのＤＮＡを有する。

【００４６】文献 １．　　Ｂａｉｒｄ，　Ａ．およびＢｏｈｌｅｎ，　Ｐ
．　（１９９０）著、「ペプチド増殖因子およびそれら
のレセプタ」（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃ
ｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）
（Ｓｐｏｒｎ，　Ｍ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，　Ａ．編
集）、　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐ．　Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ．　９５（１）、　３６９−４１８頁、　Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ。

【００４７】２．　　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，　
Ｄ．、　Ｎａｔｕｒｅ　２４９：１２３−１２７　（１
９７４）。

【００４８】３．　　Ｂｕｒｇｅｓｓ，　Ｗ．Ｈ．およ
びＭａｃｉａｇ，　Ｔ．、　Ａｎｎ　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ　８：５７５−６０６　（１９８９）。

【００４９】４．　　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　Ｄ
．他、　Ｎａｔ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉ．　Ｍｏ
ｎ．　４８：１０９−１３０　（１９７８）。

【００５０】５．　Ｄａｖｉｄｓｏｎ，　Ｊ．Ｍ．他、
　Ｊ．　ＣｅｌｌＢｉｏ．　１００：１２１９−１２２
７　（１９８５）。

【００５１】６．　　Ｕ．　Ｆｒａｎｃｏ，　Ｗ．Ｐ．
、　米国特許番号４，２９６，１００　（１９８１）。

【００５２】７．　　Ｕ．　Ｆｒａｎｃｏ，　Ｗ．Ｐ．
、　米国特許番号４，３７８，３４７　（１９８３）。

【００５３】８．　　Ｗａｌｉｃｋｅ，　Ｐ．他、　Ｐ
ｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｃ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　
８３：　３０１２−３０１６　（１９８６）。

【００５４】９．　　Ｅｓｃｈ，　Ｆ．他、　Ｐｒｏｃ
．　Ｎａｔ．　Ａｃａｃ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：
　６５０７−６５１１　（１９８５）。

【００５５】１０．　　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　
Ｄ．他、米国特許番号４，７８５，０７９　（１９８８
）。

【００５６】１１．　　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　
Ｄ．他、米国特許番号４，９０２，７８２　（１９９０
）。

【００５７】１２．　　Ｉｗａｎｅ，　Ｍ．他、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ
ｕｎ．　１４６：４７０−４７７　（１９８７）。

【００５８】１３．　　Ｓｑｕｉｒｅｓ，　Ｃ．Ｈ．他
、　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３：１６２９
７−１６３０２　（１９８８）。

【００５９】１４．　　Ｂａｒｒ，　Ｐ．Ｊ．他、　Ｂ
ｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３：１６４７１−１６４７
８　（１９８８）。

【００６０】１５．　　Ｅｓｃｈ．　Ｆ．他、　ヨーロ
ッパ特許出願公開番号２８１，８２２　（１９８８）。

【００６１】１６．　　Ｓｅｎｏ，　Ｍ．他、　ヨーロ
ッパ特許出願公開番号２８１，８２２　（１９８８）。

【００６２】１７．　　Ａｒａｋａｗａ，　Ｔ．および
Ｆｏｘ，　Ｇ．Ｍ．、　ヨーロッパ特許出願公開番号３
２０，１４８。

【００６３】１８．　　ＴｈｏｍａｓおよびＬｉｎｅｍ
ｅｙｅｒ、　ヨーロッパ特許出願公開番号３１９，０５
２　（１９８９）。

【００６４】１９．　　Ｓｅｎｏ，　Ｍ．他、ヨーロッ
パ特許出願公開番号３２６，９０７　（１９８９）。

【００６５】２０．　　Ｆｉｄｄｅｓ，　Ｊ．Ｃ．他、
　ヨーロッパ特許出願公開番号２９８，７２３　（１９
８９）。

【００６６】２１．　　Ｂｅｒｇｏｎｚｏｎｉ，　Ｌ．
他、　ヨーロッパ特許出願公開番号３６３，６７５　（
１９８９）。

【００６７】２２．　　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　
Ｄ．、Ｃｈｅｎｇ，　Ｊ．、　Ｌｕｉ，　Ｇ．、　Ｂａ
ｉｒｄ，　Ａ．およびＢｏｈｌｅｎ，　Ｐ．（１９８４
）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　
８１、　６９６３−６９６７。

【００６８】２３．　　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　
Ｄ．およびＣｈｅｎｇ，　Ｊ．　（１９８６）　Ｊ．　
Ｃｅｌｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１２８、　４７５−４
８４。

【００６９】２４．　　Ｓｏｍｍｅｒ，　Ａ．およびＲ
ｉｆｋｉｎ，　Ｄ．Ｂ，　（１９８９）　Ｊ．　Ｃｅｌ
ｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１３８、　２１５−２２０。

【００７０】２５．　　Ｄａｍｏｎ，　Ｄ．Ｈ．、　Ｌ
ｏｂｂ，　Ｒ．Ｒ．、　Ｄ’Ａｍｏｒｅ，　Ｐ．Ａ．お
よびＷａｇｎｅｒ，　Ｊ．Ａ．　（１９８９）Ｊ．　Ｃ
ｅｌｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１３８、　２２１−２２
６。

【００７１】２６．　　Ａｂｒａｈａｍ，　Ｊ．Ａ．、
　Ｗｈａｎｇ，　Ｊ．Ｌ．、　Ｔｕｍｏｌｏ，　Ａ．、
　Ｍｅｒｇｉａ，　Ａ．、　Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．、
　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　Ｄ．およびＦｉｄｄｅ
ｓ，　Ｊ．Ｃ．　（１９８６）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　５、
　２５２３−２５２８。

【００７２】２７．　　Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ，　Ｉ．、
　Ｆｏｌｋｍａｎ，　Ｊ．、　Ｓｕｌｌｉｖａｎ，　Ｒ
．、　Ｆｒｉｄｍａｎ，　Ｒ．、　Ｉｓｈａｉ−Ｍｉｃ
ｈａｅｌｉ，　Ｒ．、　Ｓａｓｓｅ，　Ｊ．およびＫｌ
ａｇｓｂｒｕｎ，　Ｍ．　（１９８７）　Ｐｒｏｃ．　
Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８４、　２２９２
−２２９６。

【００７３】２８．　　Ｆｏｌｋｍａｎ，　Ｊ．、　Ｋ
ｌａｇｓｂｒｕｎ，　Ｍ．、　Ｓａｓｓｅ，　Ｊ．、　
Ｗａｄｚｉｎｓｋｉ，　Ｍ．、　Ｉｎｇｂｅｒ，Ｄ．お
よびＶｌｏｄａｖｓｋｙ，　Ｉ．　（１９８８）　Ａｍ
．　Ｊ．　Ｐａｔｈｏｌ．　１３０、　３９３−４００
。

【００７４】２９．　　Ｂａｓｈｋｉｎ，　Ｐ．、　Ｄ
ｏｃｔｒｏｗ，　Ｓ．、　Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，　Ｍ．
、　Ｓｖａｈｎ，　Ｃ．Ｍ．、　Ｆｏｌｋｍａｎ，　Ｊ
．およびＶｌｏｄａｖｓｋｙ，　Ｉ．　（１９８９）　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８、　１７３７−１７４
３。

【００７５】３０．　　Ｐｒｅｓｔａ，　Ｍ．、　Ｍａ
ｉｅｒ，　Ｊ．Ａ．Ｍ．、　Ｒｕｓｎａｔｉ，　Ｍ．お
よびＲａｇｎｏｔｔｉ，　Ｇ．　（１９８９）Ｊ．　Ｃ
ｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１４０　６８−７４。

【００７６】３１．　　Ｓａｋｓｅｌａ，　Ｏ．および
Ｒｉｆｋｉｎ，　Ｄ．Ｂ．　（１９９０）　Ｊ．　Ｃｅ
ｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１１０、　７６７−７７５。

【００７７】３２．　　Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ，　Ｉ．、
　Ｍｉｃｈａｅｌｉ，　Ｒ．Ｉ．、　Ｂａｒ−Ｎｅｒ，
　Ｍ．、　Ｆｒｉｄｍａｎ，　Ｒ．、　Ｈｏｒｏｗｉｔ
ｚ，　Ａ．Ｔ．、　Ｆｕｋｓ，　Ｚ．およびＢｉｒａｎ
，　Ｓ．　（１９８８）　Ｉｓｒａｅｌｉ　Ｊ．　Ｍｅ
ｄ．　Ｓｃｉ　２４、　４６４−４７０。

【００７８】３３．　　Ｎａｋａｊｉｍａ，　Ｍ．、　
Ｉｒｉｍｕｒａ，　Ｔ．およびＮｉｃｏｌｓｏｎ，　Ｇ
．Ｌ．　（１９８８）　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．　３６、　１５７−１６７。

【００７９】３４．　　Ｂａｉｒｄ，　Ａ．、　Ｓｃｈ
ｕｂｅｒｔ，　Ｄ．、　Ｌｉｎｇ，　Ｎ．およびＧｕｉ
ｌｌｅｍｉｎ，　Ｒ．　（１９８８）　Ｐｒｏｃ．　Ｎ
ａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８５、　２３２４−
２３２８。

【００８０】３５．　　Ｓｅｎｏ，　Ｍ．、　Ｓａｓａ
ｄａ，　Ｒ．、　Ｋｕｒｏｋａｗａ，　Ｔ．およびＩｇ
ａｒａｓｈｉ，　Ｋ．　（１９９０）　Ｅｕｒ．Ｊ．　
Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１８８、　２３９−２４５。

【００８１】３６．　　Ｆｏｘ　Ｇ．　Ｍ．、　Ｓｃｈ
ｉｆｆｅｒ，　Ｓ．Ｇ．、　Ｒｏｈｄｅ，　Ｍ．Ｆ．、
　Ｔｓａｉ，　Ｌ．Ｂ．、　Ｂａｎｋｓ，　Ａ．Ｌ．お
よびＡｒａｋａｗａ，　Ｔ．、　（１９８８）　Ｊ．　
Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３、　１８４５２−１８
４５８。

【００８２】３７．　　Ａｎｄｒｅｗｓ，　Ｐ．Ｃ．お
よびＤｉｘｏｎ，　Ｊ．Ｅ．、　（１９８７）　Ａｎａ
ｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１６１、　５２５。

【００８３】３８．　　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，　Ａ．Ｈ
．、　Ｌａｄｅ，　Ｂ．Ｎ．、　Ｃｈｕｉ，　Ｄ．、　
Ｄｕｎｎ，　Ｊ．Ｊ．およびＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．
、　（１９８７）　Ｇｅｎｅ　５６、　１２５−１３５
。

【００８４】３９．　　Ｓａｎｇｅｒ，　Ｆ．、　Ｎｉ
ｃｋｌｅｎ，　Ｓ．およびＣｏｕｌｓｏｎ，　Ａ．Ｒ．
　（１９７７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．
　Ｓｃｉ．　７４、　５４６３−５４６７。

【００８５】４０．　　Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，　Ｄ．Ｔ．
、　Ｋｎｉｇｈｔ，　Ｍ．Ｂ．、　Ｈａｒａｋａｓ，　
Ｎ．Ｋ．、　Ｗｉｔｔｗｅｒ，　Ａ．Ｊ．およびＦｅｄ
ｅｒ，　Ｊ．、　（１９８６）　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ　１５２、　１３６−１４０。

【００８６】配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願者：　　Ａｎｄｒｅｗ　Ｐ．　Ｓｅｄｄｏｎ
およびＰｅｔｅｒ　Ｂｏｈｌｅｎ（ｉｉ）発明の名称：
　　繊維芽細胞増殖因子の活性フラグメント （ｉｉｉ）配列の数：　　３ （ｉｖ）通信住所： （Ａ）住所：　　Ｄｒ．　Ｅｓｔｅｌｌｅ　Ｊ．　Ｔｓ
ｅｖｄｏｓ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｙａｎａｍｉｄ　
Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｂ）通り：　　１９３７　Ｗｅｓｔ　Ｍａｉｎ　Ｓｔ
ｒｅｅｔ、　Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ　６０（Ｃ）市：　　　　
Ｓｔａｍｆｏｒｄ （Ｄ）州：　　　　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ（Ｅ）国：
　　　　アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　　０６９０４−００６０（ｖ）コン
ピューター読み取りフォーム：（Ａ）媒体種類：　　フ
ロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：　　ＩＢＭ　
ＰＣ　ＡＴ（Ｃ）作動システム：　　ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ
）ソフトウエア：　　ＩＢＭディスプレイライトから変
換したＡＳＣＩＩ （ｖｉ）現在の出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先願出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人／代理人情報： （Ａ）名前：　　Ｔｓｅｖｄｏｓ，　Ｅｓｔｅｌｌｅ　
Ｊ．，　Ｄｒ．（Ｂ）登録番号：　　３１，１４５ （Ｃ）参照／処理予定事項番号：　　３１，３０９−０
０（ｉｘ）遠隔通信情報： （Ａ）電話：　　２０３　３２１　２７５６（Ｂ）テレ
ファックス：　　２０３　３２１　２９７１（Ｃ）テレ
ックス：　　７１０　４７４　４０５９（２）ＳＥＱ　
ＩＤ　ＮＯ：１に関する情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　　１３２個の塩基対 （Ｂ）種類：　　核酸 （Ｃ）ストランド性：　　単一 （Ｄ）トポロジー：　　線状 （ｉｉ）分子の種類：　　ＤＮＡ （ｉｉｉ）仮説： （ｉｖ）アンチ−センス： （ｖ）フラグメントの種類： （ｖｉ）オリジナル源： （Ａ）有機体： （Ｂ）株： （Ｃ）個々の単離： （Ｄ）発生段階： （Ｅ）ハプロタイプ： （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類： （Ｈ）細胞系： （Ｉ）小器官： （ｖｉｉ）直接源： （Ａ）収集： （Ｂ）クローン： （ｖｉｉｉ）ゲノムの位置： （Ａ）クロモゾーム／セグメント： （Ｂ）マップの位置： （Ｃ）単位： （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／鍵： （Ｂ）位置： （Ｃ）同定方法： （Ｄ）他の情報： （ｘ）公開情報： （Ａ）著者： （Ｂ）名称： （Ｃ）雑誌： （Ｄ）巻： （Ｅ）発行： （Ｆ）頁： （Ｇ）日付： （Ｈ）書類番号： （Ｉ）出願日： （Ｊ）公開日： （Ｋ）関係する他の情報： （ｘｉ）配列記述：　　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　　１：

【００８７】

【化２】

【００８８】（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に関する情
報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　　２５８個の塩基対 （Ｂ）種類：　　核酸 （Ｃ）ストランド性：　　単一 （Ｄ）トポロジー：　　線状 （ｉｉ）分子の種類：　　ＤＮＡ （ｉｉｉ）仮説： （ｉｖ）アンチ−センス： （ｖ）フラグメントの種類： （ｖｉ）オリジナル源： （Ａ）有機体： （Ｂ）株： （Ｃ）個々の単離： （Ｄ）発生段階： （Ｅ）ハプロタイプ： （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類： （Ｈ）細胞系： （Ｉ）小器官： （ｖｉｉ）直接源： （Ａ）収集： （Ｂ）クローン： （ｖｉｉｉ）ゲノムの位置： （Ａ）クロモゾーム／セグメント： （Ｂ）マップの位置： （Ｃ）単位： （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／鍵： （Ｂ）位置： （Ｃ）同定方法： （Ｄ）他の情報： （ｘ）公開情報： （Ａ）著者： （Ｂ）名称： （Ｃ）雑誌： （Ｄ）巻： （Ｅ）発行： （Ｆ）頁： （Ｇ）日付： （Ｈ）書類番号： （Ｉ）出願日： （Ｊ）公開日： （Ｋ）関係する他の情報： （ｘｉ）配列記述：　　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　　２：

【００８９】

【化３】

【００９０】（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３に関する情
報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：　　２５８個の塩基対 （Ｂ）種類：　　核酸 （Ｃ）ストランド性：　　単一 （Ｄ）トポロジー：　　線状 （ｉｉ）分子の種類：　　ＤＮＡ （ｉｉｉ）仮説： （ｉｖ）アンチ−センス： （ｖ）フラグメントの種類： （ｖｉ）オリジナル源： （Ａ）有機体： （Ｂ）株： （Ｃ）個々の単離： （Ｄ）発生段階： （Ｅ）ハプロタイプ： （Ｆ）組織の種類： （Ｇ）細胞の種類： （Ｈ）細胞系： （Ｉ）小器官： （ｖｉｉ）直接源： （Ａ）収集： （Ｂ）クローン： （ｖｉｉｉ）ゲノムの位置： （Ａ）クロモゾーム／セグメント： （Ｂ）マップの位置： （Ｃ）単位： （ｉｘ）特徴： （Ａ）名前／鍵： （Ｂ）位置： （Ｃ）同定方法： （Ｄ）他の情報： （ｘ）公開情報： （Ａ）著者： （Ｂ）名称： （Ｃ）雑誌： （Ｄ）巻： （Ｅ）発行： （Ｆ）頁： （Ｇ）日付： （Ｈ）書類番号： （Ｉ）出願日： （Ｊ）公開日： （Ｋ）関係する他の情報： （ｘｉ）配列記述：　　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　　３：

【００９１】

【化４】

【００９２】本発明の特徴および態様は以下のとおりで
ある。

【００９３】１．　　単独もしくはＦＧＦの他のフラグ
メントとの組み合わせで、ヘパリン、ヘパリンセファロ
ース、或はそれら各々の類似物と結合する塩基性繊維芽
細胞増殖因子フラグメント。

【００９４】２．　　上記フラグメントが、おおよそ塩
基性繊維芽細胞増殖因子のアミノ酸２７〜６９、或はお
およそ塩基性繊維芽細胞増殖因子のアミノ酸７０〜１５
５から成る第１項記載の塩基性繊維芽細胞増殖因子フラ
グメント。

【００９５】３．　　上記フラグメントが分裂促進性を
示す第１項記載の塩基性繊維芽細胞増殖因子フラグメン
ト。

【００９６】４．　　上記フラグメントがおおよそ塩基
性繊維芽細胞増殖因子のアミノ酸７０〜１５５から成る
第３項記載の塩基性繊維芽細胞増殖因子フラグメント。

【００９７】５．　　位置７８および９６のシステイン
がアラニン、グリシン、アルギニン、トリプトファン、
リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン
、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、
バリン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、セ
リン、トレオニンまたはプロリンで置換されている第１
項記載の塩基性繊維芽細胞増殖因子フラグメント。

【００９８】６．　　位置７８および９６のシステイン
がセリンで置換されている第５項記載の塩基性繊維芽細
胞増殖因子フラグメント。

【００９９】７．　　位置７８および９６のシステイン
がアラニン、グリシン、アルギニン、トリプトファン、
リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン
、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、
バリン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、セ
リン、トレオニンまたはプロリンで置換されている第２
項記載の塩基性繊維芽細胞増殖因子フラグメント。

【０１００】８．　　位置７８および９６のシステイン
がセリンで置換されている第７項記載の塩基性繊維芽細
胞増殖因子フラグメント。

【０１０１】９．　　組換え型塩基性繊維芽細胞増殖因
子フラグメント（このフラグメントは、単独もしくは塩
基性繊維芽細胞増殖因子の他のフラグメントとの組み合
わせで、ヘパリン、ヘパリンセファロース、或はそれら
各々の類似物と結合する）に関する遺伝情報を指定する
ＤＮＡ配列、そして組換え型塩基性繊維芽細胞増殖因子
（このフラグメントは、ヘパリン、ヘパリンセファロー
ス、或はそれら各々の類似物と結合する）に関する遺伝
情報を指定するＤＮＡ配列に対して、厳格な条件下、ハ
イブリダイズするＤＮＡ配列。

【０１０２】１０．　　上記ＤＮＡ配列が、おおよそ塩
基性繊維芽細胞増殖因子のアミノ酸２６〜６９、或はお
およそアミノ酸７０〜１５５を有する塩基性繊維芽細胞
増殖因子フラグメントに関する遺伝情報を指定する第９
項記載のＤＮＡ配列。

【０１０３】１１．　　塩基性繊維芽細胞増殖因子フラ
グメント（このフラグメントは分裂促進性を示す）に関
する遺伝情報を指定する第９項記載のＤＮＡ配列。

【０１０４】１２．　　上記ＤＮＡ配列が、おおよそ塩
基性繊維芽細胞増殖因子のアミノ酸７０〜５５を有する
塩基性繊維芽細胞増殖因子フラグメントに関する遺伝情
報を指定する第１１項記載のＤＮＡ配列。

【０１０５】１３．　　位置７８および９６のシステイ
ンに関する遺伝情報を指定する上記ＤＮＡ配列が、アラ
ニン、グリシン、アルギニン、トリプトファン、リジン
、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グル
タミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン
、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、セリン、
トレオニンまたはプロリンに関する遺伝情報を指定する
ＤＮＡ配列によって置換されている第９項記載のＤＮＡ
配列。

【０１０６】１４．　　上記ＤＮＡの位置７８および９
６が、セリンに関する遺伝情報を指定するＤＮＡ配列に
よって置換されている第１３項記載のＤＮＡ配列。

【０１０７】１５．　　位置７８および９６のシステイ
ンに関する遺伝情報を指定する上記ＤＮＡ配列が、アラ
ニン、グリシン、アルギニン、トリプトファン、リジン
、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グル
タミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン
、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、セリン、
トレオニンまたはプロリンに関する遺伝情報を指定する
ＤＮＡ配列によって置換されている第１０項記載のＤＮ
Ａ配列。

【０１０８】１６．　　位置７８および９６のシステイ
ンに関する遺伝情報を指定する上記ＤＮＡ配列が、セリ
ンに関する遺伝情報を指定するＤＮＡ配列によって置換
されている第１５項記載のＤＮＡ配列。

【０１０９】１７．　　位置７８および９６のシステイ
ンに関する遺伝情報を指定する上記ＤＮＡ配列が、アラ
ニン、グリシン、アルギニン、トリプトファン、リジン
、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グル
タミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン
、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、セリン、
トレオニンまたはプロリンに関する遺伝情報を指定する
ＤＮＡ配列によって置換されている第１１項記載のＤＮ
Ａ配列。

【０１１０】１８．　　位置７８および９６のシステイ
ンに関する遺伝情報を指定する上記ＤＮＡ配列が、セリ
ンに関する遺伝情報を指定するＤＮＡ配列によって置換
されている第１７項記載のＤＮＡ配列。

【０１１１】１９．　　位置７８および９６のシステイ
ンに関する遺伝情報を指定する上記ＤＮＡ配列が、アラ
ニン、グリシン、アルギニン、トリプトファン、リジン
、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グル
タミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、バリン
、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、セリン、
トレオニンまたはプロリンに関する遺伝情報を指定する
ＤＮＡ配列によって置換されている第１２項記載のＤＮ
Ａ配列。

【０１１２】２０．　　位置７８および９６のシステイ
ンに関する遺伝情報を指定する上記ＤＮＡ配列が、セリ
ンに関する遺伝情報を指定するＤＮＡ配列によって置換
されている第１９項記載のＤＮＡ配列。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１：ＨＢＦ−１およびＨＢＦ−２のＲＰＬＣ
精製 ヘパリンセファロースからの３Ｍ　ＮａＣｌ溶離液の一
部（３μｇ）に対して、記述されているように、Ｖｙｄ
ａｃ　Ｃ４カラムを用いて逆相ＨＰＬＣを行う。

【図２】図２：ウシの大動脈弓内皮細胞増殖に対する、
ヘパリンセファロースから溶離されたＨＢＦ−１および
ＨＢＦ−２から成る混合物の効果 記述されているように、ヘパリン−セファロースからの
３Ｍ　ＮａＣｌ溶離液中の蛋白質をアミノ酸分析で測定
し、そしてＤＭＥＭ／ＢＳＡ中で適当に希釈した後、一
定分量を分裂促進活性定量用細胞に添加し、細胞数を数
えることによって、細胞増殖を評価する。

【図３】図３：ウシの大動脈弓内皮細胞増殖に対する、
ＲＰＬＣ精製したＨＢＦ−１、ＨＢＦ−２およびｇｌｕ
３・５，ｓｅｒ７８・９６ｂＦＧＦの効果適当に希釈（
ＤＭＥＭ／ＢＳＡ中）したところの、ＲＰＬＣ精製した
変異体ｂＦＧＦ（−　　−）、ＨＢＦ−１（−ｏ−）、
ＨＢＦ−２（−　　−）のサンプルを細胞に加えた後、
酸性ホスファターゼ分析により増殖を測定する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　単独もしくはＦＧＦの他のフラグメン
   トとの組み合わせで、ヘパリン、ヘパリンセファロース
   、或はそれら各々の類似物と結合する塩基性繊維芽細胞
   増殖因子フラグメント。
2. 【請求項２】　　組換え型塩基性繊維芽細胞増殖因子フ
   ラグメント（このフラグメントは、単独もしくは塩基性
   繊維芽細胞増殖因子の他のフラグメントとの組み合わせ
   で、ヘパリン、ヘパリンセファロース、或はそれら各々
   の類似物と結合する）に関する遺伝情報を指定するＤＮ
   Ａ配列、そして組換え型塩基性繊維芽細胞増殖因子（こ
   のフラグメントは、ヘパリン、ヘパリンセファロース、
   或はそれら各々の類似物と結合する）に関する遺伝情報
   を指定するＤＮＡ配列に対して、厳格な条件下、ハイブ
   リダイズするＤＮＡ配列。