JPH0429352B2 - - Google Patents
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- JPH0429352B2 JPH0429352B2 JP59122953A JP12295384A JPH0429352B2 JP H0429352 B2 JPH0429352 B2 JP H0429352B2 JP 59122953 A JP59122953 A JP 59122953A JP 12295384 A JP12295384 A JP 12295384A JP H0429352 B2 JPH0429352 B2 JP H0429352B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ラツト肝チトクロムＰ−450c遺伝子
を組込んだ組換えプラスミド及びその製造方法に
関する。 ３−メチルコラントレン投与により誘導される
ラツト肝チトクロムＰ−450cは還元型で一酸化炭
素と結合し、その差スペクトルが447nmに吸収極
大を示すヘム蛋白質である。このチトクロムＰ−
450cは、ステロイドや脂肪酸の代謝、外来の脂溶
性有機化合物の酸化的代謝反応あるいは化学変異
剤の代謝活性化などに関与している。 本発明は、この高い水酸化活性を有し、しかも
基質特異性の幅が広いチトクロムＰ−450cを酵母
内で発現させ、工業的なレベルでの酸化反応過程
や、産業排水中の有機化合物の酸化除去等に応用
することを可能にする酵母内発現を目的とした発
現プラスミドを提供する。 近年、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼプロ
モーターや酸性ホスフアターゼなどのプロモータ
ーを用い、異種遺伝子の酵母内発現を行つた例が
いくつか報告されている。例えば、Ｂ型肝炎ウイ
ルスの表面抗原を菌当り５×105分子まで発現さ
せた例や、インターフエロンの発現を行つたもの
などである。酵母内異種遺伝子の発現実験は、大
腸菌を宿主とした発現実験に比較してまだその例
は少ないが、近年益々、増加する傾向にある。し
かしながら、細胞のミクロソーム膜に局在し、分
子量が59300ダルトンと大きくしかも蛋白分子内
にヘムを含有している水酸化活性を司どるチトク
ロムＰ−450cについては、発現を行つた報告はな
い。 本発明者らは、チトクロムＰ−450cの酵母内発
現について、種々研究を行ない本発明を完成し
た。 本発明の発現用プラスミドpAMC1は、ラツト
肝チトクロムＰ−450c蛋白質の全コーデイング領
域をもつ組換え体プラスミドpAU157より単離し
たチトクロムＰ−450c遺伝子を、アルコール脱水
素酵母（以下ADHと略す）プロモーターの保持
する発現ベクターpAAH5へ組み込むことにより
構築することができる。 ー本発明で得られた酵母内発現を目的とした組
換え体プラスミドpAMC1は、酵母の強力プロモ
ーターであるADHプロモーターの下流に、高い
水酸化活性を示すラツト肝のチトクロムＰ−450c
遺伝子が連結している。さらにチトクロムＰ−
450c遺伝子の後部には、ADH遺伝子の転写終結
シグナルが存在しているため、pAMC1のDNA
構造は、発現用プラスミドとして理想的なものと
なつている。 このような構造をもつpAMC1プラスミドを酵
母宿主に導入し、大量発現を行なことにより、純
粋なラツト肝チトクロムＰ−450c酵素を大量に分
離、精製することができる。得られたチトクロム
Ｐ−450c酵素は、NADPH−チトクロムＰ−450
還元酵素とともに安定化し、酸化反応を行わせる
ことが可能である。また産性チトクロムＰ−450c
酵素を分離、精製せず、ミクロソーム画分あるい
は酸化反応を行う酵母菌体として開発し、バイオ
リアクターとしてあるいは活性汚泥などと共に排
水処理に応用することも可能である。 次に、実施例により本発明をより詳細に説明す
る。 実施例 ラツト肝チトクロムＰ−450c遺伝子の酵母内発
現を目的とした発現用プラスミドpAMC1の構
築： ラツト肝チトクロムＰ−450c蛋白質の全コーデ
イング領域をもつ組換え体プラスミドpAU157
（Nucleic Acids Res.12、p2929−2938、
Yabusakiらの方法により、製造することができ
る。第１ａ〜１ｅ図参照）より、チトクロムＰ−
450c遺伝子部分を単離し、アルコール脱水素酵素
（ADH）プロモーターを保持する発現ベクター
pAAH5（Methods in Enzymology 101、partC
p192−201、Ammererらの方法により製造する
ことができる。）に接続し、酵母内発現用プラス
ミドpAMC1を以下のように構築した。 組換え体プラスミドpTF1の構築 発現用プラスミド構築の第一段階としてチトク
ロムＰ−450c遺伝子の先頭に制限酵素部位Sal
を持ち、後尾に制限酵素部位Hindを持つ組換
え体プラスミドpTF1を構築した。第２図にその
概要を示す。以下、４つのステツプに分けて、構
築の方法を述べる。 ステツプ １： 組換え体プラスミドpNF2の構築 (a)：10μgのpAU157プラスミドDNAに10ユニツ
トの制限酵素（宝酒造）Pst を加え、50μ
のPst 反応液〔20mM Tris−HCl、（PH
7.5）、10mM MgCl2、50mM（NH4）2SO4、0.01
％ウシ血清アルブミン〕中で37℃１時間反応さ
せた。反応液を0.1μg／mlの臭化エチジウム
（アルドリツチ社）を含む0.8％の低融点アガロ
ースゲル（ベセスダ・リサーチ社）に供し、
100Vで90分電気泳動した。泳動後、紫外線ラ
ンプ下で、DNA断片（約330塩基）に相当す
るゲル部分を切り出し、エツペンドルフ管にと
り、65℃で５分加熱した。融解したゲルに２倍
量のTE緩衝液〔10mMトリス−塩酸（PH8.0）、
0.5mM EDTA〕を加え、次にTE緩衝液で飽
和したフエノールを等量加えて、フエノール抽
出を行つた。10000rpmで５分遠心し、上層を
分取した後、２倍量の冷エタノールを加えて、
−80℃に10分放置することによりDNAをエタ
ノール沈殿した。その後、10000rpmで10分遠
心し、約1μgのDNA断片を回収し、20μの
蒸留水に懸濁した。 (b)：つぎに、調整した1μgのDNA断片に１ユ
ニツトの制限酵素Sau 3A1（宝酒造）を加え、
50μのSau 3A1反応液〔10mM Tris−HCl
（PH7.5）、7mM MgCl2、100mM NaCl〕中で
37℃１時間反応させた後、前述のようにフエノ
ール抽出、エタノール沈殿の操作を行いDNA
を回収し、20μの蒸留水に懸濁した。この
DNAは、DNA断片′と″の混合液となつて
いる。（第２図参照）。 (c)：2μgのPUC9 クローニングベクター（Ｐ−
Ｌバイオケミカル社）に２ユニツト制限酵素
BamH （宝酒造）および２ユニツトの制
限酵素Pst を加え、50μのBam Ｈ反応
液〔10mM Tris−HCl（PH8.0）、7mM MgCl2、
100mM NaCl、2mM ２−メルカプトエタノ
ール、0.01％ウシ血清アルブミン〕中で37℃１
時間反応し、フエノール抽出、エタノール沈殿
を行い、DNAを回収し、20μの蒸留水に懸
濁した。なお、制限酵素BamHと制限酵素
Sau3A1の認識部位は共通部分を持つため、お
互いにクローニングが可能である。 (d)：(b)および(c)で得たDNA断片20μを混合し、
５ユニツトのT4DNAリガーゼ（宝酒造）を加
えて、60μのT4DNAリガーゼ反応液
〔66mM Tris−HCl（PH7.6）、6.6mM MgCl2、
10mM dithiothreitol、1.0mM ATP〕中で16
℃３時間反応した。反応後、反応液をCohenら
の方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69、P2110
〜2114）を用いて大腸菌（Escherichia coli）
JM103株〔△（lac−pro）、thi、sfr Ａ、sup
Ｅ、end Ａ、sbc Ｂ、hsd R-、Ｆ tra D36、
proAB、lacq、Ｚ△45、Ｐ−Ｌバイオケミカ
ル社より入手〕に形質転換した。 大腸菌の培養にはLB培地（１当り10gポリ
ペプトン、5gイーストエキストラクト、
5gNaClを含む）を用い、LBプレート培地に
は、LB培地１に12gの寒天を加えたものを用
いた。以後も同様である。 目的とするDNA断片″をクローニングする
たため、Rutherらの方法（Mol.Gen.Genetics、
178p475−477）に従い、200μg／mlの５−ブロ
ム−４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（半井化学）、2μmole／mlのイソプ
ロピルチオガラクトシド（東京化成）および
25μg／mlのアンピシリン（シグマ社）を含む
LBプレートに、形質転換体を広げ、青色コロ
ニー中に出現する白色コロニーを単離した。つ
ぎにBirnboimらの方法（NuCl.Acids.Res ７
p1513−1523）に従つて該白色コロニーより
プラスミドDNAを単離し、1μgのプラスミド
DNAに対し、１ユニツトの制限酵素EcoR
および１ユニツトの制限酵素Pstを加えて、
Pst反応液中で37℃１時間反応した後で、0.8
％のアガロース電気泳動で分析し、DNA断片
″を組み込んだ組換え体プラスミドを選択し、
pNF1とした。なお、アガロースは、和光純薬
より購入した。 (e)：前述のBirnboimらの方法に従い、5μgの
pNF1 DNAを調製し、５ユニツトの制限酵素
Sma（宝酒造）を加えて、50μのSma
（宝反応〔10mM This−HCl、（PH8.0）、7mM
MgCl2、20mM KCl、7mM2−メルカプトエ
タノール、0.01％ウシ血清アルブミン）中で37
℃１時間反応し、DNAを回収し、20μの蒸
留水に懸濁した。約2μgのこのDNA溶液に、
2μgのSalリンカー（宝酒造）および10ユニ
ツトのT4DNAリガーゼを加え、60μの
T4DNAリガーゼ反応液中で16℃３時間反応し
た。つぎに反応液をCohenらの方法に従い、大
腸菌（Escherichia coli）DH1〔F-、recA1、
end A1、gyr A96、thi−１、hsd R17、Sup
E44、λ-九州大学医学部遺伝子情報施設保存菌
株、住友化学工業株式会社宝塚総合研究所にて
も保存）に形質転換し、25μg／mlのアンピシ
リンを含むLBプレートに広げた。得られたコ
ロニーよりプラスミドDNAを調製し、1μgの
プラスミドDNAに対して１ユニツトの制限酵
素Sal（宝酒造）を加え、50μの反応液
〔10mM Tris−HCl、（PH7.5）、7mM MgC12、
175mM NaCl、0.2mM EDTA、7mM2−メル
カプトエタール〕中で37℃１時間反応し、従来
通り0.8％のアガロース電気泳動で分析し、制
限酵素Salで切断されるプラスミドを選択し、
得られたプラスミドをpNF2とした。 ステツプ ２ 組換え体プラスミドpCF2の構築 (a)：10μgのpAU157プラスミドDNAに10ユニツ
トの制限酵素Pstおよび10ユニツトの制限酵
素Pvu（宝酒造）を加え、50μの反応液
〔20mM Tris−HCl、（PH7.5）、10mM MgCl2、
50mM（NH4）2SO4、0.01％ウシ血清アルブミ
ン〕中で、37℃１時間反応させた。反応液を
0.8％の低融点アガロースゲル電気泳動で分析
し、目的のDNA断面を前述の方法に従い、
単離した。 (b)：約1μgのDNA断片に１ユニツトの制限酵
素Sau3A1を加え、50μのSau3A1反応液中
で、37℃、１時間反応させた後、DNAを回収
し、20μの蒸留水に懸濁した。 (c)：ステツプ１(c)と同じ操作を行い、制限酵素
BamHおよびPstで切断されたクローニン
グベクターpUC9DNAを調製した。 (d)：(b)および(c)で得たDNA断片20μを混合し、
５ユニツトのT4DNAリガーゼを加えて、60μ
のT4DNAリガーゼ反応液中で16℃３時間反
応した。反応後、ステツプ１(d)と同様に、反応
液を大腸菌（Escherichia coli）JM103株に形
質転換し、白色コロニーを選択した。この白色
コロニーよりプラスミドDNAを単離し、1μg
のプラスミドDNAに対し、１ユニツトの制限
酵素Pstおよび１ユニツトの制限酵素Sma
を加えて、37℃で１時間反応し、0.8％のアガ
ロース電気泳動で分析することにより、DNA
断片′を組込んだプラスミドを選択し、pCF1
とした。 (e) ：つぎにBirnboimらの方法に従い、5μgの
pCF1 DNAを調製し、５ユニツトの制限酵素
Smaを加えて、50μのSma反応液中で37
℃１時間反応し、DNAを回収し、20μの蒸
留水に懸濁した。約2μgのこのDNA溶液に、
2μgのHindリンカー（宝酒造）および10ユニ
ツトのT4DNAリガーゼを加え、60μの
T4DNAリガーゼ反応液中で16℃３時間、反応
した。つぎに反応液を大腸菌（Escherichia
coli）DH1に前述と同様の方法で形質転換し、
得られたコロニーよりプラスミドDNAを調製
した。得られた1μgのプラスミドDNAに対し
て１ユニツトの制限酵素Salを加え、50μ
のHind 反応液〔10mM Tris−HCl、（PH
7.5）、7mM MgCl2、60mM NaCl〕中で37℃
１時間反応し、0.8％アガロース電気泳動で分
析し、制限酵素Hindで切断されるプラスミ
ドを選択し、得られたプラスミドをpCF2とし
た。 ステツプ ３ 組換え体プラスミドpNC1の構築 (a) 5μgのpNF2DNAに５ユニツトの制限酵素
Pstおよび５ユニツトの制限酵素Hindを加
え、50μのHind反応液中で37℃１時間反応
し、DNAを回収し、20μの蒸留水に懸濁し
た。 (b) 5μgのpCF2DNAについて同様の操作を行い、
DNAを回収後、0.8％の低融点アガロースゲル
電気泳動で分析し、Pst−Hindの小さい方
のDNA断片をゲルより切り出し、フエノール
抽出、エタノール沈澱後、DNA断片を回収し、
20μの蒸留水に懸濁した。 (c) (a)および(b)で調製したDNA溶液20μを混
合し、５ユニツトのT4DNAリガーゼを加え、
60μのT4DNAリガーゼ反応液中で16℃３時
間反応した。得られた反応液を従来通りの方法
で大腸菌（Escherichia coli）DH1へ形質転換
し、出現コロニーよりプラスミドDNAを調製
した。得られた1μgのプラスミドDNAに対し
て、１ユニツトの制限酵素Salおよび１ユニ
ツトの制限酵素Hindを加え、50μHind反
応液中で37℃１時間反応し、0.8％のアガロー
ス電気泳動で分析した。目的とする構造を保持
するプラスミドを選択し、pNC1とした。 ステツプ ４ 組換え体プラスミドpTF1の構築 (a) 1μgのpNC1 DNAに対して１ユニツトの制
限酵素Pstを加え、50μ1Pst反応液中で37
℃１時間反応し、DNAを回収し、20μの蒸
留水に懸濁した。このDNA溶液に1.5ユニツト
のアルカリフオスフアターゼ（宝酒造）を加
え、100μのアルカリフオスフアターゼ反応
液〔50mM Tris−HCl、（PH8.0）〕中で60℃60
分反応させた。反応後、フエノール抽出を２回
行い、エタノール沈澱後、DNAを回収し20μ
の蒸留水に懸濁した。 (b) 10μgのpAU157プラスミドDNAに10ユニツ
トの制限酵素Pstを加え、50μのPst反応
液中で37℃１時間反応させ、DNAを回収した。
0.8％のアガロースゲル電気泳動を行い、DNA
断片に相当するゲル部分を切り出し、DNA
を回収し、20μの蒸留水に懸濁した。 (c) (a)および(b)で調製したDNA溶液20μを混
合し、５ユニツトのT4DNAリガーゼを加え、
60μのT4DNAリガーゼ反応液で16℃、３時
間反応させた。反応後、反応液を大腸菌
（Escherichia coli）DH1株に形質転換した。 (d) 得られたコロニーよりプラスミドDNAを調
製し、1μgのプラスミドDNAに対して１ユニ
ツトの制限酵素Salおよび１ユニツトの制限
酵素Hindを加え、50μのHind反応液中
で37℃１時間反応し、0.8％のアガロース電気
泳動で分析した。分析したプラスミドのうち、
約1.8KbのDNA断片を組み込んだものをまず
選択した。DNA断片には、その方向性によ
り２通りの組み込みが考えられるので、さらに
プラスミドDNAの構造を分析した。上記のプ
ラスミド1μgに対して、１ユニツトの制限酵素
Hindおよび１ユニツトの制限酵素Stu（ニ
ツポンジーン）を加え、50μのStu反応液
〔10mMTris−HCl、（PH7.5）、100mM NaCl、
10mM MgCl2、6mM2−メルカプトエタノー
ル、0.1mg／mlウシ血清アルブミン〕中で37℃
１時間反応し、0.8％のアガロースゲル電気泳
動で分析した。分析したプラスミドのうち、
DNA構造が、DNA断片″→→′という順
方向に接続ものを選択し、pTF1プラスミドと
した。 発現用プラスミドpAMC1の構築 で構築したpTF1プラスミドより、ラツト肝
チトクロムＰ−450c遺伝子部分を取り出し、
ADHプロモーターを保持する酵母発現ベクター
pAAH5（Washington Research Foundationよ
り入手、Methcds in Enzymology，101part
Cp192−201、Ammererらの方法により、製造す
ることができる。）に組み込み、発現用プラスミ
ドpAMC1を構築した。第３図にその概要を示
す。以下３つのステツプに分けて構築の方法を述
べる。 ステツプ １： ラツト肝チトクロムＰ−450c遺伝子を含む
1.8KbのHind断片の単離 (a)：1μgのpTF1プラスミドに５ユニツトの制限
酵素Salを加え、50μのSal反応液中で37
℃１時間反応し、DNAを回収し、20μの蒸
留水に懸濁した。つぎに、このDNA溶液に、
２ユニツトの大腸菌ポリメラーゼのクルー
ノ．フラグメントを加え、50μのポリメラー
ゼ反応液〔40mMリン酸カリウム（PH7.5）、
6.6mM MgCl2、1.0mM2−メルカプトエタノ
ール、33μMdNTP〕中で37℃１時間反応した。
反応後、DNAを回収し、20μの蒸留水に懸
濁した。得られたDNA溶液20μに、約1μgの
Hindリンカーおよび３ユニツトのT4DNAリ
ガーゼを加え、60μのT4DNAリガーゼ反応
液中で16℃３時間反応した。反応後、反応液を
大腸菌DH1株に形質転換し、得られたコロニ
ーよりプラスミドDNAを調製した。1μgのプ
ラスミドDNAに対して１ユニツトの制限酵素
Hindを加え、50μのHind反応液中で37
℃１時間反応させ、反応後、0.8％のアガロー
スゲル電気泳動で分析した。調べたプラスミド
のうち、約1.8KbのHind断片を組込んだもの
を選択し、pTF2とした。 (b)：2μgのpTF2DNAに２ユニツトの制限酵素
Hindを加え、50μのHind反応液中で37
℃２時間反応させた後、DNAを回収した。得
られたDNA溶液を0.8％の低融点アガロースゲ
ルに供し、電気泳動後、1.8KbのHindDNA
断片をゲルより切り出し、DNAを回収し、
20μの蒸留水に懸濁した。 (c)：0.5μgのADHプロモーターを保持する酵母発
現用ベクターpAAH5に、１ユニツトの制限酵
素Hindを加え、50μのHind反応液中で、
37℃１時間反応し、DNAを回収後、20μの
蒸留水に懸濁した。このDNA20μに2.0ユニ
ツトのアルカリフオスフアターゼを加え、
100μのアルカリフオスフアターゼ反応液中
で60℃60分反応させた。反応後、フエノール抽
出を２回行い、エタノール沈澱後、DNAを回
収し20μの蒸留水に懸濁した。 (d)：(b)および(c)で調製したDNA溶液20μを混
合し、２ユニツトのT4DNAリガーゼを加え、
T4DNAリガーゼ反応液中で16℃３時間反応さ
せた。反応後、反応液を大腸菌DH1に形質転
換し、得られたコロニーよりプラスミドDNA
を調製した。1μgのプラスミドDNAに対して
１ユニツトの制限酵素Hindを加え、50μの
Hind反応液中で37℃１時間反応させ、反応
後、0.8％のアガロースゲル電気泳動で分析し
た。分析したプラスミドのうち、約1.8Kbの
DNA断片を組み込んだものを選択した。得ら
れたプラスミドの中には、ADHプロモーター
とは逆向きに1.8KbのHindDNA断片が接続
したものがある。そこで、選択したプラスミド
DNA1μgに対して、１ユニツトの制限酵素Stu
および１ユニツトの制限酵素BamH1を加
え、50μのBamH1反応液中で37℃１時間反
応した。反応後、反応液を0.8％のアガロース
ゲル電気泳動で分析し、発現ベクターpAAH5
から生じるDNA断片以外に2.7KbDNA断片と
1.1KbのDNA断片が検出されるプラスミドを
選択した。このプラスミドは、ADHプロモー
ターと順方向にチトクロムＰ−450c遺伝子が接
続しており、pAMC1と名付けた。 発現用プラスミドpAMC1によるラツト肝チトク
ロムＰ−450cの発現 構築した発現用プラスミドpAMC1を用いて酵
母内でラツト肝チトクロムＰ−450cの発現を行つ
た。以下にその詳細な方法を述べる。 ステツプ １： 酵母形質転換体の単離 酵母内でラツト肝チトクロムＰ−450cを発現さ
せるため、Beggsらの方法（Nature、275p104−
109（1978））を用いて、組換え体プラスミド
pAMC1を、サツカロミセス酵母
（Saccharomyses cerevisiae）SHY3株
（MATa、ste−vc9、uta3、trp1、his1、leu2−
３、leu2−112、ade1、can1〔Cir+〕
（ATCC44771）に形質転換し、Leu+の表現型を
示すコロニーを選択し、形質転換SHY3
（pAMC1）株を得た。 ステツプ ２ 粗抽出液の調製 発現用プラスミドpAMC1を保持する酵母
SHY3（pAMC1）株をロイシンを除いた10mlの合
成培地〔0.67％Bacto−yeast nitrogen base
Ｗ／Ｏ amino acids（Difco社）、２％Dextrose、
20mg／mlのトリプトフアン・20μg／mlのヒスチ
ジン、20μg／mlの硫酸アデニン〕中で、２×
107cells／mlとなるまで培養した。培養液１mlを、
7000rpm3分で遠心し、集菌後１mlの1.2Mソルビ
トールに懸濁した。再度、遠心し、0.2mlのザイ
モリエース溶液〔1.2Mソルビトール、50mMリ
ン酸カルシウム（PH7.5）、14mM2−メルカプト
エタノール、400μg／mlザイモリエース60000〕
に懸濁し、30℃で30分インキユベートした。
7000rpm、３分遠心することにより、スフエロプ
ラストを集め、0.4mlの緩衝液Ａ〔1.2Mソルビト
ール、50mM Tris−HCl（PH7.5）〕で洗浄後、再
度遠心し、50μのSDS溶液〔２％ドデシル硫酸
ナトリウム−50mM Tris−HCl（PH7.5）〕に懸濁
した。つぎに、100℃で５分間熱処理し、
10000rpmで５分間遠心した後、上澄を分取し、
50μのサンプル緩衝液〔62.5mM Tris−HCl
（PH6.8）、２％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウ
ム、５％（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエタノール、
10％（Ｗ／Ｖ）グリセロール、0.001％ブロムフ
エノールブルー〕を加えた。 ステツプ ３： 発現蛋白の同定 ステツプ２で調製した酵母SHY3（pAMC1）株
の粗抽出液約100μのうち、20μをSDS−ポリ
アクリルアミドゲルに供し、Laemmliらの方法
（Nature227、p680−685）に従つて電気泳動を行
つた。泳動後、アクリルアミドゲルとニトロセル
ロースフイルター（Shleicher＆Scnuli社）を重
ね、ブロツテイング用緩衝液〔25mM Tris−
HCl（PH8.3）、192mMグリシン、20％メタノー
ル〕中で、30Vの電圧を約10時間かけ、蛋白質を
ニトロセルロースフイルターへ移行させた。泳動
後、ニトロセルロースフイルターをブロツキング
溶液〔３％ゼラチン、50mM Tris−HCl（PH
7.5）、200mM NaCl、0.05％Tween20〕に浸し、
30分間撹拌した。つぎに、1μg／mlの抗Ｐ−450c
IgGを含む緩衝液〔１％ゼラチン、50mM Tris
−HCl（PH7.5）、200mM NaCl、0.05％
Tween20〕に浸し、さらに２時間撹拌した。続
いて、ニトロセルロース膜を、0.05％のTween20
を含むTBS溶液〔50mM Tris−HCl（PH7.5）、
200mM NaCl〕で40分づつ、４回洗浄し、再度
ブロツキング溶液に浸した。つぎに、ブロツキン
グ溶液を除き、50mlの125−Protein Ａ溶液
（7μCi）に１時間浸し、0.05％のTween20を含む
TBS溶液で30分づつ４回洗浄し、最後にTBS溶
液で洗浄した。処理を終つたニトロセルロースフ
イルターを濾紙の上で乾燥させ、オートラジオグ
ラフイーを行つた。 図４は以上の方法を用いてSHY3（pAMC1）の
発現蛋白を分析したものである。Ａは対照に用い
たpAAH5ベクターの結果で、抗Ｐ−450cIgGに
認識される蛋白は検出されなかつた。一方、Ｂは
発現プラスミドpAMC1を用いた場合で、抗Ｐ−
450c IgGと反応する蛋白分子が、チトクロムＰ
−450cの分子量に相当する位置に検出された。チ
トクロムＰ−450c精製標品を基準にとり算出する
と１細胞当り約４×105分子のラツト肝チトクロ
ムＰ−450c蛋白が産生されていた。 以上、酵母宿主としてSHY3株を用いたが、サ
ツカロミセスAH22株（ａ、leu2−３、leu2−
112、his4−519、can1〔cir+〕；ATCC38626〕お
よびNA87−11A株（α、pho3−１、pho5−１、
trp1、his3、leu2、〔cir+〕；大阪大学工学部醗酵
工学科第４研究室より入手；住友化学工業株式会
社、宝塚総合研究所保存）を宿主として、それぞ
れLeu+形質転換、AH22（pAMC1）株および
NA87−11A（pAMC1）株を得て、同様に、ラツ
ト肝チトクロムＰ−450c蛋白の発現を確認した。
を組込んだ組換えプラスミド及びその製造方法に
関する。 ３−メチルコラントレン投与により誘導される
ラツト肝チトクロムＰ−450cは還元型で一酸化炭
素と結合し、その差スペクトルが447nmに吸収極
大を示すヘム蛋白質である。このチトクロムＰ−
450cは、ステロイドや脂肪酸の代謝、外来の脂溶
性有機化合物の酸化的代謝反応あるいは化学変異
剤の代謝活性化などに関与している。 本発明は、この高い水酸化活性を有し、しかも
基質特異性の幅が広いチトクロムＰ−450cを酵母
内で発現させ、工業的なレベルでの酸化反応過程
や、産業排水中の有機化合物の酸化除去等に応用
することを可能にする酵母内発現を目的とした発
現プラスミドを提供する。 近年、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼプロ
モーターや酸性ホスフアターゼなどのプロモータ
ーを用い、異種遺伝子の酵母内発現を行つた例が
いくつか報告されている。例えば、Ｂ型肝炎ウイ
ルスの表面抗原を菌当り５×105分子まで発現さ
せた例や、インターフエロンの発現を行つたもの
などである。酵母内異種遺伝子の発現実験は、大
腸菌を宿主とした発現実験に比較してまだその例
は少ないが、近年益々、増加する傾向にある。し
かしながら、細胞のミクロソーム膜に局在し、分
子量が59300ダルトンと大きくしかも蛋白分子内
にヘムを含有している水酸化活性を司どるチトク
ロムＰ−450cについては、発現を行つた報告はな
い。 本発明者らは、チトクロムＰ−450cの酵母内発
現について、種々研究を行ない本発明を完成し
た。 本発明の発現用プラスミドpAMC1は、ラツト
肝チトクロムＰ−450c蛋白質の全コーデイング領
域をもつ組換え体プラスミドpAU157より単離し
たチトクロムＰ−450c遺伝子を、アルコール脱水
素酵母（以下ADHと略す）プロモーターの保持
する発現ベクターpAAH5へ組み込むことにより
構築することができる。 ー本発明で得られた酵母内発現を目的とした組
換え体プラスミドpAMC1は、酵母の強力プロモ
ーターであるADHプロモーターの下流に、高い
水酸化活性を示すラツト肝のチトクロムＰ−450c
遺伝子が連結している。さらにチトクロムＰ−
450c遺伝子の後部には、ADH遺伝子の転写終結
シグナルが存在しているため、pAMC1のDNA
構造は、発現用プラスミドとして理想的なものと
なつている。 このような構造をもつpAMC1プラスミドを酵
母宿主に導入し、大量発現を行なことにより、純
粋なラツト肝チトクロムＰ−450c酵素を大量に分
離、精製することができる。得られたチトクロム
Ｐ−450c酵素は、NADPH−チトクロムＰ−450
還元酵素とともに安定化し、酸化反応を行わせる
ことが可能である。また産性チトクロムＰ−450c
酵素を分離、精製せず、ミクロソーム画分あるい
は酸化反応を行う酵母菌体として開発し、バイオ
リアクターとしてあるいは活性汚泥などと共に排
水処理に応用することも可能である。 次に、実施例により本発明をより詳細に説明す
る。 実施例 ラツト肝チトクロムＰ−450c遺伝子の酵母内発
現を目的とした発現用プラスミドpAMC1の構
築： ラツト肝チトクロムＰ−450c蛋白質の全コーデ
イング領域をもつ組換え体プラスミドpAU157
（Nucleic Acids Res.12、p2929−2938、
Yabusakiらの方法により、製造することができ
る。第１ａ〜１ｅ図参照）より、チトクロムＰ−
450c遺伝子部分を単離し、アルコール脱水素酵素
（ADH）プロモーターを保持する発現ベクター
pAAH5（Methods in Enzymology 101、partC
p192−201、Ammererらの方法により製造する
ことができる。）に接続し、酵母内発現用プラス
ミドpAMC1を以下のように構築した。 組換え体プラスミドpTF1の構築 発現用プラスミド構築の第一段階としてチトク
ロムＰ−450c遺伝子の先頭に制限酵素部位Sal
を持ち、後尾に制限酵素部位Hindを持つ組換
え体プラスミドpTF1を構築した。第２図にその
概要を示す。以下、４つのステツプに分けて、構
築の方法を述べる。 ステツプ １： 組換え体プラスミドpNF2の構築 (a)：10μgのpAU157プラスミドDNAに10ユニツ
トの制限酵素（宝酒造）Pst を加え、50μ
のPst 反応液〔20mM Tris−HCl、（PH
7.5）、10mM MgCl2、50mM（NH4）2SO4、0.01
％ウシ血清アルブミン〕中で37℃１時間反応さ
せた。反応液を0.1μg／mlの臭化エチジウム
（アルドリツチ社）を含む0.8％の低融点アガロ
ースゲル（ベセスダ・リサーチ社）に供し、
100Vで90分電気泳動した。泳動後、紫外線ラ
ンプ下で、DNA断片（約330塩基）に相当す
るゲル部分を切り出し、エツペンドルフ管にと
り、65℃で５分加熱した。融解したゲルに２倍
量のTE緩衝液〔10mMトリス−塩酸（PH8.0）、
0.5mM EDTA〕を加え、次にTE緩衝液で飽
和したフエノールを等量加えて、フエノール抽
出を行つた。10000rpmで５分遠心し、上層を
分取した後、２倍量の冷エタノールを加えて、
−80℃に10分放置することによりDNAをエタ
ノール沈殿した。その後、10000rpmで10分遠
心し、約1μgのDNA断片を回収し、20μの
蒸留水に懸濁した。 (b)：つぎに、調整した1μgのDNA断片に１ユ
ニツトの制限酵素Sau 3A1（宝酒造）を加え、
50μのSau 3A1反応液〔10mM Tris−HCl
（PH7.5）、7mM MgCl2、100mM NaCl〕中で
37℃１時間反応させた後、前述のようにフエノ
ール抽出、エタノール沈殿の操作を行いDNA
を回収し、20μの蒸留水に懸濁した。この
DNAは、DNA断片′と″の混合液となつて
いる。（第２図参照）。 (c)：2μgのPUC9 クローニングベクター（Ｐ−
Ｌバイオケミカル社）に２ユニツト制限酵素
BamH （宝酒造）および２ユニツトの制
限酵素Pst を加え、50μのBam Ｈ反応
液〔10mM Tris−HCl（PH8.0）、7mM MgCl2、
100mM NaCl、2mM ２−メルカプトエタノ
ール、0.01％ウシ血清アルブミン〕中で37℃１
時間反応し、フエノール抽出、エタノール沈殿
を行い、DNAを回収し、20μの蒸留水に懸
濁した。なお、制限酵素BamHと制限酵素
Sau3A1の認識部位は共通部分を持つため、お
互いにクローニングが可能である。 (d)：(b)および(c)で得たDNA断片20μを混合し、
５ユニツトのT4DNAリガーゼ（宝酒造）を加
えて、60μのT4DNAリガーゼ反応液
〔66mM Tris−HCl（PH7.6）、6.6mM MgCl2、
10mM dithiothreitol、1.0mM ATP〕中で16
℃３時間反応した。反応後、反応液をCohenら
の方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69、P2110
〜2114）を用いて大腸菌（Escherichia coli）
JM103株〔△（lac−pro）、thi、sfr Ａ、sup
Ｅ、end Ａ、sbc Ｂ、hsd R-、Ｆ tra D36、
proAB、lacq、Ｚ△45、Ｐ−Ｌバイオケミカ
ル社より入手〕に形質転換した。 大腸菌の培養にはLB培地（１当り10gポリ
ペプトン、5gイーストエキストラクト、
5gNaClを含む）を用い、LBプレート培地に
は、LB培地１に12gの寒天を加えたものを用
いた。以後も同様である。 目的とするDNA断片″をクローニングする
たため、Rutherらの方法（Mol.Gen.Genetics、
178p475−477）に従い、200μg／mlの５−ブロ
ム−４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（半井化学）、2μmole／mlのイソプ
ロピルチオガラクトシド（東京化成）および
25μg／mlのアンピシリン（シグマ社）を含む
LBプレートに、形質転換体を広げ、青色コロ
ニー中に出現する白色コロニーを単離した。つ
ぎにBirnboimらの方法（NuCl.Acids.Res ７
p1513−1523）に従つて該白色コロニーより
プラスミドDNAを単離し、1μgのプラスミド
DNAに対し、１ユニツトの制限酵素EcoR
および１ユニツトの制限酵素Pstを加えて、
Pst反応液中で37℃１時間反応した後で、0.8
％のアガロース電気泳動で分析し、DNA断片
″を組み込んだ組換え体プラスミドを選択し、
pNF1とした。なお、アガロースは、和光純薬
より購入した。 (e)：前述のBirnboimらの方法に従い、5μgの
pNF1 DNAを調製し、５ユニツトの制限酵素
Sma（宝酒造）を加えて、50μのSma
（宝反応〔10mM This−HCl、（PH8.0）、7mM
MgCl2、20mM KCl、7mM2−メルカプトエ
タノール、0.01％ウシ血清アルブミン）中で37
℃１時間反応し、DNAを回収し、20μの蒸
留水に懸濁した。約2μgのこのDNA溶液に、
2μgのSalリンカー（宝酒造）および10ユニ
ツトのT4DNAリガーゼを加え、60μの
T4DNAリガーゼ反応液中で16℃３時間反応し
た。つぎに反応液をCohenらの方法に従い、大
腸菌（Escherichia coli）DH1〔F-、recA1、
end A1、gyr A96、thi−１、hsd R17、Sup
E44、λ-九州大学医学部遺伝子情報施設保存菌
株、住友化学工業株式会社宝塚総合研究所にて
も保存）に形質転換し、25μg／mlのアンピシ
リンを含むLBプレートに広げた。得られたコ
ロニーよりプラスミドDNAを調製し、1μgの
プラスミドDNAに対して１ユニツトの制限酵
素Sal（宝酒造）を加え、50μの反応液
〔10mM Tris−HCl、（PH7.5）、7mM MgC12、
175mM NaCl、0.2mM EDTA、7mM2−メル
カプトエタール〕中で37℃１時間反応し、従来
通り0.8％のアガロース電気泳動で分析し、制
限酵素Salで切断されるプラスミドを選択し、
得られたプラスミドをpNF2とした。 ステツプ ２ 組換え体プラスミドpCF2の構築 (a)：10μgのpAU157プラスミドDNAに10ユニツ
トの制限酵素Pstおよび10ユニツトの制限酵
素Pvu（宝酒造）を加え、50μの反応液
〔20mM Tris−HCl、（PH7.5）、10mM MgCl2、
50mM（NH4）2SO4、0.01％ウシ血清アルブミ
ン〕中で、37℃１時間反応させた。反応液を
0.8％の低融点アガロースゲル電気泳動で分析
し、目的のDNA断面を前述の方法に従い、
単離した。 (b)：約1μgのDNA断片に１ユニツトの制限酵
素Sau3A1を加え、50μのSau3A1反応液中
で、37℃、１時間反応させた後、DNAを回収
し、20μの蒸留水に懸濁した。 (c)：ステツプ１(c)と同じ操作を行い、制限酵素
BamHおよびPstで切断されたクローニン
グベクターpUC9DNAを調製した。 (d)：(b)および(c)で得たDNA断片20μを混合し、
５ユニツトのT4DNAリガーゼを加えて、60μ
のT4DNAリガーゼ反応液中で16℃３時間反
応した。反応後、ステツプ１(d)と同様に、反応
液を大腸菌（Escherichia coli）JM103株に形
質転換し、白色コロニーを選択した。この白色
コロニーよりプラスミドDNAを単離し、1μg
のプラスミドDNAに対し、１ユニツトの制限
酵素Pstおよび１ユニツトの制限酵素Sma
を加えて、37℃で１時間反応し、0.8％のアガ
ロース電気泳動で分析することにより、DNA
断片′を組込んだプラスミドを選択し、pCF1
とした。 (e) ：つぎにBirnboimらの方法に従い、5μgの
pCF1 DNAを調製し、５ユニツトの制限酵素
Smaを加えて、50μのSma反応液中で37
℃１時間反応し、DNAを回収し、20μの蒸
留水に懸濁した。約2μgのこのDNA溶液に、
2μgのHindリンカー（宝酒造）および10ユニ
ツトのT4DNAリガーゼを加え、60μの
T4DNAリガーゼ反応液中で16℃３時間、反応
した。つぎに反応液を大腸菌（Escherichia
coli）DH1に前述と同様の方法で形質転換し、
得られたコロニーよりプラスミドDNAを調製
した。得られた1μgのプラスミドDNAに対し
て１ユニツトの制限酵素Salを加え、50μ
のHind 反応液〔10mM Tris−HCl、（PH
7.5）、7mM MgCl2、60mM NaCl〕中で37℃
１時間反応し、0.8％アガロース電気泳動で分
析し、制限酵素Hindで切断されるプラスミ
ドを選択し、得られたプラスミドをpCF2とし
た。 ステツプ ３ 組換え体プラスミドpNC1の構築 (a) 5μgのpNF2DNAに５ユニツトの制限酵素
Pstおよび５ユニツトの制限酵素Hindを加
え、50μのHind反応液中で37℃１時間反応
し、DNAを回収し、20μの蒸留水に懸濁し
た。 (b) 5μgのpCF2DNAについて同様の操作を行い、
DNAを回収後、0.8％の低融点アガロースゲル
電気泳動で分析し、Pst−Hindの小さい方
のDNA断片をゲルより切り出し、フエノール
抽出、エタノール沈澱後、DNA断片を回収し、
20μの蒸留水に懸濁した。 (c) (a)および(b)で調製したDNA溶液20μを混
合し、５ユニツトのT4DNAリガーゼを加え、
60μのT4DNAリガーゼ反応液中で16℃３時
間反応した。得られた反応液を従来通りの方法
で大腸菌（Escherichia coli）DH1へ形質転換
し、出現コロニーよりプラスミドDNAを調製
した。得られた1μgのプラスミドDNAに対し
て、１ユニツトの制限酵素Salおよび１ユニ
ツトの制限酵素Hindを加え、50μHind反
応液中で37℃１時間反応し、0.8％のアガロー
ス電気泳動で分析した。目的とする構造を保持
するプラスミドを選択し、pNC1とした。 ステツプ ４ 組換え体プラスミドpTF1の構築 (a) 1μgのpNC1 DNAに対して１ユニツトの制
限酵素Pstを加え、50μ1Pst反応液中で37
℃１時間反応し、DNAを回収し、20μの蒸
留水に懸濁した。このDNA溶液に1.5ユニツト
のアルカリフオスフアターゼ（宝酒造）を加
え、100μのアルカリフオスフアターゼ反応
液〔50mM Tris−HCl、（PH8.0）〕中で60℃60
分反応させた。反応後、フエノール抽出を２回
行い、エタノール沈澱後、DNAを回収し20μ
の蒸留水に懸濁した。 (b) 10μgのpAU157プラスミドDNAに10ユニツ
トの制限酵素Pstを加え、50μのPst反応
液中で37℃１時間反応させ、DNAを回収した。
0.8％のアガロースゲル電気泳動を行い、DNA
断片に相当するゲル部分を切り出し、DNA
を回収し、20μの蒸留水に懸濁した。 (c) (a)および(b)で調製したDNA溶液20μを混
合し、５ユニツトのT4DNAリガーゼを加え、
60μのT4DNAリガーゼ反応液で16℃、３時
間反応させた。反応後、反応液を大腸菌
（Escherichia coli）DH1株に形質転換した。 (d) 得られたコロニーよりプラスミドDNAを調
製し、1μgのプラスミドDNAに対して１ユニ
ツトの制限酵素Salおよび１ユニツトの制限
酵素Hindを加え、50μのHind反応液中
で37℃１時間反応し、0.8％のアガロース電気
泳動で分析した。分析したプラスミドのうち、
約1.8KbのDNA断片を組み込んだものをまず
選択した。DNA断片には、その方向性によ
り２通りの組み込みが考えられるので、さらに
プラスミドDNAの構造を分析した。上記のプ
ラスミド1μgに対して、１ユニツトの制限酵素
Hindおよび１ユニツトの制限酵素Stu（ニ
ツポンジーン）を加え、50μのStu反応液
〔10mMTris−HCl、（PH7.5）、100mM NaCl、
10mM MgCl2、6mM2−メルカプトエタノー
ル、0.1mg／mlウシ血清アルブミン〕中で37℃
１時間反応し、0.8％のアガロースゲル電気泳
動で分析した。分析したプラスミドのうち、
DNA構造が、DNA断片″→→′という順
方向に接続ものを選択し、pTF1プラスミドと
した。 発現用プラスミドpAMC1の構築 で構築したpTF1プラスミドより、ラツト肝
チトクロムＰ−450c遺伝子部分を取り出し、
ADHプロモーターを保持する酵母発現ベクター
pAAH5（Washington Research Foundationよ
り入手、Methcds in Enzymology，101part
Cp192−201、Ammererらの方法により、製造す
ることができる。）に組み込み、発現用プラスミ
ドpAMC1を構築した。第３図にその概要を示
す。以下３つのステツプに分けて構築の方法を述
べる。 ステツプ １： ラツト肝チトクロムＰ−450c遺伝子を含む
1.8KbのHind断片の単離 (a)：1μgのpTF1プラスミドに５ユニツトの制限
酵素Salを加え、50μのSal反応液中で37
℃１時間反応し、DNAを回収し、20μの蒸
留水に懸濁した。つぎに、このDNA溶液に、
２ユニツトの大腸菌ポリメラーゼのクルー
ノ．フラグメントを加え、50μのポリメラー
ゼ反応液〔40mMリン酸カリウム（PH7.5）、
6.6mM MgCl2、1.0mM2−メルカプトエタノ
ール、33μMdNTP〕中で37℃１時間反応した。
反応後、DNAを回収し、20μの蒸留水に懸
濁した。得られたDNA溶液20μに、約1μgの
Hindリンカーおよび３ユニツトのT4DNAリ
ガーゼを加え、60μのT4DNAリガーゼ反応
液中で16℃３時間反応した。反応後、反応液を
大腸菌DH1株に形質転換し、得られたコロニ
ーよりプラスミドDNAを調製した。1μgのプ
ラスミドDNAに対して１ユニツトの制限酵素
Hindを加え、50μのHind反応液中で37
℃１時間反応させ、反応後、0.8％のアガロー
スゲル電気泳動で分析した。調べたプラスミド
のうち、約1.8KbのHind断片を組込んだもの
を選択し、pTF2とした。 (b)：2μgのpTF2DNAに２ユニツトの制限酵素
Hindを加え、50μのHind反応液中で37
℃２時間反応させた後、DNAを回収した。得
られたDNA溶液を0.8％の低融点アガロースゲ
ルに供し、電気泳動後、1.8KbのHindDNA
断片をゲルより切り出し、DNAを回収し、
20μの蒸留水に懸濁した。 (c)：0.5μgのADHプロモーターを保持する酵母発
現用ベクターpAAH5に、１ユニツトの制限酵
素Hindを加え、50μのHind反応液中で、
37℃１時間反応し、DNAを回収後、20μの
蒸留水に懸濁した。このDNA20μに2.0ユニ
ツトのアルカリフオスフアターゼを加え、
100μのアルカリフオスフアターゼ反応液中
で60℃60分反応させた。反応後、フエノール抽
出を２回行い、エタノール沈澱後、DNAを回
収し20μの蒸留水に懸濁した。 (d)：(b)および(c)で調製したDNA溶液20μを混
合し、２ユニツトのT4DNAリガーゼを加え、
T4DNAリガーゼ反応液中で16℃３時間反応さ
せた。反応後、反応液を大腸菌DH1に形質転
換し、得られたコロニーよりプラスミドDNA
を調製した。1μgのプラスミドDNAに対して
１ユニツトの制限酵素Hindを加え、50μの
Hind反応液中で37℃１時間反応させ、反応
後、0.8％のアガロースゲル電気泳動で分析し
た。分析したプラスミドのうち、約1.8Kbの
DNA断片を組み込んだものを選択した。得ら
れたプラスミドの中には、ADHプロモーター
とは逆向きに1.8KbのHindDNA断片が接続
したものがある。そこで、選択したプラスミド
DNA1μgに対して、１ユニツトの制限酵素Stu
および１ユニツトの制限酵素BamH1を加
え、50μのBamH1反応液中で37℃１時間反
応した。反応後、反応液を0.8％のアガロース
ゲル電気泳動で分析し、発現ベクターpAAH5
から生じるDNA断片以外に2.7KbDNA断片と
1.1KbのDNA断片が検出されるプラスミドを
選択した。このプラスミドは、ADHプロモー
ターと順方向にチトクロムＰ−450c遺伝子が接
続しており、pAMC1と名付けた。 発現用プラスミドpAMC1によるラツト肝チトク
ロムＰ−450cの発現 構築した発現用プラスミドpAMC1を用いて酵
母内でラツト肝チトクロムＰ−450cの発現を行つ
た。以下にその詳細な方法を述べる。 ステツプ １： 酵母形質転換体の単離 酵母内でラツト肝チトクロムＰ−450cを発現さ
せるため、Beggsらの方法（Nature、275p104−
109（1978））を用いて、組換え体プラスミド
pAMC1を、サツカロミセス酵母
（Saccharomyses cerevisiae）SHY3株
（MATa、ste−vc9、uta3、trp1、his1、leu2−
３、leu2−112、ade1、can1〔Cir+〕
（ATCC44771）に形質転換し、Leu+の表現型を
示すコロニーを選択し、形質転換SHY3
（pAMC1）株を得た。 ステツプ ２ 粗抽出液の調製 発現用プラスミドpAMC1を保持する酵母
SHY3（pAMC1）株をロイシンを除いた10mlの合
成培地〔0.67％Bacto−yeast nitrogen base
Ｗ／Ｏ amino acids（Difco社）、２％Dextrose、
20mg／mlのトリプトフアン・20μg／mlのヒスチ
ジン、20μg／mlの硫酸アデニン〕中で、２×
107cells／mlとなるまで培養した。培養液１mlを、
7000rpm3分で遠心し、集菌後１mlの1.2Mソルビ
トールに懸濁した。再度、遠心し、0.2mlのザイ
モリエース溶液〔1.2Mソルビトール、50mMリ
ン酸カルシウム（PH7.5）、14mM2−メルカプト
エタノール、400μg／mlザイモリエース60000〕
に懸濁し、30℃で30分インキユベートした。
7000rpm、３分遠心することにより、スフエロプ
ラストを集め、0.4mlの緩衝液Ａ〔1.2Mソルビト
ール、50mM Tris−HCl（PH7.5）〕で洗浄後、再
度遠心し、50μのSDS溶液〔２％ドデシル硫酸
ナトリウム−50mM Tris−HCl（PH7.5）〕に懸濁
した。つぎに、100℃で５分間熱処理し、
10000rpmで５分間遠心した後、上澄を分取し、
50μのサンプル緩衝液〔62.5mM Tris−HCl
（PH6.8）、２％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウ
ム、５％（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエタノール、
10％（Ｗ／Ｖ）グリセロール、0.001％ブロムフ
エノールブルー〕を加えた。 ステツプ ３： 発現蛋白の同定 ステツプ２で調製した酵母SHY3（pAMC1）株
の粗抽出液約100μのうち、20μをSDS−ポリ
アクリルアミドゲルに供し、Laemmliらの方法
（Nature227、p680−685）に従つて電気泳動を行
つた。泳動後、アクリルアミドゲルとニトロセル
ロースフイルター（Shleicher＆Scnuli社）を重
ね、ブロツテイング用緩衝液〔25mM Tris−
HCl（PH8.3）、192mMグリシン、20％メタノー
ル〕中で、30Vの電圧を約10時間かけ、蛋白質を
ニトロセルロースフイルターへ移行させた。泳動
後、ニトロセルロースフイルターをブロツキング
溶液〔３％ゼラチン、50mM Tris−HCl（PH
7.5）、200mM NaCl、0.05％Tween20〕に浸し、
30分間撹拌した。つぎに、1μg／mlの抗Ｐ−450c
IgGを含む緩衝液〔１％ゼラチン、50mM Tris
−HCl（PH7.5）、200mM NaCl、0.05％
Tween20〕に浸し、さらに２時間撹拌した。続
いて、ニトロセルロース膜を、0.05％のTween20
を含むTBS溶液〔50mM Tris−HCl（PH7.5）、
200mM NaCl〕で40分づつ、４回洗浄し、再度
ブロツキング溶液に浸した。つぎに、ブロツキン
グ溶液を除き、50mlの125−Protein Ａ溶液
（7μCi）に１時間浸し、0.05％のTween20を含む
TBS溶液で30分づつ４回洗浄し、最後にTBS溶
液で洗浄した。処理を終つたニトロセルロースフ
イルターを濾紙の上で乾燥させ、オートラジオグ
ラフイーを行つた。 図４は以上の方法を用いてSHY3（pAMC1）の
発現蛋白を分析したものである。Ａは対照に用い
たpAAH5ベクターの結果で、抗Ｐ−450cIgGに
認識される蛋白は検出されなかつた。一方、Ｂは
発現プラスミドpAMC1を用いた場合で、抗Ｐ−
450c IgGと反応する蛋白分子が、チトクロムＰ
−450cの分子量に相当する位置に検出された。チ
トクロムＰ−450c精製標品を基準にとり算出する
と１細胞当り約４×105分子のラツト肝チトクロ
ムＰ−450c蛋白が産生されていた。 以上、酵母宿主としてSHY3株を用いたが、サ
ツカロミセスAH22株（ａ、leu2−３、leu2−
112、his4−519、can1〔cir+〕；ATCC38626〕お
よびNA87−11A株（α、pho3−１、pho5−１、
trp1、his3、leu2、〔cir+〕；大阪大学工学部醗酵
工学科第４研究室より入手；住友化学工業株式会
社、宝塚総合研究所保存）を宿主として、それぞ
れLeu+形質転換、AH22（pAMC1）株および
NA87−11A（pAMC1）株を得て、同様に、ラツ
ト肝チトクロムＰ−450c蛋白の発現を確認した。
第１ａ図〜第１ｅ図は、pAU157プラスミドに
クローン化されたラツト肝チトクロムＰ−450c遺
伝子の塩基配列を示す。第２図は、組換えプラス
ミドpTF1構築の概要を示す。第３図は、組換え
プラスミドpAMC1の構築の概要を示す。第４図
は、酵母で発現したラツト肝チトクロムＰ−450c
をデンシトメーターでスキヤンした結果である。 Ａは対照に用いたSHY3（pAAH5）でＢは
SHY3（pAMC1）である。
クローン化されたラツト肝チトクロムＰ−450c遺
伝子の塩基配列を示す。第２図は、組換えプラス
ミドpTF1構築の概要を示す。第３図は、組換え
プラスミドpAMC1の構築の概要を示す。第４図
は、酵母で発現したラツト肝チトクロムＰ−450c
をデンシトメーターでスキヤンした結果である。 Ａは対照に用いたSHY3（pAAH5）でＢは
SHY3（pAMC1）である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ラツト肝チトクロムＰ−450c蛋白質の全コー
テイング領域を持つ組換えプラスミドpAU157よ
り単離したチトクロムＰ−450c遺伝子をアルコー
ル脱水素酵素プロモーターの保持する発現ベクタ
ーpAHH5へ組み込むことにより構築した酵母内
でチトクロムＰ−450cを発現するプラスミド。 ２ 約14200塩基対からなり、下記の制限酵素地
図で表されるpMAC1である特許請求の範囲第１
項記載の発現プラスミド。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122953A JPS6188878A (ja) | 1984-06-16 | 1984-06-16 | ラット肝チトクロムＰ−４５０ｍｃ遺伝子の酵母内発現を目的とした発現用プラスミドｐＡＭＣ１の構築 |
| US06/741,592 US4766068A (en) | 1984-06-16 | 1985-06-05 | Cytochrome P-450MC gene, expression plasmid carrying the said gene, yeasts transformed with the said plasmid and a process for producing cytochrome P-450MC by culturing the said transformant yeasts |
| GB858514971A GB8514971D0 (en) | 1984-06-16 | 1985-06-13 | Cytochrome p-450mc gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122953A JPS6188878A (ja) | 1984-06-16 | 1984-06-16 | ラット肝チトクロムＰ−４５０ｍｃ遺伝子の酵母内発現を目的とした発現用プラスミドｐＡＭＣ１の構築 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6188878A JPS6188878A (ja) | 1986-05-07 |
| JPH0429352B2 true JPH0429352B2 (ja) | 1992-05-18 |
Family
ID=14848707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59122953A Granted JPS6188878A (ja) | 1984-06-16 | 1984-06-16 | ラット肝チトクロムＰ−４５０ｍｃ遺伝子の酵母内発現を目的とした発現用プラスミドｐＡＭＣ１の構築 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6188878A (ja) |
| GB (1) | GB8514971D0 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7547613B2 (en) | 2000-09-13 | 2009-06-16 | Hamamatsu Photonics K.K. | Laser processing method and laser processing apparatus |
| US7566635B2 (en) | 2002-03-12 | 2009-07-28 | Hamamatsu Photonics K.K. | Substrate dividing method |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6152284A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-14 | Agency Of Ind Science & Technol | ラツト肝チトクロムｐ−４５０遺伝子 |
| JPS6447380A (en) * | 1987-08-19 | 1989-02-21 | Agency Ind Science Techn | Steroid-oxidizing yeast strain |
| JPH0231680A (ja) * | 1988-07-22 | 1990-02-01 | Agency Of Ind Science & Technol | チトクロムＰ４５０ｃ↓２↓１産生酵母菌株 |
-
1984
- 1984-06-16 JP JP59122953A patent/JPS6188878A/ja active Granted
-
1985
- 1985-06-13 GB GB858514971A patent/GB8514971D0/en active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| METHODS IN ENZYMOLOGY=1983 * |
| NUCLEIC ACIDS RESEARCH=1984 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7547613B2 (en) | 2000-09-13 | 2009-06-16 | Hamamatsu Photonics K.K. | Laser processing method and laser processing apparatus |
| US7592238B2 (en) | 2000-09-13 | 2009-09-22 | Hamamatsu Photonics K.K. | Laser processing method and laser processing apparatus |
| US7626137B2 (en) | 2000-09-13 | 2009-12-01 | Hamamatsu Photonics K.K. | Laser cutting by forming a modified region within an object and generating fractures |
| US7566635B2 (en) | 2002-03-12 | 2009-07-28 | Hamamatsu Photonics K.K. | Substrate dividing method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6188878A (ja) | 1986-05-07 |
| GB8514971D0 (en) | 1985-07-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |