JPH047193B2 - - Google Patents

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JPH047193B2
JPH047193B2 JP59122952A JP12295284A JPH047193B2 JP H047193 B2 JPH047193 B2 JP H047193B2 JP 59122952 A JP59122952 A JP 59122952A JP 12295284 A JP12295284 A JP 12295284A JP H047193 B2 JPH047193 B2 JP H047193B2
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JP
Japan
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dna
plasmid
add
coli
restriction enzyme
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JP59122952A
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JPS615783A (ja
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Kenji Oita
Keiko Nakamura
Hideo Ookawa
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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Agency of Industrial Science and Technology
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Priority to JP25543090A priority patent/JPH03172175A/ja
Publication of JPH047193B2 publication Critical patent/JPH047193B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)

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  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ラツト肝チトクロムＰ−450c遣伝子
を組込んだ組換えプラスミドに関する。
３−メチルコラントレン投与により誘導される
ラツト肝チトクロムＰ−450cは、還元型で一酸化
炭素と結合し、その差スペクトルが447nｍに吸
収極大を示すヘム蛋白質であり、ステロイドや脂
肪酸の代謝、外来の脂溶性有機化合物の酸化的代
謝反応あるいは化学変異剤の代謝活性化などに関
与している。本発明は、この高い水酸化活性を有
し、しかも基質特異性の幅が広いチトクロムＰ−
450cを大腸菌内で発現させ、工業的なレベルでの
酸化反応過程や産業排水中の有機化合物の酸化除
去等に応用することを可能にする大腸菌内発現用
のプラスミドを提供するものである。
近年、高等生物由来の生理活性ペプチドをコー
ドするcDNAあるいは合成DNAにプロモータを
接続することにより構築したプラスミドを大腸菌
に導入し、生理活性ペプチドを大腸菌に発現させ
た例は少なくない。インスリン、成長ホルモン、
インターフエロン等は工業的レベルでの微生物生
産が試みられている。しかしながら、細胞のミク
ロソーム膜に局在し、分子量も59300ダルトンと
大きくしかも蛋白分子内にヘムを含有しているチ
トクロムＰ−450については、現在のところ大腸
菌内で発現を行つた報告はない。
本発明者らは、ラツト肝チトクロムＰ−450cの
大腸菌内発現について、種々研究を行ない本発明
を完成した。
本発明の大腸菌内発現を目的とした組換え体プ
ラスミドpMG1は、強力プロモーターであるtac
プロモーターの下流に、高い酸化活性を示すラツ
ト肝のチトクロムＰ−450c遺伝子が連結してい
る。さらに、大腸菌での発現を調節する転写因子
であるSD配列やSD配列と開始コドン間の距離等
も十分満たされている。
取得したpMG1プラスミドを用いて大腸菌を形
質転換することにより、大腸菌細胞内にラツト肝
チトクロムＰ−450cが合成され、それを分離、精
製することができる。このようにして、得られた
チトクロムＰ−450c標品とラツト肝のNADPH
−チトクロムＰ−450c還元酵素をともに同時固定
化し、酸化反応を行わせることが可能である。ま
た、産生チトクロムＰ−450cを分離、精製せず、
酸化反応を司どる大腸菌として、固定化し、バイ
オリアクターとして応用することもでき、また、
活性汚泥に加えることも可能である。
本発明の組換えプラスミドpMG1は、第１ａ図
から第１ｅ図に示された塩基配列をもつ組換えプ
ラスミドpAU157を大腸菌の強力プロモーターで
あるtacプロモーターに接続することにより構築
できる。
tacプロモーターは、trpプロモーターの“−35
領域”とlacUV5プロモーターの“−10領域”か
ら構成されている大腸菌の強力プロモーターの１
つである。
次に実施例により本発明について詳細に説明す
る。
実施例 ラツト肝チトクロムＰ−450c遺伝子の大腸菌内
発現を目的とした発現用プラスミドpMG1の構
築 ラツト肝チトクロムＰ−450c蛋白質の全コーデ
イング領域をもつ組換え体プラスミドpAU157
（Nucl.Acids.Res.12、p2929−2938に記載の方法
で製造できる。）より単離したチトクロムＰ−
450cの構造遺伝子を、大腸菌の強力プロモーター
であるtacプロモーター（P.L.バイオケミカル社）
に接続し、大腸菌内発現用プラスミドpMG1を以
下のように構築した。pAU157プラスミドに含ま
れるcDNAの塩基配列を第１ａ図から第１ｅ図に
示す。
発現ベクターpDG1の構築 発現用プラスミドpMG1構築の第一段階とし
て、tacプロモーターを保持する発現ベクター
pDR540（PLバイオケミカル社）を改変し、新
たな発現ベクターpDG1を構築した。第２図に
その概要を示す。以下に、２つのステツプに分
け、その構築の方法を述べる。
ステツプ１：pDR540プラスミドの部分的分解 1μgのpDR540プラスミドDNAに、２ユニツ
トの制限酵素BamHI（宝酒造）を加え、10μ
のBamHI反応液〔10ｍＭ Tris−HCl（PH
8.0）、７ｍＭ MgCl2、100ｍＭ NaCl、２ｍ
M2−メルカプトエタノール、0.01％ウシ血清
アルブミン〕中で37℃１時間反応した。つぎに
この反応液に１ユニツトのS1ヌクレース（PL
バイオケミカル社）および10μのS1ヌクレー
ス反応液〔100ｍＭ NaOAc−HOAc（PH4.0）、
300ｍＭ NaCl、12ｍＭ ZnSO4〕を加え、さ
らに18℃で２時間反応させた。反応後、反応液
に等量のフエノール−クロロホルム溶液〔フエ
ノール：クロロホルム（１：１）〕を加え、混
合し、10000rpmで５分間遠心後、上澄を分取
した。つぎに、２倍量の冷エタノールを加えて
−80℃に15分間放置した後、10000rpmで10分
間遠心し、DNAを回収し、10μの蒸留水に
懸濁した。
ステツプ２：pDG1の構築 ステツプ１で調製した10μのDNA溶液に
1μｇのBglリンカー（宝酒造）および４ユニ
ツトのT4DNAリガーゼ（宝酒造）を加え、
20μのT4DNAリガーゼ反応液〔66ｍＭ
Tris−HCl（PH7.6）、6.6ｍＭ MgCl2、10ｍＭ
dithiothreitol、1.0ｍＭ ATP〕中で16℃15
時間反応させた。反応後、反応液をCohenらの
方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69、p2110−
2114）を用いて、大腸菌（Escheric hia coli）
DH1株（F-、recA1、endA1、gyrA96、thi−
１、hsdR17、supE44、λ-、九州大学医学部遺
伝情報施設保存菌株・住友化学工業株式会社宝
塚総合研究所にても保存）に形質転換し、
100μｇ／mlのアンピシリン（シグマ社）を含
むLBプレート（１当り10ｇのポリペプトン、
５ｇのイーストエキストラクト、５ｇのNaCl、
12ｇの寒天を含む）に形質転換体を広げ、出現
したコロニーを単離した。つぎに、Birnboim
らの方法（Nucl、Acids、Res.７、p1513−
1523）に従つて、コロニーよりプラスミド
DNAを調製し、1μｇのプラスミドDNAに対
し、１ユニツトの制限酵素Bglを加えて、
Bgl反応液〔10ｍＭ Tris−HCl（PH7.5）、７
ｍＭ MgCl2、100ｍＭ NaCl、７ｍM2−メ
ルカプトエタノール〕中で、37℃、１時間反応
した。反応後、反応液を0.1μｇ／mlの臭化エチ
ジウム（アルドリツチ社）を含む1.0％のアガ
ロースゲル（シグマ社）に供し、100Vで60分
間電気泳動した。紫外線ランプ下で泳動パター
ンを観察し、制限酵素Bglで１カ所切断を受
けたプラスミドを選択し、pDG1プラスミドと
名付けた。構築した発現ベクターは、tacプロ
モーターを保持し、SD配列の下流７塩基に、
制限酵素Bglの認識部位を持つており、この
部位に目的のDNA断片を組込むことにより、
目的蛋白質の発現を行うことができる。
tacプロモーターとチトクロムＰ−450cの開
始コドンを含むDNAの結合（pDGN101の構
築） 発現用プラスミドpMG1構築の第二段階とし
て、で構築した発現ベクターpDG1より、
tacプロモーターを含むEcoR−BglDNA
断片を単離し、これに、チトクロムＰ−450遺
伝子の開始コドンを含む約300塩基対のSau3A
−Pst断片を接続し、組換え体プラスミド
pDGN101を得た。構築の概要を第３図に示し、
以下、４つのステツプに分け、その構築の方法
を述べる。
ステツプ１：3600塩基対のEcoR−Pst断片
の調製 1μｇのpBR322DNA（和光純薬）に、１ユ
ニツトの制限酵素EcoR（宝酒造）および
１ユニツトの制限酵素Pst（宝酒造）を加
え、20μのEcoR反応液〔100ｍＭ Tris
−HCl、（PH7.5）、７ｍＭ MgCl2、50ｍＭ
NaCl、７ｍM2−メルカプトエタノール、
0.01％ウシ血清アルブミン〕中で37℃１時間
反応した。反応後、反応液を0.1μｇ／mlの臭
化エチジウムを含む1.0％の低融点アガロー
スゲル（ベセスダ・リサーチ社）に供し、電
気泳動を行つた。泳動後、紫外線ランプ下
で、3.6KbのEcoR−Pst DNA断片に
相当するゲル部分を切り出し、エツペンドル
フ管にとり、65℃で５分間加熱した。融解し
たゲルに２倍量のTE緩衝液〔10ｍＭ Tris
−HCl（PH8.0）、0.5ｍＭ EDTA〕を加え、
次にTE緩衝液で飽和したフエノールを加え
て、フエノール抽出を行つた。10000r.p.m.
で５分間遠心し、上層を分取した後、140量
の4MNaClおよび２倍量のエタノールを加え
て−80℃に10分間放置することによりDNA
をエタノール沈殿した。その後10000rpmで
10分間遠心し、約0.2μｇの3.6Kb EcoR−
Pst DNA断片を回収し、10μの蒸留水
に懸濁した。
ステツプ２ tacプロモーター断片の調製 1μｇの発現ベクターpDG1に、１ユニツト
の制限酵素EcoRおよび１ユニツトの制限
酵素Bglを加え、20μのEcoR反応液中
で37℃１時間反応した。反応後、ステツプ１
と同様の操作により、低融点アガロース電気
泳動を行い、約420塩基のEcoR−Bgl
DNA断片をゲルより切り出し、DNAを回収
し、10μの蒸留水に懸濁した。
ステツプ３ チトクロムＰ−450c遺伝子の開始
コドンを含むSau3A1−Pst断片の調製 5μｇのpAU157DNAに、５ユニツトの制
限酵素Pstを加え、20μのPst反応液
〔20ｍＭ Tris−HCl（PH7.5）、10ｍＭ
MgCl2、50ｍＭ（NH4）2SO4、0.01％ウシ血清
アルブミン〕中で37℃１時間反応し、低融点
アガロース電気泳動後、約300塩基対のPst
DNA断片を切り出し、DNA回収後、10μ
の蒸留水に懸濁した。なお、このDNA断片
中にあるSau3A1切断部位の４塩基下流にチ
トクロムＰ−450c遺伝子の開始コドンが存在
していることが判明している。そこで、この
PstDNA断片を含む溶液に、３ユニツトの
制限酵素Sau3A1（宝酒造）を加え、20μの
Sau3A1反応液〔10ｍＭ Tris−HCl（PH
7.5）、７ｍＭ MgCl2、100ｍＭ NaCl〕中
で37℃１時間反応させ、等量のフエノール−
クロロホルム溶液で処理後、DNAを回収し、
10μの蒸留水に懸濁した。第３図から明ら
かなように、このDNA溶液には、２種類の
DNA断片が混在している。
ステツプ４ 組換え体プラスミドpDGN101の
構築 ステツプ１・２・３で調製した、3600塩基
対のEcoR−PstDNA断片、400塩基対の
EcoR−BglDNA断片および開始コドン
を保持するSau3A1−PstDNA断片混液を
それぞれ0.2μｇづつ混合し、7.2ユニツトの
T4DNAリガーゼを加え、45μのT4DNAリ
ガーゼ反応液中で16℃２時間反応した。その
後、Cohenらの方法に従い、反応液で大腸菌
DH1株を形質転換した。形質転換体を
Rutherらの方法（Mol.Gen.Genetics 178、
P475−477）に従い、200μｇ／mlの５−ブロ
ム−４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトシド（半井化学）、および15μｇ／
mlのテトラサイクリン（シグマ社）を含む
LBプレートに広げ、出現した青色コロニー
を単離した。前述のBirnboimらの方法に従
い、コロニーよりプラスミドDNAを調製し、
2μｇのプラスミドDNAに対し、２ユニツト
の制限酵素Hind（宝酒造）および２ユニ
ツトの制限酵素Bgl（ニツポンジーン）を
加え、20μのHind反応液中で37℃１時間
反応した。反応液を1.0％アガロースゲル電
気泳動で分析し、2300塩基対、900塩基対、
450塩基対、350塩基対および250塩基対の５
つのDNA断片が検出されるプラスミドを選
択し、pDGN101とした。
発現用プラスミドpMG1の構築 で構築した組換え体プラスミドpDGN101
およびpAU157プラスミドとpBR322プラスミ
ドから、発現用プラスミドpMG1を構築した。
構築の概要は第４図に示されている。以下、４
つのステツプに分け、構築の方法について述べ
る。
ステツプ１ 300塩基のHind−Pst断片の
調製 2μｇのpDGN101プラスミドに、２ユニツ
トの制限酵素Hindを加え、20μのHind
反応液中で37℃１時間反応し、1.0％低融
点アガロース電気泳動を行い、3900塩基対の
HindDNA断片を単離した。つぎにこの
DNA溶液に、２ユニツトの制限酵素Pstを
加え、20μのPst反応液中で37℃１時間
反応し、同様の操作により、tacプロモータ
ーを含む300塩基対のHind−PstDNA断
片を調製した。このDNAを、以後、DNA断
片ａと呼ぶ。
ステツプ２ Pvu−HincDNA断片および
Pst−HincDNA断片の調製 5μｇのpAU157プラスミドDNAに５ユニ
ツトの制限酵素Pvu（バイオラボ社）を加
え、20μのPvu反応後〔７ｍＭ Tris−
HCl（PH7.4）、150ｍＭ NaCl、６ｍＭ
MgCl2、６ｍM2−メルカプトエタノール、
100μｇ／mlウシ血清アルブミン〕中で37℃
１時間反応し、DNAを回収した。引きつづ
き、このDNA溶液に５ユニツトの制限酵素
Hinc（宝酒造）を加え、20μのHinc
反応液〔10ｍＭ Tris−HCl、（PH8.0）、７
ｍＭ MgCl2、60ｍＭ NaCl、７ｍM2−メ
ルカプトエタノール〕中で37℃１時間反応
し、1.0％の低融点アガロースゲルで電気泳
動後、3200塩基対のPvu−HincDNA断
片を単離した（DNA断片ｂとする。） また、同時に2100塩基対のHincDNA断
片を同様の方法で調製し、引きつづきこの
DNA溶液に３ユニツトの制限酵素Pstを加
え、20μのPst反応液中で37℃１時間反
応した。得られた反応生成物を1.0％の低融
点アガロースゲルで分離し、1000塩基対の
Pst−HincDNA断片を単離した（DNA
断片ｃとする。） ステツプ３ 700塩基対のHind−Pvu
DNA断片の調製 2μｇのpBR322DNAに２ユニツトの制限
酵素Pvuを加え、20μのPvu反応液中
で37℃１時間反応し、DNAを回収した。次
いでこのDNA溶液に２ユニツトの制限酵素
Hindを加え、20μのHind反応液中で
37℃１時間反応した。反応生成物を、1.0％
低融点アガロースゲルで分離し、700塩基対
のPvu−HindDNA断片を単離した
（DNA断片ｄとする。） ステツプ４ ステツプ１・２・３で調製したDNAを
各々約0.2μｇづつ混合し、３ユニツトの
T4DNAリガーゼを加え、30μのT4DNAリ
ガーゼ反応液中で16℃15時間反応した。反応
後、反応液で大腸菌DH1株を形質転換し、
200μｇ／mlの５−ブロム−４−クロル−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドおよび
10μｇ／mlのアンピシリン（シグマ社）を含
むLBプレートに広げ、出現した青色コロニ
ーを単離した。コロニーよりプラスミド
DNAを調製し、1μｇのプラスミドDNAに対
して１ユニツトの制限酵素Hincを加えて、
20μのHind反応液中で37℃１時間反応さ
せた後、反応生成物を1.0％のアガロ−スゲ
ルで分析したプラスミドのうち、3300塩基
対、500塩基対および1300塩基対のDNA断片
が検出されたプラスミドを選択し、pMG1と
名付けた。
発現用プラスミドpMG1によるラツト肝チト
クロムＰ−450cの発現 構築した発現用プラスミドpMG1を用い
て、大腸菌内でラツト肝チトクロムＰ−450c
の発現を行つた。以下にその詳細な方法を述
べる。
ステツプ１ マキシ・セル法による発現蛋白の
標識 構築したpMG1プラスミドを、Cohenらの
方法に従い、大腸菌CSR603株（uvrA6、rec
A1、phr、thr、1eu、pro、his、arg、lac、
gal、ara、xy1、mt1、stf）（九州大学理学
部分子遺伝学講座保存菌株；住友化学工業株
式会社、宝塚総合研究所にても保存）に形質
転換し、形質転換体CSR603（pMG1）株を得
た。得られたコロニーを培養し、サンカー
（Sancar）らのマキシセル法（J.M.B 148
p45−62）に従い、発現蛋白の標識を行
た。まず、大腸菌CSR603（pMG1）株を、Ｋ
培地〔１％カザミノ酸、0.1μｇ／mlチアミン
＋M9培地、但しM9培地は、Na2HPO4 ６
ｇ、KH2PO4 ３ｇ、NaCl 0.5ｇ、NH4Cl
１ｇに蒸留水を加えて１とし、オートクレ
ーブ後、0.01M CaCl2を10ml、1M MgSO4
を１mlを加えたもの。〕中で37℃１晩培養し
た。その0.1mlを10mlのＫ培地に植え継ぎ、
37℃でインキユベートして、OD660が0.2にな
るまで増殖させた。滅菌した時計皿に10mlの
培養液を移し、15Wの紫外線ランプ直下約90
cmの距離で、５〜20秒照射した。照射後、培
養液を100ml容三角フラスコに移し、37℃で
１時間培養し、サイクロセリンを100μｇ／
mlになるように加え、37℃で８〜12時間イン
キユベートした。3000rpmで15分間遠心して
集菌し、ハーシーソルト（5.4ｇ NaCl、3.0
ｇ KCl、1.1ｇ NH4Cl、15mg CaCl2・
2H2O、0.2ｇ MgCl2・6H2O、0.2mg
FeCl3・6H2O、87mg KH2PO4、12.1ｇ
Trizmab ase／１）で２回洗浄した。つ
ぎに菌を５mlのハーシ培地〔ハーシソルト
100ml当たり、0.5mlスレオニン（２％）、１
mlロイシン（１％）、１mlプロリン（２％）、
１mlアルギニン（２％）、0.1mlチアミン
（0.1％）〕に懸濁し、37℃１時間インキユベ
ートした。さらに 35S−メチオニン
（1000Ci／ｍmole）を50μCi／mlになる様に
加え、37℃で１時間インキユベートした。遠
心して集菌し、0.1mlの２％SDS（ドデシル硫
酸ナトリウム）に懸濁後、100℃で４分間熱
処理し、タンパク質を溶解させた。以上のよ
うにして、調製した粗抽出液の25μに対し
て、75μの沈降用緩衝液〔25％TritonX−
100、190ｍＭ NaCl、6m MEDTA、50ｍ
Ｍ Tris HCl（PH7.4）〕を加え、抗Ｐ−
450cIgGを10μｇを添加し、４℃で１晩放置
した。これに、Ｔ緩衝液〔２％TritonX−
100、２ｍＭ Met、150ｍＭ NaCl、5m
MEDTA、50ｍＭ Tris−HCl（PH7.4）〕で
平衡化したProteinA−SepharoseCL−4B
（フアルマシア社）を50μ添加し、10分ご
とに攪拌しながら、室温で１時間反応させ
た。12000r.p.m.で５分間遠心し、沈殿した
ゲルを１mlのＴ緩衝液で２回洗浄し非特異的
吸着物を除去した。得られたゲルを50μの
サンプル緩衝液（上記）中で１分間煮沸し
て、ゲルに吸着した免疫沈降物を溶出した
後、溶出液を、Laemmliらの方法（Nature
227 p680−685）に従つて、SDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけ、フルオログ
ラフイーを行つた。結果を第５図に示す。Ａ
は対称として用いたpAU157の例で、免疫沈
降物は検出されなかつたが、pMG1を用いた
Ｂではラツト肝チトクロムＰ−450cに相当す
る免疫沈降物が確認された。また、その発現
量は、検出量から推定して大腸菌細胞当り、
102〜103分子であると考えられる。
以上のことから、大腸菌CSR603株に組換え体
プラスミドpMG1を導入することにより、ラツト
肝チトクロムＰ−450c蛋白が発現することが確認
された。
【図面の簡単な説明】
第１ａ図から第１ｅ図は、pAU157プラスミド
に含まれるcDNAの塩基配列を示す。第２図は、
発現ベクターpDG1構築の概要を示す。第３図
は、プラスミドpDGN101構築の概要を示す。第
４図は、発現用プラスミドpMG1構築の概要を示
す。第５図には、ラツト肝チトクロムＰ−450c蛋
白の大腸菌内での発現量を示すフルオログラフイ
ー結果を示す。第６図は、発現用プラスミド
pMG1の制限酵素地図を示す。〓はプロモータ
ー、〓は、Ｐ−450c遺伝子、〓は、Ori遺伝子、
〓は、アンピシリン耐性遺伝子を表す。また、
AhはAha部位を、EcはEcoR部位を、Hcは
Hinc部位を、HdはHind部位を、PsはPst部
位を、PvはPvu部位を、PvはPvu部位
を表す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 約5200塩基対からなり、下に示す制限酵素地
    図で特徴づけられ、 プロモーターのSD配列とＰ−450c遺伝子開始
    コドンATGの接続部分の塩基配列が、 AGGAAACAGCAGATCATG であるプラスミドpMG1。 ２ 約5200塩基対からなり、下に示す制限酵素地
    図で特徴づけられ、 プロモーターのSD配列とＰ−450c遣伝子開始
    コドンATGの接続部分の塩基配列が、 AGGAAACAGCAGATCATG であるプラスミドpMG1で形質転換した大腸菌。
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