JPH04288094A - 血圧降下性生産物の微生物転換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は化合物（ＩＩ）

【化４】 を微生物ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
）種ＭＡ６７５１で発酵させることを特徴とする降圧剤
、化合物（Ｉ）

【化５】 の新規な製造方法に関する。化合物（Ｉ）及びその前駆
体（ＩＩ）はヒト高血圧性疾患の治療に有用なアンギオ
テンシンＩＩ（ＡＩＩ）受容体拮抗薬である。

【０００２】ＡＩＩはアンギオテンシンＩのアンギオテ
ンシン変換酵素（ＡＣＥ）による分解中に主として血中
に生産されるオクタペプチドホルモンである。ＡＣＥは
肺、腎及び多くの他の臓器血管の内皮に局在する。ＡＩ
Ｉはレニン−アンギオテンシン系（ＲＡＳ）の最終産物
であり、この系は正常血圧の調節に中心的な役割を担っ
ており、高血圧症の発生と維持並びに欝血性心不全に臨
界的に関係していると思われている。ＡＩＩは細胞膜に
存在する特異的受容体と相互作用することによってその
作用を示す強力な動脈血管収縮物質である。ＩＩ受容体
拮抗作用はＲＡＳを調節することが可能な方法の１つで
ある。

【０００３】１９９０年５月４日に出願した同時係属中
の米国特許第５１６，２８６号（代理人整理番号１７９
４６ＩＡ）は本発明で使用され、本明細書で化合物（Ｉ
Ｉ）として示される基質化合物を開示している。

【０００４】新規な血圧降下性生物転換生産物（Ｉ）は
基質化合物（ＩＩ）の存在下微生物ストレプトミセス種
ＭＡ６７５１（ＡＴＣＣ　　Ｎｏ．５５０４３）による
発酵によって得られる。生物転換は窒素栄養素を含有す
る水性炭水化物培地中で深部好気的条件下ｐＨ約７にお
いて化合物（Ｉ）を十分産生するだけの時間で達成され
る。得られたＮ２−テトラゾールβ−グルクロニド類縁
体はＡＩＩ拮抗体活性を示す、即ちウサギ大動脈由来の
膜調製試料に特異的に結合した全　１２５Ｉ−Ｓａｒ１
Ｉｌｅ８−アンギオテンシンＩＩの５０％を置換するの
に必要とされる潜在的ＡＩＩ拮抗体の濃度を測定する検
定において阻害濃度（ＩＣ５０）５０μｍ以下を有する
。従ってこれは降圧剤である。この検定はまた本明細書
で“ＩＣ５０”検定と呼ばれる。

【０００５】また本発明は化合物（Ｉ）の治療的有効量
を医薬的に使用し得る無毒性の担体又は賦形剤と含有し
ている医薬組成物を提供する。

【０００６】更に化合物（Ｉ）の治療的に有効な量をヒ
ト宿主に投与することを特徴とする該宿主における高血
圧性疾患又は欝血性心不全の治療方法を提供する。

【０００７】本発明の生産物は化合物（Ｉ）である。

【化６】 本発明の新規な方法は栄養培地中基質化合物（ＩＩ）

【
化７】 の存在下微生物ストレプトミセス種ＭＡ６７５１の発酵
及び得られた生物転換生産物、化合物（Ｉ）の常法での
分離を包含する。ストレプトミセス種ＭＡ６７５１の生
物学的に純粋な試料は現在１２３０１パークラウンドラ
イブ、ロックビル、マリーランドのアメリカンタイプカ
ルチュアコレクションの永久培養蒐集で入手することが
でき、ここから受け入れ番号ＡＴＣＣ５５０４３として
入手することができる。

【０００８】以下はストレプトミセス種ＭＡ６７５１菌
株の一般的説明である。発育の観察、一般の培養特徴及
び炭素源の利用はシャーリング（Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）及
びゴットリーブ（Ｇｏｔｔｌｅｉｂ）（Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔｅｍ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　
第１６巻、第３１３〜３４０頁）に従って行なった。細
胞の化学組成はレケバリア（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ）
とレケバリアの方法（放線菌分類学（Ａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ）、Ａ．ディーツ（Ｄｉｅ
ｔｚ）及びＤ．Ｗ．セーヤー（Ｔｈａｙｅｒ）編集、工
業微生物学会１９８０年）を用いて決定した。培養の呈
色は　インター−ソサイェティ　カラー　カウンシル−
ナショナルビューロー　オブ　スタンダード　セントロ
イド　カラー　チャート（Ｉｎｔｅｒ−Ｓｏｃｉｅｔｙ
　Ｃｏｌｏｒ　Ｃｏｕｎｃｉｌ−Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂ
ｕｒｅａｕ　ｏｆ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｃｅｎｔｒｏ
ｉｄ　Ｃｏｌｏｒ　Ｃｈａｒｔｓ）（１９８５年　ＵＳ
　Ｄｅｐｔ．のコマース　ナショナル　ビューロー　オ
ブ　スタンダード（Ｃｏｍｍｅｒｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｏｆ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）ＮＢＳ
　サーキュラー５５３に増補）に含まれる色標準と比較
して決定した。

【０００９】菌株源 培養株をケニヤのキリマンジャロ山海抜９０００〜１３
，４００フィートのヘザー森林の土壌から分離した。 細胞壁組成の分析 ペプチドグリカンはＬ−ジアミノピメリン酸を含有する
。全細胞分析の炭水化物はガラクトース、グルコース、
マンノース及びキシロースを示す。 一般的発育特徴 酵母麦芽エキス、（Ｗ／Ｏ痕跡元素）、グリセロールア
スパラギン、無機塩−デンプン、オートミール、胞子形
成及びトリプチケース大豆寒天上で良好な発育。増殖は
２７及び３７℃で起こる。また培養は酵母デキストロー
スブイヨンのような液体培地で良好に増殖する。 コロニー形態（酵母麦芽エキス寒天上）基質菌糸は橙色
（７１ｍ．ＯＹ）であり、コロニーは不透明で隆起し裂
片でゴム状である。コロニーの表面は粗い組織を呈する
。気中菌糸は４日温置した後に見え色は白（２６３ホワ
イト）である。存在する場合、胞子集合体は白（２６３
ホワイト）である。 顕微鏡的形態 気中菌糸（直径０．５７〜０．７６μｍ）は基質菌糸か
らでき分岐し、波状である。成熟培養では気中菌糸は一
般に主としてらせん体と波状鎖についた胞子で終わって
いる。

【００１０】種々の生理的反応 培養はトリプトン酵母エキスブイヨンでメラニン色素を
産生せず、黄色の非ｐＨ依存性拡散色素はグリセリンア
スパラギン寒天で産生する。デンプンは加水分解される
。 　　　　　　　　　　ストレプトミセス種ＭＡ６７５１
の２１日目の培養特徴　　　　　培　　地　　　　　　
発育量　　　　気中菌糸及び／　　　　　可溶性色素　
　　　裏　面　色　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　又は胞子　　─────────
─────────────────────────
　　　　酵母エキス−　　　　良好　　　　　白　色（
２６３）　　　　　特に無し　　　　　黄　　　　　色
　　麦芽エキス　　　　　　　　　　　　　　　らせん
状胞子体　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ｓ．
Ｙ８７）　　グルコース　　　　　　良好　　　　　白
　色（２６３）　　　　　黄色、非ｐＨ　　　　黄　　
　　　色　　アスパラギン　　　　　　　　　　　　　
らせん状胞子体　　　　　　依　存　性　　　　（ｐ．
Ｙ８９）　　無機塩−　　　　　　　　良好　　　　　
白　色（２６３）　　　　　特に無し　　　　　黄　　
　　　色　　デンプン　　　　　　　　　　　　　　　
　　らせん状胞子体　　　　　　　　　　　　　　　　
　　（ｐ．Ｙ８９）　　オートミール　　　　良好　　
　　　白　色（２６３）　　　　　特に無し　　　　　
黄　　　　　色　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　らせん状胞子体　　（ｍ．ｏＹ８４
） 　　　　　　ストレプトミセス種ＭＡ６７５１の２１日
目の炭水化物利用パターン　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　炭素源　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　利　　用＊　　　　　　　　　
　　　　　Ｄ−アラビノース　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　
　　Ｌ−アラビノース　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　セ
ロビオース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　　　Ｄ−
フルクトース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２　　　　　　　　　　　　　　イノシトー
ル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２　　　　　　　　　　　　　　α−Ｄ−ラク
トース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２　　　　　　　　　　　　　　β−Ｄ−ラクトース　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　　　
　　　　　　　　　　　Ｄ−マルトース　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　　　　　
　　　　　　　　　Ｄ−マンニトール　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　３　　　　　　　　
　　　　　　Ｄ−ラフィノース　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　
　　　Ｌ−ラムノース　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　　
　スクロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　　
　Ｄ−キシロース　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　　　Ｌ
−キシロース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　　　α−Ｄ
−グルコース（対照）　　　　　　　　　　　　　　３
　　　　＊　　３＝良好な利用 ２＝中程度の利用 １＝不十分な利用 ０＝利用無し

【００１１】一般に化合物（Ｉ）は上述の微生物を適当
な濃度の基質化合物（ＩＩ）の存在下同化される炭素源
及び窒素源を含有する水性栄養培地中、好適には深部好
気的条件（例えば振盪培養、深部培養等）下で培養（発
酵）させて生産することができる。水性培地中もとの基
体の化合物の適当な濃度は０．０５〜０．２ｍｇ／ｍｌ
好適には０．１ｍｇ／ｍｌであり、０．０５ｍｇ／ｍｌ
以下は不十分であり、０．２ｍｇ／ｍｌ以上は培養を阻
止してしまう。水性培地は２６〜２９℃好適には２７℃
の温度で温置し、この温度範囲以下では培養増殖が阻止
され、この温度範囲以上では培養菌が死んでしまう。水
性培地はＨＰＬＣで監視した場合生物転換を完了するの
に必要な時間通常約２４時間、約２２０ｒｐｍで操作す
る回転振盪機で約２回注入して温置する。水性培地は発
酵工程の開始から最後（回収）までｐＨ６〜８、好適に
は約７に維持する。このｐＨより高いかあるいは低いと
培養菌を死なせてしまう。望ましいｐＨはモルホリノエ
タンスルホン酸（ＭＥＳ）、モルホリノ−プロパンスル
ホン酸（ＭＯＰＳ）等の緩衝液の使用によって又は後述
される産生培地のような本質的に緩衝特性を有する栄養
物質の選択によって維持することができる。

【００１２】栄養培地中の好適な炭素源はグルコース、
キシロース、ガラクトース、グリセリン、デンプン、デ
キストリン等のある種炭水化物である。他にマルトース
、ラムノース、ラフィノース、アラビノース、マンノー
ス、サリシン、コハク酸ナトリウム等を含むことができ
る。

【００１３】好適な窒素源は酵母エキス、肉エキス、ペ
プトン、グルテンミール、綿実ミール、大豆ミール及び
他の植物ミール（一部又は全部脱脂されている）、カゼ
イン加水分解物、大豆加水分解物及び酵母加水分解物、
コーン浸漬液、乾燥酵母、麦芽、フェザーミール、落花
生末、酵造可溶成分等並びにアンモニウム塩（例えば硝
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム等）、尿素、アミノ酸等の無機及び有機窒素化合物で
ある。

【００１４】炭素源及び窒素源は併用して有利に使用さ
れるが痕跡量の発育因子を含む純粋でない物質と相当量
の鉱物栄養素も使用に適していることから純粋な形で使
用する必要はない。所望される場合、炭酸ナトリウム又
はカルシウム、リン酸ナトリウム又はカリウム、塩化ナ
トリウム又はカリウム、ヨウ化ナトリウム又はカリウム
、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等の鉱酸塩を培地
に加えることができる。必要な場合特に培地が深刻に泡
立つ場合、流動パラフィン、脂肪油、植物油、鉱油又は
シリコーンのような泡止め剤を加えることができる。

【００１５】深部好気的培養条件は化合物（Ｉ）の大量
生産に好適である。少量の生産の場合、フラスコ又はビ
ンの振盪又は表面培養を使用する。更にその上、発育を
大きなタンクで実施する場合、化合物（Ｉ）の生産工程
での発育のずれを回避するために生産タンク内の接種に
増殖形の微生物を使用することが好ましい。従ってまず
比較的少量の培地に“斜面”で生産した微生物の胞子又
は菌糸を接種し“種子培地”とも呼ばれる該接種培地を
培養して増殖接種物を生産し次に培養した増殖接種物を
無菌的に大きなタンクに移すことが望ましい。接種物が
生産される発酵培地は化合物（Ｉ）の生産に使用される
培地と実質的に同じか又は異なり、一般に接種前にオー
トクレーブにかけて培地を滅菌する。発酵培地は一般に
オートクレーブ段階の前に酸又は塩基を好適には緩衝液
として適当に添加してｐＨ６〜８、好適には約７に調整
する。種子培地の温度は２６〜２９℃、好適には２７℃
に維持し、この範囲以下では培養増殖が阻止され、この
範囲以上では培養菌が死んでしまう。種子培地の温置は
通常２２０ｒｐｍで操作する回転振盪機で約１０〜３０
時間好適には２４時間行なわれ、温置時間の長さは発酵
条件及び規模によって異なる。培養混合液の攪伴及び通
気は種々の方法で達成することができる。攪伴はプロペ
ラ又は類似の機械的攪伴装置によって、発酵槽を回転又
は振盪することによって又は滅菌空気を培地に通過させ
ることによって行なうことができる。通気は滅菌空気を
発酵混合液に通過させて行なうことができる。

【００１６】発酵を行なうのに好適な培養／産生培地は
次の培地を含む。 種子培地Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｇ／
ｌデキストロース　　　　　　　　　　　　　　　　　
１．０デキストリン　　　　　　　　　　　　　　　　
　１０．０牛肉エキス　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　３．０アルダミンｐＨ　　　　　　　　　
　　　　　　　　５．０ＮＺアミンタイプＥ　　　　　
　　　　　　　　５．０ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　
　　　　　　　　　０．０５Ｋ２ＨＰＯ４　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　０．３ｐＨ７．１に調
整 ＣａＣＯ３　　０．５ｇ／ｌを加える 転換培地Ｂ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｇ／
ｌグルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１０ハイケースＳＦ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２ 牛肉エキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１コーン浸漬液　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　３ｐＨ７．０に調整

【００１７】生産物、化合物（Ｉ）は一般に他の既知の
生物学的に活性な物質の回収に用いられる常法によって
培地から回収することができる。化合物（Ｉ）は培養ブ
イヨンを濾過又は遠心分離して得られる培養菌糸及び濾
液に見られ、従って常法例えば減圧下濃縮、凍結乾燥、
塩化メチレン等の通常の溶媒による抽出、ｐＨ調整、通
常の樹脂（例えばアニオン又はカチオン交換樹脂、非イ
オン吸着樹脂等）による処理、通常の吸着剤（例えば活
性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等）
による処理、結晶化、再結晶等の常法によって菌糸及び
濾液から分離及び精製することができる。好適な回収方
法は特に塩化メチレンを用いる溶媒抽出である。好適な
精製方法はシリカゲルカラム及び水とメタノール、アセ
トニトリル等の有機溶媒と少量の酢酸、トリフルオロ酢
酸、リン酸等の酸から成る溶離液混合液を用いるクロマ
トグラフィー特に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）の使用を含む。好適な溶離液はアセトニトリルと
０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水からなり直線勾
配としてカラムを通して行なわれる。

【００１８】本発明の化合物は発明の範囲内でもある種
々の無機酸及び有機酸及び塩基と塩を形成する。このよ
うな塩としてはアンモニウム塩、ナトリウム及びカリウ
ム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシ
ウム塩のようなアルカリ土類金属塩、有機塩基との塩、
例えばジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グ
ルカミン、アミノ酸との塩例えばアルギニンリジン等が
ある。また有機及び無機酸例えばＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ２
ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４、メタンスルホン酸、トルエンスル
ホン酸、マレイン酸、フマル酸、ショウノウスルホン酸
との塩を調製することもできる。無毒性の生理的に使用
し得る塩が好ましい。

【００１９】塩は生産物の遊離酸又は遊離塩基形を１当
量以上の適当な酸又は塩基と塩が不溶の溶媒又は媒質中
で又は後で真空下又は凍結乾燥により除去される水のよ
うな媒質中で反応させるか又は存在する塩のカチオンを
適当なイオン交換樹脂で別のカチオンに交換する常法に
よって生成させることができる。

【００２０】この物質の適当な製剤はまた分子のヒドロ
キシ基又はカルボキシ基により形成される化合物（Ｉ）
の通常医薬的に使用し得る生物活性エステル例えば酢酸
塩を含むこともできる。

【００２１】本発明の生産物、化合物（Ｉ）はＩＣ５０
検定によりＡＩＩ拮抗体活性を示し従って高血圧症の治
療に有用である。これはまた急性及び慢性欝血性心不全
の治療にも有効である。この化合物はまた続発性高アル
ドステロン症、原発性及び続発性肺性高アルドステロン
症、原発性及び続発性肺性高血圧症、糖尿病性腎臓病、
糸球体腎炎、強皮症、糸球体硬化症、原発性腎臓病のタ
ンパク尿症、末期の腎臓病、腎臓移植治療等の腎不全、
腎血管性高血圧症、左心室機能障害、糖尿病性網膜症の
治療に及び片頭痛レイノー病、ルミナール過形成の治療
に有用であり、アテローム性動脈硬化過程を最少限にす
ることを予期することができる。本発明の生産物は認識
機能増強にも有用である。これらの及び類似の疾病に対
する本発明の化合物の適用は当業者に明らかになるであ
ろう。

【００２２】本発明の化合物はまた上昇した眼内圧を治
療し、網膜の血流を高めるのに有用であり、錠剤、カプ
セル剤、注射剤等の典型的な医薬製剤並びに液剤、軟膏
、挿入剤、ゲル剤等としての典型的な眼製剤でこのよう
な治療を必要としている患者に投与することができる。 眼内圧を治療するために調製される医薬製剤は典型的に
は本発明の化合物約０．１〜１５重量％、好適には０．
５〜２重量％を含有する。

【００２３】高血圧症及び上述した臨床症状の治療には
、本発明の化合物は経口投与の場合錠剤、カプセル剤又
はエリキシル剤、直腸投与の場合坐薬、非経口又は筋肉
内投与の場合無菌液剤又は懸濁液剤等の組成物として使
用することができる。本発明の化合物は、最適の医薬効
能を得る投薬量でかかる治療を必要としている患者（動
物及びヒト）に投与することができる。投与量は個々の
患者に対して病気の種類及び程度、患者の体重、その後
は患者によって続けられる特別の食事、同時投薬及び当
業者が認めるであろう他の要因によって異なるが、投薬
量範囲は一般に患者一人当り１日約１〜１０００ｍｇで
あり、１回又は数回で投与することができる。好適には
投薬量範囲は患者一人当り１日約２．５〜２５０ｍｇ、
更に好適には患者一人当り１日約２．５〜７５ｍｇであ
る。

【００２４】本発明の化合物はまた他の降圧剤例えばα
−メチルドパ及び／又は利尿剤例えばヒドロクロロチア
ジド及び／又はアンギオテンシン変換酵素阻害剤例えば
エナラプリル及び／又はカルシウム経路遮断剤例えばニ
フェジピンと併用して投与することもできる。典型的に
は、これらの併用剤についての個々の日用量はそれらが
単独に投与された場合個体にとって最小で勧められる臨
床投薬量の約１／５から最大で勧められる投薬量までの
範囲とすることができる。これらの投薬量範囲は日用量
に分けるために必要に応じて単位として調節することが
でき、上述の通り投与量は病気の種類と程度、患者の体
重、特別の食事及び他の要因により異なる。典型的には
、これらの併用剤は以下で述べる医薬組成物中に処方す
ることができる。

【００２５】化合物（Ｉ）又はその生理的に使用し得る
塩約１〜１００ｍｇは生理的に使用し得る使薬、担体、
賦形剤、結合剤、防腐剤、安定剤、香味剤等と受け入れ
られた医薬実施により要求される単位投薬形として配合
される。これらの組成物又は製剤中有効物質の量は指示
した範囲の適当な投薬量を得るような量である。

【００２６】錠剤、カプセル剤等に混合することができ
る補助剤の具体例は、次の結合剤例えばトラガントゴム
、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチン、賦形剤
例えば微晶性セルロース、崩壊剤例えばコーンスターチ
、ゲル化前デンプン、アルギン酸等、滑沢剤例えばステ
アリン酸マグネシウム、甘味剤例えばスクロース、ラク
トース又はサッカリン、香味剤例えばハッカ、アカモノ
油又はチェリーである。他の種々の材料は被覆剤として
さもなければ投薬単位の物理的形態を変化させるために
存在させることができる。例えば錠剤はシェラック、砂
糖又は両方で被覆することができる。シロップ又はエリ
キシルは有効化合物、甘味剤としてスクロース、防腐剤
としてメチル及びプロピルパラベン、色素及びチェリー
又はオレンジ香味のような香味剤を含有することができ
る。

【００２７】注射用滅菌組成物は有効物質を注射用水、
ごま油、やし油、落花生油、綿実油等の天然の植物油又
はオレイン酸エチルのような合成脂肪賦形剤等の賦形剤
に溶解又は懸濁させて通常の医薬実施に従って処方する
ことができる。緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤等は必要に応
じて混合することができる。

【００２８】ウサギ大動脈膜調製試料を用いる受容体結
合検定 ３本の凍結ウサギ大動脈（ペルーフリーズバイオロジカ
ルスから入手）を５ｍＭトリス−０．２５Ｍスクロース
ｐＨ７．４緩衝液（５０ｍｌ）に浮遊しホモジナイズし
次に遠心分離した。この混合液をチーズクロスで濾過し
、上清を４℃において２０，０００ｒｐｍで３０分間遠
心分離した。こうして得た沈降物を０．２％ウシ血清ア
ルブミン及び０．２ｍｇ／ｍｌバシトラチオンを含有す
る５０ｍＭトリス−５ｍＭ　ＭｇＣｌ２緩衝液３０ｍｌ
に再浮遊させ、浮遊液を１００本の検定管に用いた。ス
クリーニングに試験される試料は２回の実験で行なった
。膜調製試料（０．２５ｍｌ）に１２５Ｉ−Ｓａｒ１Ｉ
ｌｅ８−アンギオテンシンＩＩ［ニューイングランドヌ
クレアから入手］（１０μｌ、２０，０００ｃｐｍ）を
試験試料を存在させて又は存在させずに加え、この混合
液を３７℃で９０分間温置した。次にこの混合液を氷冷
却５０ｍＭトリス−０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（４
ｍｌ）で希釈し、ガラス繊維フィルター（ＧＦ／Ｂホワ
ットマン２．４”直径）で濾過した。フィルターをシン
チレーション反応混液（１０ｍｌ）に浸漬し、パッカー
ド２６６０トリカーブ液体シンチレーションカウンター
を用いて放射能を計数した。特異的に結合した全１２５
Ｉ−Ｓａｒ１Ｉｌｅ８−アンギオテンシンＩＩの５０％
置換を得る潜在的ＡＩＩ拮抗体の阻害濃度（ＩＣ５０）
をＡＩＩ拮抗薬のような化合物の効能の尺度として示し
た。上述の方法を用いて本発明の化合物を評価し少なく
ともＩＣ５０＜５０μｍの活性を示すことがわかり、こ
れによって本発明の化合物の有効なＡＩＩ拮抗薬として
の有用性が証明確認された。

【００２９】基質化合物（ＩＩ）：５，７−ジメチル−
２−エチル−３−（２’−（テトラゾール−５−イル）
ビフェン−４−イル）メチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５
−ｂ］ピリジン Ｉ．Ｎ−トリフェニルメチル−５−（４’−ブロモメチ
ル−ビフェン−２−イル）テトラゾールの製造　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　工程１：２−シアノ−
４’−メチルビフェニル−７８℃において乾燥エーテル
（１５０ｍｌ）中ｐ−ブロモトルエン（３０ｇ）の溶液
にペンタン（１．７Ｍ）（２１０ｍｌ）中ｔ−ＢｕＬｉ
の溶液を滴下漏斗を用いて１時間３０分かけて徐々に加
えた。次に浴を取り除き、この混合液を室温で更に２時
間攪伴した。次にフラスコの含量をエーテル（１Ｍ）（
１８０ｍｌ）と乾燥ＴＨＦ（３６０ｍｌ）中　ＺｎＣｌ
２の予め混合した溶液に室温で徐々に（カニューレを用
いて）加えた。この混合液を室温で２時間攪伴し、スラ
リーを乾燥ＴＨＦ（３００ｍｌ）中２−ブロモベンゾニ
トリル（２１．３ｇ）とＮｉＣｌ２（Ｐｈ３Ｐ）２（２
．１ｇ）の溶液に加えた（カニューレを用いて）。室温
で一晩（１８時間）攪伴した後、この混合液を氷冷０．
５Ｎ　　ＨＣｌ（１５００ｍｌ）に攪伴しながら徐々に
注ぎ入れた。有機層を分離し、水相をエーテル（３００
ｍｌずつで３回）で抽出した。合わせた有機層を水、食
塩水で洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去
して粗生成物を半固形物質として得た（３４ｇ）。この
物質を酢酸エチル／ヘキサン（１：１２）を用いてシリ
カゲルフラッシュカラムにより精製して所望のニトリル
を低融点固形物として得た（２８ｇ、８８％）。ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ３）δ２．４２（Ｓ，３Ｈ），７．２−７．
８（ｍ，８Ｈ）；ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｅ１９４（Ｍ＋Ｈ
）

【００３０】 工程２：トリメチルスタンニルアジド水（１００ｍｌ）
中ＮａＮ３（４０ｇ）の濃縮溶液にジオキサン（１０ｍ
ｌ）中塩化トリメチルスズ（２０ｇ）の溶液を激しく攪
伴しながら３回に分けて加えた。瞬間的に沈殿の生成が
見られた。室温で一晩攪伴した後、この混合液を濾過し
た。残留物を水洗し吸引して次に真空中でＰ２Ｏ５によ
り乾燥した。収量１８．７ｇ（８１％）、ｍ．ｐ．１３
２〜１３６℃。

【００３１】工程３：Ｎ−トリフェニルメチル−５−（
４’−ブロモメチル−ビフェン−２−イル）テトラゾー
ル 欧州特許出願第０，２９１，９６９号に記載される２−
シアノ−４’−メチルビフェニル（工程１）から出発し
て標記化合物を製造した。

【００３２】ＩＩ．　５，７−ジメチル−２−エチルイ
ミダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの製造 工程１：２−アミノ−４，６−ジメチル−３−ニトロピ
リジン ２−アミノ−４，６−ジメチルピリジン（１０．０ｇ、
８１．８ミリモル）をＨ２ＳＯ４（濃、ｄ＝１．８４）
６５ｍｌに分けて加え０℃で攪伴した。添加が完了した
後、混合液が均一になるまでこの混合液を室温に温めた
。次にこの溶液を−１０℃に冷却し、濃ＨＮＯ３（１１
．５ｍｌ、ｄ＝１．４０）とＨ２ＳＯ４（８．２ｍｌｄ
＝１．８４）の予め冷却した（０℃）混合液を内部反応
温度が−９℃以上に上がらないような速度で加えた。添
加が完了した１０分後にこの冷却（−１０℃）混合液を
砕いた氷４００ｇに注いだ。得られたスラリーは　濃Ｎ
Ｈ４ＯＨを冷却しながら（氷浴）加えて（ｐＨ５．５に
）中和した。固形物を濾過で分離し、室温で乾燥して２
−ニトラミノ−４，６−ジメチルピリジン１３．３ｇを
白色固形物として得た。−５℃に冷却した（氷−塩浴）
攪伴濃Ｈ２ＳＯ４７５ｍｌに４，６−ジメチル−２−ニ
トラミノピリジン（１３．２ｇ、７９ミリモル）を内部
温度が−３℃以下に維持するような速度で分けて加えた
。この混合液を均一になるまで０℃に温め（３０分）、
この時ｔｌｃ（ＳｉＯ２、ＮＨ４０Ｈ中和アリコートに
よる１：１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）は転位が完了したこ
とを示した。この混合液を砕いた氷４００ｇに注ぎ、濃
ＮＨ４ＯＨを加えてｐＨ５．５に調整した。得られた黄
色スラリーを０℃に冷却し、濾過、冷水（５０ｍｌ）で
洗浄し、室温で乾燥して標記化合物と５−ニトロ異性体
の混合物１０．３２ｇを５５：４５比（１Ｈ　　ＮＭＲ
で定量）で得た。 この混合物を工程２で直接使用した。

【００３３】工程２：５，７−ジメチル−２−エチルイ
ミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン ＭｅＯＨ（１．２リットル）中２−アミノ−３−ニトロ
−４，６−ジメチルピリジンと２−アミノ−４，６−ジ
メチル−５−ニトロピリジンの５５：４５混合物８．４
４ｇの混合液に１０％Ｐｄ／Ｃ（２．４ｇ）を加えた。 反応容器を真空にし　次にＨ２で１気圧にパージし、１
８時間激しく攪伴した。濾過（セライト）及び濃縮する
と２，３−ジアミノ−４，６−ジメチルピリジンと２，
５−ジアミノ−４，６−ジメチルピリジンの混合物６．
６５ｇを暗色固形物として得た。この混合物５．４０ｇ
（３９．４ミリモル）にプロピオン酸（８．８０ｍｌ、
１１８ミリモル）次にポリリン酸（１００ｍｌ）を加え
た。 この攪伴混合液を９０℃に３時間次に１００℃に１時間
加熱した。反応が完結した後、温かい混合液を氷３００
ｇに注ぎ、この混合液をＮＨ４ＯＨで塩基性にした。こ
の混合液を抽出（ＣＨ２Ｃｌ２　　５０ｍｌずつで４回
）、乾燥（Ｋ２ＣＯ３）、濃縮して標記化合物と４，６
−ジメチル−２，５−ビス（プロピオンアミド）ピリジ
ンの混合物を得た。精製（ＳｉＯ２、５％ＭｅＯＨ／Ｅ
ｔＯＡｃ）して標記化合物１．６６ｇを遅い方の溶離成
分として得た。１Ｈ　　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００Ｍ
Ｈｚ）δ　６．９５（Ｓ，１Ｈ），２．９２（ｑ，２Ｈ
，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．５４（はっきりしたＳ，６Ｈ
），１．４０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）

【００３４】ＩＩＩ．　　５，７−ジメチル−２−エチ
ル−３−（２’−（テトラゾール−５−イル）−ビフェ
ン−４−イル）メチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］
−ピリジン パートＡ 室温に於て乾燥ジメチルホルムアミド（３０ｍｌ）中Ｎ
ａＨ（１７．２ミリモル、８０％分散液）の攪拌懸濁液
に５，７−ジメチル−２−エチルイミダゾ［４，５−ｂ
］ピリジン（１．５１ｇ、８．６２ミリモル）を一度に
加えた。２０分後この混合液を０℃に冷却し、Ｎ−トリ
フェニルメチル−５−（４’−ブロモメチルビフェニル
−２−イル）テトラゾール（５．２９ｇ、９．４８ミリ
モル）を一度に加えた。得られた混合液を室温に温め、
１５時間攪拌した。過剰のＮａＨを水で急冷し、ＤＭＦ
の大部分を真空中４０〜５０℃で除去した。残留物をＥ
ｔＯＡｃで食塩水から抽出し、乾燥（Ｋ２ＣＯ３）、濃
縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、溶
媒勾配：８０％　ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１００％Ｅｔ
ＯＡｃ）で精製して５，７−ジメチル−２−エチル−３
−（２’−（Ｎ−トリフェニルメチルテトラゾール−５
−イル）ビフェン−４−イル）メチル−３Ｈ−イミダゾ
［４，５−ｂ］ピリジン４．２５ｇを得た。 １Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８６
（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．５０−７．４１
（ｍ，２Ｈ），７．３６−７．２１（ｍ，１０Ｈ），７
．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），６．９５−６．
８９（ｍ，７Ｈ），６．８６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈ
ｚ），５．３５（ｓ，２Ｈ），２．６７（ｑ，２Ｈ，Ｊ
＝７．５Ｈｚ），２．６５（ｓ，３Ｈ），２．５８（ｓ
，３Ｈ），１．２５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）．

【００３５】パートＢ 室温に於てＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍｌ）中トリチル保護テ
トラゾール（４．１３ｇ、６．３３ミリモル）の攪拌溶
液に８５％ギ酸（６０ｍｌ）を加えた。４５分後、この
混合液を濃縮し、残留物をクロマトグラフィー（ＳｉＯ
２、８５：１３．５：１．５のＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−
ＮＨ４ＯＨ）で精製し、次にＭｅＯＨ３０ｍｌから結晶
化して固形物２．１８ｇ（８４％）を得た、ｍ．ｐ．１
５６〜１５８℃。 １Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ　７．６
８−７．６１（ｍ，２Ｈ），７．５７−７．５０（ｍ，
２Ｈ），７．０７（はっきりした一重線，４Ｈ），７．
０４（ｓ，１Ｈ），５．５５（ｓ，２Ｈ），２．８５（
ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．６１（ｓ，３Ｈ），
２．５８（ｓ，３Ｈ），１．２５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．
５Ｈｚ）． 分析Ｃ２４Ｈ２３Ｎ７・０．２５Ｈ２Ｏの計算値：Ｃ，
６９．６３；　Ｈ，５．７２；　Ｎ，２３．６８　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　実測値
：Ｃ，６９．９１；　Ｈ，５．７３；　Ｎ，２３．６０

【００３６】次の実施例は本発明を具体的に説明するた
めであり、本発明の範囲又は精神を限定するものとして
解決すべきではない。 実施例１ 微生物及び培養条件 培養株ＭＡ６７５１（ＡＴＣＣ　　Ｎｏ．５５０４３）
の凍結バイアル（２．０ｍｌ）をデキストリン１０．０
、デキストロース１．０、牛肉エキス３．０、アルダミ
ンＰＨ（イーストプロダクツ社）５．０、Ｎ−Ｚアミン
タイプＥ５．０、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　０．０５、
Ｋ２ＨＰＯ４　　０．３及びＣａＣＯ３　　０．５（ｇ
／ｌ単位として）からなるオートクレーブにかけた（滅
菌した）種子培地５０ｍｌを含有する２５０ｍｌのバッ
フル付き振盪フラスコに接種するために使用した。オー
トクレーブにかける前に種子培地をｐＨ７．１に調整し
た。種子を種子培地中２２０ｒｐｍで操作する回転振盪
機で２７℃に於て２４時間温置した。得られた種子培地
のアリコート２．５ｍｌを各々のフラスコに次の予めオ
ートクレーブにかけた（滅菌した）転換培地Ｂ＊　５０
ｍｌを含有する２本の２５０ｍｌバッフル付きでない振
盪フラスコに接種するために使用した。基質化合物（Ｉ
Ｉ）をｐＨ８を有する水溶液として各フラスコに加えて
最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌを得た。次に振盪フラスコの
内容物を２２０ｒｐｍで操作する回転振盪機で２７℃に
於て２４時間温置した。得られたブイヨンを分離精製の
ために合わせた。 ＊１．グルコース１０．０；ハイケースＳＦ２．０；牛
肉エキス１．０；コーン浸漬液３．０（ｇ／ｌ）からな
り、オートクレーブにかける前にｐＨ７．０に調整した
転換培地Ｂ。

【００３７】ブイヨンの分離及び精製方法転換培地Ｂの
全ブイヨン（１０５ｍｌ）をｐＨ２．０に酸性にし、次
に塩化メチレン（１００ｍｌずつで３回）で３回抽出し
た。塩化メチレン抽出液を合わせ、硫酸ナトリウムで乾
燥し、真空下で濃縮して油状残留物を得た。残留物をメ
タノールに溶解し、高性能液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）精製にかけた。ＨＰＬＣを室温に於てホワット
マンパーチシル１０　　ＯＤＳ−３、９．４ｍｍ×２５
ｃｍカラムで行ない、２５５ｎｍと２７５ｎｍで監視し
た。カラムを０．１％水性ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ、８５：
１５から０．１％水性ＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ、１５：８５
まで６０分の直線勾配について３ｍｌ／分で展開させた
。上述の抽出液の繰り返し注入の間で化合物を集めた。 化合物は２５５ｎｍと２７５ｎｍで見えた。保持時間２
４．５分の画分をプールし、蒸発させて溶媒を除去して
化合物（Ｉ）４．０ｍｇを得た。 確　　認 本発明の化合物（Ｉ）をＮＭＲ分光測定により確認する
と図１のプロトンＮＭＲスペクトルを得、これは指定し
た分子構造も含んでいる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は４００ＭＨｚで測定したＣＤ３ＯＤ中化
合物（Ｉ）の１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルであ
る。

【図２】図２は４００ＭＨｚで測定したＣＤ３ＯＤ中化
合物（ＩＩ）の１ＨＮＭＲスペクトルである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　構造式（Ｉ） 【化１】 で表わされる化合物。
2. 【請求項２】請求項１記載の化合物の無毒性の治療的に
   有効な量及び医薬的に使用し得る担体を包含している血
   圧降下性医薬組成物。
3. 【請求項３】請求項１記載の化合物の無毒性の治療的に
   有効な量を治療を必要としている患者に投与することを
   特徴とする高血圧症又は欝血性心不全の治療方法。
4. 【請求項４】同化される窒素源および炭素源と基質化合
   物（ＩＩ） 【化２】 を含有する栄養培地中で微生物ストレプトミセス種ＭＡ
   ６７５１（ＡＴＣＣ　ＮＯ．５５０４３）を好気的条件
   下化合物の実質量が生産されるまで培養し、こうして生
   産した化合物を分離する工程を包含している【化３】 で表わされる化合物の製造方法。
5. 【請求項５】温度が２６〜２９℃である請求項４記載の
   方法。
6. 【請求項６】温度が２７℃である請求項５記載の方法。