JPH0429040A - 細胞内の物質測定方法およびその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ、産業上の利用分野 本発明は、試料中に含まれる被測定物質を抽出し、その
抽出液中の被測定物質の濃度を生物発光反応および化学
発光反応を利用して測定する細胞内の物質測定方法およ
びその装置に関するものである。

Ｂ１発明の概要 本発明は、抽出試薬で試料中の細胞膜を破壊して生体細
胞内から被測定物質を抽出した後、その被測定物質を光
学的手法により測定する方法において、生体細胞を含む
試料に抽出試薬を混合させて細胞内の被測定物質を抽出
し、この抽出液に発光試薬を混合させて発光反応を起こ
し、この反応混合液の光学情報を光学的手法により測定
し、この測定値を予め作成した検量線にもとづいて被測
定物質の量を推定することにより、抽出から計測まで一
連の操作を自動化し、簡便で高精度の測定が行えるよう
にしたものである。

Ｃ１従来の技術 一般に、下水処理場では、汚水を活性汚泥法により浄化
処理することが広く行われている。この活性汚泥法は、
まず下水や工場廃水等の汚水に含まれている浮遊物を沈
殿除去し、その後に有機性汚濁物質を各種の微生物に摂
取させ、浄化する方法である。このような活性汚泥法に
よる汚水処理プロセスでは、浄化に関与する微生物濃度
は最も重要な操作条件となる。

現在、微生物濃度を測定する方法としては、活性汚泥浮
遊物質（ＭＬ　Ｓ　Ｓ　）や活性汚泥有機性浮遊物質（
ＭＬＶＳＳ）が用いられている。

活性汚泥浮遊物質とは、試料の浮遊物質を１！９／Ｑで
表したもので、特にエアレーショツタンク内混合液の浮
遊物質をＭＬＳＳと称し、微生物量の指標として用いら
れている。また、活性汚泥有機性浮遊物質とは、活性汚
泥浮遊物質の強熱減量を１９／Ｑで表したもので、特に
エアレーショツタンク内混合液の有機性浮遊物質をＭＬ
ＶＩ；Ｓと略称する。これらの試験操作方法は、社団法
人日本下水道協会発行の［下水試験方法Ｊ１９Ｂ４年版
、第２８４，２８５頁に開示されている。

活性汚泥浮遊物質の試験操作方法は、試料を沈殿管（５
０ｙＱ）にとり、°３０００〜４０００　ｒ　ｐｍで２
〜３分間遠心分離を行い、浮遊物質を管底に沈殿させる
。ついで上澄液をデカントして捨て、沈殿物に水を加え
て５０ａ＋Ｑとし、ガラス棒を用いてよくかき混ぜたの
ち、再び前と同様に遠心分離し上澄液を捨てる。次に、
沈殿物を、あらかじめ強熱してデシケータ−中で放冷し
たのち、質量をはかっである蒸発皿に水で洗い入れ、水
浴上で蒸発乾固する。これを乾燥４中で１０５〜１４０
”ｃで、約２時間乾燥したのち、・デシケータ−中で放
冷して測り、蒸発皿の前後の質量の差を求め、計算式に
よって浮遊物質の１１９７Ｑを算出する。

活性汚泥有機性浮遊物質の試験操作方法は、上述の試験
操作方法で測定した活性性汚泥浮遊物質を含む蒸発皿を
強熱灰化（６００±２５℃、１時間）し、デシケータ−
中で放冷したのち質量を測り、この質量と蒸発皿の質量
との差を求め、計算式によって活性汚泥有機性浮遊物質
の１９／　ｆｆを算出する。

ＭＬＳＳやＭＬＶＳＳは、野菜くずや砂などの復活性物
質および死滅して活性のない微生物をも微生物濃度とし
て測定してしまうため、正確な指標とは言えない。しか
し、現状では微生物濃度を正確に測定する方法がないた
めに、ＭＬＳＳやＭＬＶＳＳが微生物濃度を表す指標と
して用いられている。特に、ＭＬＶＳＳは測定に時間が
かかるために、主としてＭＬＳＳが用いられている。

上述の下水試験方法に記載されている分析方法は、非常
に操作が煩雑で一連の分析操作を手動で行っているため
に、相当な時間と手間を要するばかりか、再現性を得る
ことが困難となる問題がある。

近年、ＭＬＳＳやＭＬＶＳＳに代゛わる微生物濃度の測
定方法として、いろいろな測定方法が研究されている。

その中で、生体細胞中に存在するアデノシン三りん酸（
ＡＴＰ）を抽出して測定することにより微生物濃度を推
定する方法が注目されている。

生体細胞中には、生体のりん酸代謝およびエネルギー代
謝の役割を果しているアデノシン三りん酸（ＡＴＰ）が
必ず存在し、死細胞中にはＡＴＰが存在しないことが知
られている。また、１個の細胞中に存在するＡＴＰ量は
、同一細胞では同一濃度のＡＴＰが存在する。従って、
ＡＴＰが定量できれば、細胞の数および生細胞か死細胞
かの判定や細胞の活性度が測定できることになる。生物
処理プロセスを正常に機能させる上で、微生物の量と活
性度を同時に知ることが不可欠であり、活性汚泥中のＡ
ＴＰを測定することは極めて有用である。

このようなことから、微生物の細胞中のＡＴＰを測定す
ることは、水処理１食品、医学等の様々な分野において
注目されている。特に、水処理分野においては、水を浄
化するために活性汚泥を用いているので、その微生物量
および活性度を迅速に測定することが重要であり、ＡＴ
Ｐは重要な指標と考えられる。

ところで、細胞内に存在する物質また生成した物質を測
定するためには、細胞に何らかの処理を施して細胞膜を
破壊し、被測定物質を細胞の外へ取り出す抽出操作が必
要であり、抽出剤を使用して抽出する方法が主流となっ
ている。この抽出方法について、現在までに数多くの方
法か試みられている。その条件として、被測定物質の抽
出効率が高く、操作性が優れ、測定に対する影響の小さ
いことが挙げられる。

従来、活性汚泥中のＡＴＰを測定する方法とし。

て、ボイリングトリス法およびブタノール法が、社団法
人日本下水道協会発行の「下水試験方法」１９８４年版
、第２９３．第２９４頁に開示されている。

ボイリングトリス法は、試料１１１ｆ２を試験管にとり
沸騰させたトリス緩衝液２４厘ｅを加え、沸騰水浴中で
１０分間かきまぜながら抽出を行う。ついで、沈殿管に
移し３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上澄液を
とり、室温まで冷却させて試料液とする。まず、空試験
としてトリス緩衝液０．２０１Ｑと酵素混合液０．２０
ｍＱを蛍光光度計のキュベツトに入れ、ｌＯ〜６０秒間
蛍光強度を測定する。次に、キュベツトに試料液０．２
０ｊ＋Ｑをとり、直ちにキュベツト内に酵素混合液０．
２０１１Ｑを加えて十分にかき混ぜたのち、１０〜６０
秒間蛍光弥度を測定する。空試験値を差し引き補正した
のち、あらかじめ作成した検量線から、ＡＴＰの量を求
め、計算式によって試料中のＡＴＰのｍｇ／Ｑを算出す
る。

また、ブタノール法は、試料ｔｉＱを試験管にとり、ブ
タノール２１１Ｑを加え撹拌したのち、オクタツール１
６ｊ＋１２を加えて、さらに１０秒間撹拌する。

ついで、沈殿管に移し３０００ｒｐｍで５分間遠心分敵
し、この上澄液を試料液として用いる。以下、上記ボイ
リングトリス法に準じて操作する。

Ｄ１発明が解決しようとする課題 上述の下水試験法に記載されているボイリングトリス法
は、沸騰、撹拌、遠心分離、冷却等の抽出操作が必要で
ある。また、ブタノール法は、撹拌、遠心分離等の抽出
操作が必要である。これらの分析方法は、操作が繁雑で
一連の分析操作を手動で行っているため、相当の時間と
手間を必要とするばかりか、再現性を得ることが困難と
なる問題がある。また、一連の操作を自動化する場合、
複雑な機構が必要となり実用性に欠ける問題がある。

現在、活性汚泥等の試料中に存在する生体細胞の体内に
含まれている被測定物質を、精度良く高感度に、抽出か
ら計測までの一連の操作を自動的に行う測定装置はなか
った。

一連の操作を自動化する重要な技術の１つとして、抽出
効率が良く、自動化が容易な抽出方法を開発する必要が
ある。そこで、本出願人は、抽出効率が良く、かつ自動
化が容易な抽出方法を開発し、既に特許出願した。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、自動化が
容易な抽出方法に基づいて、試料中に含まれる細胞内の
被測定物質を抽出から測定までの一連の操作を自動化し
、簡便で高精度の測定が行い得る実用性に優れた細胞内
の物質測定方法お上びその装置を提供することを目的と
する。

Ｅ１課題を解決するための手段 本発明の細胞内の物質測定方法は、上記目的を達成する
ために、生体細胞を含む試料に抽出試薬を混合させ、細
胞膜を破壊して細胞内の被測定物質を抽出する抽出工程
と、前記抽出手段により得られた抽出液を所定量分取し
、この抽出液に発光試薬を混合させて発光反応を起こす
発光反応工程と、前記発光反応工程により発光した反応
混合液の光学情報を光学的手法により測定し、その測定
値を予め作成した検量線にもとづいて前記被測定物質の
量を推定するデータ処理工程とを具備したことを特徴と
する。

また、本発明の細胞内の物質測定装置は、生体細胞を含
む試料が注入されている複数の容器を順欠移送する移送
装置と、抽出試薬タンク内に貯蔵された抽出試薬を前記
各容器内に所定量注入する抽出試薬用ポンプと、希釈液
タンク内に貯蔵された希釈液を前記各容器内に所定量注
入する希釈液用ポンプと、前記各容器内の試料に前記抽
出試薬および希釈液を混合させて得た抽出混合液を分取
する測定用ノズルと、前記測定用ノズルにより分取され
た抽出混合液をフローセルに導く流通路と、キャリアー
液タンク内に貯蔵されたキャリアー液を前記流通路に送
波するキャリアー液用ポンプと、発光試薬タンク内に貯
蔵された発光試薬を前記キャリアー液により送られてき
た抽出混合液に所定量注入する発光試薬用ポンプと、前
記抽出混合液に発光試薬を混合させて得た反応混合液の
光情報を前記フローセルを介して測定する光学的測定装
置とを具備したことを特徴とする。

２１作用 生体細胞含む試料中に抽出試薬を混合させると、抽出試
薬により細胞膜か破壊されて細胞外に被測定物質が放出
される。この抽出液を所定量分取し、これに発光試薬を
混合させると、被測定物質と発光試薬との反応により発
光が生ずる。この発光反応により発生する光量は被測定
物質量に比例する。

この発光量を光学的手法により測定し、予め作成した検
量線にもとづいて被測定物質量を推定することにより、
細胞の数および生細胞か死細胞かの判定や細胞の活性度
を測定することができる。

Ｇ、実施例 以下、本発明の実施例を第１図ないし第４図に基づいて
説明する。第１図は本発明を適用したＡＴＰ測定装置の
測定プロセスを説明するための説明図、第２図は生物発
光現象における時間と発光量との関係を示すグラフ、第
３図は同ＡＴＰ測定装置の概略的な構成を示すブロック
図、第４図はＡＴＰ濃度と発光量との関係を示すグラフ
である。

まず、本発明を適用したＡＴＰ定量方法の測定プロセス
の一例を第１図により説明する。

（１）ＡＴＰ抽出 試料（活性汚泥）０．２５ｘＱに抽出試薬（５％のトリ
クロロ酢酸）０．２５ｘＱを混合し、微生物の細胞膜を
破壊して、微生物体内に存在するＡＴＰを微生物体外へ
放出する操作を行う。その後、発光反応に及ぼす抽出試
薬の影響を最小限に抑えるために、希釈液（４Ｘ　１０
−３ｍｏｆｆ／　（２のＥＤＴＡを含む０　、　１　ａ
ｏＱ／Ｑのトリス緩衝液ｐＨ７，７５）４．５ｘＣを添
加する操作を行う。ここで、試料と抽出試薬と希釈液の
液量は混合比率を一定にすれば良く、上記の液量に限定
されないことが予備実験により確認されている。

（２）発光反応 抽出液５　から０，５峠を分取して、発光試薬（ベーリ
ンガー・マンハイム山之内社製のＡＴＰ測定用キットｒ
ＡＴＰ　ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ＣＬＳＪ）
　Ｃ，５ｒｓＱと反応させ、その反応により発光した混
合液をフローセルに導き、センサー（光電子増倍管）で
発光量を計数する。この発光法は、生物発光法と呼ばれ
、ＡＴＰは生物発光物質であるルシフェリンとルシフェ
ラーゼとをマグネシウムイオンと酸素の存在下で反応さ
せて、以下のように発光現象を起こさせることができる
。なお、この発光反応はホタルの体内で起こっているの
と同じ反応である。

上述の発光反応はＡＴＰ　１分子に対して光が１個放出
されるので、発光量からＡＴＰを定量することができる
。実際には、種々の濃度に調製した既知濃度のＡＴＰ量
を測定し、標準曲線（検量線を作成する。そして、活性
汚泥の測定結果から得られる発光量に対するＡＴＰ濃度
を標準曲線から読み取り、活性汚泥中に含まれる微生物
体内のＡＴＰ量の測定を行う。

ＡＴＰとルシフェリンおよびルシフェラーゼなどの試薬
との反応により生ずる生物発光現象における時間と発光
量との関係は、第２図に示すような発光パターンとなる
。第２図において、発光量（ＣＰＳ）はＡＴＰと試薬と
の混合時間ｔ０から時間の経過に伴って急激に増加し、
時間１１で最大値（ＣＰ　Ｓ　）　ｗａｘに達し、その
後は徐々に減少して行く。

（３）データ処理 このデータ処理では、発光反応終了後に標準曲線の発光
量のパラメータとして必要となる最大発光量の積分値を
演算処理してプリンタに印字する操作を行う。本装置は
、必要ならば演算処理した結果をＲ５−２３２Ｇにより
パーソナルコンピュータに伝送し、標準曲線の作成など
種々のデータ処理ができるようになっている。標準曲線
の発光パターンは通常最大発光量（ＣＰ　Ｓ　）　ｗａ
ｘかまたはある時間間隔の発光量（ＣＰＳ）の積分値が
用いられる。

（４）洗浄 この洗浄は一連の測定が終了した後に、抽出液の分取に
用いられる測定用ノズルの内部または周囲を洗浄液（蒸
留水）で洗浄する操作を行う。本測定装置は、１本の測
定用ノズルで抽出液を分取し、濃度の異なる試料を連続
的に自動測定するようになっている。測定用ノズルの内
部に１つ前に測定した抽出液が残存していると、この液
に含まれるＡＴＰが次の抽出液の測定に影響を及ぼし、
正確な測定ができなくなる。そのために、一連の測定が
終了した後に、測定用ノズルの内部または周囲を洗浄す
るようにしている。

以上に述べたＡＴＰ測定プロセスを自動化するＡＴ、Ｐ
測定装置は、第３図に示すように構成されている。

本図において、ｌは生体細胞を含む試料（例えば活性汚
泥）が注入される複数の試験管を、同心位置に配置した
ターンテーブルである。このターンテーブルｌの下方に
は、予め試験管内に入れられた磁石を回転させるスター
テ２が設けられている。このターンテーブルｌは、駆動
モーター３を制御器４で制御することにより、原点調整
がなされ複数の試験管を測定順に測定用ノズル５で吸弓
する位置（吸引ボート）まで移送する。測定用ノズル５
は、モーター６を制御器７で制御することにより、上下
方向および回転方向（吸引ボートと廃液ボートとの間）
を移動する。このとき、測定用ノズル５の上下方向およ
び回転方向の位置検出はリミットスイッチによりおこな
われる。

８はトリクロロ酢酸等の抽出試薬を貯蔵する抽出試薬タ
ンクであり、９はトリス緩衝液等の希釈液を貯蔵する希
釈液タンクである。これらのタンク８．９には、抽出試
薬タンク８内に貯蔵された抽出試薬および希釈タンク９
内に貯蔵された希釈液を前記試験管内に所定量注入する
抽出試薬用シリンジ１０および希釈液用シリンジ１１が
三方バルブ１２および１３を介して連結されている。三
方バルブ１２は、後述するマイクロプロセッサの制御を
受けて切り替えられ、抽出試薬流通路１４ａと１４ｂを
連結し、また抽出試薬流通路１４ｂと１４ｃを連結する
。三方バルブ１３は、後述するマイクロプロセッサの制
御を受けて切り替えられ、希釈流通路１５２Ｌと１５ｂ
を連結し、また希釈流通路１５ｂと１５ｃを連結する。

シリンジＩＯ，１１は、シリンダ部にピストン部を嵌挿
して構成され、両方のシリンジ１０．１１のピストン部
を機械的に結合し、１個のモーター１６で駆動できるよ
うになっている。モーター１６は制御器１７により制御
される。

１８は測定用ノズル５により分取された試料に前記抽出
試薬および希釈液を混合させて得た抽出混合液を、反応
コイル１９を介してフローセル２０に導く主流通路であ
る。２１は蒸留水等のキャリアー液を貯蔵するキャリア
ー液タンク、２２は洗浄液を貯蔵する洗浄液タンク、２
３．２４はルンフエリンおよびルシフェラーゼ等の発光
試薬を貯蔵する発光試薬タンク、２５は廃液を収容する
廃液タンクである。

キャリアー液タンク２１には、キャリアー液タンク２１
内に貯蔵されたキャリアー液を主流通路１８に供給する
キャリアー液用シリンジ２６が三方バルブ２７を介して
連結されている。三方バルブ２７は、後述するマイクロ
プロセッサの制御を受けて切り替えられ、キャリアー液
流通路２８ａと２８ｂを連結し、またキャリアー液流通
路２８ｂと２８ｃを連結する。キャリアー液流通路２８
Ｃは三方バルブ２９を介して主流通路１８に連結されて
いる。シリンジ２６は、シリンダ部にピストン部を嵌挿
して構成され、ピストン部をモーター３０で駆動できる
ようになっている。モーター３０は前記制御器１７によ
り制御される。

洗浄液タンク２２には、洗浄液タンク２１内に貯蔵され
た洗浄液を主流通路１８に供給する洗浄液用シリンジ３
１が三方バルブ３２．３３を介して連結されている。三
方バルブ３２．３３は、後述するマイクロプロセッサの
制御を受けて切り替えられ、洗浄液流通路３４ａ、３４
’ｂ、３４ｃを連結し、洗浄液流通路３４ｃ、３４ｂ、
３４ｄを連結し、洗浄液流通路３４ｃ、３４ｅを連結す
る。

洗浄液流通路３４ｄは三方バルブ３５を介して主流通路
１８に連結され、３４ｅは洗浄ボート３６に連結されて
いる。シリンジ３１は、シリンダ部にピストン部を嵌挿
して構成され、ピストン部をモーター３７で駆動てきる
ようになっている。モーター３７は制御器３８により制
御される。

発光試薬タンク２３および２４には、発光試薬タンク２
３．２４内に貯蔵された発光試薬を前記主流通路１８に
所定量供給する発光試薬用シリンジ３．９．４０が三方
バルブ４１．４２を介して連結されている。三方バルブ
４１は、後述するマイクロプロセッサの制御を受けて切
り替えられ、発光試薬流通路４３λ、４３ｂを連結し、
また発光試薬流通路４３ｂ、４３ｃを連結する。三方バ
ルブ４２は、後述するマイクロプロセッサの制御を受け
て切り替えられ、発光試薬流通路４４ａ、４４ｂを連結
し、また発光試薬流通路４４ｂ、４４Ｃを連結する。シ
リンジ３９．４０は、シリンダ部にピストン部を嵌挿し
て構成され、両方のシリンジ３９．４０のピストン部を
機械的に結合し、１個のモーター４５で駆動できるよう
になっている。モーター４５は前記制御器３８により制
御される。

４６は電源、４７はシャッタ、４８は光電子増倍管、４
９は増幅器、５０は波形整形回路であり、これらは抽出
混合液に発光試薬を混合させて得た反応混合液の光情報
を、前記フローセル２０を介して測定する光学的測定装
置を構成する。

５１はマイクロプロセッサ、５２はキーボード、５３は
レコーダ、５４は表示器、５５はプリンタである。

次に、本実施例のＡＴＰ測定装置の動作を説明する。

［測定準備］ 試験管内にテフロン等によりコーティングされた磁石を
入れ毛。この試験管をターンテーブル１にセットし、各
試験管に試料（活性汚泥）０．２５　をピペットなどの
手動式分注器により分取する。

その後、ターンテーブル１をターンテーブル取付台にセ
ットし、正面パネルのモード（ＭＯＤＥ）スイッチを投
入して準備（ＲＥＡＤＹ）モードに選択する。このとき
、正面パネルに印刷された“ＲＥＡＤＹ”の側面に設置
された緑色の発光ダイオードが点灯する。

この状態で、スタート（ＳＴＡＲＴ）スイッチを投入す
ると、モーター１６，３０，３７．４５が駆動してシリ
ンジ１０．１１，２６．３１，３９．４０の各シリンダ
部および各流通路内に試薬等が充填される。この準備工
程を実施している間は、緑色の発光ダイオードが点滅す
るようになついる。この発光ダイオードの点滅により、
操作者は準備工程実施中であることを認識することがで
きる。

［測定コ 正面パネルのモードスイッチを投入して測定（ＭＥＡＳ
ＵＲＥ）モードに選択する。このとき、正面パネルに印
刷された“ＭＥＡＳＵＲＥ″の側面に設置された赤色の
発光ダイオードが点灯する。

測定を実施している間は、赤色の発光ダイオードが点滅
するようになっている。この発光ダイオードの点滅によ
り、操作者は測定実施中であることを認識することがで
きる。このように、各発光ダイオードに異なる色を使用
することにより、準備モードと測定モードのどちらかで
あるかを容易に認識することができる。

次に、スタートスイッチを投入すると、ターンテーブル
ｌに設置されたモーター３が駆動し、原点調整が行われ
る。この原点調整により、試料の測定順序が指定される
。すなわち、ターンテーブルｌ上に刻印された“１”の
数字が刻印された場所に設置された試験管から測定され
るようになっている。このとき、各シリンジｔｏ、１１
，２６゜３１．３９．４０を駆動してシリンダ部内およ
び各流通路内に存在する気泡を除去する操作が行われる
。本装置では、シリンジ１０，１１，２６゜３１．３９
．４０を縦に設置して気泡がシリンダ部内に溜まらない
ように考慮しである。気泡は測定精度に少なからず悪影
響を及ぼすために、この気泡抜きの操作は重要である。

原点調整が行われると、まず“１゛の数字が刻印された
位置に設置された試験管にシリンジ１０により、抽出試
薬（５％のトリクロロ酢酸）０．２５１が注入される。

これにより、試料中の微生物からＡＴＰが抽出される。

続いて、３０秒後に同じ試験管内にシリンジ１１により
希釈液（４Ｘ１０−”ｍｏ１２／　ＱのＥＤＴＡを含む
０　、　１　ｍｏＱ／Ｑのトリス緩衝液ｐＨ７，７５）
　４．５ｍ１２が注入される。

このとき、スターテ２て試験管内の磁石を回転させ、試
験管内部の混合液を適度に撹拌させることにより、抽出
試薬の作用を促進させ、適切な抽出処理を行うことがで
きる。

この抽出操作が終了すると、ターンテーブル１が所定の
角度回転して、前記の試験管は吸引ポートの位置に設置
される。続いて、測定用ノズル５が廃液ポート位置から
吸引ポート位置まで移動する。その後、測定用ノズル５
は所定の位置まで下降し、試験管内の抽出液を０．５１
１１２吸引する。吸引された抽出液はキャリアー液によ
り反応コイル１９の直前まで導入され、−時的に配管内
に滞留される。その後、この抽出液に発光試薬（ベーリ
ンガー・マンハイム山之内社製のＡＴＰ測定用キットｒ
　ＡＴＰ　ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ＣＬＳＪ
）　０　、５　ｘＱが注入される。この混合液は、反応
コイル１９へ送波されし、ここで抽出液と発光試薬が混
合されて生物発光反応が起こる。

発光反応した反応混合液は、瞬時に光電子倍増管４８の
直前の位置に設置されたフローセル２０内に導かれる。

ここで反応混合液の光情報は光電子倍管４８により検出
される。この検出信号は増幅器４９で増幅され、波形整
形回路５０で波形整形された後、マイクロプロセッサ５
１に入力される。このマイクロプロセッサ５１は、標準
曲線のパラメータとして必要となる最大発光量と発光量
の積分値を演算処理して、その情報を表示器５４に表示
し、プリンタ５５に印字するとともに、レコーダ５３に
記録する操作を行う。発光量の計測は、予め測定開始前
にキーボード５２により設定された時間の間実行される
。そして、フローセル２０内の反応混合液は廃液槽２５
へ送波される。

このデータ処理が終了すると、測定用ノズル５は上昇し
、吸引ポートの位置から廃液ポートの位置まで移動する
。そして、測定用ノズル５は下降して、ここで測定用ノ
ズル５の内部と周囲が洗浄され、１検体の測定が終了す
る。

［測定例１］ 本実施例の装置により、ベーリンガー・マンハイム山内
社製のＡＴＰ測定用キットの標準ＡＴＰおよび発光試薬
を用いて、標準曲線を作成する。

まず、標準ＡＴＰを蒸留水で１０倍づつ希釈して、１０
−１１〜１０−’ｔ＋ｏｌ／（ｌの濃度に調製する。８
本の試験管にそれぞれ７種類の濃度に調製したＡＴＰ溶
液とブランクとして蒸留水を５　づつ試験管に分取する
。この計８本の試験管をターンテーブルｌにセットする
とともに、上記発光試薬をいれた試薬ビンを装置下段の
試薬収納ケースに設置する。その後、正面パネルのモー
ドスイッチを投入して準備（ＲＥＡＤＹ）モードに選択
し、シリンジポンプ１０．１１，２６．３１．３９．４
０および各流通路内に試薬等を充填する。続いて、正面
パネルのモードスイッチを測定（ＭＥＡＳＵＲＥ）モー
ドに選択し、各濃度のＡＴＰ溶液に対する発光反応をそ
れぞれ３回づつ３０秒間計測する。

各濃度のＡＴＰ溶液に対する発光量を計測した結果を第
４図に示す。第４図のグラフによれば、ＡＴＰ濃度と発
光量との間に１ｏ−１ｎ〜１０−Ｓ霞ｏ１までほぼ良好
な直線関係が成立することが判明した。

また、各測定点における変動係数は全て５％以内と良好
であった。

［測定例２］ 本装置により活性汚泥を測定し、第４図に示す標準曲線
からＡＴＰ濃度を読み取った値と手分析値とを比較した
結果を表１に示す。

表１ 表１から、本装置による活性汚泥中のＡＴＰ濃度（ｍｏ
ｌ／１２）は手分析値とほぼ同等の値が得られ、本装置
の測定プロセスおよび構造が自動測定に十分に適用でき
ることが証明された。

［測定例３コ 本装置を使用して、低濃度（１，０−＠＋＋ｏｌ／　１
２）と高濃度（１０−＠ｍｏｌ／Ｑ）の標準ＡＴＰ溶液
を連続し、同時再現性試験を行った結果を表２に示す。

表２ 表２から、１２回の測定（ｎ　＝　１２　）おける変動
係数は、低濃度および高濃度共に５％以内で、精度にお
いても非常に良好な結果が得られた。

以上に説明したように、本実施例によれば、試料中に含
まれるＡＴＰの抽出から計測までの一連の操作を自動化
することができるので、操作が極めて簡便で、熟練者で
なくとも精度の高い測定を行うことができる。しかも、
短時間で活性汚泥中のＡＴＰ量を測定することができる
ので、エアレーショツタンク内の微生物濃度および活性
度の経時的変化を容易に把握することができ、運転管理
および維持管理を良好に行える。

なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、
要旨を変更しない範囲において種々変形して実施するこ
とができる。

本発明の対象となる細胞は、微生物あるいは体細胞のい
ずれであってもよく、微生物として大腸菌やサルモネラ
菌等の細菌、線状菌、酵母、変形菌、単細胞の藻類ある
いは原生動物等が挙げられる。また、抽出すべき物質と
しては、元から細胞内に存在する物質および外部からの
刺激により生成する物質のいずれも含む。さらに、発光
試薬としては、過酸化水素を測定するものであればよく
、生物発光物質であるルンフエリンとルンフエラーゼの
生物発光試薬や化学発光物質であるルミノール、ルノゲ
ニン、イソルミノール等が挙げられる。

Ｈ発明の効果 以上に詳述したように本発明によれば、生体細胞含む試
料中に抽出試薬を混合させて、抽出試薬により細胞膜を
破壊して被測定物質を抽出し、この抽出液を所定量分取
し、この抽出液に発光試薬を混合させて発光反応を起こ
し、その光学情報を光学的手法により測定して予め作成
した検量線にもとづいて被測定物質量を推定することが
できるので、試料中に含まれる細胞内の被測定物質を抽
出から測定までの一連の操作を自動化し、簡便で高精度
の測定が行い得る実用性に優れた細胞内の物質測定方法
およびその装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を適用したＡＴＰ測定装置の測定プロセ
スを説明するための説明図、第２図は生物発光現象にお
ける時間と発光量との関係を示すグラフ、第３図は同Ａ
ＴＰ測定装置の概略的な構成を示すブロック図、第４図
はＡＴＰ濃度と発光量との関係を示すグラフである。 ターンテーブル、２・・スターテ、３．６１６．３０　
４５−−モーター、４．７　１７．３８　制御器、５　
測定用ノズル、８・・抽出試薬タンク、９−希釈液タン
ク、ＩＯ・−・抽出試薬用シリンジ、１１・・希釈液用
シリンジ、１２，１３２７．２９．３２．３３．３５．
４１．４２・三方バルブ、１４２Ｌ＝１４ｃ−抽出試薬
流通路、＋５ａ〜＋５ｃ・希釈液流通路、Ｉ８・主流通
路、１９・・反応コイル、２０・・フローセル、２１キ
ヤリアー液タンク、２２・洗浄液タンク、２３２４　・
発光試薬タンク、２５　・廃液タンク、２７キヤリアー
液用ノリンノ、２８ａ〜２８ｃキヤリア一液流通路、３
１・洗浄液用ノリツノ、３４ａ〜３４ｅ−洗浄液流通路
、３６　洗浄ボート、３９．４０　　発光試薬用シリン
ジ、４３ａ〜４３ｃ、４４ａ〜４４ｃ　　発光試薬流通
路、４６電源、４７　ツヤツタ、４８−光電子増倍管、
４９　増幅器、５０　・波形整形回路、５トマイクロプ
ロセッサ、５２・キーホード、５３・　レコーダ、 ５４・・表示器、 プリンタ。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）生体細胞を含む試料に抽出試薬を混合させ、細胞
   膜を破壊して細胞内の被測定物質を抽出する抽出工程と
   、 前記抽出工程により得られた抽出液を所定量分取し、こ
   の抽出液に発光試薬を混合させて発光反応を起こす発光
   反応工程と、 前記発光反応工程により発光した反応混合液の光学情報
   を光学的手法により測定、その測定値を予め作成した検
   量線にもとづいて前記被測定物質の量を推定するデータ
   処理工程とを具備したことを特徴とする細胞内の物質測
   定方法。
2. （２）生体細胞を含む試料が注入されている複数の容器
   を順次移送する移送装置と、 抽出試薬タンク内に貯蔵された抽出試薬を前記各容器内
   に所定量注入する抽出試薬用ポンプと、希釈液タンク内
   に貯蔵された希釈液を前記各容器内に所定量注入する希
   釈液用ポンプと、 前記各容器内の試料に前記抽出試薬および希釈液を混合
   させて得た抽出混合液を分取する測定用ノズルと、 前記測定用ノズルにより分取された抽出混合液をフロー
   セルに導く流通路と、 キャリアー液タンク内に貯蔵されたキャリアー液を前記
   流通路に送波するキャリアー液用ポンプと、 発光試薬タンク内に貯蔵された発光試薬を前記キャリア
   ー液により送られてきた抽出混合液に所定量注入する発
   光試薬ポンプと、 前記抽出混合液に発光試薬を混合させて得た反応混合液
   の光情報を前記フローセルを介して測定する光学的測定
   装置とを具備したことを特徴とする細胞内の物質測定装
   置。