JPH04297870A - 抗ユビキチン抗体の定量法 - Google Patents
抗ユビキチン抗体の定量法Info
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- JPH04297870A JPH04297870A JP3591191A JP3591191A JPH04297870A JP H04297870 A JPH04297870 A JP H04297870A JP 3591191 A JP3591191 A JP 3591191A JP 3591191 A JP3591191 A JP 3591191A JP H04297870 A JPH04297870 A JP H04297870A
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- ubiquitin
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
- G01N2800/104—Lupus erythematosus [SLE]
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【従来の技術】全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は全
身性の多臓器障害性炎症疾患である。その原因は明らか
でないが、非感染性、非腫瘍性の疾患で慢性に経過する
難病である。血清学的には抗核抗体をはじめとする各種
自己抗体が検出され、細胞性免疫を含めた免疫異常が観
察される。全身性エリテマトーデスの診断法としては、
患者血清中の自己抗体、特に抗ＤＮＡ抗体を測定定量す
る方法が開発利用されている。しかしながら、この方法
では全身性エリテマトーデス患者の約半数が検出される
程度であり、高感度な臨床診断法とはなっていない。ま
た、全身性エリテマトーデス患者血清中に高頻度に出現
する自己抗体、抗ユビキチン抗体を、ユビキチンを抗原
蛋白質として用いた酵素免疫測定法で測定する方法〔ミ
ューラー（Ｍｕｌｌｅｒ）ら：プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） ＵＳ
Ａ， ８５， ８１７６（１９８８）〕が知られている
。しかしながら、ポリユビキチン蛋白質を抗原蛋白質と
して利用することができるという開示も示唆もその文献
にはない。
身性の多臓器障害性炎症疾患である。その原因は明らか
でないが、非感染性、非腫瘍性の疾患で慢性に経過する
難病である。血清学的には抗核抗体をはじめとする各種
自己抗体が検出され、細胞性免疫を含めた免疫異常が観
察される。全身性エリテマトーデスの診断法としては、
患者血清中の自己抗体、特に抗ＤＮＡ抗体を測定定量す
る方法が開発利用されている。しかしながら、この方法
では全身性エリテマトーデス患者の約半数が検出される
程度であり、高感度な臨床診断法とはなっていない。ま
た、全身性エリテマトーデス患者血清中に高頻度に出現
する自己抗体、抗ユビキチン抗体を、ユビキチンを抗原
蛋白質として用いた酵素免疫測定法で測定する方法〔ミ
ューラー（Ｍｕｌｌｅｒ）ら：プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） ＵＳ
Ａ， ８５， ８１７６（１９８８）〕が知られている
。しかしながら、ポリユビキチン蛋白質を抗原蛋白質と
して利用することができるという開示も示唆もその文献
にはない。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、全身
性エリテマトーデス患者の血清中により高頻度に出現す
る自己抗体、抗ユビキチン抗体を高感度に検出すること
によって、全身性エリテマトーデス患者をより高感度に
検出する診断法を開発することにある。
性エリテマトーデス患者の血清中により高頻度に出現す
る自己抗体、抗ユビキチン抗体を高感度に検出すること
によって、全身性エリテマトーデス患者をより高感度に
検出する診断法を開発することにある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、配列番
号１に示されるペプチド配列を３個含有してなる固相化
ポリペプチドに、検体中の抗ユビキチン抗体を結合させ
、ついで標識物質で標識された抗ヒトイムノグロブリン
特異的抗体を該結合した抗ユビキチン抗体に結合させ、
結合した抗ヒトイムノグロブリン特異的抗体の標識物質
を定量することにより検体中の抗ユビキチン抗体を定量
する方法および定量用キットを提供することができる。
号１に示されるペプチド配列を３個含有してなる固相化
ポリペプチドに、検体中の抗ユビキチン抗体を結合させ
、ついで標識物質で標識された抗ヒトイムノグロブリン
特異的抗体を該結合した抗ユビキチン抗体に結合させ、
結合した抗ヒトイムノグロブリン特異的抗体の標識物質
を定量することにより検体中の抗ユビキチン抗体を定量
する方法および定量用キットを提供することができる。
【０００４】以下に本発明を詳細に説明する。
（１） 配列番号１に示されるペプチド配列を３個含
有してなるポリペプチド（以下、ポリユビキチンという
。）蛋白質の取得ポリユビキチン蛋白質は組換えＤＮＡ
技法を用いて下記のごとく取得することができる。
有してなるポリペプチド（以下、ポリユビキチンという
。）蛋白質の取得ポリユビキチン蛋白質は組換えＤＮＡ
技法を用いて下記のごとく取得することができる。
【０００５】ヒト赤芽球系細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２４３）細胞懸濁液から遠心分離により細胞を
集め、チオシアン酸グアニジンを含む溶液に可溶化する
。 次いでＣｓＣｌ溶液層に重層し、超遠心分離後、沈澱物
として全細胞質ＲＮＡを得る。またチオシアン酸グアニ
ジン可溶化物にＬｉＣｌを加えてＲＮＡのみを沈澱回収
することもできる。Ｋ５６２株はプロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） Ｕ
ＳＡ， ７６， １２９３（１９７９）、ブラッド（Ｂ
ｌｏｏｄ）， ４５， ３２１ （１９７５）などに記
載されている公知の細胞株で一般的に入手可能な細胞株
である。
ＣＣＬ２４３）細胞懸濁液から遠心分離により細胞を
集め、チオシアン酸グアニジンを含む溶液に可溶化する
。 次いでＣｓＣｌ溶液層に重層し、超遠心分離後、沈澱物
として全細胞質ＲＮＡを得る。またチオシアン酸グアニ
ジン可溶化物にＬｉＣｌを加えてＲＮＡのみを沈澱回収
することもできる。Ｋ５６２株はプロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） Ｕ
ＳＡ， ７６， １２９３（１９７９）、ブラッド（Ｂ
ｌｏｏｄ）， ４５， ３２１ （１９７５）などに記
載されている公知の細胞株で一般的に入手可能な細胞株
である。
【０００６】得られたＲＮＡをＮａＣｌまたはＫＣｌの
高塩濃度（たとえば０． ５Ｍ）溶液に溶解し、オリゴ
（ｄＴ）セルロースのカラムに通塔してポリアデニル酸
〔以下、ポリ（Ａ）という〕を有するｍＲＮＡをカラム
に吸着させる。水あるいは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポリ（
Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。
高塩濃度（たとえば０． ５Ｍ）溶液に溶解し、オリゴ
（ｄＴ）セルロースのカラムに通塔してポリアデニル酸
〔以下、ポリ（Ａ）という〕を有するｍＲＮＡをカラム
に吸着させる。水あるいは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポリ（
Ａ）を有するｍＲＮＡを単離する。
【０００７】以下、オカヤマ−バーグの方法〔Ｏｋａｙ
ａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ：モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジィ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）
，２ ， １６１（１９８２）〕に従い、ｃＤＮＡの
合成および、そのベクターへの組み込みを行う。まず、
ベクタープライマーを合成する。ベクターとしてはたと
えばｐｃＤＶ１を適当な溶液、たとえば１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５） 、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２ および１０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液の中でＫ
ｐｎＩで処理し、ｐｃＤＶ１のＫｐｎＩ部位を切断する
。このＤＮＡをたとえば３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ６．８）、１４０ｍＭ カコジル酸ナト
リウム、１ｍＭＣｏＣｌ２ 、０．１ｍＭ ジチオス
レイトール（以下、ＤＴＴという）および０．２５ｍＭ
デオキシチアミン三リン酸（以下、ｄＴＴＰという
）からなる溶液中、ターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ（以下、ＴｄＴという）とともに一
定温度（たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分
間）インキュベートし、ベクターＤＮＡの両３’ 末端
に６０個前後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤ
ＮＡをたとえば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（
ｐＨ７．５）、 ６ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む溶液中ＥｃｏＲＩで切断後、低融
点アガロースゲル電気泳動〔ラース・ウイスランダー（
Ｌａｒｓ Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ ）：アナリティカル
・バイオケミストリィ（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．
）， ９８， ３０５ （１９７９）， 以下ＬＧＴ法
という〕にて分画し、約３．１キロベースの断片を回収
する。次いで該ＤＮＡをＮａＣｌまたはＫＣｌの高塩濃
度（たとえば０． ５Ｍ）溶液に溶解し、ポリデオキシ
アデニル酸セルロースカラムに通塔してポリチミジル酸
〔以下、ポリ（Ｔ）という〕を有するベクタープライマ
ー分子のみをカラムに吸着させる。水あるいは１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液のような低塩濃度溶液を用
いて溶出し、ポリ（Ｔ）の付加したベクタープライマー
分子のみを単離する。
ａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ：モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジィ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）
，２ ， １６１（１９８２）〕に従い、ｃＤＮＡの
合成および、そのベクターへの組み込みを行う。まず、
ベクタープライマーを合成する。ベクターとしてはたと
えばｐｃＤＶ１を適当な溶液、たとえば１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５） 、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２ および１０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液の中でＫ
ｐｎＩで処理し、ｐｃＤＶ１のＫｐｎＩ部位を切断する
。このＤＮＡをたとえば３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ６．８）、１４０ｍＭ カコジル酸ナト
リウム、１ｍＭＣｏＣｌ２ 、０．１ｍＭ ジチオス
レイトール（以下、ＤＴＴという）および０．２５ｍＭ
デオキシチアミン三リン酸（以下、ｄＴＴＰという
）からなる溶液中、ターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼ（以下、ＴｄＴという）とともに一
定温度（たとえば３７℃）で一定時間（たとえば２０分
間）インキュベートし、ベクターＤＮＡの両３’ 末端
に６０個前後のチミジル残基を付加する。さらにこのＤ
ＮＡをたとえば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（
ｐＨ７．５）、 ６ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む溶液中ＥｃｏＲＩで切断後、低融
点アガロースゲル電気泳動〔ラース・ウイスランダー（
Ｌａｒｓ Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ ）：アナリティカル
・バイオケミストリィ（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．
）， ９８， ３０５ （１９７９）， 以下ＬＧＴ法
という〕にて分画し、約３．１キロベースの断片を回収
する。次いで該ＤＮＡをＮａＣｌまたはＫＣｌの高塩濃
度（たとえば０． ５Ｍ）溶液に溶解し、ポリデオキシ
アデニル酸セルロースカラムに通塔してポリチミジル酸
〔以下、ポリ（Ｔ）という〕を有するベクタープライマ
ー分子のみをカラムに吸着させる。水あるいは１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液のような低塩濃度溶液を用
いて溶出し、ポリ（Ｔ）の付加したベクタープライマー
分子のみを単離する。
【０００８】次にリンカーＤＮＡを合成する。たとえば
ｐＬ１ＤＮＡを適当な溶液、たとえば１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２ 、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液中でＰｓｔＩ
で処理し、ｐＬ１のＰｓｔＩ部位を切断する。このＤＮ
Ａを、ｄＴＴＰの代わりにデオキシグアノシン５’−三
リン酸（以下、ｄＧＴＰという）を加える以外はベクタ
ープライマー合成の場合と同様に処理し、１５個前後の
オリゴｄＧ鎖を付加する。該ＤＮＡを適当な溶液たとえ
ば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ および６０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む溶液中でＨｉｎｄ ＩＩＩにて切断する。アガロ
ースゲル電気泳動にて約０． ５キロベースのＤＮＡ断
片を分画し、ＤＥＡＥペーパーにて回収する。このよう
にしてリンカーＤＮＡを得る。
ｐＬ１ＤＮＡを適当な溶液、たとえば１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２ 、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液中でＰｓｔＩ
で処理し、ｐＬ１のＰｓｔＩ部位を切断する。このＤＮ
Ａを、ｄＴＴＰの代わりにデオキシグアノシン５’−三
リン酸（以下、ｄＧＴＰという）を加える以外はベクタ
ープライマー合成の場合と同様に処理し、１５個前後の
オリゴｄＧ鎖を付加する。該ＤＮＡを適当な溶液たとえ
ば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ および６０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む溶液中でＨｉｎｄ ＩＩＩにて切断する。アガロ
ースゲル電気泳動にて約０． ５キロベースのＤＮＡ断
片を分画し、ＤＥＡＥペーパーにて回収する。このよう
にしてリンカーＤＮＡを得る。
【０００９】以上のようにして得たポリ（Ａ）ＲＮＡ、
ベクタープライマー、リンカーＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ
合成を行う。ポリ（Ａ）ＲＮＡ、ベクタープライマーＤ
ＮＡをたとえば５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（
ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、３０ｍＭ
ＫＣｌ、０．３ｍＭ ＤＴＴ、デオキシアデノシン５
’−三リン酸（以下、ｄＡＴＰという）、ｄＴＴＰ、デ
オキシシチジン５’−三リン酸（以下、ｄＣＴＰという
）およびｄＧＴＰ（たとえば各々２ｍＭ）を含む溶液中
、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７℃）、一定時間
（たとえば４０分間）反応させる。こうして得たＲＮＡ
−ＤＮＡ二重鎖の３’ 末端に、ｄＴＴＰがｄＣＴＰに
変わる以外はベクタープライマーにｄＴ鎖を付加した条
件と同様の操作でオリゴｄＣ鎖を１５個前後付加する。 このＤＮＡをたとえば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ および６
０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液中ＨｉｎｄＩＩＩ で切
断する。このＤＮＡに、先に調製したリンカーＤＮＡを
混合し、たとえは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１０ｍＭ（
ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 、０．１Ｍ ＫＣｌおよび０
．１ｍＭ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（β−ＮＡＤ）を含む溶液中、大腸菌ＤＮＡリガーゼ
とともに一定時間（たとえば１６時間）、一定温度（た
とえば１２℃）でインキュベートする。こうしてｃＤＮ
ＡとリンカーＤＮＡとの環状化が行われる。この反応液
にｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各々、終
濃度４０μＭとなるよう加え、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌リボヌクレアーゼ
Ｈ（ＲＮａｓｅ）を加え、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換す
ることにより、完全な二重鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラ
スミドを得る。
ベクタープライマー、リンカーＤＮＡを用い、ｃＤＮＡ
合成を行う。ポリ（Ａ）ＲＮＡ、ベクタープライマーＤ
ＮＡをたとえば５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（
ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、３０ｍＭ
ＫＣｌ、０．３ｍＭ ＤＴＴ、デオキシアデノシン５
’−三リン酸（以下、ｄＡＴＰという）、ｄＴＴＰ、デ
オキシシチジン５’−三リン酸（以下、ｄＣＴＰという
）およびｄＧＴＰ（たとえば各々２ｍＭ）を含む溶液中
、逆転写酵素を一定温度（たとえば３７℃）、一定時間
（たとえば４０分間）反応させる。こうして得たＲＮＡ
−ＤＮＡ二重鎖の３’ 末端に、ｄＴＴＰがｄＣＴＰに
変わる以外はベクタープライマーにｄＴ鎖を付加した条
件と同様の操作でオリゴｄＣ鎖を１５個前後付加する。 このＤＮＡをたとえば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ および６
０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液中ＨｉｎｄＩＩＩ で切
断する。このＤＮＡに、先に調製したリンカーＤＮＡを
混合し、たとえは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１０ｍＭ（
ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 、０．１Ｍ ＫＣｌおよび０
．１ｍＭ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（β−ＮＡＤ）を含む溶液中、大腸菌ＤＮＡリガーゼ
とともに一定時間（たとえば１６時間）、一定温度（た
とえば１２℃）でインキュベートする。こうしてｃＤＮ
ＡとリンカーＤＮＡとの環状化が行われる。この反応液
にｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを各々、終
濃度４０μＭとなるよう加え、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌リボヌクレアーゼ
Ｈ（ＲＮａｓｅ）を加え、ＲＮＡ部分をＤＮＡに変換す
ることにより、完全な二重鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラ
スミドを得る。
【００１０】こうして得られた組換えプラスミドを用い
大腸菌、例えば大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株〔カメロン（Ｃ
ａｍｅｒｏｎ ）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） ＵＳＡ． ７
２ ， ３４１６（１９７５）〕を、たとえばスコット
（Ｓｃｏｔｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学， ２，
６１６（１９８３）〕により形質転換する。上記で得
られた組換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性遺伝
子が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシリン
耐性を示す。
大腸菌、例えば大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株〔カメロン（Ｃ
ａｍｅｒｏｎ ）ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） ＵＳＡ． ７
２ ， ３４１６（１９７５）〕を、たとえばスコット
（Ｓｃｏｔｔ）らの方法〔重定勝哉：細胞工学， ２，
６１６（１９８３）〕により形質転換する。上記で得
られた組換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性遺伝
子が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシリン
耐性を示す。
【００１１】アンピシリン耐性（以下Ａｐｒ という）
菌株からポリユビキチンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子
を持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡを保有する菌株を
選択するには、一般的に用いられている以下の手法を用
いることができる。すなわち、上記で得られた形質転換
株をニトロセルロースフィルター上に固定し、ヒトユビ
キチンのアミノ酸配列より予想されるＤＮＡ配列を有す
る合成ＤＮＡプローブと会合させ、強く会合するものを
選択する〔グルンステイン−ホフネス（Ｇｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ ）の方法：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．）
ＵＳＡ， ７２， ３９６１ （１９７５）〕。プロ
ーブＤＮＡは通常のトリエステル法〔ア−ル・クレア（
Ｒ． Ｃｒｅａ ）ら：プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） ＵＳＡ，
７５， ５７６５ （１９７８）〕で合成される。合
成ＤＮＡによる選択はサザン（ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ）
らの方法〔ジャーナル・モレキュラー・バイオロジィ（
Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ）， ９８， ５０３
（１９７５）〕によってさらに確実にできる。合成ＤＮ
Ａと強く会合した菌株からプラスミドを回収し、その翻
訳領域の全塩基配列をＭ１３ファージを用いたディデオ
キシ・シークエンス法〔ジェイ・メシング（Ｊ． Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）ら：ジーン（Ｇｅｎｅ）， １９， ２６
９ （１９８５）〕により決定し、ポリユビキチンをコ
ードしているｃＤＮＡを得る。
菌株からポリユビキチンｍＲＮＡに相補性を示す遺伝子
を持つ新規組換え体プラスミドＤＮＡを保有する菌株を
選択するには、一般的に用いられている以下の手法を用
いることができる。すなわち、上記で得られた形質転換
株をニトロセルロースフィルター上に固定し、ヒトユビ
キチンのアミノ酸配列より予想されるＤＮＡ配列を有す
る合成ＤＮＡプローブと会合させ、強く会合するものを
選択する〔グルンステイン−ホフネス（Ｇｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓ ）の方法：プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．）
ＵＳＡ， ７２， ３９６１ （１９７５）〕。プロ
ーブＤＮＡは通常のトリエステル法〔ア−ル・クレア（
Ｒ． Ｃｒｅａ ）ら：プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） ＵＳＡ，
７５， ５７６５ （１９７８）〕で合成される。合
成ＤＮＡによる選択はサザン（ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ）
らの方法〔ジャーナル・モレキュラー・バイオロジィ（
Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ）， ９８， ５０３
（１９７５）〕によってさらに確実にできる。合成ＤＮ
Ａと強く会合した菌株からプラスミドを回収し、その翻
訳領域の全塩基配列をＭ１３ファージを用いたディデオ
キシ・シークエンス法〔ジェイ・メシング（Ｊ． Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）ら：ジーン（Ｇｅｎｅ）， １９， ２６
９ （１９８５）〕により決定し、ポリユビキチンをコ
ードしているｃＤＮＡを得る。
【００１２】ポリユビキチンの発現は、該ポリペプチド
をコードするＤＮＡ断片をＤＮＡの発現機能を持つ適当
なプラスミドに組み込むことにより行うことができる。 用いるポリユビキチンｃＤＮＡとしては、ポリユビキチ
ンをコードしているものであればいかなるものも用いる
ことができる。好適な例として、ポリユビキチンをコー
ドするｍＲＮＡから組換えＤＮＡ技術で逆転写して得ら
れるｃＤＮＡ（上記で調製した配列番号１０に示したｃ
ＤＮＡ）、または、染色体ＤＮＡから得られるポリユビ
キチンをコードするＤＮＡなどが挙げられる。具体的に
は本発明者らにより製造されたｐＬＧＣ１５を用いるこ
とができる。ｐＬＧＣ１５の製造法は実施例に記載され
ている。
をコードするＤＮＡ断片をＤＮＡの発現機能を持つ適当
なプラスミドに組み込むことにより行うことができる。 用いるポリユビキチンｃＤＮＡとしては、ポリユビキチ
ンをコードしているものであればいかなるものも用いる
ことができる。好適な例として、ポリユビキチンをコー
ドするｍＲＮＡから組換えＤＮＡ技術で逆転写して得ら
れるｃＤＮＡ（上記で調製した配列番号１０に示したｃ
ＤＮＡ）、または、染色体ＤＮＡから得られるポリユビ
キチンをコードするＤＮＡなどが挙げられる。具体的に
は本発明者らにより製造されたｐＬＧＣ１５を用いるこ
とができる。ｐＬＧＣ１５の製造法は実施例に記載され
ている。
【００１３】ポリユビキチンをコードするＤＮＡを組み
込むプラスミドとしては、大腸菌または動物細胞で該Ｄ
ＮＡが発現できるものならいかなるプラスミドも用いる
ことができる。好ましくは、適当なプロモーター、例え
ば、ｔｒｐ系、ｌａｃ系のプロモーターの下流に外来Ｄ
ＮＡを挿入することができ、しかもシャイン−ダルガー
ノ配列と開始コドン（ＡＴＧ）の間を適当な距離、例え
ば６〜１８塩基対に調製したプラスミドが用いられる。 具体的に好適なプラスミドとしては、本発明者らによっ
て造成されたｐＫＹＰ１０、ｐＫＹＰ１１、ｐＫＹＰ１
２（特開昭５８−１１０６００）などがあげられる。
込むプラスミドとしては、大腸菌または動物細胞で該Ｄ
ＮＡが発現できるものならいかなるプラスミドも用いる
ことができる。好ましくは、適当なプロモーター、例え
ば、ｔｒｐ系、ｌａｃ系のプロモーターの下流に外来Ｄ
ＮＡを挿入することができ、しかもシャイン−ダルガー
ノ配列と開始コドン（ＡＴＧ）の間を適当な距離、例え
ば６〜１８塩基対に調製したプラスミドが用いられる。 具体的に好適なプラスミドとしては、本発明者らによっ
て造成されたｐＫＹＰ１０、ｐＫＹＰ１１、ｐＫＹＰ１
２（特開昭５８−１１０６００）などがあげられる。
【００１４】ポリユビキチンｃＤＮＡとしてはｐＬＧＣ
１５を、該ｃＤＮＡを組み込むためのプラスミドとして
はｐＫＹＰ１０を用い、ポリユビキチンをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを造成する例を以
下に述べる。図１に示したようにｐＬＧＣ１５をＸｈｏ
Ｉで切断した後、ＬＧＴ法にて約１． ３ＫｂのＤＮＡ
断片を精製する。また、ｐＵＣ１９〔シー・ヤニッシュ
・ペロン（Ｃ． Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）ら：
ジーン（Ｇｅｎｅ）， ３３， １０３ （１９８５）
〕をＳａｌＩで切断した後、ＬＧＴ法にて約２． ７Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製する。このようにして得たＤＮＡ
断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、ｐＬＧＣ：Ｓ
ｃ１１を得る。さらに図２に示したように、ｐＬＧＣ：
Ｓｃ１１をＢｇｌ ＩＩ で部分分解し、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ・クレノー断片（以下クレノー断片という）で
処理した後、ＢａｍＨＩで切断し、ＬＧＴ法にて約９５
０ｂｐのＤＮＡ断片を精製する。また、ｐＧＥＬ１〔関
根ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミィ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） ＵＳＡ， ８２， ４３０６
（１９８５）〕をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩ
ＩおよびＰｓｔＩで切断し、ＬＧＴ法にて約１． ７Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製する。別に、ｐＫＹＰ１０をＰｓ
ｔＩとＢａｎＩＩＩ で切断し、ＬＧＴ法にて約１．
１ＫｂのＤＮＡ断片を精製する。このようにして得た
ＤＮＡ断片と図２に示した合成ＤＮＡ〔開始コドン（Ａ
ＴＧ）から２番目のアミノ酸であるグルタミン（Ｇｌｎ
）をコードするトリプレット（ＣＡＧ）の２番目の塩基
（ＣＡ）までを含む〕をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合
し、ｐＬＧＣ−ｘ１を得る。図１および図２中のＵＬ−
Ｃは配列番号１０で示されるＤＮＡ領域である。
１５を、該ｃＤＮＡを組み込むためのプラスミドとして
はｐＫＹＰ１０を用い、ポリユビキチンをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体プラスミドを造成する例を以
下に述べる。図１に示したようにｐＬＧＣ１５をＸｈｏ
Ｉで切断した後、ＬＧＴ法にて約１． ３ＫｂのＤＮＡ
断片を精製する。また、ｐＵＣ１９〔シー・ヤニッシュ
・ペロン（Ｃ． Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）ら：
ジーン（Ｇｅｎｅ）， ３３， １０３ （１９８５）
〕をＳａｌＩで切断した後、ＬＧＴ法にて約２． ７Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製する。このようにして得たＤＮＡ
断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、ｐＬＧＣ：Ｓ
ｃ１１を得る。さらに図２に示したように、ｐＬＧＣ：
Ｓｃ１１をＢｇｌ ＩＩ で部分分解し、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ・クレノー断片（以下クレノー断片という）で
処理した後、ＢａｍＨＩで切断し、ＬＧＴ法にて約９５
０ｂｐのＤＮＡ断片を精製する。また、ｐＧＥＬ１〔関
根ら：プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミィ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） ＵＳＡ， ８２， ４３０６
（１９８５）〕をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩ
ＩおよびＰｓｔＩで切断し、ＬＧＴ法にて約１． ７Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製する。別に、ｐＫＹＰ１０をＰｓ
ｔＩとＢａｎＩＩＩ で切断し、ＬＧＴ法にて約１．
１ＫｂのＤＮＡ断片を精製する。このようにして得た
ＤＮＡ断片と図２に示した合成ＤＮＡ〔開始コドン（Ａ
ＴＧ）から２番目のアミノ酸であるグルタミン（Ｇｌｎ
）をコードするトリプレット（ＣＡＧ）の２番目の塩基
（ＣＡ）までを含む〕をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合
し、ｐＬＧＣ−ｘ１を得る。図１および図２中のＵＬ−
Ｃは配列番号１０で示されるＤＮＡ領域である。
【００１５】上記組換え技法における反応条件は、一般
的に下記のとおりである。ＤＮＡの制限酵素による消化
反応は通常０． １〜２０μｇのＤＮＡを２〜２００ｍ
Ｍ（好ましくは１０〜４０ｍＭ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ６． ０〜９． ５好ましくはｐＨ７． ０〜
８． ０）、０〜２００ｍＭ ＮａＣｌおよび２〜２
０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣｌ２ を含
む反応溶液中で、制限酵素０． １〜１００単位（好ま
しくは１μｇのＤＮＡに対して１〜３単位）を用い、２
０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素により異なる）
において、１５〜２４時間行う。反応停止は、通常５５
〜７５℃で、５〜３０分間加熱することによるが、フェ
ノールまたはジエチルピロカーボネートなどの試薬によ
り制限酵素を失活させる方法も用いることができる。
的に下記のとおりである。ＤＮＡの制限酵素による消化
反応は通常０． １〜２０μｇのＤＮＡを２〜２００ｍ
Ｍ（好ましくは１０〜４０ｍＭ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ６． ０〜９． ５好ましくはｐＨ７． ０〜
８． ０）、０〜２００ｍＭ ＮａＣｌおよび２〜２
０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇＣｌ２ を含
む反応溶液中で、制限酵素０． １〜１００単位（好ま
しくは１μｇのＤＮＡに対して１〜３単位）を用い、２
０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素により異なる）
において、１５〜２４時間行う。反応停止は、通常５５
〜７５℃で、５〜３０分間加熱することによるが、フェ
ノールまたはジエチルピロカーボネートなどの試薬によ
り制限酵素を失活させる方法も用いることができる。
【００１６】制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の
精製は、前記ＬＧＴ法やポリアクリルアミドゲル電気泳
動などによって行う。ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２
００ｍＭ（好ましくは１０〜４０ｍＭ）Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ６． １〜９． ５、好ましくはｐＨ７
． ０〜８． ０）、２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜１
０ｍＭ）ＭｇＣｌ２ 、０． １〜１０ｍＭ（好ましく
は０． ５〜２． ０ｍＭ）ＡＴＰおよび１〜５０ｍＭ
（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＤＴＴを含む反応液中で
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０． ３〜１００単位を用い、１
〜３７℃（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時
間（好ましくは２〜２０時間）行う。
精製は、前記ＬＧＴ法やポリアクリルアミドゲル電気泳
動などによって行う。ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２
００ｍＭ（好ましくは１０〜４０ｍＭ）Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ６． １〜９． ５、好ましくはｐＨ７
． ０〜８． ０）、２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜１
０ｍＭ）ＭｇＣｌ２ 、０． １〜１０ｍＭ（好ましく
は０． ５〜２． ０ｍＭ）ＡＴＰおよび１〜５０ｍＭ
（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＤＴＴを含む反応液中で
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０． ３〜１００単位を用い、１
〜３７℃（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時
間（好ましくは２〜２０時間）行う。
【００１７】結合反応によって生じた組換え体プラスミ
ドＤＮＡは、必要によりコーエンらの形質転換法〔エス
・エヌ・コーエン（Ｓ． Ｎ． Ｃｏｈｅｎ ）ら：プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ．） ＵＳＡ，６９， ２１１０（１９７２
）〕によって、大腸菌に導入する。組換え体プラスミド
ＤＮＡを持つ大腸菌からの該ＤＮＡの単離は、後に述べ
る実施例１に示した方法あるいはバーンボイムらの方法
〔エイチ・シー・バーンボイム（Ｈ． Ｃ． Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ）ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）， ７， １５
１３ （１９７９）〕などを用いて行う。
ドＤＮＡは、必要によりコーエンらの形質転換法〔エス
・エヌ・コーエン（Ｓ． Ｎ． Ｃｏｈｅｎ ）ら：プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ．） ＵＳＡ，６９， ２１１０（１９７２
）〕によって、大腸菌に導入する。組換え体プラスミド
ＤＮＡを持つ大腸菌からの該ＤＮＡの単離は、後に述べ
る実施例１に示した方法あるいはバーンボイムらの方法
〔エイチ・シー・バーンボイム（Ｈ． Ｃ． Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ）ら：ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）， ７， １５
１３ （１９７９）〕などを用いて行う。
【００１８】プラスミドＤＮＡの塩基配列の確認は、プ
ラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で切断後アガ
ロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電
気泳動により切断部位を調べることで行う。さらに、Ｄ
ＮＡの塩基配列を決定する必要があるときは、ディデオ
キシ・シークエンス法〔ジェイ・メシング（Ｊ． Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）：ジーン（Ｇｅｎｅ）， １９ ， ２６
９（１９８５）〕によって決定する。
ラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で切断後アガ
ロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電
気泳動により切断部位を調べることで行う。さらに、Ｄ
ＮＡの塩基配列を決定する必要があるときは、ディデオ
キシ・シークエンス法〔ジェイ・メシング（Ｊ． Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）：ジーン（Ｇｅｎｅ）， １９ ， ２６
９（１９８５）〕によって決定する。
【００１９】以上のような条件で組換え体プラスミドＤ
ＮＡを造成することができる。
ＮＡを造成することができる。
【００２０】ポリユビキチンは以下のとおりに製造でき
る。すなわち、ポリユビキチンをコードしているプラス
ミド（例えばｐＬＧＣ−ｘ１）を用いて大腸菌Ｃ６００
ＳＦ８を形質転換させ、Ａｐｒ のコロニーの中からｐ
ＬＧＣ−ｘ１を有する大腸菌を選び出す。ｐＬＧＣ−ｘ
１を有する大腸菌を培地に培養することにより培養物中
にポリユビキチンを生成させることができる。生成した
ポリユビキチンは陽イオン交換樹脂、限外濾過などを用
いて精製する。
る。すなわち、ポリユビキチンをコードしているプラス
ミド（例えばｐＬＧＣ−ｘ１）を用いて大腸菌Ｃ６００
ＳＦ８を形質転換させ、Ａｐｒ のコロニーの中からｐ
ＬＧＣ−ｘ１を有する大腸菌を選び出す。ｐＬＧＣ−ｘ
１を有する大腸菌を培地に培養することにより培養物中
にポリユビキチンを生成させることができる。生成した
ポリユビキチンは陽イオン交換樹脂、限外濾過などを用
いて精製する。
【００２１】ここで用いる培地としては、大腸菌の生育
ならびにポリユビキチンの生産に好適なものならば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。炭素源としては
、グルコース、フラクトース、ラクトース、グリセロー
ル、マンニトール、ソルビトールなどが、窒素源として
は、ＮＨ４ Ｃｌ、（ＮＨ４）２ ＳＯ４ 、カザミノ
酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、バクトトリ
プトン、コーン・スティープ・リカーなどが、その他の
栄養源としては、Ｋ２ ＨＰＯ４ 、ＫＨ２ ＰＯ４
、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４ 、ビタミンＢ１ 、ＭｇＣｌ
２ などが使用できる。
ならびにポリユビキチンの生産に好適なものならば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。炭素源としては
、グルコース、フラクトース、ラクトース、グリセロー
ル、マンニトール、ソルビトールなどが、窒素源として
は、ＮＨ４ Ｃｌ、（ＮＨ４）２ ＳＯ４ 、カザミノ
酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、バクトトリ
プトン、コーン・スティープ・リカーなどが、その他の
栄養源としては、Ｋ２ ＨＰＯ４ 、ＫＨ２ ＰＯ４
、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ４ 、ビタミンＢ１ 、ＭｇＣｌ
２ などが使用できる。
【００２２】培養はｐＨ５．５〜８．５、温度１８〜４
０℃で通気攪拌培養により行われる。培養５〜９０時間
で培養菌体中に細胞内顆粒としてポリユビキチンが蓄積
するので、培養物から菌体を集菌し、菌体を超音波処理
により破砕し、遠心分離して上清にポリユビキチンを分
離抽出する。
０℃で通気攪拌培養により行われる。培養５〜９０時間
で培養菌体中に細胞内顆粒としてポリユビキチンが蓄積
するので、培養物から菌体を集菌し、菌体を超音波処理
により破砕し、遠心分離して上清にポリユビキチンを分
離抽出する。
【００２３】菌体より分離抽出したポリユビキチン画分
には大腸菌体内由来の蛋白分解酵素が含まれているため
、蛋白分解酵素阻害剤である１ｍＭ ジイソプロピル
フルオロリン酸（ＤＦＰ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
０２ｍＭ Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイ
シルアミド−４−グアニジノブタン（Ｅ−６４）、０．
０１ｍＭペプスタチンを加える。これによってポリユビ
キチン分解が抑えられる。蛋白分解酵素阻害剤で処理し
た溶液に、弱酸性の緩衝液を加え不純物を可溶化しポリ
ユビキチンを沈澱物質として回収する。沈澱物として回
収したポリユビキチンはたとえば６ｍＭ尿素を含んだ弱
塩基性の緩衝液を加えることによって可溶化される。可
溶化した画分を陽イオン交換樹脂に通塔し、溶出してく
る画分を精製ポリユビキチン画分として集める。陽イオ
ン交換樹脂としては、セファデックス類（ファルマシア
・ファイン・ケミカル社製）、トヨパール（東ソー社製
）などを用いる。 このようにして得られるポリユビ
キチンのアミノ酸配列は、たとえば、アプライド・バイ
オシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）社製４７０Ａ型シーケンサーおよびスペクトラ・フィ
ジクス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ ）社製高速
液体クロマトグラフィーとの組合せによって決定するこ
とができる。
には大腸菌体内由来の蛋白分解酵素が含まれているため
、蛋白分解酵素阻害剤である１ｍＭ ジイソプロピル
フルオロリン酸（ＤＦＰ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
０２ｍＭ Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイ
シルアミド−４−グアニジノブタン（Ｅ−６４）、０．
０１ｍＭペプスタチンを加える。これによってポリユビ
キチン分解が抑えられる。蛋白分解酵素阻害剤で処理し
た溶液に、弱酸性の緩衝液を加え不純物を可溶化しポリ
ユビキチンを沈澱物質として回収する。沈澱物として回
収したポリユビキチンはたとえば６ｍＭ尿素を含んだ弱
塩基性の緩衝液を加えることによって可溶化される。可
溶化した画分を陽イオン交換樹脂に通塔し、溶出してく
る画分を精製ポリユビキチン画分として集める。陽イオ
ン交換樹脂としては、セファデックス類（ファルマシア
・ファイン・ケミカル社製）、トヨパール（東ソー社製
）などを用いる。 このようにして得られるポリユビ
キチンのアミノ酸配列は、たとえば、アプライド・バイ
オシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）社製４７０Ａ型シーケンサーおよびスペクトラ・フィ
ジクス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ ）社製高速
液体クロマトグラフィーとの組合せによって決定するこ
とができる。
【００２４】（２） 抗ユビキチン抗体の定量法（
１） により得られるポリユビキチンを用いて検体、と
くにヒト血清中の抗ユビキチン抗体を次のように定量す
る。
１） により得られるポリユビキチンを用いて検体、と
くにヒト血清中の抗ユビキチン抗体を次のように定量す
る。
【００２５】９６穴ＥＩＡ用プレートに、（１） で得
られるポリユビキチン１０〜１００μｇ／ｍｌを５〜１
００μｇ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩あるいは、室
温で２〜４時間放置する。リン酸緩衝液（リン酸二ナト
リウム１． ８３ｇ、リン酸一カリウム０． ２１ｇ、
ＮａＣｌ７． ６５ｇを含む水溶液１リットル、ｐＨ７
． ２、以下ＰＢＳという。）で洗浄後、１％牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ ２００μｌ／穴を加
え、さらに４℃で１晩あるいは室温で２時間放置する。 このプレートをＰＢＳでよく洗浄後、各穴に血清検体を
１〜５００倍希釈で、５０〜１００μｌを加える。４℃
で１晩あるいは室温で２時間放置後、ＰＢＳでよく洗浄
する。
られるポリユビキチン１０〜１００μｇ／ｍｌを５〜１
００μｇ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩あるいは、室
温で２〜４時間放置する。リン酸緩衝液（リン酸二ナト
リウム１． ８３ｇ、リン酸一カリウム０． ２１ｇ、
ＮａＣｌ７． ６５ｇを含む水溶液１リットル、ｐＨ７
． ２、以下ＰＢＳという。）で洗浄後、１％牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ ２００μｌ／穴を加
え、さらに４℃で１晩あるいは室温で２時間放置する。 このプレートをＰＢＳでよく洗浄後、各穴に血清検体を
１〜５００倍希釈で、５０〜１００μｌを加える。４℃
で１晩あるいは室温で２時間放置後、ＰＢＳでよく洗浄
する。
【００２６】次に標識物質で標識した抗ヒトイムノグロ
ブリン特異的抗体（１０〜１００μｇ／ｍｌ）を５０〜
１００μｌ／穴加え、さらに４℃で１晩あるいは室温で
３０分〜４時間放置する。抗ヒトイムノグロブリン特異
的抗体の標識物質としては、酵素、ビオチン、化学発光
物質、放射線化合物などをあげることができる。特に酵
素で標識された抗ヒトイムノグロブリン特異的抗体を用
いるのが好ましい。
ブリン特異的抗体（１０〜１００μｇ／ｍｌ）を５０〜
１００μｌ／穴加え、さらに４℃で１晩あるいは室温で
３０分〜４時間放置する。抗ヒトイムノグロブリン特異
的抗体の標識物質としては、酵素、ビオチン、化学発光
物質、放射線化合物などをあげることができる。特に酵
素で標識された抗ヒトイムノグロブリン特異的抗体を用
いるのが好ましい。
【００２７】酵素で標識した抗ヒトイムノグロブリン特
異的抗体は、酵素としてペルオキシダーゼ、ウレアーゼ
、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼな
どが直接標識されている市販の抗体、または、ビオチン
−アビジンの結合（アビジン−ビオチン−酵素複合体）
を介して間接的に標識されている抗体を用いることがで
きる。これらの抗体は既に市販もされている。
異的抗体は、酵素としてペルオキシダーゼ、ウレアーゼ
、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼな
どが直接標識されている市販の抗体、または、ビオチン
−アビジンの結合（アビジン−ビオチン−酵素複合体）
を介して間接的に標識されている抗体を用いることがで
きる。これらの抗体は既に市販もされている。
【００２８】放置後、ＰＢＳでよく洗浄する。次に酵素
基質溶液を５０〜１００μｌ／穴加え、室温で１０〜３
０分間放置し、５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
溶液５０〜１００μｌ／穴加え、反応を停止する。酵素
基質溶液としては、ペルオキシダーゼで標識された抗ヒ
トイムノグロブリン特異的抗体を用いる場合には、ＡＢ
ＴＳ基質溶液〔２，２’ −アジノビス（３−エチルベ
ンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム５５
０ｍｇを０． １Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１リ
ットルに溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１μｌ
／ｍｌを加えた溶液〕を用い、ウレアーゼの基質として
は８ｍｇブロムクレゾールパープル、１００ｍｇ尿素お
よび０．２ｍＭ ＥＤＴＡを１００ｍｌ中に含むｐＨ
４．８の溶液を使い、アルカリフォスファターゼの基質
としては１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルリン酸を
０． １Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６）に
溶かしたものを使う。 反応停止後、各穴のＯＤ４１５ 値を測定し、その発色
度より検体中の抗ユビキチン抗体量を算出する。ただし
、ウレアーゼで標識された抗ヒトイムノグロブリン抗体
を用いたときは、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・
メソッズ〔（Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ）， ５３， １８７（１９８２） 〕
に記載の方法にしたがって測定する。
基質溶液を５０〜１００μｌ／穴加え、室温で１０〜３
０分間放置し、５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
溶液５０〜１００μｌ／穴加え、反応を停止する。酵素
基質溶液としては、ペルオキシダーゼで標識された抗ヒ
トイムノグロブリン特異的抗体を用いる場合には、ＡＢ
ＴＳ基質溶液〔２，２’ −アジノビス（３−エチルベ
ンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム５５
０ｍｇを０． １Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１リ
ットルに溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１μｌ
／ｍｌを加えた溶液〕を用い、ウレアーゼの基質として
は８ｍｇブロムクレゾールパープル、１００ｍｇ尿素お
よび０．２ｍＭ ＥＤＴＡを１００ｍｌ中に含むｐＨ
４．８の溶液を使い、アルカリフォスファターゼの基質
としては１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルリン酸を
０． １Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６）に
溶かしたものを使う。 反応停止後、各穴のＯＤ４１５ 値を測定し、その発色
度より検体中の抗ユビキチン抗体量を算出する。ただし
、ウレアーゼで標識された抗ヒトイムノグロブリン抗体
を用いたときは、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・
メソッズ〔（Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ）， ５３， １８７（１９８２） 〕
に記載の方法にしたがって測定する。
【００２９】（３） 全身性エリテマトーデス患者
の血清診断 （２） に記載の定量法により得られる健常人血清中の
抗ユビキチン抗体量と全身性エリテマトーデス患者血清
中の抗ユビキチン抗体量を比較することにより、正常値
を決定し、その正常値を超えるものを全身性エリテマト
ーデス陽性とする。
の血清診断 （２） に記載の定量法により得られる健常人血清中の
抗ユビキチン抗体量と全身性エリテマトーデス患者血清
中の抗ユビキチン抗体量を比較することにより、正常値
を決定し、その正常値を超えるものを全身性エリテマト
ーデス陽性とする。
【００３０】以下に本発明の実施例および参考例を示す
。
。
【００３１】
【実施例】実施例１ 抗原蛋白質としてのユビキ
チンとポリユビキチンの比較 ９６穴ＥＩＡ用プレート〔ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製〕に
、ユビキチン〔シグマ（Ｓｉｇｍａ ）社製〕あるいは
、参考例６で取得したポリユビキチンを１５μｇ／ｍｌ
の濃度で５０μｌ／穴加え、４℃で１晩放置した。ＰＢ
Ｓで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を２００μｌ
／穴加え１時間放置し、ＰＢＳでよく洗浄した。このプ
レートに、１０、１、０． １、０．０１、０．００１
μｇ／ｍｌの各濃度の兎抗ユビキチンポリクローナル抗
体〔エイ・エル・ハス（Ａ． Ｌ． Ｈａａｓ）ら：ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）， ２６０，１２４６４（
１９８５）〕を５０μｌ／穴加え、室温で２時間放置後
、ＰＢＳでよく洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識
抗兎イムノグロブリン特異的抗体〔ダコ（Ｄａｋｏ）社
製〕１０μｇ／ｍｌを５０μｌ／穴加え、室温で２時間
放置後、ＰＢＳでよく洗浄した。さらに、ＡＢＴＳ基質
溶液を５０μｌ／穴加え、室温で３０分間反応させ、５
％ＳＤＳ溶液１００μｌ／穴を加え反応を停止した。各
穴の発色（ＯＤ４１５ 値）を吸光度計 イムノリー
ダーＮＪ−２０００（日本インターメッド社製）を用い
て測定した。その結果、図３に示した様に、抗原蛋白質
としてポリユビキチンを用いた場合、ユビキチンを用い
るよりも高値の発色が測定された。このことより、ポリ
ユビキチンを抗原蛋白質として用いれば、ユビキチンを
用いる場合に比べて、抗ユビキチン抗体を高感度に測定
できることがわかった。
チンとポリユビキチンの比較 ９６穴ＥＩＡ用プレート〔ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製〕に
、ユビキチン〔シグマ（Ｓｉｇｍａ ）社製〕あるいは
、参考例６で取得したポリユビキチンを１５μｇ／ｍｌ
の濃度で５０μｌ／穴加え、４℃で１晩放置した。ＰＢ
Ｓで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を２００μｌ
／穴加え１時間放置し、ＰＢＳでよく洗浄した。このプ
レートに、１０、１、０． １、０．０１、０．００１
μｇ／ｍｌの各濃度の兎抗ユビキチンポリクローナル抗
体〔エイ・エル・ハス（Ａ． Ｌ． Ｈａａｓ）ら：ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ（Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）， ２６０，１２４６４（
１９８５）〕を５０μｌ／穴加え、室温で２時間放置後
、ＰＢＳでよく洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識
抗兎イムノグロブリン特異的抗体〔ダコ（Ｄａｋｏ）社
製〕１０μｇ／ｍｌを５０μｌ／穴加え、室温で２時間
放置後、ＰＢＳでよく洗浄した。さらに、ＡＢＴＳ基質
溶液を５０μｌ／穴加え、室温で３０分間反応させ、５
％ＳＤＳ溶液１００μｌ／穴を加え反応を停止した。各
穴の発色（ＯＤ４１５ 値）を吸光度計 イムノリー
ダーＮＪ−２０００（日本インターメッド社製）を用い
て測定した。その結果、図３に示した様に、抗原蛋白質
としてポリユビキチンを用いた場合、ユビキチンを用い
るよりも高値の発色が測定された。このことより、ポリ
ユビキチンを抗原蛋白質として用いれば、ユビキチンを
用いる場合に比べて、抗ユビキチン抗体を高感度に測定
できることがわかった。
【００３２】実施例２ 本発明による血清の全身
性エリテマトーデス（ＳＬＥ）診断の結果 ９６穴ＥＩＡ用プレート〔ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製〕に
、ユビキチン〔シグマ（Ｓｉｇｍａ ）社製〕あるいは
、参考例６で取得したポリユビキチン１０μｇ／ｍｌを
５０μｌ／穴加え、４℃で１晩放置後、ＰＢＳで洗浄し
、１％ＢＳＡを含んだＰＢＳ溶液を２００μｌ／穴加え
、１時間放置し、ＰＢＳでよく洗浄した。このプレート
に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％ＢＳＡを含んだ
ＰＢＳ溶液を用いて２００倍に希釈した健常人血清（１
０検体）および全身性エリテマトーデス患者血清（３３
検体）を各々５０μｌ／穴加え、室温で２時間放置後、
ＰＢＳでよく洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識抗
ヒトイムノグロブリン特異的抗体〔ダコ（Ｄａｋｏ）社
製〕１０μｇ／ｍｌを５０μｌ／穴加え、室温で２時間
放置後、ＰＢＳでよく洗浄した。さらに、ＡＢＴＳ基質
溶液を５０μｌ／穴加え、室温で３０分間反応させ、５
％ＳＤＳ溶液１００μｌ／穴を加え反応を停止した。各
穴の発色（ＯＤ４１５ 値）を吸光度計 イムノリー
ダーＮＪ−２０００（日本インターメッド社製）を用い
て測定した。その結果を図４に示した。ユビキチンを抗
原蛋白質として用いた場合、健常人血清ではＯＤ４１５
が０．０６をこえる陽性例は１０例中１例もなかった
が、全身性エリテマトーデス患者血清ではＯＤ４１５
が０．０６をこえる陽性例が３４例中２５例あった。ポ
リユビキチンを抗原蛋白質として用いた場合、健常人血
清ではＯＤ４１５ が０．１をこえる陽性例は１０例中
１例もなかったが、全身性エリテマトーデス患者血清で
はＯＤ４１５ が０． １をこえる陽性例が３４例中３
１例あった。このことより、ポリユビキチンを用いる本
血清診断法はユビキチンを用いる場合に比べ優れており
、約９０％の頻度で全身性エリテマトーデス患者を見い
だすことが可能である。
性エリテマトーデス（ＳＬＥ）診断の結果 ９６穴ＥＩＡ用プレート〔ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製〕に
、ユビキチン〔シグマ（Ｓｉｇｍａ ）社製〕あるいは
、参考例６で取得したポリユビキチン１０μｇ／ｍｌを
５０μｌ／穴加え、４℃で１晩放置後、ＰＢＳで洗浄し
、１％ＢＳＡを含んだＰＢＳ溶液を２００μｌ／穴加え
、１時間放置し、ＰＢＳでよく洗浄した。このプレート
に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％ＢＳＡを含んだ
ＰＢＳ溶液を用いて２００倍に希釈した健常人血清（１
０検体）および全身性エリテマトーデス患者血清（３３
検体）を各々５０μｌ／穴加え、室温で２時間放置後、
ＰＢＳでよく洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識抗
ヒトイムノグロブリン特異的抗体〔ダコ（Ｄａｋｏ）社
製〕１０μｇ／ｍｌを５０μｌ／穴加え、室温で２時間
放置後、ＰＢＳでよく洗浄した。さらに、ＡＢＴＳ基質
溶液を５０μｌ／穴加え、室温で３０分間反応させ、５
％ＳＤＳ溶液１００μｌ／穴を加え反応を停止した。各
穴の発色（ＯＤ４１５ 値）を吸光度計 イムノリー
ダーＮＪ−２０００（日本インターメッド社製）を用い
て測定した。その結果を図４に示した。ユビキチンを抗
原蛋白質として用いた場合、健常人血清ではＯＤ４１５
が０．０６をこえる陽性例は１０例中１例もなかった
が、全身性エリテマトーデス患者血清ではＯＤ４１５
が０．０６をこえる陽性例が３４例中２５例あった。ポ
リユビキチンを抗原蛋白質として用いた場合、健常人血
清ではＯＤ４１５ が０．１をこえる陽性例は１０例中
１例もなかったが、全身性エリテマトーデス患者血清で
はＯＤ４１５ が０． １をこえる陽性例が３４例中３
１例あった。このことより、ポリユビキチンを用いる本
血清診断法はユビキチンを用いる場合に比べ優れており
、約９０％の頻度で全身性エリテマトーデス患者を見い
だすことが可能である。
【００３３】参考例１ Ｋ５６２細胞株からのポ
リ（Ａ）ＲＮＡの調製 ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２より、チオシアン酸グ
アニジン−塩化リチウム法〔カサ（Ｃａｔｈａｌａ ）
ら：ディーエヌエイ（ＤＮＡ）， ２， ３２９ （
１９８３）〕に従い、ポリ（Ａ）を有するＲＮＡを下記
のごとく調製した。Ｋ５６２株を、基礎培地としてハム
−Ｆ１０培地（フローラボ社製）およびダルベッコらの
ＭＥＭ培地（日水製薬社製）を３：１の比率で混合した
ものに、５ｍＭ ピルビン酸、１．２５×１０−７Ｍ
亜セレン酸、１ｍｇ／ｍｌ ガラクトース、４ｍ
Ｍ グルタミン、２５Ｕ／ｍｌ ペニシリン、２５
μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンおよび０．０１％
重曹を加えた無蛋白培地１リットルに、８×１０５個
／ｍｌとなるように接種し、スピンナー・カルチャー・
ボトルを用い、３７℃で３日間培養した。
リ（Ａ）ＲＮＡの調製 ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２より、チオシアン酸グ
アニジン−塩化リチウム法〔カサ（Ｃａｔｈａｌａ ）
ら：ディーエヌエイ（ＤＮＡ）， ２， ３２９ （
１９８３）〕に従い、ポリ（Ａ）を有するＲＮＡを下記
のごとく調製した。Ｋ５６２株を、基礎培地としてハム
−Ｆ１０培地（フローラボ社製）およびダルベッコらの
ＭＥＭ培地（日水製薬社製）を３：１の比率で混合した
ものに、５ｍＭ ピルビン酸、１．２５×１０−７Ｍ
亜セレン酸、１ｍｇ／ｍｌ ガラクトース、４ｍ
Ｍ グルタミン、２５Ｕ／ｍｌ ペニシリン、２５
μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンおよび０．０１％
重曹を加えた無蛋白培地１リットルに、８×１０５個
／ｍｌとなるように接種し、スピンナー・カルチャー・
ボトルを用い、３７℃で３日間培養した。
【００３４】続いて、この細胞懸濁液の一部（２５０ｍ
ｌ）から１，１００ｘｇ、４℃、１０分間の遠心分離に
よって細胞を集め、８０ｍｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７
．０）で洗浄した後、５Ｍチオシアン酸グアニジン、１
０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．０）および８％（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエ
タノールからなる溶液１０ｍｌ中でボルテックス・ミキ
サーを用い可溶化した。この可溶化物を遠心管に移し、
４Ｍ ＬｉＣｌ溶液８０ｍｌを加えて攪はんした後、
４℃、２０時間静置した。Ｈｉｔａｃｈｉ ＲＰＲ１０
ローター（日立製作所社製）にて９，０００ｒｐｍ、９
０分間遠心後、ＲＮＡを沈澱物として回収した。ＲＮＡ
の沈澱を４Ｍ尿素および２Ｍ塩化リチウムからなる溶液
５０ｍｌに懸濁し、ＨｉｔａｃｈｉＲＰＲ１０ローター
にて９，０００ｒｐｍ、６０分間遠心後、再びＲＮＡを
沈澱として回収した。ＲＮＡの沈澱を０．１％ラウリル
硫酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる溶液１０
ｍｌに溶解し、フェノールクロロホルムで抽出後、エタ
ノール沈澱により回収した。得られたＲＮＡ約２．５ｍ
ｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液１ｍｌに溶かし
た。６５℃、５分間インキュベートし、０．１ｍｌの５
Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をオリゴ（ｄＴ）セル
ロース・カラム〔ピー・エル・バイオケミカルズ（Ｐ−
Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ）社製〕クロマトグラ
フィー（カラム体積０．５ｍｌ）にかけた。吸着したポ
リ（Ａ）を有するｍＲＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）および１ｍＭ ＥＤＴＡか
らなる溶液で溶出し、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約１
００μｇを得た。
ｌ）から１，１００ｘｇ、４℃、１０分間の遠心分離に
よって細胞を集め、８０ｍｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７
．０）で洗浄した後、５Ｍチオシアン酸グアニジン、１
０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．０）および８％（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエ
タノールからなる溶液１０ｍｌ中でボルテックス・ミキ
サーを用い可溶化した。この可溶化物を遠心管に移し、
４Ｍ ＬｉＣｌ溶液８０ｍｌを加えて攪はんした後、
４℃、２０時間静置した。Ｈｉｔａｃｈｉ ＲＰＲ１０
ローター（日立製作所社製）にて９，０００ｒｐｍ、９
０分間遠心後、ＲＮＡを沈澱物として回収した。ＲＮＡ
の沈澱を４Ｍ尿素および２Ｍ塩化リチウムからなる溶液
５０ｍｌに懸濁し、ＨｉｔａｃｈｉＲＰＲ１０ローター
にて９，０００ｒｐｍ、６０分間遠心後、再びＲＮＡを
沈澱として回収した。ＲＮＡの沈澱を０．１％ラウリル
硫酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる溶液１０
ｍｌに溶解し、フェノールクロロホルムで抽出後、エタ
ノール沈澱により回収した。得られたＲＮＡ約２．５ｍ
ｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液１ｍｌに溶かし
た。６５℃、５分間インキュベートし、０．１ｍｌの５
Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をオリゴ（ｄＴ）セル
ロース・カラム〔ピー・エル・バイオケミカルズ（Ｐ−
Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ）社製〕クロマトグラ
フィー（カラム体積０．５ｍｌ）にかけた。吸着したポ
リ（Ａ）を有するｍＲＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）および１ｍＭ ＥＤＴＡか
らなる溶液で溶出し、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約１
００μｇを得た。
【００３５】参考例２ ｃＤＮＡ合成とポリユビ
キチンｃＤＮＡのベクターへの挿入 オカヤマ−バーグの方法〔Ｏｋａｙａｍａ ＆ Ｂｅｒ
ｇ：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ（
Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．）， ２ ， １６
１ （１９８２）〕に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組
み込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程
の概略を図５に示す。
キチンｃＤＮＡのベクターへの挿入 オカヤマ−バーグの方法〔Ｏｋａｙａｍａ ＆ Ｂｅｒ
ｇ：モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ（
Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．）， ２ ， １６
１ （１９８２）〕に従い、ｃＤＮＡの合成とそれを組
み込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程
の概略を図５に示す。
【００３６】ｐｃＤＶ１（ファルマシア社製）〔オカヤ
マ−バーグ（Ｏｋａｙａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ）：モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ（Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．）， ３， ２８０（１９８３
）〕４００μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ および１０ｍ
Ｍ ＮａＣｌからなる溶液３００μｌに加え、さらに
５００単位のＫｐｎＩを加えて、３７℃、６時間反応さ
せ、プラスミド中のＫｐｎＩ部位で切断した。フェノー
ル−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱によりＤＮＡ
を回収した。ＫｎｐＩ切断した該ＤＮＡ約２００μｇを
４０ｍＭ カコジル酸ナトリウム、３０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）、１ｍＭＣａＣｌ２
および０． １ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液（以下
、ＴｄＴ緩衝液という）にｄＴＴＰを０．２５ｍＭとな
るよう加えた溶液２００μｌに加え、さらに８１単位の
ＴｄＴ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加
えて、３７℃、１１分間反応させた。ここで、ｐｃＤＶ
１のＫｐｎＩ切断部位の３’末端にポリ（ｄＴ）鎖が約
６７個付加された。該溶液からフェノール−クロロホル
ム抽出、エタノール沈澱により、ポリ（ｄＴ）鎖の付加
したｐｃＤＶ１ＤＮＡ約１００μｇを回収した。該ＤＮ
Ａを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５
）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ および１００ｍＭＮａＣｌ
からなる緩衝液１５０μｌに加え、さらに３６０単位の
ＥｃｏＲＩを加え、３７℃２時間反応させた。該反応物
をＬＧＴ法で処理後、約３．１ＫｂのＤＮＡ断片を回収
し、約６０μｇのポリ（ｄＴ）鎖付加ｐｃＤＶ１を得た
。該ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５０
０μｌに溶解し、６５℃５分間インキュベート後、氷冷
して５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をオ
リゴデオキシアデニル酸セルロースカラム（コラボラテ
ィブリサーチ社製）クロマトグラフィーにかけた。ポリ
（ｄＴ）鎖長が充分なものはカラムに吸着し、これを１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）およ
び１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポリ（ｄＴ）
鎖の付加したｐｃＤＶ１（以下ベクタープライマーと略
記する）２７μｇを得た。
マ−バーグ（Ｏｋａｙａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ）：モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ（Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．）， ３， ２８０（１９８３
）〕４００μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ および１０ｍ
Ｍ ＮａＣｌからなる溶液３００μｌに加え、さらに
５００単位のＫｐｎＩを加えて、３７℃、６時間反応さ
せ、プラスミド中のＫｐｎＩ部位で切断した。フェノー
ル−クロロホルム抽出後、エタノール沈澱によりＤＮＡ
を回収した。ＫｎｐＩ切断した該ＤＮＡ約２００μｇを
４０ｍＭ カコジル酸ナトリウム、３０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）、１ｍＭＣａＣｌ２
および０． １ｍＭ ＤＴＴからなる緩衝液（以下
、ＴｄＴ緩衝液という）にｄＴＴＰを０．２５ｍＭとな
るよう加えた溶液２００μｌに加え、さらに８１単位の
ＴｄＴ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加
えて、３７℃、１１分間反応させた。ここで、ｐｃＤＶ
１のＫｐｎＩ切断部位の３’末端にポリ（ｄＴ）鎖が約
６７個付加された。該溶液からフェノール−クロロホル
ム抽出、エタノール沈澱により、ポリ（ｄＴ）鎖の付加
したｐｃＤＶ１ＤＮＡ約１００μｇを回収した。該ＤＮ
Ａを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５
）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ および１００ｍＭＮａＣｌ
からなる緩衝液１５０μｌに加え、さらに３６０単位の
ＥｃｏＲＩを加え、３７℃２時間反応させた。該反応物
をＬＧＴ法で処理後、約３．１ＫｂのＤＮＡ断片を回収
し、約６０μｇのポリ（ｄＴ）鎖付加ｐｃＤＶ１を得た
。該ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液５０
０μｌに溶解し、６５℃５分間インキュベート後、氷冷
して５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加えた。混合物をオ
リゴデオキシアデニル酸セルロースカラム（コラボラテ
ィブリサーチ社製）クロマトグラフィーにかけた。ポリ
（ｄＴ）鎖長が充分なものはカラムに吸着し、これを１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）およ
び１ｍＭＥＤＴＡからなる溶液で溶出し、ポリ（ｄＴ）
鎖の付加したｐｃＤＶ１（以下ベクタープライマーと略
記する）２７μｇを得た。
【００３７】次にリンカーＤＮＡの調製を行った。ｐＬ
１（ファルマシア社製）〔オカヤマ−バーグ（Ｏｋａｙ
ａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ）：モレキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジィ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ
．），３ ， ２８０ （１９８３）〕約１４μｇを１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、６
ｍＭＭｇＣｌ２ および５０ｍＭ ＮａＣｌからなる
緩衝液２００μｌに加え、さらに５０単位のＰｓｔＩを
加え３７℃４時間反応させ、ｐＬ１ ＤＮＡ中のＰｓ
ｔＩ部位で切断させた。該反応物をフェノール−クロロ
ホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、ＰｓｔＩで切断
したｐＬ１ ＤＮＡ約１３μｇを回収した。該ＤＮＡ
約１３μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃度０．２５ｍＭのｄＧ
ＴＰを含む溶液５０μｌに加え、さらにＴｄＴ５４単位
を加えて３７℃１３分間インキュベートし、ｐＬ１のＰ
ｓｔＩ切断部位３’末端に（ｄＧ）鎖を約１４個付加し
た。フェノール−クロロホルム抽出後エタノール沈澱に
てＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ お
よび６０ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液１００μｌに
加え、さらに８０単位のＨｉｎｄ ＩＩＩを加えて３７
℃３時間インキュベートし、ｐＬ１ ＤＮＡのＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位で切断した。該反応物をアガロースゲル
電気泳動にて分画し、約０．５ＫｂのＤＮＡ断片をＤＥ
ＡＥペーパー法〔ドレツェン（Ｄｒｅｔｚｅｎ ）ら：
アナリティカル・バイオケミストリィ（Ａｎａｌ． Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．）， １１２， ２９５（１９８１）〕
にて回収し、オリゴ（ｄＧ）鎖付きのリンカーＤＮＡ（
以下単にリンカーＤＮＡという）を得た。
１（ファルマシア社製）〔オカヤマ−バーグ（Ｏｋａｙ
ａｍａ ＆ Ｂｅｒｇ）：モレキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジィ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ
．），３ ， ２８０ （１９８３）〕約１４μｇを１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、６
ｍＭＭｇＣｌ２ および５０ｍＭ ＮａＣｌからなる
緩衝液２００μｌに加え、さらに５０単位のＰｓｔＩを
加え３７℃４時間反応させ、ｐＬ１ ＤＮＡ中のＰｓ
ｔＩ部位で切断させた。該反応物をフェノール−クロロ
ホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、ＰｓｔＩで切断
したｐＬ１ ＤＮＡ約１３μｇを回収した。該ＤＮＡ
約１３μｇをＴｄＴ緩衝液に終濃度０．２５ｍＭのｄＧ
ＴＰを含む溶液５０μｌに加え、さらにＴｄＴ５４単位
を加えて３７℃１３分間インキュベートし、ｐＬ１のＰ
ｓｔＩ切断部位３’末端に（ｄＧ）鎖を約１４個付加し
た。フェノール−クロロホルム抽出後エタノール沈澱に
てＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ お
よび６０ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液１００μｌに
加え、さらに８０単位のＨｉｎｄ ＩＩＩを加えて３７
℃３時間インキュベートし、ｐＬ１ ＤＮＡのＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ部位で切断した。該反応物をアガロースゲル
電気泳動にて分画し、約０．５ＫｂのＤＮＡ断片をＤＥ
ＡＥペーパー法〔ドレツェン（Ｄｒｅｔｚｅｎ ）ら：
アナリティカル・バイオケミストリィ（Ａｎａｌ． Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．）， １１２， ２９５（１９８１）〕
にて回収し、オリゴ（ｄＧ）鎖付きのリンカーＤＮＡ（
以下単にリンカーＤＮＡという）を得た。
【００３８】上記で調製したポリ（Ａ）ＲＮＡ約２μｇ
、ベクタープライマー約１． ４μｇを５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）、８ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２ 、３０ｍＭ ＫＣｌ ０．３ｍＭ ＤＴ
Ｔ、２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴ
ＰおよびｄＣＴＰ）および１０単位のリボヌクレアーゼ
インヒビター（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
からなる溶液２２． ３μｌに溶解し、１０単位の逆転
写酵素（生化学工業社製）を加え、４１℃９０分間イン
キュベートし、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成させた
。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エタノー
ル沈澱を行い、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の付加したベクタ
ープライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを６６μＭ
ｄＣＴＰおよび０． ２μｇポリ（Ａ）を含むＴｄＴ
緩衝液２０μｌに溶解し、１４単位のＴｄＴを加えて３
７℃２分間インキュベートし、ｃＤＮＡ３’末端に２０
個の（ｄＣ）鎖を付加した。該反応物をフェノール−ク
ロロホルム抽出し、エタノール沈澱により（ｄＣ）鎖の
付加したｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを回収し
た。該ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（
ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ および６０ｍＭ
ＮａＣｌからなる溶液４００μｌに溶かし、２０単
位のＨｉｎｄ ＩＩＩを加え、３７℃２時間インキュベ
ートし、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位で切断した。該反応物を
フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱して０
．５ピコモルの（ｄＣ）鎖付加ｃＤＮＡ−ベクタープラ
イマーＤＮＡを得た。該ＤＮＡ０．２ピコモルおよび前
記のリンカーＤＮＡ０． ４ピコモルを１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液１００μ
ｌに溶かし、６５℃、４２℃、０℃でそれぞれ１０分、
２５分、３０分間インキュベートした。２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ
２ 、１０ｍＭ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 、０．１Ｍ
ＫＣｌおよび０．１ ｍＭ β−ＮＡＤの組成で、全
量１０００μｌとなるよう反応液を調製した。該反応液
に２５単位の大腸菌リガーゼ（ニューイングランド・バ
イオラブズ社製）を加え、１１℃、１８時間インキュベ
ートした。該反応液を各４０μＭのｄＮＴＰ、０．１５
ｍＭ β−ＮＡＤとなるよう成分を追加調製し、１０
単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、２０単位の大腸菌ポリメ
ラーゼＩ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）お
よび１０単位の大腸菌リボヌクレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加え、１２℃、２５℃
で順次１時間ずつインキュベートした。上記反応で、ｃ
ＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ
二重鎖のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換された完全な二重鎖
となったＤＮＡの組換え体プラスミドが生成した。
、ベクタープライマー約１． ４μｇを５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）、８ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２ 、３０ｍＭ ＫＣｌ ０．３ｍＭ ＤＴ
Ｔ、２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴ
ＰおよびｄＣＴＰ）および１０単位のリボヌクレアーゼ
インヒビター（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
からなる溶液２２． ３μｌに溶解し、１０単位の逆転
写酵素（生化学工業社製）を加え、４１℃９０分間イン
キュベートし、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成させた
。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出、エタノー
ル沈澱を行い、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の付加したベクタ
ープライマーＤＮＡを回収した。該ＤＮＡを６６μＭ
ｄＣＴＰおよび０． ２μｇポリ（Ａ）を含むＴｄＴ
緩衝液２０μｌに溶解し、１４単位のＴｄＴを加えて３
７℃２分間インキュベートし、ｃＤＮＡ３’末端に２０
個の（ｄＣ）鎖を付加した。該反応物をフェノール−ク
ロロホルム抽出し、エタノール沈澱により（ｄＣ）鎖の
付加したｃＤＮＡ−ベクタープライマーＤＮＡを回収し
た。該ＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（
ｐＨ７．５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２ および６０ｍＭ
ＮａＣｌからなる溶液４００μｌに溶かし、２０単
位のＨｉｎｄ ＩＩＩを加え、３７℃２時間インキュベ
ートし、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位で切断した。該反応物を
フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱して０
．５ピコモルの（ｄＣ）鎖付加ｃＤＮＡ−ベクタープラ
イマーＤＮＡを得た。該ＤＮＡ０．２ピコモルおよび前
記のリンカーＤＮＡ０． ４ピコモルを１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡからなる溶液１００μ
ｌに溶かし、６５℃、４２℃、０℃でそれぞれ１０分、
２５分、３０分間インキュベートした。２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ
２ 、１０ｍＭ（ＮＨ４ ）２ ＳＯ４ 、０．１Ｍ
ＫＣｌおよび０．１ ｍＭ β−ＮＡＤの組成で、全
量１０００μｌとなるよう反応液を調製した。該反応液
に２５単位の大腸菌リガーゼ（ニューイングランド・バ
イオラブズ社製）を加え、１１℃、１８時間インキュベ
ートした。該反応液を各４０μＭのｄＮＴＰ、０．１５
ｍＭ β−ＮＡＤとなるよう成分を追加調製し、１０
単位の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、２０単位の大腸菌ポリメ
ラーゼＩ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）お
よび１０単位の大腸菌リボヌクレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を加え、１２℃、２５℃
で順次１時間ずつインキュベートした。上記反応で、ｃ
ＤＮＡを含む組換えＤＮＡの環状化と、ＲＮＡ−ＤＮＡ
二重鎖のＲＮＡ部分がＤＮＡに置換された完全な二重鎖
となったＤＮＡの組換え体プラスミドが生成した。
【００３９】参考例３ ポリユビキチンｃＤＮＡ
を含む組換えＤＮＡの選択 参考例２で得られた組換え体プラスミドを用い、大腸菌
Ｃ６００ＳＦ８株〔カメロン（Ｃａｍｅｒｏｎ）ら：プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ．）ＵＳＡ， ７２， ３４１６ （１９７
５）、本出願人により昭和６１年５月２７日付で工業技
術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−１０７０と
して寄託〕をスコット（Ｓｃｏｔｔ ）らの方法〔重定
勝哉：細胞工学， ２， ６１６（１９８３）〕に従い
形質転換した。 得られた約１万個のコロニーをニトロセルロースフィル
ター上に固定した。ウィボルグらが単離したヒトユビキ
チン前駆体遺伝子〔オウ・ウィボルグ（Ｏ． Ｗｉｂｏ
ｒｇ ）ら：エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ． ）
， ４ ， ７５５ （１９８５）〕のユビキチン前駆
体のＮ末端から１番目〜１５番目のアミノ酸配列対応す
る合成ＤＮＡ、すなわち、配列番号２に示した合成ＤＮ
Ａを３２Ｐで標識したプローブに４５℃で強く会合し、
また、Ｎ末端から３０番目〜３５番目のアミノ酸配列に
対応する合成ＤＮＡ、すなわち、配列番号３に示した合
成ＤＮＡ（３番目の塩基はＣ、Ｔ、Ａのいずれか、６番
目はＡまたはＧ、９番目はＴまたはＣ、１２番目はＧま
たはＡ、１５番目はＡまたはＧであり、組み合わせて４
８通りの合成ＤＮＡの混合物となる）を３２Ｐで標識し
たプローブに４０℃で強く会合した８菌株を選んだ〔グ
ルンステイン−ホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇ
ｎｅｓｓ ）の方法：プロシーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．）ＵＳＡ， ７２
，３９６１（１９７５）〕。これらのプラスミドはｐ
ＬＧＡ８、ｐＬＧＡ９、ｐＬＧＡ１１、ｐＬＧＡ１３、
ｐＬＧＢ１２、ｐＬＧＢ１６、ｐＬＧＢ１９、ｐＬＧＣ
１５と命名した。上記で得られたプラスミド８種につき
、種々の制限酵素で消化し、ｃＤＮＡ部分の切断地図を
決定した。制限酵素部位の存在位置から得られたプラス
ミドは３群に分類でき、ｐＬＧＡ８、ｐＬＧＡ９、ｐＬ
ＧＡ１１、ｐＬＧＡ１３の群、ｐＬＧＢ１２、ｐＬＧＢ
１６、ｐＬＧＢ１９の群およびｐＬＧＣ１５に分けられ
た。それぞれの群の制限酵素地図を図６に示す。
を含む組換えＤＮＡの選択 参考例２で得られた組換え体プラスミドを用い、大腸菌
Ｃ６００ＳＦ８株〔カメロン（Ｃａｍｅｒｏｎ）ら：プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ．）ＵＳＡ， ７２， ３４１６ （１９７
５）、本出願人により昭和６１年５月２７日付で工業技
術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−１０７０と
して寄託〕をスコット（Ｓｃｏｔｔ ）らの方法〔重定
勝哉：細胞工学， ２， ６１６（１９８３）〕に従い
形質転換した。 得られた約１万個のコロニーをニトロセルロースフィル
ター上に固定した。ウィボルグらが単離したヒトユビキ
チン前駆体遺伝子〔オウ・ウィボルグ（Ｏ． Ｗｉｂｏ
ｒｇ ）ら：エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ． ）
， ４ ， ７５５ （１９８５）〕のユビキチン前駆
体のＮ末端から１番目〜１５番目のアミノ酸配列対応す
る合成ＤＮＡ、すなわち、配列番号２に示した合成ＤＮ
Ａを３２Ｐで標識したプローブに４５℃で強く会合し、
また、Ｎ末端から３０番目〜３５番目のアミノ酸配列に
対応する合成ＤＮＡ、すなわち、配列番号３に示した合
成ＤＮＡ（３番目の塩基はＣ、Ｔ、Ａのいずれか、６番
目はＡまたはＧ、９番目はＴまたはＣ、１２番目はＧま
たはＡ、１５番目はＡまたはＧであり、組み合わせて４
８通りの合成ＤＮＡの混合物となる）を３２Ｐで標識し
たプローブに４０℃で強く会合した８菌株を選んだ〔グ
ルンステイン−ホグネス（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇ
ｎｅｓｓ ）の方法：プロシーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．）ＵＳＡ， ７２
，３９６１（１９７５）〕。これらのプラスミドはｐ
ＬＧＡ８、ｐＬＧＡ９、ｐＬＧＡ１１、ｐＬＧＡ１３、
ｐＬＧＢ１２、ｐＬＧＢ１６、ｐＬＧＢ１９、ｐＬＧＣ
１５と命名した。上記で得られたプラスミド８種につき
、種々の制限酵素で消化し、ｃＤＮＡ部分の切断地図を
決定した。制限酵素部位の存在位置から得られたプラス
ミドは３群に分類でき、ｐＬＧＡ８、ｐＬＧＡ９、ｐＬ
ＧＡ１１、ｐＬＧＡ１３の群、ｐＬＧＢ１２、ｐＬＧＢ
１６、ｐＬＧＢ１９の群およびｐＬＧＣ１５に分けられ
た。それぞれの群の制限酵素地図を図６に示す。
【００４０】次に、各群からほぼ完全長のｃＤＮＡを含
むと考えられるプラスミドｐＬＧＡ８、ｐＬＧＢ１２、
ｐＬＧＣ１５を選び、その翻訳領域の全塩基配列をＭ１
３ファージを用いたディデオキシ・シークエンス法〔ジ
ェイ・メシング（Ｊ． Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら：ジーン（
Ｇｅｎｅ）， １９，２６９ （１９８５）〕により決
定した。ｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列をｐＬＧ
Ａ８については配列番号８に、ｐＬＧＢ１２については
配列番号９に、ｐＬＧＣ１５については配列番号１０に
示す。いずれもヒトユビキチンに相当するアミノ酸配列
を構造の一部として有しており、ｐＬＧＣ１５が３つの
ユビキチンつながったポリユビキチンをコードしている
ことが判明した。
むと考えられるプラスミドｐＬＧＡ８、ｐＬＧＢ１２、
ｐＬＧＣ１５を選び、その翻訳領域の全塩基配列をＭ１
３ファージを用いたディデオキシ・シークエンス法〔ジ
ェイ・メシング（Ｊ． Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら：ジーン（
Ｇｅｎｅ）， １９，２６９ （１９８５）〕により決
定した。ｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列をｐＬＧ
Ａ８については配列番号８に、ｐＬＧＢ１２については
配列番号９に、ｐＬＧＣ１５については配列番号１０に
示す。いずれもヒトユビキチンに相当するアミノ酸配列
を構造の一部として有しており、ｐＬＧＣ１５が３つの
ユビキチンつながったポリユビキチンをコードしている
ことが判明した。
【００４１】参考例４ 組換え体プラスミドｐＬ
ＧＣ：Ｓｃ１１の造成 参考例３により得られたｐＬＧＣ１５（４． ２Ｋｂ）
をもつ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を培養し、培養菌体から
常法〔マンアティス（Ｍａｕｉａｔｉｓ）ら：モレキュ
ラー・クローニング（Ｍａｌｅｃｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）（１９８２）コールド・スプリング ハーバー・
ラボラトリー〕によりｐＬＧＣ１５ＤＮＡを調製した。 得られたｐＬＧＣ１５ＤＮＡ ３μｇを１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２ 、 ６ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび
１００ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液（以下”Ｙ−１００
緩衝液”という）全量６０μｌに溶かし、制限酵素Ｘｈ
ｏＩ６単位を加え３７℃で２時間切断反応を行った。こ
の反応溶液からＬＧＴ法によりポリユビキチン蛋白質（
ＵＬ−Ｃ）遺伝子を含む約１． ３ＫｂのＤＮＡ断片（
ＸｈｏＩ断片）約０． ５μｇを得た。
ＧＣ：Ｓｃ１１の造成 参考例３により得られたｐＬＧＣ１５（４． ２Ｋｂ）
をもつ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を培養し、培養菌体から
常法〔マンアティス（Ｍａｕｉａｔｉｓ）ら：モレキュ
ラー・クローニング（Ｍａｌｅｃｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）（１９８２）コールド・スプリング ハーバー・
ラボラトリー〕によりｐＬＧＣ１５ＤＮＡを調製した。 得られたｐＬＧＣ１５ＤＮＡ ３μｇを１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２ 、 ６ｍＭ ２−メルカプトエタノールおよび
１００ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液（以下”Ｙ−１００
緩衝液”という）全量６０μｌに溶かし、制限酵素Ｘｈ
ｏＩ６単位を加え３７℃で２時間切断反応を行った。こ
の反応溶液からＬＧＴ法によりポリユビキチン蛋白質（
ＵＬ−Ｃ）遺伝子を含む約１． ３ＫｂのＤＮＡ断片（
ＸｈｏＩ断片）約０． ５μｇを得た。
【００４２】別に、ｐＵＣ１９（２． ７Ｋｂ）２μｇ
を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
、７ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、６ｍＭ ２−メルカプト
エタノールおよび１７５ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液全
量４０μｌに溶かし、制限酵素ＳａｌＩ １０単位を
加え３７℃で２時間切断反応を行った。この反応液から
ＬＧＴ法により約２．７ＫｂのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ断
片）約１．０μｇを得た。
を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）
、７ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、６ｍＭ ２−メルカプト
エタノールおよび１７５ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液全
量４０μｌに溶かし、制限酵素ＳａｌＩ １０単位を
加え３７℃で２時間切断反応を行った。この反応液から
ＬＧＴ法により約２．７ＫｂのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ断
片）約１．０μｇを得た。
【００４３】次に、上記で得たｐＬＧＣ１５由来のＸｈ
ｏＩ断片（約１． ３Ｋｂ）０．４μｇとｐＵＣ１９由
来のＳａｌＩ断片（約２．７Ｋｂ）０．３μｇを全量２
０μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７
．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１０ｍＭＤＴＴお
よび１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液（以下この緩衝液を
Ｔ４リガーゼ緩衝液という）に溶かし、この混合液にさ
らに２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え
４℃で１８時間反応を行った。
ｏＩ断片（約１． ３Ｋｂ）０．４μｇとｐＵＣ１９由
来のＳａｌＩ断片（約２．７Ｋｂ）０．３μｇを全量２
０μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７
．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１０ｍＭＤＴＴお
よび１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液（以下この緩衝液を
Ｔ４リガーゼ緩衝液という）に溶かし、この混合液にさ
らに２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加え
４℃で１８時間反応を行った。
【００４４】組換え体プラスミドを含む反応混合物を用
いて大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を形質転換し、Ａｐｒ の
コロニーを得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡ
を公知の方法〔エイチ・シー・バーンボイム（Ｈ． Ｃ
． Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）ら：ヌクレイック・アシッド・
リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），
７ ， １５１３（１９７９）〕に従って分離し精製
した。得られたプラスミドの構造は、制限酵素ＳａｌＩ
、ＢａｍＨＩで切断後、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により確認した。このプラスミドをｐＬＧＣ：Ｓｃ１
１と呼ぶ。
いて大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を形質転換し、Ａｐｒ の
コロニーを得た。この形質転換株よりプラスミドＤＮＡ
を公知の方法〔エイチ・シー・バーンボイム（Ｈ． Ｃ
． Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）ら：ヌクレイック・アシッド・
リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），
７ ， １５１３（１９７９）〕に従って分離し精製
した。得られたプラスミドの構造は、制限酵素ＳａｌＩ
、ＢａｍＨＩで切断後、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により確認した。このプラスミドをｐＬＧＣ：Ｓｃ１
１と呼ぶ。
【００４５】参考例５ 組換えプラスミドｐＬＧ
Ｃ−ｘ１の造成 参考例４により得られたｐＬＧＣ：Ｓｃ１１（４．０Ｋ
ｂ）をもつ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を培養し、培養菌体
から常法によりｐＬＧＣ：Ｓｃ１１ＤＮＡを調製した。 得られたｐＬＧＣ：Ｓｃ１１ＤＮＡ １０μｇをＹ−
１００緩衝液１００μｌに溶かし、制限酵素Ｂｇｌ Ｉ
Ｉ １０単位を加え３７℃で１時間切断反応を行った（
この条件でｐＬＧＣ：Ｓｃ１１ＤＮＡはＢｇｌ ＩＩ
により部分切断された）。フェノール抽出、クロロホル
ム抽出の後、エタノール沈澱によりＤＮＡ断片約８．
０μｇを精製回収した。この４． ０ＫｂのＤＮＡ断片
約８． ０μｇを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７． ８）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２ および６ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノールを含む溶液に溶かし、
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰをそれぞれ１
ｍＭになるように加え（全量１６０μｌ）、さらに、５
単位のクレノー断片（宝酒造社製）を加えて室温で１時
間反応させた。フェノール抽出、クロロホルム抽出の後
、エタノール沈澱によりＤＮＡ断片約６．０μｇを回収
した。該ＤＮＡ断片６．０μｇを全量１２０μｌのＹ−
１００緩衝液に溶かし、１２単位のＢａｍＨＩを加え、
３７℃で３時間切断反応を行った。この反応液からＬＧ
Ｔ法により、ＵＬ−ＣポリペプチドのＮ末端の一部を除
く全領域をを含む約９５０ｂｐのＤＮＡ断片〔ＢｇｌＩ
Ｉ（部分切断）−クレノー断片−ＢａｍＨＩ断片〕約０
．１μｇを得た。
Ｃ−ｘ１の造成 参考例４により得られたｐＬＧＣ：Ｓｃ１１（４．０Ｋ
ｂ）をもつ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を培養し、培養菌体
から常法によりｐＬＧＣ：Ｓｃ１１ＤＮＡを調製した。 得られたｐＬＧＣ：Ｓｃ１１ＤＮＡ １０μｇをＹ−
１００緩衝液１００μｌに溶かし、制限酵素Ｂｇｌ Ｉ
Ｉ １０単位を加え３７℃で１時間切断反応を行った（
この条件でｐＬＧＣ：Ｓｃ１１ＤＮＡはＢｇｌ ＩＩ
により部分切断された）。フェノール抽出、クロロホル
ム抽出の後、エタノール沈澱によりＤＮＡ断片約８．
０μｇを精製回収した。この４． ０ＫｂのＤＮＡ断片
約８． ０μｇを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７． ８）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２ および６ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノールを含む溶液に溶かし、
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰをそれぞれ１
ｍＭになるように加え（全量１６０μｌ）、さらに、５
単位のクレノー断片（宝酒造社製）を加えて室温で１時
間反応させた。フェノール抽出、クロロホルム抽出の後
、エタノール沈澱によりＤＮＡ断片約６．０μｇを回収
した。該ＤＮＡ断片６．０μｇを全量１２０μｌのＹ−
１００緩衝液に溶かし、１２単位のＢａｍＨＩを加え、
３７℃で３時間切断反応を行った。この反応液からＬＧ
Ｔ法により、ＵＬ−ＣポリペプチドのＮ末端の一部を除
く全領域をを含む約９５０ｂｐのＤＮＡ断片〔ＢｇｌＩ
Ｉ（部分切断）−クレノー断片−ＢａｍＨＩ断片〕約０
．１μｇを得た。
【００４６】別に、ｐＧＥＬ１ ２μｇをＹ−１００緩
衝液４０μｌに溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ 、Ｐ
ｓｔＩおよびＢａｍＨＩそれぞれ４単位ずつを加え３７
℃で３時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法
により、リポプロテイン由来ターミネーターを含む１．
７ＫｂのＤＮＡ断片（ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片）約０
．７μｇを得た。
衝液４０μｌに溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ 、Ｐ
ｓｔＩおよびＢａｍＨＩそれぞれ４単位ずつを加え３７
℃で３時間切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法
により、リポプロテイン由来ターミネーターを含む１．
７ＫｂのＤＮＡ断片（ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片）約０
．７μｇを得た。
【００４７】また、特開昭５８−１１０６００号公報記
載の方法で調製したｐＫＹＰ１０３μｇをＹ−１００緩
衝液に溶かし、制限酵素Ｂａｎ ＩＩＩ（東洋紡績社製
）とＰｓｔＩをそれぞれ６単位ずつ加え３７℃で３時間
切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によりトリ
プトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ）を含む約１． １
ＫｂのＤＮＡ断片（ＢａｎＩＩＩ −ＰｓｔＩ断片）約
０．６μｇを得た。
載の方法で調製したｐＫＹＰ１０３μｇをＹ−１００緩
衝液に溶かし、制限酵素Ｂａｎ ＩＩＩ（東洋紡績社製
）とＰｓｔＩをそれぞれ６単位ずつ加え３７℃で３時間
切断反応を行った。この反応液からＬＧＴ法によりトリ
プトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ）を含む約１． １
ＫｂのＤＮＡ断片（ＢａｎＩＩＩ −ＰｓｔＩ断片）約
０．６μｇを得た。
【００４８】一方、ポリユビキチンペプチド（ＵＬ−Ｃ
）のＮ末端であるＭｅｔ（ＡＴＧ）から、２番目のアミ
ノ酸であるＧｌｎ（ＣＡＧ）の２番目の塩基（ＣＡ）ま
でを付与する必要があること、また、Ｐｔｒｐ下流のＳ
Ｄ配列とＡＴＧとの距離は、６〜１８ｂｐの間の適当な
長さにする必要があることなどの理由から、配列番号４
および配列番号５に示したＤＮＡリンカーを合成した。 まず、一本鎖ＤＮＡ、１３−ｍｅｒと１５−ｍｅｒを通
常のトリエステル法により合成した。１３−ｍｅｒおよ
び１５−ｍｅｒの各２０ピコモルを５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７． ５）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２ 、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
および１ｍＭ ＡＴＰを含む全量４０μｌの溶液に溶
かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）１
単位を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った
。
）のＮ末端であるＭｅｔ（ＡＴＧ）から、２番目のアミ
ノ酸であるＧｌｎ（ＣＡＧ）の２番目の塩基（ＣＡ）ま
でを付与する必要があること、また、Ｐｔｒｐ下流のＳ
Ｄ配列とＡＴＧとの距離は、６〜１８ｂｐの間の適当な
長さにする必要があることなどの理由から、配列番号４
および配列番号５に示したＤＮＡリンカーを合成した。 まず、一本鎖ＤＮＡ、１３−ｍｅｒと１５−ｍｅｒを通
常のトリエステル法により合成した。１３−ｍｅｒおよ
び１５−ｍｅｒの各２０ピコモルを５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７． ５）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２ 、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
および１ｍＭ ＡＴＰを含む全量４０μｌの溶液に溶
かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）１
単位を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反応を行った
。
【００４９】次に、上記で得たｐＬＧＣ：Ｓｃ１１由来
のＢｇｌＩＩ（部分切断）−クレノー断片−ＢａｍＨＩ
断片（約９５０ｂｐ）０．１μｇとｐＧＥＬ１由来のＰ
ｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（約１．７Ｋｂ）０．１μｇお
よび発現ベクターｐＫＹＰ１０のＢａｎＩＩＩ −Ｐｓ
ｔＩ断片（約１．１Ｋｂ）０． ３μｇをＴ４リガーゼ
緩衝液２０μｌに溶かし、この混合溶液に上記ＤＮＡリ
ンカーを約１ピコモル加えた。この混合溶液をさらにＴ
４ＤＮＡリガーゼ５０単位を加え、４℃で１８時間反応
を行った。
のＢｇｌＩＩ（部分切断）−クレノー断片−ＢａｍＨＩ
断片（約９５０ｂｐ）０．１μｇとｐＧＥＬ１由来のＰ
ｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（約１．７Ｋｂ）０．１μｇお
よび発現ベクターｐＫＹＰ１０のＢａｎＩＩＩ −Ｐｓ
ｔＩ断片（約１．１Ｋｂ）０． ３μｇをＴ４リガーゼ
緩衝液２０μｌに溶かし、この混合溶液に上記ＤＮＡリ
ンカーを約１ピコモル加えた。この混合溶液をさらにＴ
４ＤＮＡリガーゼ５０単位を加え、４℃で１８時間反応
を行った。
【００５０】組換え体プラスミドを含む反応混合物を用
いて大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を形質転換し、Ａｐｒ の
コロニーを得た。このコロニーの培養菌体からプラスミ
ドを回収した。得られたプラスミドの構造は制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩで切断後、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により確認した。このプラスミ
ドをｐＬＧＣ−ｘ１と呼ぶ。ｐＬＧＣ−ｘ１のＨｉｎｄ
ＩＩＩ付近の塩基配列は配列番号６のとおりであること
をディデオキシ・シークエンス法で確認した。
いて大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株を形質転換し、Ａｐｒ の
コロニーを得た。このコロニーの培養菌体からプラスミ
ドを回収した。得られたプラスミドの構造は制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩで切断後、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により確認した。このプラスミ
ドをｐＬＧＣ−ｘ１と呼ぶ。ｐＬＧＣ−ｘ１のＨｉｎｄ
ＩＩＩ付近の塩基配列は配列番号６のとおりであること
をディデオキシ・シークエンス法で確認した。
【００５１】参考例６ ｐＬＧＣ−ｘ１を保有す
る大腸菌によるポリユビキチンペプチド（ＵＬ−Ｃ）の
生産および精製 参考例５で得られた組換え体プラスミドｐＬＧＣ−ｘ１
を持つ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株をＬＧ培地（バクトトリ
プトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グ
ルコース１ｇを水１リットルに溶かし、ＮａＯＨにてｐ
Ｈを７．０に調製した培地）で３７℃１８時間培養し、
この培養液５０ｍｌを２５μｇ／ｍｌのトリプトファン
と５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＭＣＧ培地（Ｎａ
２ ＨＰＯ４ ０．６％、ＫＨ２ ＰＯ４ ０．３％、
ＮａＣｌ ０．５％、カザミノ酸０．５％、ＭｇＳＯ
４１ｍＭ、ビタミンＢ１ ４μｇ／ｍｌを含むｐＨ７．
２の培地）１リットルに接種し、３０℃で４〜８時間培
養後、トリプトファンオペロンの誘導物質である３β−
インドール−アクリル酸（３β−ｉｎｄｏｌｅａｃｒｙ
ｌｉｃ ａｃｉｄ ）を１０μｇ／ｍｌになるように加
え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液をＨｉｔ
ａｃｈｉ ＲＰＲ１０ローターにて８，０００ｒｐｍ、
１０分間遠心して集菌し、ＰＢＳ溶液に再度懸濁し洗浄
した。洗浄菌体を蒸留水１００ｍｌに懸濁し、０℃で超
音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮＳＯＮＩＣ ＰＯＷＥＲ Ｃ
ＯＭＰＡＮＹ 社ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＣＥＬＬ ＤＩＳ
ＲＵＰＴＯＲ ２００ 、ＯＵＴＰＵＴ２で１０分間処
理）した。これをＨｉｔａｃｈｉ ＲＰＲＷ２０−２−
１０３ローターにて５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分
離することにより該ポリユビキチンを上清に分離抽出し
た。この遠心上清に、終濃度１ｍＭ ＤＦＰ、０．０
２ｍＭ Ｅ−６４、０．０１ｍＭペプスタチンになるよ
うに蛋白分解阻害剤を加えた（いずれの蛋白分解酵素阻
害剤も終濃度の１，０００倍濃度の原液を使用した）。 さらに、６．６Ｍ尿素、１．１％ ２−メルカプトエ
タノール、１．１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ１１ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．５）を９倍量加えた。４℃で一晩浸
透した後、Ｈｉｔａｃｈｉ ＲＰＲ１０ローターにて８
，０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離することにより沈澱
物質を回収した。この沈澱物質を６Ｍ尿素、１％ ２
−メルカプトエタノール、１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液１リットル
に溶解し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰ
ＥＡＲＬ（東ソー社製）カラム（直径５０ｍｍ、長さ５
０ｃｍ）に流速１．８ｍｌ／ｍｉｎで通塔した。このカ
ラムに吸着せず素通った画分を集め精製標品とした。図
７に精製したポリユビキチンのＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動の結果を示した。ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動は、電気泳動用グラジェントゲルＳＤＳ−
ＰＡＧプレート１０／２０（第一化学薬品社製）を用い
、溝に精製標品０．５μｇを添加し、レムリーらの方法
〔ユウ・ケイ・レムリー（Ｕ． Ｋ． Ｌａｅｍｍｌｉ
）：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）， ２２７， ６８
０ （１９７０）〕に従って行った。分子量マーカーは
ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Ｌｏｗ ）（バイオ・
ラッド社製）を用いた。精製標品はＤＮＡの配列から予
想される分子量約２６，０００の付近に、単一のバンド
として検出された。さらに、この精製標品のアミノ酸配
列を、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製４７０Ａ型シーケンサーお
よびスペクトラ・フィジクス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙ
ｓｉｃｓ ）社製高速液体クロマトグラフィーとの組合
せによってＮ末端３０アミノ酸まで決定した。すなわち
、配列番号７であることが判明した。
る大腸菌によるポリユビキチンペプチド（ＵＬ−Ｃ）の
生産および精製 参考例５で得られた組換え体プラスミドｐＬＧＣ−ｘ１
を持つ大腸菌Ｃ６００ＳＦ８株をＬＧ培地（バクトトリ
プトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グ
ルコース１ｇを水１リットルに溶かし、ＮａＯＨにてｐ
Ｈを７．０に調製した培地）で３７℃１８時間培養し、
この培養液５０ｍｌを２５μｇ／ｍｌのトリプトファン
と５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＭＣＧ培地（Ｎａ
２ ＨＰＯ４ ０．６％、ＫＨ２ ＰＯ４ ０．３％、
ＮａＣｌ ０．５％、カザミノ酸０．５％、ＭｇＳＯ
４１ｍＭ、ビタミンＢ１ ４μｇ／ｍｌを含むｐＨ７．
２の培地）１リットルに接種し、３０℃で４〜８時間培
養後、トリプトファンオペロンの誘導物質である３β−
インドール−アクリル酸（３β−ｉｎｄｏｌｅａｃｒｙ
ｌｉｃ ａｃｉｄ ）を１０μｇ／ｍｌになるように加
え、さらに２〜１２時間培養を続けた。培養液をＨｉｔ
ａｃｈｉ ＲＰＲ１０ローターにて８，０００ｒｐｍ、
１０分間遠心して集菌し、ＰＢＳ溶液に再度懸濁し洗浄
した。洗浄菌体を蒸留水１００ｍｌに懸濁し、０℃で超
音波破砕（ＢＲＡＮＳＯＮＳＯＮＩＣ ＰＯＷＥＲ Ｃ
ＯＭＰＡＮＹ 社ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＣＥＬＬ ＤＩＳ
ＲＵＰＴＯＲ ２００ 、ＯＵＴＰＵＴ２で１０分間処
理）した。これをＨｉｔａｃｈｉ ＲＰＲＷ２０−２−
１０３ローターにて５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分
離することにより該ポリユビキチンを上清に分離抽出し
た。この遠心上清に、終濃度１ｍＭ ＤＦＰ、０．０
２ｍＭ Ｅ−６４、０．０１ｍＭペプスタチンになるよ
うに蛋白分解阻害剤を加えた（いずれの蛋白分解酵素阻
害剤も終濃度の１，０００倍濃度の原液を使用した）。 さらに、６．６Ｍ尿素、１．１％ ２−メルカプトエ
タノール、１．１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ１１ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．５）を９倍量加えた。４℃で一晩浸
透した後、Ｈｉｔａｃｈｉ ＲＰＲ１０ローターにて８
，０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離することにより沈澱
物質を回収した。この沈澱物質を６Ｍ尿素、１％ ２
−メルカプトエタノール、１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液１リットル
に溶解し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰ
ＥＡＲＬ（東ソー社製）カラム（直径５０ｍｍ、長さ５
０ｃｍ）に流速１．８ｍｌ／ｍｉｎで通塔した。このカ
ラムに吸着せず素通った画分を集め精製標品とした。図
７に精製したポリユビキチンのＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動の結果を示した。ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動は、電気泳動用グラジェントゲルＳＤＳ−
ＰＡＧプレート１０／２０（第一化学薬品社製）を用い
、溝に精製標品０．５μｇを添加し、レムリーらの方法
〔ユウ・ケイ・レムリー（Ｕ． Ｋ． Ｌａｅｍｍｌｉ
）：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）， ２２７， ６８
０ （１９７０）〕に従って行った。分子量マーカーは
ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Ｌｏｗ ）（バイオ・
ラッド社製）を用いた。精製標品はＤＮＡの配列から予
想される分子量約２６，０００の付近に、単一のバンド
として検出された。さらに、この精製標品のアミノ酸配
列を、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製４７０Ａ型シーケンサーお
よびスペクトラ・フィジクス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙ
ｓｉｃｓ ）社製高速液体クロマトグラフィーとの組合
せによってＮ末端３０アミノ酸まで決定した。すなわち
、配列番号７であることが判明した。
【００５２】
【発明の効果】本発明によれば、全身性エリテマトーデ
ス患者の血清診断を簡便に効率よく行うことができる。
ス患者の血清診断を簡便に効率よく行うことができる。
【図１】 プラスミドｐＬＧＣ：Ｓｃ１１の造成工程
を示すフローシートである。
を示すフローシートである。
【図２】 プラスミドｐＬＧＣ−ｘ１の造成工程を示
すフローシートである。
すフローシートである。
【図３】 兎抗ユビキチンポリクローナル抗体に対す
る抗原蛋白質の反応性を、ユビキチンとポリユビキチン
とで比較した図である。
る抗原蛋白質の反応性を、ユビキチンとポリユビキチン
とで比較した図である。
【図４】 本発明方法による血清の全身性エリテマト
ーデス診断の結果を示す。
ーデス診断の結果を示す。
【図５】 オカヤマ−バーグによるｃＤＮＡ合成と、
該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造成過程の概略を
示す。
該ＤＮＡを含む組換え体プラスミドの造成過程の概略を
示す。
【図６】 ｐＬＧＡ８、ｐＬＧＢ１２、ｐＬＧＣ１５
に含まれるｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。
に含まれるｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。
【図７】 精製ポリユビキチンをＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動し蛋白染色した染色像である。
ルアミド電気泳動し蛋白染色した染色像である。
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：７６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌ
ｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １
５
１０ １５ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｐ
２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ ３５
４０
４５ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
５０ ５５
６０ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａ
ｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ６５
７０
配列番号：２ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ配列 ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＴＣ ＴＴＣ ＧＴＧ ＡＡＧ Ａ
ＣＣ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＡＧ ＡＣＣ ＡＴ
Ｃ ＡＣＣ ＣＴＣ ４５ Ｍｅｔ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ １
５ １０
１５ 配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ配列 ＡＴＨ ＣＡＲ ＧＡＹ ＡＡＲ ＧＡＲ ＧＧ
１７ Ｉｌｅ
Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ １
５ 配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴ ＡＴＧ ＣＡ
１５
Ｍｅｔ １ 配列番号：５ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＧＣＡＴＡＡＧＣＴ ＴＡＴ
１３ 配列番
号：６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴ ＡＴＧ ＣＧＡ ＡＴＣ ＴＴ
Ｃ ＧＴＧ
２５
Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖ
ａｌ １
５配列番号：７ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌ
ｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １
５
１０ １５ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｘａａ Ａｓｐ Ｘａａ Ｉｌ
ｅ Ｘａａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｘａａ Ａｌａ Ｘａａ
Ｉｌｅ ２０
２５
３０ 配列番号：８ 配列の長さ：４７１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 セルライン：Ｋ５６２ 配列 ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＴＴ ＴＴＣ ＧＴＧ ＡＡＡ Ａ
ＣＣ ＣＴＴ ＡＣＧ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＣＣ ＡＴ
Ｃ ＡＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ４８ Ｍｅｔ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １
５ １０
１５ ＧＴＴ Ｇ
ＡＡ ＣＣＣ ＴＣＧ ＧＡＴ ＡＣＧ ＡＴＡ ＧＡ
Ａ ＡＡＴ ＧＴＡ ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＡＧ ＡＴＣ
ＣＡＧ ＧＡＴ ９６ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａ
ｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ａｓｐ ２０
２５
３０ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＧＡ Ａ
ＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＧ
Ａ ＣＴＧ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＡＧ
１４４ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
３５
４０ ４５
ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＣＧＴ Ａ
ＣＴ ＴＴＧ ＴＣＴ ＧＡＣ ＴＡＣ ＡＡＴ ＡＴ
Ｔ ＣＡＡ ＡＡＧ ＧＡＧ １９２ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ ５０
５５
６０ ＴＣＴ ＡＣＴ ＣＴＴ ＣＡＴ
ＣＴＴ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＧＡ ＣＴＴ ＣＧＴ Ｇ
ＧＴ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＧＧ
２４０ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ ６５
７０
７５
８０ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＴＣＴ Ｔ
ＡＣ ＡＣＣ ＡＣＴ ＣＣＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡ
Ｔ ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＡＧ
２８８ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌ
ｙｓ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ
８５
９０
９５ ＡＡＧ ＧＴＴ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＣＴ Ｇ
ＴＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＴＡＴ ＡＡＧ ＧＴ
Ｇ ＧＡＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＧＣ ３３６
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａ
ｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ
１００ １０５
１１０ ＡＡＡ
ＡＴＴ ＡＧＴ ＣＧＣ ＣＴＴ ＣＧＴ ＣＧＡ Ｇ
ＡＧ ＴＧＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＴＧ
Ｔ ＧＧＴ ＧＣＴ ３８４ Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｙ Ａｌａ １１５
１２０
１２５ ＧＧＧ ＧＴＧ ＴＴＴ ＡＴＧ
ＧＣＡ ＡＧＴ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＡＧＡ Ｃ
ＡＴ ＴＡＴ ＴＧＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＧＴ
４３２ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｈｉｓ
Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｃｙｓ １
３０ １３５
１４０ ＴＧＴ ＣＴＧ
ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＧＴ ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＡＡ
ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＴＡＡ
４７１ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈ
ｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ １４５
１５０
１５５ 配列番号：９ 配列の長さ：２３４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 セルライン：Ｋ５６２ 配列 ＡＴＧ ＣＡＡ ＡＴＡ ＴＴＣ ＧＴＧ ＡＡＧ Ａ
ＣＣ ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＧＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＡＴ
Ｃ ＡＣＴ ＣＴＧ ＧＡＧ ４８ Ｍｅｔ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １
５ １０
１５ ＧＴＧ
ＧＡＧ ＣＣＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＴＣ Ｇ
ＡＡ ＡＡＴ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＡＧ ＡＴ
Ｃ ＣＡＡ ＧＡＴ ９６ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｎ Ａｓｐ ２０
２５
３０ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＧＣ
ＡＴＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＣＡＧ Ａ
ＧＧ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＡ
Ｇ １４４ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
３５
４０ ４５
ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＧＣ
ＡＣＴ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＡＣ ＴＡＣ ＡＡＣ Ａ
ＴＣ ＣＡＧ ＡＡＡ ＧＡＧ １９２ Ｇｌ
ｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ ５０
５５
６０ ＴＣＧ ＡＣＣ ＣＴＧ ＣＡＣ
ＣＴＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＴＧ ＡＧＧ
ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＧＴ ＴＡＡ
２３４ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｃｙｓ ６５
７０
７５ 配列番号：１０ 配列の長さ：６９０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 セルライン：Ｋ５６２ 配列
ｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌ
ｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １
５
１０ １５ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｉｌ
ｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｓｐ
２０ ２５
３０ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ ３５
４０
４５ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
５０ ５５
６０ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａ
ｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ６５
７０
配列番号：２ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ配列 ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＴＣ ＴＴＣ ＧＴＧ ＡＡＧ Ａ
ＣＣ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＡＧ ＡＣＣ ＡＴ
Ｃ ＡＣＣ ＣＴＣ ４５ Ｍｅｔ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ １
５ １０
１５ 配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ配列 ＡＴＨ ＣＡＲ ＧＡＹ ＡＡＲ ＧＡＲ ＧＧ
１７ Ｉｌｅ
Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ １
５ 配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴ ＡＴＧ ＣＡ
１５
Ｍｅｔ １ 配列番号：５ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＧＣＡＴＡＡＧＣＴ ＴＡＴ
１３ 配列番
号：６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴ ＡＴＧ ＣＧＡ ＡＴＣ ＴＴ
Ｃ ＧＴＧ
２５
Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖ
ａｌ １
５配列番号：７ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌ
ｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １
５
１０ １５ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｘａａ Ａｓｐ Ｘａａ Ｉｌ
ｅ Ｘａａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｘａａ Ａｌａ Ｘａａ
Ｉｌｅ ２０
２５
３０ 配列番号：８ 配列の長さ：４７１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 セルライン：Ｋ５６２ 配列 ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＴＴ ＴＴＣ ＧＴＧ ＡＡＡ Ａ
ＣＣ ＣＴＴ ＡＣＧ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＣＣ ＡＴ
Ｃ ＡＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ４８ Ｍｅｔ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １
５ １０
１５ ＧＴＴ Ｇ
ＡＡ ＣＣＣ ＴＣＧ ＧＡＴ ＡＣＧ ＡＴＡ ＧＡ
Ａ ＡＡＴ ＧＴＡ ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＡＧ ＡＴＣ
ＣＡＧ ＧＡＴ ９６ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａ
ｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｎ Ａｓｐ ２０
２５
３０ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＧＡ Ａ
ＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＧ
Ａ ＣＴＧ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＡＧ
１４４ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
３５
４０ ４５
ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＣＧＴ Ａ
ＣＴ ＴＴＧ ＴＣＴ ＧＡＣ ＴＡＣ ＡＡＴ ＡＴ
Ｔ ＣＡＡ ＡＡＧ ＧＡＧ １９２ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ ５０
５５
６０ ＴＣＴ ＡＣＴ ＣＴＴ ＣＡＴ
ＣＴＴ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＧＡ ＣＴＴ ＣＧＴ Ｇ
ＧＴ ＧＧＴ ＧＣＴ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＧＧ
２４０ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ ６５
７０
７５
８０ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＴＣＴ Ｔ
ＡＣ ＡＣＣ ＡＣＴ ＣＣＣ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡ
Ｔ ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＡＧ
２８８ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌ
ｙｓ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ
８５
９０
９５ ＡＡＧ ＧＴＴ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＣＴ Ｇ
ＴＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＴＡＴ ＡＡＧ ＧＴ
Ｇ ＧＡＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＧＣ ３３６
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａ
ｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ
１００ １０５
１１０ ＡＡＡ
ＡＴＴ ＡＧＴ ＣＧＣ ＣＴＴ ＣＧＴ ＣＧＡ Ｇ
ＡＧ ＴＧＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＴＧ
Ｔ ＧＧＴ ＧＣＴ ３８４ Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｙ Ａｌａ １１５
１２０
１２５ ＧＧＧ ＧＴＧ ＴＴＴ ＡＴＧ
ＧＣＡ ＡＧＴ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＡＧＡ Ｃ
ＡＴ ＴＡＴ ＴＧＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＧＴ
４３２ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｈｉｓ
Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｃｙｓ １
３０ １３５
１４０ ＴＧＴ ＣＴＧ
ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＧＴ ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＡＡ
ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＴＡＡ
４７１ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈ
ｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ １４５
１５０
１５５ 配列番号：９ 配列の長さ：２３４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 セルライン：Ｋ５６２ 配列 ＡＴＧ ＣＡＡ ＡＴＡ ＴＴＣ ＧＴＧ ＡＡＧ Ａ
ＣＣ ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＧＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＡＴ
Ｃ ＡＣＴ ＣＴＧ ＧＡＧ ４８ Ｍｅｔ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １
５ １０
１５ ＧＴＧ
ＧＡＧ ＣＣＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＡＣＣ ＡＴＣ Ｇ
ＡＡ ＡＡＴ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＡＧ ＡＴ
Ｃ ＣＡＡ ＧＡＴ ９６ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ａｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇ
ｌｎ Ａｓｐ ２０
２５
３０ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＧＣ
ＡＴＣ ＣＣＣ ＣＣＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＣＡＧ Ａ
ＧＧ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＡ
Ｇ １４４ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
３５
４０ ４５
ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＧＣ
ＡＣＴ ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＡＣ ＴＡＣ ＡＡＣ Ａ
ＴＣ ＣＡＧ ＡＡＡ ＧＡＧ １９２ Ｇｌ
ｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ ５０
５５
６０ ＴＣＧ ＡＣＣ ＣＴＧ ＣＡＣ
ＣＴＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＴＧ ＡＧＧ
ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＧＴ ＴＡＡ
２３４ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｃｙｓ ６５
７０
７５ 配列番号：１０ 配列の長さ：６９０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起源 セルライン：Ｋ５６２ 配列
Claims (4)
- 【請求項１】 配列番号１に示されるペプチド配列を
３個含有してなる固相化ポリペプチドに、検体中の抗ユ
ビキチン抗体を結合させ、ついで標識物質で標識された
抗ヒトイムノグロブリン特異的抗体を該結合した抗ユビ
キチン抗体に結合させ、結合した抗ヒトイムノグロブリ
ン特異的抗体の標識物質を定量することを特徴とする抗
ユビキチン抗体の定量法。 - 【請求項２】 標識物質が、酵素、ビオチン、化学発
光物質および放射線化合物から選ばれる請求項１記載の
定量法。 - 【請求項３】 酵素が、ペルオキシダーゼ、ウレアー
ゼ、アルカリフォスファターゼおよびβ−ガラクトシダ
ーゼから選ばれる請求項２記載の定量法。 - 【請求項４】 配列番号１に示されるペプチドを３個
含有してなる固相化ポリペプチド、標識物質で標識した
抗ヒトイムノグロブリン特異的抗体、標識した標識物質
の定量システムからなる抗ユビキナン抗体定量用キット
。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3591191A JPH04297870A (ja) | 1991-03-01 | 1991-03-01 | 抗ユビキチン抗体の定量法 |
| EP19920103486 EP0502448A3 (en) | 1991-03-01 | 1992-02-28 | Method of assaying anti-ubiquitin antibody |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3591191A JPH04297870A (ja) | 1991-03-01 | 1991-03-01 | 抗ユビキチン抗体の定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04297870A true JPH04297870A (ja) | 1992-10-21 |
Family
ID=12455216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3591191A Withdrawn JPH04297870A (ja) | 1991-03-01 | 1991-03-01 | 抗ユビキチン抗体の定量法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0502448A3 (ja) |
| JP (1) | JPH04297870A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8518660B2 (en) * | 2010-06-24 | 2013-08-27 | Lifesensors, Inc. | Di- and poly-ubiquitin deubiquitinase substrates and uses thereof |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2646425B1 (fr) * | 1989-04-26 | 1991-08-30 | Neosystem Sa | Peptides synthetiques du conjugue de l'ubiquitine et de l'histone h2a |
-
1991
- 1991-03-01 JP JP3591191A patent/JPH04297870A/ja not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-02-28 EP EP19920103486 patent/EP0502448A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0502448A2 (en) | 1992-09-09 |
| EP0502448A3 (en) | 1993-01-20 |
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|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19980514 |