JPH04299985A - 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 - Google Patents
植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法Info
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- JPH04299985A JPH04299985A JP6294591A JP6294591A JPH04299985A JP H04299985 A JPH04299985 A JP H04299985A JP 6294591 A JP6294591 A JP 6294591A JP 6294591 A JP6294591 A JP 6294591A JP H04299985 A JPH04299985 A JP H04299985A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学的手法によ
り植物体に遺伝子を導入して新しい形質を持った新品種
を開発する際、その形質転換体を効率よく検出あるいは
確認するためのプローブとしてのオリゴヌクレオチドお
よびその検出方法に関するものである。 更に詳しく
は、組換え微生物などを用いて植物組織より形質転換組
織の誘導を行う場合、得られた組織が親植物の組織なの
か、形質転換した組織なのかを判断するのに極めて有効
なプローブとしてのオリゴヌクレオチドおよびその検出
方法に関するものである。
り植物体に遺伝子を導入して新しい形質を持った新品種
を開発する際、その形質転換体を効率よく検出あるいは
確認するためのプローブとしてのオリゴヌクレオチドお
よびその検出方法に関するものである。 更に詳しく
は、組換え微生物などを用いて植物組織より形質転換組
織の誘導を行う場合、得られた組織が親植物の組織なの
か、形質転換した組織なのかを判断するのに極めて有効
なプローブとしてのオリゴヌクレオチドおよびその検出
方法に関するものである。
【０００２】
【従来技術】植物の品種改良技術において、近年では遺
伝子工学的手法により植物体へある種の外来遺伝子を導
入し、その遺伝子に特有な形質を発現させることによっ
て、既存種には無かった新しい形質を付加しようとする
試みが数多く為されている。組換え微生物として使用す
る微生物は、元来植物に能動的に感染する能力を持つ微
生物が適当であり、これがいわゆる植物病原性微生物と
呼ばれているものである。これらの微生物を植物の形質
転換に用いるには、植物への感染能は少なくとも維持し
た上で本来持つ病原性の発現を無くし、目的となる有用
な遺伝子の発現が望まれる。
伝子工学的手法により植物体へある種の外来遺伝子を導
入し、その遺伝子に特有な形質を発現させることによっ
て、既存種には無かった新しい形質を付加しようとする
試みが数多く為されている。組換え微生物として使用す
る微生物は、元来植物に能動的に感染する能力を持つ微
生物が適当であり、これがいわゆる植物病原性微生物と
呼ばれているものである。これらの微生物を植物の形質
転換に用いるには、植物への感染能は少なくとも維持し
た上で本来持つ病原性の発現を無くし、目的となる有用
な遺伝子の発現が望まれる。
【０００３】ここで、新しく得られた植物組織が真に形
質転換体であるか否かの確認は、導入確認・発現確認と
もに遺伝子レベルでの解析が必要となってくる。
質転換体であるか否かの確認は、導入確認・発現確認と
もに遺伝子レベルでの解析が必要となってくる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、現段階
においては、組換えＤＮＡ に用いる有用な遺伝子資源
の獲得に努めている段階であり、まだ実用化には達して
いないのが現状である。
においては、組換えＤＮＡ に用いる有用な遺伝子資源
の獲得に努めている段階であり、まだ実用化には達して
いないのが現状である。
【０００５】そこで、本発明は、遺伝子レベルで、植物
組織が真に形質転換体であるか否かを検出することを目
的とする。
組織が真に形質転換体であるか否かを検出することを目
的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するために鋭意研究を重ねてきたところ、オリゴヌ
クレオチドをプライマーとして用いた遺伝子増幅法によ
り、植物細胞付近に存在する特定遺伝子を効率よく検出
することを見いだし、さらに研究を重ねて本発明を完成
するに至った。ここに、遺伝子増幅法は、Ｓａｉｋｉ
らが開発したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ 法（以下、略してＰＣＲ 法；Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ． ２３０， １３５０ （１９８５））に基づ
き行っている。
達成するために鋭意研究を重ねてきたところ、オリゴヌ
クレオチドをプライマーとして用いた遺伝子増幅法によ
り、植物細胞付近に存在する特定遺伝子を効率よく検出
することを見いだし、さらに研究を重ねて本発明を完成
するに至った。ここに、遺伝子増幅法は、Ｓａｉｋｉ
らが開発したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ 法（以下、略してＰＣＲ 法；Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ． ２３０， １３５０ （１９８５））に基づ
き行っている。
【０００７】この方法では、ある特定のヌクレオチド配
列領域を検出する場合、その領域の一端は＋鎖を他端は
−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドを、一方のプライマーおよび他方のプライマー
として用意し、それらを熱変成により１本鎖状態にした
試料核酸に対して鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を１本鎖
に分離し、再度同様な反応を起こさせる。この一連の操
作を繰り返すことで、２つのプライマーに挟まれた領域
は確実に検出できるまでにコピー数が増大してくる。
列領域を検出する場合、その領域の一端は＋鎖を他端は
−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドを、一方のプライマーおよび他方のプライマー
として用意し、それらを熱変成により１本鎖状態にした
試料核酸に対して鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を１本鎖
に分離し、再度同様な反応を起こさせる。この一連の操
作を繰り返すことで、２つのプライマーに挟まれた領域
は確実に検出できるまでにコピー数が増大してくる。
【０００８】材料としては植物体のあらゆる組織、器官
、例えば脱分化細胞、腫瘍組織など、また根、茎、葉、
花弁などでもよい。これらの材料をＰＣＲ 反応の試料
として用いるには、植物材料から核酸成分を遊離させる
前処理が必要である。しかし、プライマーがハイブリダ
イズできる核酸は数分子から数十分子以上存在すればＰ
ＣＲ反応は進行するので、材料を酸素、界面活性剤、ア
ルカリ、あるいは機械的破砕などで短時間処理する簡単
な操作だけでＰＣＲ 反応を進行させるに十分な核酸量
を持った試料液が調製できる。
、例えば脱分化細胞、腫瘍組織など、また根、茎、葉、
花弁などでもよい。これらの材料をＰＣＲ 反応の試料
として用いるには、植物材料から核酸成分を遊離させる
前処理が必要である。しかし、プライマーがハイブリダ
イズできる核酸は数分子から数十分子以上存在すればＰ
ＣＲ反応は進行するので、材料を酸素、界面活性剤、ア
ルカリ、あるいは機械的破砕などで短時間処理する簡単
な操作だけでＰＣＲ 反応を進行させるに十分な核酸量
を持った試料液が調製できる。
【０００９】本発明でプライマーとして用いるオリゴヌ
クレオチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇ
ａｅのＤＮＡ にコードされている遺伝子であって、氷
核活性タンパク質の合成に関する遺伝子ｉｎａＺ（ｉｃ
ｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ
） （Ｎａｔｕｒｅ ３１７，６４５−６４８（’８５
） ）を標的とし、該遺伝子のヌクレオチド配列に相補
的な下記の（ａ）または（ｂ）配列を有するオリゴヌク
レオチド （５’）ｄ−ＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＡＣＴ
Ｇ （３’）……（ａ）（５’）ｄ−ＧＡＡＴＡＧＣＡ
ＴＣＡＴＧＡＣＧＣＣＡＧ （３’）……（ｂ）または
、Ｅｒｖｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａＡのＤＮＡ に
コードされている遺伝子であって、氷核活性タンパク質
の合成に関する遺伝子ｉｃｅＥ（ｉｃｅ ｎｕｃｌｅａ
ｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ）（Ｗａｒｒｅｎ
，Ｇ．Ｊ．＆ Ｃｏｒｏｔｔｏ，Ｃｏｒｏｔｔｏ．Ｌ．
Ｖ．Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ（’８９））を標的とし、
該遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な下記の（ｃ）ま
たは（ｄ）配列を有するオリゴヌクレオチド（５’）ｄ
−ＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＣＴＧ （３’
）……（ｃ）（５’）ｄ−ＧＴＴＡＧＴＣＣＧＴＴＣＴ
ＣＡＡＡＧＣＣ （３’）……（ｄ）が用いられる。
クレオチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇ
ａｅのＤＮＡ にコードされている遺伝子であって、氷
核活性タンパク質の合成に関する遺伝子ｉｎａＺ（ｉｃ
ｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ
） （Ｎａｔｕｒｅ ３１７，６４５−６４８（’８５
） ）を標的とし、該遺伝子のヌクレオチド配列に相補
的な下記の（ａ）または（ｂ）配列を有するオリゴヌク
レオチド （５’）ｄ−ＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＡＣＴ
Ｇ （３’）……（ａ）（５’）ｄ−ＧＡＡＴＡＧＣＡ
ＴＣＡＴＧＡＣＧＣＣＡＧ （３’）……（ｂ）または
、Ｅｒｖｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａＡのＤＮＡ に
コードされている遺伝子であって、氷核活性タンパク質
の合成に関する遺伝子ｉｃｅＥ（ｉｃｅ ｎｕｃｌｅａ
ｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ）（Ｗａｒｒｅｎ
，Ｇ．Ｊ．＆ Ｃｏｒｏｔｔｏ，Ｃｏｒｏｔｔｏ．Ｌ．
Ｖ．Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ（’８９））を標的とし、
該遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な下記の（ｃ）ま
たは（ｄ）配列を有するオリゴヌクレオチド（５’）ｄ
−ＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＣＴＧ （３’
）……（ｃ）（５’）ｄ−ＧＴＴＡＧＴＣＣＧＴＴＣＴ
ＣＡＡＡＧＣＣ （３’）……（ｄ）が用いられる。
【００１０】なお、本発明でプライマーとして用いるオ
リゴヌクレオチドは、特異性や検出感度および再現性か
ら考えて、少なくとも１５塩基から３０塩基程度までの
ヌクレオチド断片でよく、化学合成したものあるいは天
然のものどちらでもよい。
リゴヌクレオチドは、特異性や検出感度および再現性か
ら考えて、少なくとも１５塩基から３０塩基程度までの
ヌクレオチド断片でよく、化学合成したものあるいは天
然のものどちらでもよい。
【００１１】また、本発明における２つのプライマーと
は、例えば一方のプライマーがａ配列を含有するオリゴ
ヌクレオチドであれば、他方のプライマーはｂ配列を含
有するオリゴヌクレオチドである。
は、例えば一方のプライマーがａ配列を含有するオリゴ
ヌクレオチドであれば、他方のプライマーはｂ配列を含
有するオリゴヌクレオチドである。
【００１２】また、プライマーは検出用として特に標識
しなくてもよい。プライマーによって規定されているＤ
ＮＡ における増幅領域は５０塩基から２０００塩基と
なればよく、好ましくは２００ 塩基から３００ 塩基
程度である。
しなくてもよい。プライマーによって規定されているＤ
ＮＡ における増幅領域は５０塩基から２０００塩基と
なればよく、好ましくは２００ 塩基から３００ 塩基
程度である。
【００１３】鋳型依存性ヌクレオチドの重合反応には、
耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼを用いるが、この酵素は９
０〜９５℃の温度で活性が維持されるならば、何れの生
物種由来でもよい。この酵素は既知物質であり、例えば
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社製の物を用い
てもよい。熱変性温度は、通常９０〜９５℃、プライマ
ーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度は通
常３７〜６５℃、ヌクレオチド重合反応は通常５０〜７
５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ 反応を、試料
としてのＤＮＡ 重にもよるが、通常２０サイクル以上
で、好ましくは３０〜４５サイクル行って標的とするヌ
クレオチド断片のコピー数を増幅させる。検出に際して
は、酵素反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にか
ければ増幅されたヌクレオチド断片の存在およびその長
さが確認できる。
耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼを用いるが、この酵素は９
０〜９５℃の温度で活性が維持されるならば、何れの生
物種由来でもよい。この酵素は既知物質であり、例えば
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社製の物を用い
てもよい。熱変性温度は、通常９０〜９５℃、プライマ
ーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度は通
常３７〜６５℃、ヌクレオチド重合反応は通常５０〜７
５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ 反応を、試料
としてのＤＮＡ 重にもよるが、通常２０サイクル以上
で、好ましくは３０〜４５サイクル行って標的とするヌ
クレオチド断片のコピー数を増幅させる。検出に際して
は、酵素反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にか
ければ増幅されたヌクレオチド断片の存在およびその長
さが確認できる。
【００１４】その結果から、材料中に、プライマーが認
識すべき配列を持った核酸が存在していたか否か判定で
きる。この判定は、ＤＮＡ の有無を直接判定するもの
となる。
識すべき配列を持った核酸が存在していたか否か判定で
きる。この判定は、ＤＮＡ の有無を直接判定するもの
となる。
【００１５】なお、増幅されたヌクレオチド断片の検出
には、例えばアクリルアミド電気泳動など各種の電気泳
動やクロマトグラフィーも有効である。また、電気泳動
では、マーカーを入れて分子量を決定し、および／また
は臭化エチジウムなどを用いての核酸染色法を用いるこ
とにより、プライマーなどに標識をせずに検出を行うこ
とができる。
には、例えばアクリルアミド電気泳動など各種の電気泳
動やクロマトグラフィーも有効である。また、電気泳動
では、マーカーを入れて分子量を決定し、および／また
は臭化エチジウムなどを用いての核酸染色法を用いるこ
とにより、プライマーなどに標識をせずに検出を行うこ
とができる。
【００１６】
【作用】本発明によれば、ＰＣＲ 法により特定遺伝子
を増幅して、その遺伝子を検出しているので、遺伝子レ
ベルで形質転換体か否かの確認が可能となる。
を増幅して、その遺伝子を検出しているので、遺伝子レ
ベルで形質転換体か否かの確認が可能となる。
【００１７】
【実施例】（実験例１：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙ
ｒｉｎｇａｅのｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｇｅｎｅ の検出）試料の調製 タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．
Ｓａｍｓｕｎ）展開葉の表面に、一晩ＬＢ培地にて振
とう培養したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａ
ｅ ｓｔｒａｉｎ Ｎｉ２３培養懸濁液 ２μｌ を塗
布した。
ｒｉｎｇａｅのｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｇｅｎｅ の検出）試料の調製 タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．
Ｓａｍｓｕｎ）展開葉の表面に、一晩ＬＢ培地にて振
とう培養したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａ
ｅ ｓｔｒａｉｎ Ｎｉ２３培養懸濁液 ２μｌ を塗
布した。
【００１８】菌体懸濁液を塗布した中心点から半径２．
５ｍｍ の円盤状に葉を打ち抜き、１．５ｍｌ容のエッ
ペンドルフチューブにとり、緩衝液４０μｌ （０．１
Ｍ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ＰｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ７．
０）を加え０．５ｍｌ 容のエッペンドルフチューブで
粉砕した。
５ｍｍ の円盤状に葉を打ち抜き、１．５ｍｌ容のエッ
ペンドルフチューブにとり、緩衝液４０μｌ （０．１
Ｍ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ＰｈｏｓｐｈａｔｅｐＨ７．
０）を加え０．５ｍｌ 容のエッペンドルフチューブで
粉砕した。
【００１９】そこにＬｙｓｏｚｙｍｅ （１０ｍｇ／ｍ
ｌ） を ２μｌ 加え２５℃で１５分間インキューベ
ートした。続いてＡｌｋ−ＳＤＳ 溶液（０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨ ，１％ ＳＤＳ）を５０μｌ 加え、２５℃で
１０分間静置した。次に３Ｍ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａ
ｃｅｔａｔｅを３７．５μｌ 加え２５℃で１０分間静
置した。
ｌ） を ２μｌ 加え２５℃で１５分間インキューベ
ートした。続いてＡｌｋ−ＳＤＳ 溶液（０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨ ，１％ ＳＤＳ）を５０μｌ 加え、２５℃で
１０分間静置した。次に３Ｍ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａ
ｃｅｔａｔｅを３７．５μｌ 加え２５℃で１０分間静
置した。
【００２０】４ ℃１５，０００ｒｐｍ で２０分間遠
心分離を行って上清を回収し、０．５ 容の２−ｐｒｏ
ｐａｎｏｌを加え、２０℃１５，０００ｒｐｍ で２分
間遠心分離を行った。得られた沈澱を７５％ ｅｔｈａ
−ｎｏｌで洗浄し乾燥後１ｍｌの蒸留水を加えて試料液
とした。
心分離を行って上清を回収し、０．５ 容の２−ｐｒｏ
ｐａｎｏｌを加え、２０℃１５，０００ｒｐｍ で２分
間遠心分離を行った。得られた沈澱を７５％ ｅｔｈａ
−ｎｏｌで洗浄し乾燥後１ｍｌの蒸留水を加えて試料液
とした。
【００２１】プライマーの合成
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅが保有する
ＤＮＡ の氷核活性タンパク質の合成に関する遺伝子ｉ
ｎａＺの塩基配列から、 （５’）ｄ−ＣＴＧＣＡＣ
ＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＡＣＴＧ （３’）……（ａ配列
；配列番号１）および、 （５’）ｄ−ＧＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＣＧＣ
ＣＡＧ （３’）……（ｂ配列；配列番号２）を選び、
それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し
、それぞれプライマー（ａ）およびプライマー（ｂ）と
した。化学合成にはＭＩＬＬＩＰＯＲＥ 社のＣｙｃｌ
ｏｎ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ を
用い、ホスフォネイト法により行った。合成したオリゴ
ヌクレオチドの精製にはＣ１８ 逆相カラムを用いた。
ＤＮＡ の氷核活性タンパク質の合成に関する遺伝子ｉ
ｎａＺの塩基配列から、 （５’）ｄ−ＣＴＧＣＡＣ
ＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＡＣＴＧ （３’）……（ａ配列
；配列番号１）および、 （５’）ｄ−ＧＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＣＧＣ
ＣＡＧ （３’）……（ｂ配列；配列番号２）を選び、
それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し
、それぞれプライマー（ａ）およびプライマー（ｂ）と
した。化学合成にはＭＩＬＬＩＰＯＲＥ 社のＣｙｃｌ
ｏｎ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ を
用い、ホスフォネイト法により行った。合成したオリゴ
ヌクレオチドの精製にはＣ１８ 逆相カラムを用いた。
【００２２】ＰＣＲ
前記の試料液 ３μｌ を用い、それに滅菌蒸留水 １
４．５５μｌ 、１０×反応用緩衝液３ μｌ 、ｄＮ
ＴＰ溶液 ４．８μｌ 、ＮＰ４０溶液 ３μｌ 、プ
ライマー（ａ）０．７５μｌ 、プライマー（ｂ）０．
７５μｌ 、そして耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼ０．１
５μｌ を加え、３０μｌの反応液を調製した。この反
応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ 社）
を５０μｌ 重層した。
４．５５μｌ 、１０×反応用緩衝液３ μｌ 、ｄＮ
ＴＰ溶液 ４．８μｌ 、ＮＰ４０溶液 ３μｌ 、プ
ライマー（ａ）０．７５μｌ 、プライマー（ｂ）０．
７５μｌ 、そして耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼ０．１
５μｌ を加え、３０μｌの反応液を調製した。この反
応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ 社）
を５０μｌ 重層した。
【００２３】添加液の詳細は下記の通りである。
１０×反応用緩衝液；５００ｍＭ ＫＣｌ， １００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．３）， １５ｍＭ Ｍ
ｇＣ１２， ０．１ ％（ｗ／ｖ）ゼラチンＮＰ４０溶
液；ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ−４０， Ｔｗｅｅｎ ２０を
混合したもの（終濃度何れも０．０５％） ｄＮＴＰ溶液；ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ，
ｄＴＴＰを混合したもの（終濃度何れも１．２５ｍＭ） プライマー（ａ）及び（ｂ） ；前述した化学合成精製
品の各水溶液（５ＯＤＵ／ｍｌ） 耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼ；Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメ
ラーゼ（５ ｕｎｉｔ／ｍｌ； Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ） 。
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．３）， １５ｍＭ Ｍ
ｇＣ１２， ０．１ ％（ｗ／ｖ）ゼラチンＮＰ４０溶
液；ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ−４０， Ｔｗｅｅｎ ２０を
混合したもの（終濃度何れも０．０５％） ｄＮＴＰ溶液；ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ，
ｄＴＴＰを混合したもの（終濃度何れも１．２５ｍＭ） プライマー（ａ）及び（ｂ） ；前述した化学合成精製
品の各水溶液（５ＯＤＵ／ｍｌ） 耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼ；Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメ
ラーゼ（５ ｕｎｉｔ／ｍｌ； Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ） 。
【００２４】反応条件は、次の通りである。
熱変性；９４℃ １分
アニーリング；５５℃ １分
重合反応；７２℃ １分。
【００２５】熱変性からアニーリングを経て重合反応に
至る過程を１サイクル（所用時間５．７ 分）とし、こ
れを４２サイクル（総所用時間約４時間）反復した。こ
れらの操作は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒに上記反応
条件をプログラムして行った。
至る過程を１サイクル（所用時間５．７ 分）とし、こ
れを４２サイクル（総所用時間約４時間）反復した。こ
れらの操作は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ
社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒに上記反応
条件をプログラムして行った。
【００２６】検出
反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下の条件で行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下の条件で行った。
【００２７】アガロースゲルはゲル濃度 ２％（ｗ／ｖ
）とし、臭化エチジウム（０．５μｇ ／ｍｌ） を含
むものを用いた。泳動は定電圧１５０Ｖで３５分行った
。なお、操作方法ならびに他の条件は、ｍａｎｉａｔｉ
ｓなどによるＭｏｌｅｃｕｌａ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９
８２）に記載されていた技法で行った。反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
より、ゲル中、紫外線光などで検出されたヌクレオチド
断片の長さを算出した。
）とし、臭化エチジウム（０．５μｇ ／ｍｌ） を含
むものを用いた。泳動は定電圧１５０Ｖで３５分行った
。なお、操作方法ならびに他の条件は、ｍａｎｉａｔｉ
ｓなどによるＭｏｌｅｃｕｌａ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９
８２）に記載されていた技法で行った。反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
より、ゲル中、紫外線光などで検出されたヌクレオチド
断片の長さを算出した。
【００２８】結果
前述したように、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎ
ｇａｅのＤＮＡ におけるｉｎａＺ遺伝子は、すでに塩
基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド
、すなわち、ＰＣＲ によってプライマーが増幅させる
ヌクレオチドの大きさは推定できる。それによると、プ
ライマー（ａ）とプライマー（ｂ）を用いた場合、推定
１５５ 塩基対のヌクレオチドが増幅されたはずである
。この推定はアガロースゲル電気泳動の結果とよく一致
した。
ｇａｅのＤＮＡ におけるｉｎａＺ遺伝子は、すでに塩
基配列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド
、すなわち、ＰＣＲ によってプライマーが増幅させる
ヌクレオチドの大きさは推定できる。それによると、プ
ライマー（ａ）とプライマー（ｂ）を用いた場合、推定
１５５ 塩基対のヌクレオチドが増幅されたはずである
。この推定はアガロースゲル電気泳動の結果とよく一致
した。
【００２９】図１は、増幅されたヌクレオチド断片のア
ガロースゲル電気泳動の結果を示す。図中、（イ）はマ
ーカー（φ× １７４／ＨｉｎＣ ＩＩ）を、（ロ）は
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎ−ｇａｅ ｓｔｒ
ａｉｎ Ｎｉ２３ を、（ハ）はタバコ葉（対照）を、
（ニ）はタバコ感染葉を示す。
ガロースゲル電気泳動の結果を示す。図中、（イ）はマ
ーカー（φ× １７４／ＨｉｎＣ ＩＩ）を、（ロ）は
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎ−ｇａｅ ｓｔｒ
ａｉｎ Ｎｉ２３ を、（ハ）はタバコ葉（対照）を、
（ニ）はタバコ感染葉を示す。
【００３０】（実験例２：Ｅｒｖｉｎｉａ ｈｅｒｂｉ
ｃｏｌａ のｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｇｅｎｅ の検出）試料として、Ｅｒｖｉｎｉ
ａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ ｓｔｒａｉｎ Ｍ４２培養懸
濁液を使用し、プライマ−として、 （５’）ｄ−ＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡ
ＧＴＡＡＧＡＣＴＧ （３’）……（ｃ配列、配列番号
３） （５’）ｄ−ＧＴＴＡＧＴＣＣＧ
ＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＣ （３’）……（ｄ配列、配列
番号４）の塩基配列のものを合成した以外は、実験例１
と同様の手法で、試料の調整、プライマ−の合成、ＰＣ
Ｒ，検出を行った。
ｃｏｌａ のｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｇｅｎｅ の検出）試料として、Ｅｒｖｉｎｉ
ａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ ｓｔｒａｉｎ Ｍ４２培養懸
濁液を使用し、プライマ−として、 （５’）ｄ−ＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡ
ＧＴＡＡＧＡＣＴＧ （３’）……（ｃ配列、配列番号
３） （５’）ｄ−ＧＴＴＡＧＴＣＣＧ
ＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＣ （３’）……（ｄ配列、配列
番号４）の塩基配列のものを合成した以外は、実験例１
と同様の手法で、試料の調整、プライマ−の合成、ＰＣ
Ｒ，検出を行った。
【００３１】前述したように、Ｅｒｖｉｎｉａ ｈｅｒ
ｂｉｃｏｌａ のＤＮＡ におけるｉｃｅＥ遺伝子は、
すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌク
レオチド、すなわち、ＰＣＲ によってプライマーが増
幅させるヌクレオチドの大きさは推定できる。それによ
ると、プライマー（ｃ）とプライマー（ｄ）を用いた場
合、推定１８９ 塩基対のヌクレオチドが増幅されたは
ずである。この推定はアガロースゲル電気泳動の結果と
よく一致した。
ｂｉｃｏｌａ のＤＮＡ におけるｉｃｅＥ遺伝子は、
すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴヌク
レオチド、すなわち、ＰＣＲ によってプライマーが増
幅させるヌクレオチドの大きさは推定できる。それによ
ると、プライマー（ｃ）とプライマー（ｄ）を用いた場
合、推定１８９ 塩基対のヌクレオチドが増幅されたは
ずである。この推定はアガロースゲル電気泳動の結果と
よく一致した。
【００３２】図２は、増幅されたヌクレオチド断片のア
ガロースゲル電気泳動の結果を示す。図中、（イ）はマ
ーカー（φ× １７４／ＨｉｎＣ ＩＩ）を、（ロ）は
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎ−ｇａｅ ｓｔｒ
ａｉｎ Ｎｉ２３ を、（ハ）はタバコ葉（対照）を、
（ニ）はタバコ感染葉を示す。
ガロースゲル電気泳動の結果を示す。図中、（イ）はマ
ーカー（φ× １７４／ＨｉｎＣ ＩＩ）を、（ロ）は
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎ−ｇａｅ ｓｔｒ
ａｉｎ Ｎｉ２３ を、（ハ）はタバコ葉（対照）を、
（ニ）はタバコ感染葉を示す。
【００３３】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ の採用によりプラ
イマーが植物体の標的ヌクレオチドのコピー数を増幅す
る。 しかも増幅されるヌクレオチド配列は２本以上のプライ
マーの反応によって規定できるので、本発明に従えば形
質転換体から特定の外来遺伝子を高感度で容易に検出で
きるし、検出に際しては高い選択性が得られる。
イマーが植物体の標的ヌクレオチドのコピー数を増幅す
る。 しかも増幅されるヌクレオチド配列は２本以上のプライ
マーの反応によって規定できるので、本発明に従えば形
質転換体から特定の外来遺伝子を高感度で容易に検出で
きるし、検出に際しては高い選択性が得られる。
【００３４】本発明では、高い検出感度が得られるにも
かかわらず検出には多量の材料を必要とせず、材料の前
処理も簡便である。しかも、反応時間が短く、検出も簡
単な機材で済み、操作もまた容易なため、結果を得るま
での時間を大幅に短縮できる。 また、本発明では検
出にアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核
酸染色法を用いることで、プライマーなどに標識をせず
に検出が行え、しかもヌクレオチド断片の長さが確認で
きるので、結果の信頼性が高くなる。
かかわらず検出には多量の材料を必要とせず、材料の前
処理も簡便である。しかも、反応時間が短く、検出も簡
単な機材で済み、操作もまた容易なため、結果を得るま
での時間を大幅に短縮できる。 また、本発明では検
出にアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核
酸染色法を用いることで、プライマーなどに標識をせず
に検出が行え、しかもヌクレオチド断片の長さが確認で
きるので、結果の信頼性が高くなる。
【００３５】さらに、標的ヌクレオチドを持つ微生物の
検出に関しては、標的ヌクレオチドに高い選択性を持つ
ので、例えば組換え微生物による植物の形質転換実験な
どにおいて、微生物に標的ヌクレオチドを組み込んでい
れば植物体における微生物の存在指標として利用するこ
とが可能である。
検出に関しては、標的ヌクレオチドに高い選択性を持つ
ので、例えば組換え微生物による植物の形質転換実験な
どにおいて、微生物に標的ヌクレオチドを組み込んでい
れば植物体における微生物の存在指標として利用するこ
とが可能である。
【００３６】
【配列表】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ） ：１
配列の長さ ２０塩基配列の型
核酸鎖の数
一本鎖トポロジー 直鎖状
配列の種類 Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮ
Ａハイポセティカル配列 ＮＯアンチセンス
ＮＯ 起源 Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ配列の特徴
特徴を決定した方法 Ｓ配列
ＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＡ
ＣＴＧ
配列の長さ ２０塩基配列の型
核酸鎖の数
一本鎖トポロジー 直鎖状
配列の種類 Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮ
Ａハイポセティカル配列 ＮＯアンチセンス
ＮＯ 起源 Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ配列の特徴
特徴を決定した方法 Ｓ配列
ＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＡ
ＣＴＧ
【００３７】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
） ：２配列の長さ ２０塩基配列
の型 核酸鎖の数
一本鎖トポロジー
直鎖状配列の種類 Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ ＤＮＡハイポセティカル配列 ＮＯアン
チセンス ＮＯ 起源 Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ配列の特徴
特徴を決定した方法 Ｓ配列
ＧＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＣＧＣ
ＣＡＧ
） ：２配列の長さ ２０塩基配列
の型 核酸鎖の数
一本鎖トポロジー
直鎖状配列の種類 Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ ＤＮＡハイポセティカル配列 ＮＯアン
チセンス ＮＯ 起源 Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ配列の特徴
特徴を決定した方法 Ｓ配列
ＧＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＣＧＣ
ＣＡＧ
【００３８】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
） ：３配列の長さ ２０塩基配列
の型 核酸鎖の数
一本鎖トポロジー
直鎖状配列の種類 Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ ＤＮＡハイポセティカル配列 ＮＯアン
チセンス ＮＯ 起源 Ｅｒｖｉｎｉａ
ｈｅｒｂｉｃｏｌａ配列の特徴
特徴を決定した方法 Ｓ配列
ＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＣＴＧ
） ：３配列の長さ ２０塩基配列
の型 核酸鎖の数
一本鎖トポロジー
直鎖状配列の種類 Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ ＤＮＡハイポセティカル配列 ＮＯアン
チセンス ＮＯ 起源 Ｅｒｖｉｎｉａ
ｈｅｒｂｉｃｏｌａ配列の特徴
特徴を決定した方法 Ｓ配列
ＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＣＴＧ
【００３９】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ） ：
４配列の長さ ２０塩基配列の型
核酸鎖の数
一本鎖トポロジー 直鎖
状配列の種類 Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄ
ＮＡハイポセティカル配列 ＮＯアンチセン
ス ＮＯ 起源 Ｅｒｖｉｎｉａ
ｈｅｒｂｉｃｏｌａ配列の特徴
特徴を決定した方法 Ｓ配列
ＧＴＴＡＧＴＣＣＧＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＣ
４配列の長さ ２０塩基配列の型
核酸鎖の数
一本鎖トポロジー 直鎖
状配列の種類 Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄ
ＮＡハイポセティカル配列 ＮＯアンチセン
ス ＮＯ 起源 Ｅｒｖｉｎｉａ
ｈｅｒｂｉｃｏｌａ配列の特徴
特徴を決定した方法 Ｓ配列
ＧＴＴＡＧＴＣＣＧＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＣ
【図１】増幅された実験例１のヌクレオチド断片のアガ
ロースゲル電気泳動図である。
ロースゲル電気泳動図である。
【図２】増幅された実験例２のヌクレオチド断片のアガ
ロースゲル電気泳動図である。
ロースゲル電気泳動図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎ
ｇａｅのＤＮＡ にコードされている遺伝子であって、
氷核活性タンパク質の合成に関する遺伝子ｉｎａＺ（ｉ
ｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ
） を標的とし、該遺伝子のヌクレオチド配列に相補的
な下記の（ａ）または（ｂ）配列を有するオリゴヌクレ
オチド。 （５’）ｄ−ＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＡＣＴ
Ｇ （３’）……（ａ）（５’）ｄ−ＧＡＡＴＡＧＣＡ
ＴＣＡＴＧＡＣＧＣＣＡＧ （３’）……（ｂ）【請求
項２】 Ｅｒｖｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａＡのＤ
ＮＡ にコードされている遺伝子であって、氷核活性タ
ンパク質の合成に関する遺伝子ｉｃｅＥ（ｉｃｅ ｎｕ
ｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ） を標的
とし、該遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な下記の（
ｃ）または（ｄ）配列を有するオリゴヌクレオチド。 （５’）ｄ−ＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＣＴ
Ｇ （３’）……（ｃ）（５’）ｄ−ＧＴＴＡＧＴＣＣ
ＧＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＣ （３’）……（ｄ）【請求
項３】 植物細胞付近に存在する請求項１，２に記載
のいずれかの遺伝子を検出する方法であって、■試料中
の一本鎖状態の標的ヌクレオチド配列に、請求項１，２
に記載のいずれかのオリゴヌクレオチド（プライマー）
をハイブリダイズさせて、四種のヌクレオチドの重合反
応により鎖長反応を行い、■得られた二本鎖ヌクレオチ
ド配列を一本鎖に分離し、その相補鎖を他方のプライマ
ーによる鎖長反応の鋳型として機能させ、■これら二つ
のプライマーによる同時の鎖長反応および鎖長反応生成
物の鋳型からの分離操作を繰り返すことにより、特定の
ヌクレオチド断片のコピー数を増幅し、■増幅された該
ヌクレオチド断片を電気泳動またはクロマトグラフィー
により検出し、および、■該断片の分子量の決定および
／または核酸染色により、前記の試料中に認識されるべ
きヌクレオチド配列が存在しているか否かを判定するこ
との工程を包含することを特徴とする形質転換体の検出
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6294591A JP3094485B2 (ja) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6294591A JP3094485B2 (ja) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04299985A true JPH04299985A (ja) | 1992-10-23 |
| JP3094485B2 JP3094485B2 (ja) | 2000-10-03 |
Family
ID=13214955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6294591A Expired - Fee Related JP3094485B2 (ja) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3094485B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997037025A1 (en) * | 1996-04-02 | 1997-10-09 | Korea Institute Of Science And Technology | Surface anchoring vector and system for foreign proteins thereof |
| WO2025070271A1 (ja) * | 2023-09-26 | 2025-04-03 | 長瀬産業株式会社 | 氷核活性剤 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2376388C1 (ru) * | 2008-06-06 | 2009-12-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" | Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней овощных культур - грамотрицательной бактерии pseudomonas corrugata методом полимеразной цепной реакции |
-
1991
- 1991-03-27 JP JP6294591A patent/JP3094485B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997037025A1 (en) * | 1996-04-02 | 1997-10-09 | Korea Institute Of Science And Technology | Surface anchoring vector and system for foreign proteins thereof |
| US6071725A (en) * | 1996-04-02 | 2000-06-06 | Korea Institute Of Science And Technology | Vectors expressing ice nucleation protein fusions for cell surface anchoring of foreign proteins |
| WO2025070271A1 (ja) * | 2023-09-26 | 2025-04-03 | 長瀬産業株式会社 | 氷核活性剤 |
| JP2025053891A (ja) * | 2023-09-26 | 2025-04-07 | 長瀬産業株式会社 | 氷核活性剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3094485B2 (ja) | 2000-10-03 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |