JPH0429357B2 - - Google Patents
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- JPH0429357B2 JPH0429357B2 JP59154220A JP15422084A JPH0429357B2 JP H0429357 B2 JPH0429357 B2 JP H0429357B2 JP 59154220 A JP59154220 A JP 59154220A JP 15422084 A JP15422084 A JP 15422084A JP H0429357 B2 JPH0429357 B2 JP H0429357B2
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- human
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- serum
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明者らは、ヒト肺ガン細胞に特異的なヒト
単クローン性抗体を産生するヒト―ヒトハイブリ
ドーマを作成し、更にその抗体を大量に且つ高純
度で得ることが出来た。新規のハイブリドーマ
は、安定に継代培養され、肺ガン細胞に対して特
異的な抗体を産生する。 この肺ガン特異的抗体は、ガンの免疫学的研
究、臨床診断および免疫治療等の医学的分野での
応用やガン特異抗原の精製手段としての利用が出
来る。 従来の技術 Kohler，G.およびMilstein，K.は、マウス脾
細胞とマウス骨髄腫細胞との細胞融合によりマウ
スの単クローン性抗体を産生した（Nature，256
巻、495―497頁、1975年及びEur.J.Immunol.6
巻、511―519頁、1976年）。ハイブリドーマによ
る単クローン性抗体の産生法の特徴は、単一の抗
原決定基にのみ反応する抗体を主体外で大量に且
つ繰り返し得ることが出来ることにある。従つ
て、この方法を用い腫瘍、ウイルス等の抗原に対
する単クロー性抗体を産生し、その抗体を生物・
医学研究に応用する試みがなされ、数多くの報告
がなされているが、殆んどがマウスの単クローン
性抗体についてである。 Steinity，M.はEpstein―Barrウイルスでの形
質転換によつて得られる抗体産生ヒトＢ―リンパ
球の培養により抗体を産生した（Nature，269
巻、420―422頁、1977年）。 発明が解決しようとする問題点 Ａ Kohler及びMilsteinの基本的な細胞融合の
技術の提示以来、種々のハイブリドーマの作成
およびこれらのハイブリドーマにより産生され
る単クローン性抗体の基礎的または応用的研究
について多くの努力がされてきた（例えば
Annual Rev.Biochem.，50巻、657―680頁、
1981）。この文献ならびにこの文献に引用され
ている文献は、ハイブリドーマから単クローン
性抗体を産生することにより得られる多くの利
点と同時にその操作及びその結果の複雑さを示
している。 一般的技術は、概念的にはよく理解されてい
るが各特定の場合に多くの困難があり、従つて
それを解決するための変更が要求されるととも
に不確定の要素が存在する。事実、一定のハイ
ブリドーマを作成する場合には、所望のハイブ
リドーマが得られるかどうか、仮りにそれが得
られた場合抗体を産生するかどうか、あるいは
またそのように産生された抗体が所望の特異性
をもつかどうかは全く予測し難い。成功の程度
は、主としていかに多くの生きのよい抗体産生
リンパ球細胞を得るかおよび融合に用いる親細
胞としての腫瘍細胞の選択とその細胞の生きの
よさにより影響を受ける。 しかし、それでも成功を左右する未知の不確
定の要素が多くあると考えられ、所望の特異性
をもつ単クローン性抗体を産生するハイブリド
ーマの作成は非常に難しい。特にヒト―ヒトハ
イブリドーマの場合には、ヒト抗体産生融合細
胞を得ることすら難しく、所望の特異性をもつ
単クローン性抗体を産生するヒト―ヒトハイブ
リドーマの作成は困難を極めるといつてよい。 Ｂ 生体外でヒトのガンに対するヒト単クローン
性抗体を製造するためのアプローチがいくつか
試みられたが、それらは、現在のところ大きく
成功していない。これらには例えば次のことが
挙げられる。 (a) Epstein―Barrウイルスによるガン患者の
抗体産生リンパ球の形質転換による方法。こ
の形質転換細胞を確立するには長く冗長な過
程を必要とし、またクローン化が非常に困難
であるので、この方法はほとんど成功の例が
ない。 (b) マウス骨髄腫とガン患者の抗体産生リンパ
球細胞とのの細胞融合による方法。この方法
はマウス―マウスハイブリドーマと同様に優
れた増殖性を有するマウス―ヒトハイブリド
ーマを製造するが、それはまた、この雑種細
胞が固有の遺伝学的不安定性を有するという
大きな不利点をも持ち合わせている。すなわ
ち、抗体にとつて重要な意味をもつカツパー
鎖を形成するための遺伝子が位置するヒトの
染色体をマウス骨髄腫が融合細胞外へ放出し
てしまうということである。従つて、ヒト単
クローン性抗体を産生するハイブリドーマの
出来る可能性は非常に低い。 Ｃ マウス―マウスのハイブリドーマにより産生
されたヒトのガンに対するマウス単クローン性
抗体は数多く作成されているが、これらはヒト
にとつては異物であるため、例えば、ヒトに反
復注射した場合シヨツクを起こす危険性があ
る。従つて、ヒトの腫瘍細胞とヒトのガンに対
する抗体を産生する細胞とを融合して形成され
たヒト―ヒトハイブリドーマを用いることは有
効である。すなわち、このハイブリドーマはシ
ヨツクの危険の少ないヒトのガンに対する単ク
ローン性抗体を産生することが出来るからであ
る。 Ｄ ハイブリドーマを生体外で大量培養し、単ク
ローン性抗体を産生する場合、培地として牛胎
児血清（以下、FCSという）等の血清添加培地
（以下、血清培地という）を一般的に使用して
いる。しかし、血清は高価であること及びロツ
ト間のばらつきがあることから、血清培地は大
量培養に適さない。更に、血清は数十以上の成
分から成り且つ多量に添加されるため、培地中
に分泌された抗体の精製は非常に困難である。 問題点を解決するための手段と作用 本発明は、例えば肺ガン患者のリンパ節から分
離した細胞のような肺ガン患者の抗体産生細胞
と、抗体産生能のないヒト腫瘍細胞株からの細胞
との融合によつて得られるハイブリドーマが産生
する抗体に関するものである。詳しくは、細胞融
合により得られたハイブリドーマから間接蛍光抗
体法により測定したとき、次に(イ)〜(ハ)の特徴を有
する抗体を産生するものを選択し、そのハイブリ
ドーマに産生させた抗体に関するものである。 (イ) 肺ガン細胞に対し、特異的な蛍光が認められ
る。 (ロ) 胃ガン、腎臓ガン、メラノーマおよび膀胱ガ
ンの細胞に対し、特異的な蛍光が認められな
い。 (ハ) 正常細胞に対し反応せず、特異的な蛍光が認
められない。 すなわち、前述した解決すべき課題に対し、
各々次のように対応することにより本発明の実施
を可能とした。 Ａ 問題点Ａについて。 (a) 多くの生きのよい所望のヒト抗体産生リンパ
球細胞を得るために、肺ガン患者から摘出した
リンパ節の中で特にガン細胞が混入しているも
のを選びそれからリンパ球細胞を調製した。そ
のリンパ球細胞をすばやくその患者のガン細胞
及びリンパ球幼若化因子等とともに培養し、芽
球化させた。 (b) 融合に用いる親細胞としての腫瘍細胞として
融合効率の高いNAT―30（特願昭58−247772
号、「ヒトハイブリドーマ作成用親細胞株」）及
びその亜株を用いた。 NAT―30及びその亜株とは、ヒトバーキツト
リンパ腫細胞であるナマルバ細胞のヒポキサンチ
ン―グアニン―ホスホリボシルトランスフエラー
ゼ（HGPRT）欠損突然変異細胞である。 また、その細胞を生きのよい状態にするため
に、その継代培養用培地（30μg／ml６―チオグ
アニン入り培地）から６―チオグアニンを除き10
日培養、そして融合２日前から毎日培地を半分ず
つ新しい培地と交換した。 (a)、(b)等により所望の肺ガン細胞に特異なヒト
単クローン性抗体を産生するヒト―ヒトハイブリ
ドーマが作成された。 Ｂ 問題点Ｂについて。 本発明者らは、HGPRT欠損の安定なヒトの腫
瘍細胞株からの細胞で特に融合効率の高い、
NAT―30及びその亜株を用いヒト―ヒトハイブ
リドーマを作成し、その問題点を解決した。 Ｃ 問題点Ｃについて。 本発明者らは、ヒト―ヒトハイブリドーマを作
成することとし、(a)肺ガン患者の抗体産生細胞と
(b)HGPRT欠損の安定なヒトの腫瘍細胞株からの
細胞との融合により、ヒトの肺ガンに対するヒト
単クローン性抗体を安定に産生するヒト―ヒトハ
イブリドーマを作成し、その問題点を解決した。 Ｄ 問題点Ｄについて。 本発明者らは血清を添加しない培地（以下、無
血清培地という）でもハイブリドーマが増殖し且
つそれが単クローン性抗体を産生する系を作成す
るために、無血清培地でも増殖するヒトの腫瘍細
胞NAT―30およびその亜株を親細胞として用い
た。この親細胞を用いたハイブリドーマは親細胞
と同様に無血清培地で増殖した。且つそのハイブ
リドーマは無血清培地中で単クローン性抗体を産
生した。 なお、無血清培地としては、例えば、(a)インシ
ユリン、ラクトフエリン、エタノールアミン及び
セレニウムの４成分を含むDulbecco改質培地
（以下、Dulbecco改質培地のことをDMEとい
う）、(b)ラクトフエリンをトランスフエリンに置
き換えたもの、(c)(a)(b)に更にECGSを加えたもの
がある。 無血清培地を用いることにより、ハイブリドー
マの培養が安価に出来るようになり、更に精製も
非常に簡単に出来るようになつた。 以上に記したように、本発明の肺ガン細胞抗体
は、肺ガン患者のリンパ節から得た生きのよいヒ
ト抗体産生リンパ球細胞と、融合効率の高いヒト
腫瘍由来の細胞であるNAT―30及びその亜株と
を融合させ、得られたハイブリドーマが産生する
ものである。しかも、このハイブリドーマは、血
清培地のみならず、無血清培地においても増殖
し、しかも抗肺ガン細胞抗体を安定に産生し続け
た。 実施例 １ ヒト抗体産生リンパ球細胞の調製 ヒトリンパ球細胞は、肺ガン患者から摘出した
リンパ節のうち特にガン細胞の混入しているリン
パ節を選び、すみやかにこれを10％FCS添加
DME中で細切し、更に２枚のスライドグラスで
この細切した組織をはさみ押しつけることにより
リンパ球細胞およびガン細胞等を浮遊させた。こ
のようにして浮遊させた細胞を、１ml上記培地当
り１〜２×106個リンパ球細胞になるように調製
し、これに10μg／mlのpokeweed mitogenを添加
した。これをシヤーレ中で２〜３日間、37℃の５
％炭酸ガスインキユベーター内で培養した。培養
後、通常の方法でリンパ球細胞を調製し、これを
ヒト抗体産生リンパ球細胞画分とした。 NAT―30細胞およびその亜株の調製 NAT―30細胞を調製するには、以下のように
した。 まずナマルパ細胞（大日本製薬）を45℃で、
0.25％寒天を含むDME＋10％FCS添加血清培地
に１×103個／mlの細胞濃度で浮遊させ、５cmシ
ヤーレにその５mlを取り、37℃で５％炭酸ガス及
び95％空気のインキユベーター内で３週間培養し
た。その後生育したクローン90個を１つずつ96ウ
エプレート（ヌンク社）（１ウエルにつき200μ
の培地）に取り出し、寒天を含まない上記血清培
地中で、同様にして２週間培養した。抗体産生能
のない株を選択する目的から、各ウエルの培養上
清をとりエンザイムイムノアツセイ（カツペル
社）によりその上清中の抗体量の測定を行つた。
その結果抗体の全く検出されなかつた細胞株７株
を選び、96ウエル中で十分に増殖させた。増殖し
た細胞株をそれぞれ24ウエル（１ウエルにつき
1.5mlの培地）、５cmシヤーレ（１枚につき５mlの
培地）の順に用いて培養液量を増加していき、約
５×106細胞ずつを得た。それぞれの株について
３×104細胞を残し、他の細胞を、新しく調製し
た上記血清培地15mlに浮遊させ、−５℃で凍結後
室温で融解するという凍結・融解操作を２回繰り
返し細胞を死滅させた。この死滅細胞を含む培地
５mlを３枚の５cmシヤーレに移し、死滅させずに
残しておいた細胞をそれぞれ１×104細胞ずつ移
植した。上記と同様に５日間培養すると大部分の
細胞は死滅するが、その中の生き残つた細胞を遠
心により集めそれぞれの株について、96ウエルプ
レート３０ウエルに移植した。４〜６日ごとに培
地を交換しつつ３週間培養した結果、増殖のみら
れた株は上記７株中２株についてであつた。２株
について、増殖速度の速い５個ずつのウエルの細
胞を上記の順に培養液量を増加し、それぞれ約１
×106細胞を得た。それぞれの細胞を別々に遠沈
により集め、１回DMEで洗い、無血清培地
（ITES培地、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79巻、
1158―1162頁、1982年）５mlにそれぞれ浮遊させ
た。上記と同様に４週間、４〜６日ごとに培地を
換え培養した。この無血清培地での培養で増殖速
度の早いものから３種類の細胞を選び、十分に増
殖させて約１×107個ずつの細胞を得た。これら
をそれぞれ3μg／mlの６―チオグアニンを含む上
記血清培地10mlに浮遊させ、４日ごとに培地を交
換しつつ４週間培養した。その後生存細胞を取り
出し、30μg／mlの６―チオグアニンを含む同一
培地に１×105個／ml濃度となるように浮遊させ、
上記と同様に４週間培養した。このようにして６
―チオグアニン耐性株を得た。この株をNAT―
30と命名した。 NAT―30細胞の亜株は、NAT―30細胞を0.25
％寒天を含む培地（30μg／mlの６―チオグアニ
ンおよび10％FCS添加DME）に103個／mlの細胞
濃度で浮遊させ、37℃の５％炭酸ガスインキユベ
ーター内で３週間培養した。その間に増殖したク
ローンのうち生育の一番よかつたクローンを選び
これをNAT30―８と命名した。NAT―30およ
びNAT30―８は30μ／mlの６―チオグアニン
を含む上記血清培地で継代培養をする。融合に用
いる10日前から培地を６―チオグアニン無添加の
血清培地に換え更に融合２日前から毎日培地を半
分ずつ新しい培地と交換して培養した。 ハイブリドーマの作成 上記NAT―30またはNAT30―８細胞の３×
107個と上記ヒト抗体産生リンパ球細胞３〜10×
107個とを細胞融合に用いた。各細胞をDMEで２
回洗浄し、50mlの遠心管中で混合し、1200rpmで
７分間遠沈した。上清を完全に除去し、得られた
細胞ペレツトに、あらかじめ37℃に加温した42.5
％ポリエチレングリコール（平均分子量1500）及
び15％ジメチルスルホキシド添加DMEの１mlを
１分間かけ少しずつ加えた。更に、１分間37℃で
放置した後、あらかじめ37℃に加温しておいた
DMEを５分間かけ徐々に９ml加えた。1500rpm
で10分間遠沈し、上清を除去した。得られた細胞
ペレツトに15％FCS添加DME100mlを加えて、96
ウエルプレートに夫々100μずつ分注した。24
時間後、２倍濃度のHAT培地（上記15％FCS培
地にヒポキサンチン２×10-4M、アミノプテリン
２×10-7M及びチミジン3.2×10-5Mを添加した
培地）100μを各ウエルに加えた。以後４日ご
とに培地の半分を捨て、HAT培地100μを各ウ
エルに加える操作を繰り返し、４―６週間７％酸
素、５％炭酸ガスを含むインキユベーター内で37
℃で培養した。この間に増殖したハイブリドーマ
については、更に１週間HT培地（HAT培地か
らアミノプテリンを除いた培地）で培養した後、
無血清及び血清培地で培養した。 なお、ハイブリドーマは、現在７か月を経てい
るが、依然として安定に抗体を産生している。 間接蛍光抗体法 特異性の判定は以下のような方法を用いた。 96ウエルプレート又は組織培養用チエンバー
（ラブ−テツク社）にガン細胞及び正常二倍体細
胞を１〜５日間37℃の５％炭酸ガスインキユベー
ター中で培養し付着させた。培養後、0.05％グル
タルアルデヒド又は４％ホルムアルデヒドで固定
する。固定後、リン酸緩衝化生理食塩水（以下、
PBSという）で３回洗浄し、３％牛血清アルブ
ミンを含むPBSを加え室温で30分間放置する。
放置後、PBSで５回洗浄し、ハイブリドーマの
増殖しているウエルの培地を100μずつ加え、
37℃、５％炭酸ガスインキユベーター中で30分間
放置する。この後、PBSで５回洗浄し、蛍光標
識（FITC）したヤギのヒト抗体に対する抗体
（例えば和光純薬社、タゴ社）を20〜50倍にPBS
で希釈し加え、37℃、５％炭酸ガスインキユベー
ター中で30分間放置する。放置後、PBSで５回
洗浄し、直に蛍光顕微鏡で観察した。判定として
は、特異的な蛍光が50％以上の細胞に認められる
場合がとし、25―50％の場合がとし、25％以
下の場合が＋とし、特異的な蛍光が認められない
場合及びほとんど見当らない場合が−とした。 表―１はハイブリドーマを血清培地中で培養
し、産生された単クローン性抗体の特異性を調べ
たものである。表―１に示したようにHyb―10―
７は肺ガン細胞株であるPC−８と特に強く反応
し、他の肺ガン細胞株であるQG―56及びQG―
90とも反応した。その他のガン細胞株とはほとん
ど反応しなかつた。正常２倍体細胞とは反応しな
かつた。Hyb―４―７については肺ガン細胞株で
あるPC―８、QG―56及びQG―90と強く反応し
他の細胞とは反応しなかつた。Hyb―10―７及び
Hyb―４―７については、肺ガンの初代培養細胞
とも反応した。 Hyb―S60、Hyb―７及びHyb―９については
すべての細胞について全く反応しなかつた。 実施例 ２ 実施例１のハイブリドーマを無血清培地で培養
しその培地について実施例１に記載した特異性の
判定を行つた。 なお、無血清培地の組成は、インシユリン
10μg／ml、ラクトフエリン25μg／ml、エタノー
ルアミン10μM及びセレニウム2.5×10-8Mの４成
分を含むDMEである。 表―２から明らかなように無血清培地で培養し
てもそれぞれの単クローン性抗体の特異性は何ら
変化しない。
単クローン性抗体を産生するヒト―ヒトハイブリ
ドーマを作成し、更にその抗体を大量に且つ高純
度で得ることが出来た。新規のハイブリドーマ
は、安定に継代培養され、肺ガン細胞に対して特
異的な抗体を産生する。 この肺ガン特異的抗体は、ガンの免疫学的研
究、臨床診断および免疫治療等の医学的分野での
応用やガン特異抗原の精製手段としての利用が出
来る。 従来の技術 Kohler，G.およびMilstein，K.は、マウス脾
細胞とマウス骨髄腫細胞との細胞融合によりマウ
スの単クローン性抗体を産生した（Nature，256
巻、495―497頁、1975年及びEur.J.Immunol.6
巻、511―519頁、1976年）。ハイブリドーマによ
る単クローン性抗体の産生法の特徴は、単一の抗
原決定基にのみ反応する抗体を主体外で大量に且
つ繰り返し得ることが出来ることにある。従つ
て、この方法を用い腫瘍、ウイルス等の抗原に対
する単クロー性抗体を産生し、その抗体を生物・
医学研究に応用する試みがなされ、数多くの報告
がなされているが、殆んどがマウスの単クローン
性抗体についてである。 Steinity，M.はEpstein―Barrウイルスでの形
質転換によつて得られる抗体産生ヒトＢ―リンパ
球の培養により抗体を産生した（Nature，269
巻、420―422頁、1977年）。 発明が解決しようとする問題点 Ａ Kohler及びMilsteinの基本的な細胞融合の
技術の提示以来、種々のハイブリドーマの作成
およびこれらのハイブリドーマにより産生され
る単クローン性抗体の基礎的または応用的研究
について多くの努力がされてきた（例えば
Annual Rev.Biochem.，50巻、657―680頁、
1981）。この文献ならびにこの文献に引用され
ている文献は、ハイブリドーマから単クローン
性抗体を産生することにより得られる多くの利
点と同時にその操作及びその結果の複雑さを示
している。 一般的技術は、概念的にはよく理解されてい
るが各特定の場合に多くの困難があり、従つて
それを解決するための変更が要求されるととも
に不確定の要素が存在する。事実、一定のハイ
ブリドーマを作成する場合には、所望のハイブ
リドーマが得られるかどうか、仮りにそれが得
られた場合抗体を産生するかどうか、あるいは
またそのように産生された抗体が所望の特異性
をもつかどうかは全く予測し難い。成功の程度
は、主としていかに多くの生きのよい抗体産生
リンパ球細胞を得るかおよび融合に用いる親細
胞としての腫瘍細胞の選択とその細胞の生きの
よさにより影響を受ける。 しかし、それでも成功を左右する未知の不確
定の要素が多くあると考えられ、所望の特異性
をもつ単クローン性抗体を産生するハイブリド
ーマの作成は非常に難しい。特にヒト―ヒトハ
イブリドーマの場合には、ヒト抗体産生融合細
胞を得ることすら難しく、所望の特異性をもつ
単クローン性抗体を産生するヒト―ヒトハイブ
リドーマの作成は困難を極めるといつてよい。 Ｂ 生体外でヒトのガンに対するヒト単クローン
性抗体を製造するためのアプローチがいくつか
試みられたが、それらは、現在のところ大きく
成功していない。これらには例えば次のことが
挙げられる。 (a) Epstein―Barrウイルスによるガン患者の
抗体産生リンパ球の形質転換による方法。こ
の形質転換細胞を確立するには長く冗長な過
程を必要とし、またクローン化が非常に困難
であるので、この方法はほとんど成功の例が
ない。 (b) マウス骨髄腫とガン患者の抗体産生リンパ
球細胞とのの細胞融合による方法。この方法
はマウス―マウスハイブリドーマと同様に優
れた増殖性を有するマウス―ヒトハイブリド
ーマを製造するが、それはまた、この雑種細
胞が固有の遺伝学的不安定性を有するという
大きな不利点をも持ち合わせている。すなわ
ち、抗体にとつて重要な意味をもつカツパー
鎖を形成するための遺伝子が位置するヒトの
染色体をマウス骨髄腫が融合細胞外へ放出し
てしまうということである。従つて、ヒト単
クローン性抗体を産生するハイブリドーマの
出来る可能性は非常に低い。 Ｃ マウス―マウスのハイブリドーマにより産生
されたヒトのガンに対するマウス単クローン性
抗体は数多く作成されているが、これらはヒト
にとつては異物であるため、例えば、ヒトに反
復注射した場合シヨツクを起こす危険性があ
る。従つて、ヒトの腫瘍細胞とヒトのガンに対
する抗体を産生する細胞とを融合して形成され
たヒト―ヒトハイブリドーマを用いることは有
効である。すなわち、このハイブリドーマはシ
ヨツクの危険の少ないヒトのガンに対する単ク
ローン性抗体を産生することが出来るからであ
る。 Ｄ ハイブリドーマを生体外で大量培養し、単ク
ローン性抗体を産生する場合、培地として牛胎
児血清（以下、FCSという）等の血清添加培地
（以下、血清培地という）を一般的に使用して
いる。しかし、血清は高価であること及びロツ
ト間のばらつきがあることから、血清培地は大
量培養に適さない。更に、血清は数十以上の成
分から成り且つ多量に添加されるため、培地中
に分泌された抗体の精製は非常に困難である。 問題点を解決するための手段と作用 本発明は、例えば肺ガン患者のリンパ節から分
離した細胞のような肺ガン患者の抗体産生細胞
と、抗体産生能のないヒト腫瘍細胞株からの細胞
との融合によつて得られるハイブリドーマが産生
する抗体に関するものである。詳しくは、細胞融
合により得られたハイブリドーマから間接蛍光抗
体法により測定したとき、次に(イ)〜(ハ)の特徴を有
する抗体を産生するものを選択し、そのハイブリ
ドーマに産生させた抗体に関するものである。 (イ) 肺ガン細胞に対し、特異的な蛍光が認められ
る。 (ロ) 胃ガン、腎臓ガン、メラノーマおよび膀胱ガ
ンの細胞に対し、特異的な蛍光が認められな
い。 (ハ) 正常細胞に対し反応せず、特異的な蛍光が認
められない。 すなわち、前述した解決すべき課題に対し、
各々次のように対応することにより本発明の実施
を可能とした。 Ａ 問題点Ａについて。 (a) 多くの生きのよい所望のヒト抗体産生リンパ
球細胞を得るために、肺ガン患者から摘出した
リンパ節の中で特にガン細胞が混入しているも
のを選びそれからリンパ球細胞を調製した。そ
のリンパ球細胞をすばやくその患者のガン細胞
及びリンパ球幼若化因子等とともに培養し、芽
球化させた。 (b) 融合に用いる親細胞としての腫瘍細胞として
融合効率の高いNAT―30（特願昭58−247772
号、「ヒトハイブリドーマ作成用親細胞株」）及
びその亜株を用いた。 NAT―30及びその亜株とは、ヒトバーキツト
リンパ腫細胞であるナマルバ細胞のヒポキサンチ
ン―グアニン―ホスホリボシルトランスフエラー
ゼ（HGPRT）欠損突然変異細胞である。 また、その細胞を生きのよい状態にするため
に、その継代培養用培地（30μg／ml６―チオグ
アニン入り培地）から６―チオグアニンを除き10
日培養、そして融合２日前から毎日培地を半分ず
つ新しい培地と交換した。 (a)、(b)等により所望の肺ガン細胞に特異なヒト
単クローン性抗体を産生するヒト―ヒトハイブリ
ドーマが作成された。 Ｂ 問題点Ｂについて。 本発明者らは、HGPRT欠損の安定なヒトの腫
瘍細胞株からの細胞で特に融合効率の高い、
NAT―30及びその亜株を用いヒト―ヒトハイブ
リドーマを作成し、その問題点を解決した。 Ｃ 問題点Ｃについて。 本発明者らは、ヒト―ヒトハイブリドーマを作
成することとし、(a)肺ガン患者の抗体産生細胞と
(b)HGPRT欠損の安定なヒトの腫瘍細胞株からの
細胞との融合により、ヒトの肺ガンに対するヒト
単クローン性抗体を安定に産生するヒト―ヒトハ
イブリドーマを作成し、その問題点を解決した。 Ｄ 問題点Ｄについて。 本発明者らは血清を添加しない培地（以下、無
血清培地という）でもハイブリドーマが増殖し且
つそれが単クローン性抗体を産生する系を作成す
るために、無血清培地でも増殖するヒトの腫瘍細
胞NAT―30およびその亜株を親細胞として用い
た。この親細胞を用いたハイブリドーマは親細胞
と同様に無血清培地で増殖した。且つそのハイブ
リドーマは無血清培地中で単クローン性抗体を産
生した。 なお、無血清培地としては、例えば、(a)インシ
ユリン、ラクトフエリン、エタノールアミン及び
セレニウムの４成分を含むDulbecco改質培地
（以下、Dulbecco改質培地のことをDMEとい
う）、(b)ラクトフエリンをトランスフエリンに置
き換えたもの、(c)(a)(b)に更にECGSを加えたもの
がある。 無血清培地を用いることにより、ハイブリドー
マの培養が安価に出来るようになり、更に精製も
非常に簡単に出来るようになつた。 以上に記したように、本発明の肺ガン細胞抗体
は、肺ガン患者のリンパ節から得た生きのよいヒ
ト抗体産生リンパ球細胞と、融合効率の高いヒト
腫瘍由来の細胞であるNAT―30及びその亜株と
を融合させ、得られたハイブリドーマが産生する
ものである。しかも、このハイブリドーマは、血
清培地のみならず、無血清培地においても増殖
し、しかも抗肺ガン細胞抗体を安定に産生し続け
た。 実施例 １ ヒト抗体産生リンパ球細胞の調製 ヒトリンパ球細胞は、肺ガン患者から摘出した
リンパ節のうち特にガン細胞の混入しているリン
パ節を選び、すみやかにこれを10％FCS添加
DME中で細切し、更に２枚のスライドグラスで
この細切した組織をはさみ押しつけることにより
リンパ球細胞およびガン細胞等を浮遊させた。こ
のようにして浮遊させた細胞を、１ml上記培地当
り１〜２×106個リンパ球細胞になるように調製
し、これに10μg／mlのpokeweed mitogenを添加
した。これをシヤーレ中で２〜３日間、37℃の５
％炭酸ガスインキユベーター内で培養した。培養
後、通常の方法でリンパ球細胞を調製し、これを
ヒト抗体産生リンパ球細胞画分とした。 NAT―30細胞およびその亜株の調製 NAT―30細胞を調製するには、以下のように
した。 まずナマルパ細胞（大日本製薬）を45℃で、
0.25％寒天を含むDME＋10％FCS添加血清培地
に１×103個／mlの細胞濃度で浮遊させ、５cmシ
ヤーレにその５mlを取り、37℃で５％炭酸ガス及
び95％空気のインキユベーター内で３週間培養し
た。その後生育したクローン90個を１つずつ96ウ
エプレート（ヌンク社）（１ウエルにつき200μ
の培地）に取り出し、寒天を含まない上記血清培
地中で、同様にして２週間培養した。抗体産生能
のない株を選択する目的から、各ウエルの培養上
清をとりエンザイムイムノアツセイ（カツペル
社）によりその上清中の抗体量の測定を行つた。
その結果抗体の全く検出されなかつた細胞株７株
を選び、96ウエル中で十分に増殖させた。増殖し
た細胞株をそれぞれ24ウエル（１ウエルにつき
1.5mlの培地）、５cmシヤーレ（１枚につき５mlの
培地）の順に用いて培養液量を増加していき、約
５×106細胞ずつを得た。それぞれの株について
３×104細胞を残し、他の細胞を、新しく調製し
た上記血清培地15mlに浮遊させ、−５℃で凍結後
室温で融解するという凍結・融解操作を２回繰り
返し細胞を死滅させた。この死滅細胞を含む培地
５mlを３枚の５cmシヤーレに移し、死滅させずに
残しておいた細胞をそれぞれ１×104細胞ずつ移
植した。上記と同様に５日間培養すると大部分の
細胞は死滅するが、その中の生き残つた細胞を遠
心により集めそれぞれの株について、96ウエルプ
レート３０ウエルに移植した。４〜６日ごとに培
地を交換しつつ３週間培養した結果、増殖のみら
れた株は上記７株中２株についてであつた。２株
について、増殖速度の速い５個ずつのウエルの細
胞を上記の順に培養液量を増加し、それぞれ約１
×106細胞を得た。それぞれの細胞を別々に遠沈
により集め、１回DMEで洗い、無血清培地
（ITES培地、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79巻、
1158―1162頁、1982年）５mlにそれぞれ浮遊させ
た。上記と同様に４週間、４〜６日ごとに培地を
換え培養した。この無血清培地での培養で増殖速
度の早いものから３種類の細胞を選び、十分に増
殖させて約１×107個ずつの細胞を得た。これら
をそれぞれ3μg／mlの６―チオグアニンを含む上
記血清培地10mlに浮遊させ、４日ごとに培地を交
換しつつ４週間培養した。その後生存細胞を取り
出し、30μg／mlの６―チオグアニンを含む同一
培地に１×105個／ml濃度となるように浮遊させ、
上記と同様に４週間培養した。このようにして６
―チオグアニン耐性株を得た。この株をNAT―
30と命名した。 NAT―30細胞の亜株は、NAT―30細胞を0.25
％寒天を含む培地（30μg／mlの６―チオグアニ
ンおよび10％FCS添加DME）に103個／mlの細胞
濃度で浮遊させ、37℃の５％炭酸ガスインキユベ
ーター内で３週間培養した。その間に増殖したク
ローンのうち生育の一番よかつたクローンを選び
これをNAT30―８と命名した。NAT―30およ
びNAT30―８は30μ／mlの６―チオグアニン
を含む上記血清培地で継代培養をする。融合に用
いる10日前から培地を６―チオグアニン無添加の
血清培地に換え更に融合２日前から毎日培地を半
分ずつ新しい培地と交換して培養した。 ハイブリドーマの作成 上記NAT―30またはNAT30―８細胞の３×
107個と上記ヒト抗体産生リンパ球細胞３〜10×
107個とを細胞融合に用いた。各細胞をDMEで２
回洗浄し、50mlの遠心管中で混合し、1200rpmで
７分間遠沈した。上清を完全に除去し、得られた
細胞ペレツトに、あらかじめ37℃に加温した42.5
％ポリエチレングリコール（平均分子量1500）及
び15％ジメチルスルホキシド添加DMEの１mlを
１分間かけ少しずつ加えた。更に、１分間37℃で
放置した後、あらかじめ37℃に加温しておいた
DMEを５分間かけ徐々に９ml加えた。1500rpm
で10分間遠沈し、上清を除去した。得られた細胞
ペレツトに15％FCS添加DME100mlを加えて、96
ウエルプレートに夫々100μずつ分注した。24
時間後、２倍濃度のHAT培地（上記15％FCS培
地にヒポキサンチン２×10-4M、アミノプテリン
２×10-7M及びチミジン3.2×10-5Mを添加した
培地）100μを各ウエルに加えた。以後４日ご
とに培地の半分を捨て、HAT培地100μを各ウ
エルに加える操作を繰り返し、４―６週間７％酸
素、５％炭酸ガスを含むインキユベーター内で37
℃で培養した。この間に増殖したハイブリドーマ
については、更に１週間HT培地（HAT培地か
らアミノプテリンを除いた培地）で培養した後、
無血清及び血清培地で培養した。 なお、ハイブリドーマは、現在７か月を経てい
るが、依然として安定に抗体を産生している。 間接蛍光抗体法 特異性の判定は以下のような方法を用いた。 96ウエルプレート又は組織培養用チエンバー
（ラブ−テツク社）にガン細胞及び正常二倍体細
胞を１〜５日間37℃の５％炭酸ガスインキユベー
ター中で培養し付着させた。培養後、0.05％グル
タルアルデヒド又は４％ホルムアルデヒドで固定
する。固定後、リン酸緩衝化生理食塩水（以下、
PBSという）で３回洗浄し、３％牛血清アルブ
ミンを含むPBSを加え室温で30分間放置する。
放置後、PBSで５回洗浄し、ハイブリドーマの
増殖しているウエルの培地を100μずつ加え、
37℃、５％炭酸ガスインキユベーター中で30分間
放置する。この後、PBSで５回洗浄し、蛍光標
識（FITC）したヤギのヒト抗体に対する抗体
（例えば和光純薬社、タゴ社）を20〜50倍にPBS
で希釈し加え、37℃、５％炭酸ガスインキユベー
ター中で30分間放置する。放置後、PBSで５回
洗浄し、直に蛍光顕微鏡で観察した。判定として
は、特異的な蛍光が50％以上の細胞に認められる
場合がとし、25―50％の場合がとし、25％以
下の場合が＋とし、特異的な蛍光が認められない
場合及びほとんど見当らない場合が−とした。 表―１はハイブリドーマを血清培地中で培養
し、産生された単クローン性抗体の特異性を調べ
たものである。表―１に示したようにHyb―10―
７は肺ガン細胞株であるPC−８と特に強く反応
し、他の肺ガン細胞株であるQG―56及びQG―
90とも反応した。その他のガン細胞株とはほとん
ど反応しなかつた。正常２倍体細胞とは反応しな
かつた。Hyb―４―７については肺ガン細胞株で
あるPC―８、QG―56及びQG―90と強く反応し
他の細胞とは反応しなかつた。Hyb―10―７及び
Hyb―４―７については、肺ガンの初代培養細胞
とも反応した。 Hyb―S60、Hyb―７及びHyb―９については
すべての細胞について全く反応しなかつた。 実施例 ２ 実施例１のハイブリドーマを無血清培地で培養
しその培地について実施例１に記載した特異性の
判定を行つた。 なお、無血清培地の組成は、インシユリン
10μg／ml、ラクトフエリン25μg／ml、エタノー
ルアミン10μM及びセレニウム2.5×10-8Mの４成
分を含むDMEである。 表―２から明らかなように無血清培地で培養し
てもそれぞれの単クローン性抗体の特異性は何ら
変化しない。
【表】
【表】
実施例 ３
Hyb―10―７を血清及び無血清培地でそれぞれ
１ずつ培養し、その単クローン性抗体の精製を
行つた。 表―３に示したように、無血清培地で培養した
場合には０―50％飽和硫安分画及びSepharose
CL―4B（フアルマシア社）によるゲル濾過のみ
により高純度の単クローン性抗体が製造出来た。
１ずつ培養し、その単クローン性抗体の精製を
行つた。 表―３に示したように、無血清培地で培養した
場合には０―50％飽和硫安分画及びSepharose
CL―4B（フアルマシア社）によるゲル濾過のみ
により高純度の単クローン性抗体が製造出来た。
【表】
発明の効果
肺ガン細胞に特異的に反応するヒト単クローン
性抗体を産生するヒト―ヒトハイブリドーマを作
成することが出来た。また、このハイブリドーマ
は、無血清培地中で抗体を産生し得ることから、
容易に安価で高純度の抗体を得ることが出来た。 このような肺ガン特異ヒト単クローン性抗体の
製造は、ガンの免疫学的研究、臨床診断、免疫治
療等の医学的分野での応用やガン特異抗原の精製
手段としての利用に役立つものと思われる。
性抗体を産生するヒト―ヒトハイブリドーマを作
成することが出来た。また、このハイブリドーマ
は、無血清培地中で抗体を産生し得ることから、
容易に安価で高純度の抗体を得ることが出来た。 このような肺ガン特異ヒト単クローン性抗体の
製造は、ガンの免疫学的研究、臨床診断、免疫治
療等の医学的分野での応用やガン特異抗原の精製
手段としての利用に役立つものと思われる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 肺ガン患者の抗体産生細胞と、ヒト腫瘍細胞
株からの細胞との融合によつて形成されたハイブ
リドーマによつて産生され、間接蛍光抗体法で測
定したとき、次の(イ)(ロ)(ハ)の反応を示すヒト単クロ
ーン性抗肺ガン細胞抗体。 (イ) 肺ガン細胞に対し、特異な蛍光が認められ
る。 (ロ) 胃ガン、腎臓ガン、メラノーマおよび膀胱ガ
ンの細胞に対し、特異的な蛍光が認められな
い。 (ハ) 正常細胞に対し反応せず、特異的な蛍光が認
められない。 ２ ヒト腫瘍細胞株からの細胞が、ヒトバーキツ
トリンパ腫細胞であるナマルバ細胞のヒポキサン
チン―グアニン―ホスホリボシルトランスフエラ
ーゼ欠損突然変異細胞である特許請求の範囲第１
項記載のヒト単クローン性抗肺ガン細胞抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15422084A JPS6133125A (ja) | 1984-07-25 | 1984-07-25 | ヒト単クロ−ン性抗肺ガン細胞抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15422084A JPS6133125A (ja) | 1984-07-25 | 1984-07-25 | ヒト単クロ−ン性抗肺ガン細胞抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6133125A JPS6133125A (ja) | 1986-02-17 |
| JPH0429357B2 true JPH0429357B2 (ja) | 1992-05-18 |
Family
ID=15579468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15422084A Granted JPS6133125A (ja) | 1984-07-25 | 1984-07-25 | ヒト単クロ−ン性抗肺ガン細胞抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6133125A (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ198851A (en) * | 1980-11-07 | 1984-07-31 | Wistar Inst | Stable,continuous human myeloma cell line capable of hybridisation with antibody-producing cells:production of hybrid cell line |
| JPS58201994A (ja) * | 1982-05-21 | 1983-11-25 | Hideaki Hagiwara | 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法 |
| JPS58216125A (ja) * | 1982-06-09 | 1983-12-15 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ヒト抗体の産生方法 |
-
1984
- 1984-07-25 JP JP15422084A patent/JPS6133125A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6133125A (ja) | 1986-02-17 |
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