JPH04356189A - 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学的手法によ
り植物体に遺伝子を導入して新しい形質を持った新品種
を開発する際、その形質転換体を効率よく検出あるいは
確認するためのプローブとしてのオリゴヌクレオチドお
よびその検出方法に関するものである。　　更に詳しく
は、組換え微生物などを用いて植物組織より形質転換組
織の誘導を行う場合、得られた組織が親植物の組織なの
か、形質転換した組織なのかを判断するのに極めて有効
なプローブとしてのオリゴヌクレオチドおよびその検出
方法に関するものである。

【０００２】

【従来技術】植物の品種改良技術において、近年では遺
伝子工学的手法により植物体へある種の外来遺伝子を導
入し、その遺伝子に特有な形質を発現させることによっ
て、既存種には無かった新しい形質を付加しようとする
試みが数多く為されている。組換え微生物として使用す
る微生物は、元来植物に能動的に感染する能力を持つ微
生物が適当であり、これがいわゆる植物病原性微生物と
呼ばれているものである。これらの微生物を植物の形質
転換に用いるには、植物への感染能は少なくとも維持し
た上で本来持つ病原性の発現を無くし、目的となる有用
な遺伝子の発現が望まれる。

【０００３】ここで、新しく得られた植物組織が真に形
質転換体であるか否かの確認は、導入確認・発現確認と
もに遺伝子レベルでの解析が必要となってくる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、現段階
においては、組換えＤＮＡ　に用いる有用な遺伝子資源
の獲得に努めている段階であり、まだ実用化には達して
いないのが現状である。

【０００５】そこで、本発明は、遺伝子レベルで、植物
組織が真に形質転換体であるか否かを検出することを目
的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するために鋭意研究を重ねてきたところ、オリゴヌ
クレオチドをプライマーとして用いた遺伝子増幅法によ
り、植物細胞付近に存在する特定遺伝子を効率よく検出
することを見いだし、さらに研究を重ねて本発明を完成
するに至った。ここに、遺伝子増幅法は、Ｓａｉｋｉ　
らが開発したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ　法（以下、略してＰＣＲ　法；Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ．　２３０，　１３５０　（１９８５））に基づ
き行っている。

【０００７】この方法では、ある特定のヌクレオチド配
列領域を検出する場合、その領域の一端は＋鎖を他端は
−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドを、一方のプライマーおよび他方のプライマー
として用意し、それらを熱変成により１本鎖状態にした
試料核酸に対して鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を１本鎖
に分離し、再度同様な反応を起こさせる。この一連の操
作を繰り返すことで、２つのプライマーに挟まれた領域
は確実に検出できるまでにコピー数が増大してくる。

【０００８】材料としては植物体のあらゆる組織、器官
、例えば脱分化細胞、腫瘍組織など、また根、茎、葉、
花弁などでもよい。これらの材料をＰＣＲ　反応の試料
として用いるには、植物材料から核酸成分を遊離させる
前処理が必要である。しかし、プライマーがハイブリダ
イズできる核酸は数分子から数十分子以上存在すればＰ
ＣＲ反応は進行するので、材料を酸素、界面活性剤、ア
ルカリ、あるいは機械的破砕などで短時間処理する簡単
な操作だけでＰＣＲ　反応を進行させるに十分な核酸量
を持った試料液が調製できる。

【０００９】本発明でプライマーとして用いるオリゴヌ
クレオチドは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚ
ｏｇｅｎｅｓのＤＮＡ　にコードされている遺伝子であ
って、植物への遺伝子導入に関する遺伝子（Ｎａｔｕｒ
ｅ　３１９，４２２−４２７（’８６）　　Ｂｏｕｃｈ
ｅｚ　Ｄ．＆Ｃａｍｉｌｌｉｅｒｉ　ｃ．’８９　Ｕｎ
ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）　を標的とし、該遺伝子のヌクレ
オチド配列に相補的な下記の（ａ）〜（ｆ）配列を有す
るオリゴヌクレオチド 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴ
ＧＣＡＧＴ　（３’）……（ａ　　配列番号１）　　　
　　　　　（５’）ｄ−ＣＧＣＡＣＧＡＣＣＣＡＴＴＧ
Ｇ　　（３’）……（ｂ　　配列番号２）　　　　　　
　　（５’）ｄ−ＧＣＣＡＡＧＣＡＡＧＧＴＴＧＴＧ　
（３’）……（ｃ　　配列番号３）　　　　　　　　（
５’）ｄ−ＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＣＴＴＧＧＣ　（３’
）……（ｄ　　配列番号４）　　　　　　　　（５’）
ｄ−ＣＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＡＡＧ　　（３’）……
（ｅ　　配列番号５）　　　　　　　　（５’）ｄ−Ｇ
ＧＣＴＣＣＧＧＴＧＡＧＧＡＧ　　（３’）……（ｆ　
　配列番号６）が用いられる。

【００１０】これらのオリゴヌクレオチドは植物への遺
伝子導入に関する遺伝子であって、認識する領域は各々
のオリゴヌクレオチドにより特異的である。つまりプラ
イマー（ａ）　とプライマー（ｃ）　はＴＬ−ＤＮＡの
ＲＯＬＢ遺伝子の前半を、プライマー（ｄ）　とプライ
マー（ｆ）　はＴＬ−ＤＮＡのＲＯＬＢ遺伝子の後半を
、プライマー（ｂ）　とプライマー（ｃ）　はＴＲ−Ｄ
ＮＡのＲＯＬＢ遺伝子の前半を、プライマー（ｄ）　と
プライマー（ｅ）　はＴＲ−ＤＮＡのＲＯＬＢ遺伝子の
後半を検出する。さらにプライマー（ａ）　とプライマ
ー（ｂ）　とプライマー（ｃ）　を混ぜてＰＣＲ　反応
を行えば、ＴＬ−ＤＮＡが存在すればプライマー（ａ）
　とプライマー（ｃ）　による増幅領域が、ＴＲ−ＤＮ
Ａが存在すればプライマー（ｂ）　とプライマー（ｃ）
による増幅領域が検出できる。プライマー（ｄ）　とプ
ライマー（ｅ）　とプライマー（ｆ）　についても同様
の結果が得られる。なおプライマー（ａ）　とプライマ
ー（ｆ）　はＴＬ−ＤＮＡのＲＯＬＢ遺伝子を、プライ
マー（ｂ）　とプライマー（ｅ）　はＴＲ−ＤＮＡのＲ
ＯＬＢ遺伝子を、検出することができる。つまり標的微
生物の遺伝子の存在タイプを識別可能である。

【００１１】また、本発明で用いるプライマーは、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＤＮ
Ａ　にコードされている遺伝子であって、矮化に関する
遺伝子（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６１，１０８−１
２１（’８６））を標的とし、該遺伝子のヌクレオチド
配列に相補的な下記の（ｇ）〜（ｒ）配列を有するオリ
ゴヌクレオチド 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧ
ＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧ　（３’）……（ｇ　　配列番号
７）　　　　　　　　（５’）ｄ−ＣＣＴＣＡＴＣＧＡ
ＧＡＧＴＣＡＣＡＴＣ　　　（３’）……（ｈ　　配列
番号８）　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＣＣＴＡＣＴ
ＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＴＣ　　（３’）……（ｉ　　
配列番号９）　　　　　　　　（５’）ｄ−ＣＧＡＴＴ
ＧＣＡＡＡＣＴＴＧＣＡＣＴＣＧ　　（３’）……（ｊ
　　配列番号１０）　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＡ
ＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧ　（３’）…
…（ｋ　　配列番号１１）　　　　　　　　（５’）ｄ
−ＣＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＡＡＴＡＴＣＣ　（３
’）……（ｌ　　配列番号１２）　　　　　　　　（５
’）ｄ−ＣＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡＧＴＣＡＣＡＴＣ　　
　（３’）……（ｍ　　配列番号１３）　　　　　　　
　（５’）ｄ−ＧＧＡＴＡＴＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＧ
ＡＧＧ　（３’）……（ｎ　　配列番号１４）　　　　
　　　　（５’）ｄ−ＣＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＴＧＣ
ＡＣＴＣＧ　　（３’）……（ｏ　　配列番号１５）　
　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＧＡＴＡＴＴＧＡＣＧＡ
ＡＧＡＡＧＧＡＧＧ　（３’）……（ｐ　　配列番号１
６）　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＡＴＧＴＧＡＣＡ
ＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧ　（３’）……（ｑ　　配列
番号１７）　　　　　　　　（５’）ｄ−ＣＧＡＴＴＧ
ＣＡＡＡＣＴＴＧＣＡＣＴＣＧ　　（３’）……（ｒ　
　配列番号１８）が用いられる。

【００１２】なお、本発明でプライマーとして用いるオ
リゴヌクレオチドは、特異性や検出感度および再現性か
ら考えて、少なくとも１５塩基から３０塩基程度までの
ヌクレオチド断片でよく、化学合成したものあるいは天
然のものどちらでもよい。

【００１３】また、本発明における２つのプライマーと
は、例えば一方のプライマーがａ配列を含有するオリゴ
ヌクレオチドであれば、他方のプライマーはｂ配列を含
有するオリゴヌクレオチドである。

【００１４】また、プライマーは検出用として特に標識
しなくてもよい。プライマーによって規定されているＤ
ＮＡ　における増幅領域は５０塩基から２０００塩基と
なればよく、好ましくは２００　塩基から３００　塩基
程度である。

【００１５】鋳型依存性ヌクレオチドの重合反応には、
耐熱性ＤＮＡ　ポリメラーゼを用いるが、この酵素は９
０〜９５℃の温度で活性が維持されるならば、何れの生
物種由来でもよい。この酵素は既知物質であり、例えば
Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製の物を用い
てもよい。熱変性温度は、通常９０〜９５℃、プライマ
ーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度は通
常３７〜６５℃、ヌクレオチド重合反応は通常５０〜７
５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ　反応を、試料
としてのＤＮＡ　重にもよるが、通常２０サイクル以上
で、好ましくは３０〜４５サイクル行って標的とするヌ
クレオチド断片のコピー数を増幅させる。検出に際して
は、酵素反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にか
ければ増幅されたヌクレオチド断片の存在およびその長
さが確認できる。

【００１６】その結果から、材料中に、プライマーが認
識すべき配列を持った核酸が存在していたか否か判定で
きる。この判定は、ＤＮＡ　の有無を直接判定するもの
となる。

【００１７】なお、増幅されたヌクレオチド断片の検出
には、例えばアクリルアミド電気泳動など各種の電気泳
動やクロマトグラフィーも有効である。また、電気泳動
では、マーカーを入れて分子量を決定し、および／また
は臭化エチジウムなどを用いての核酸染色法を用いるこ
とにより、プライマーなどに標識をせずに検出を行うこ
とができる。

【００１８】

【作用】本発明によれば、ＰＣＲ　法により特定遺伝子
を増幅して、その遺伝子を検出しているので、遺伝子レ
ベルで形質転換体か否かの確認が可能となる。

【００１９】

【実施例】

（実験例１） 試料の調製 ＬＢ培地にて振とう培養したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ｓｔｒａｉｎ　Ａ４培養懸
濁液５０μｌ　を、１．５ｍｌ　容のエッペンドルフチ
ューブにとり、そこにＬｙｓｏｚｙｍｅ　（１０ｍｇ／
ｍｌ）　を　２μｌ　加え２５℃で１５分間インキュー
ベートした。続いてＡｌｋ−ＳＤＳ　溶液（０．２Ｎ　
ＮａＯＨ　，１％　ＳＤＳ）を５０μｌ　加え、２５℃
で１０分間静置した。次に３Ｍ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍａ
ｃｅｔａｔｅを３７．５μｌ　加え２５℃で１０分間静
置した。

【００２０】４　℃１５，０００ｒｐｍ　で２０分間遠
心分離を行って上清を回収し、０．５　容の２−ｐｒｏ
ｐａｎｏｌを加え、２０℃１５，０００ｒｐｍ　で２分
間遠心分離を行った。得られた沈澱を７５％　ｅｔｈａ
−ｎｏｌで洗浄し乾燥後３０ｍｌの蒸留水を加えて試料
液とした。

【００２１】プライマーの合成 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが
保有する植物への遺伝子導入に関する遺伝子の塩基配列
から、 １　　　　　　（５’）ｄ−ＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＧ
ＣＡＧＴ　（３’）……（ａ）　　　　　　および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＣＣＡＡＧＣＡＡＧＧ
ＴＴＧＴＧ　（３’）……（ｃ）２　　　　　　（５’
）ｄ−ＣＧＣＡＣＧＡＣＣＣＡＴＴＧＧ　　（３’）…
…（ｂ）　　　　　　および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＣＣＡＡＧＣＡＡＧＧ
ＴＴＧＴＧ　（３’）……（ｃ）３　　　　　　（５’
）ｄ−ＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴ　（３’）…
…（ａ）　　　　　　　　（５’）ｄ−ＣＧＣＡＣＧＡ
ＣＣＣＡＴＴＧＧ　　（３’）……（ｂ）　　　　　　
および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＣＣＡＡＧＣＡＡＧＧ
ＴＴＧＴＧ　（３’）……（ｃ）４　　　　　　（５’
）ｄ−ＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＣＴＴＧＧＣ　（３’）…
…（ｄ）　　　　　　および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＣＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡ
ＴＡＡＧ　　（３’）……（ｅ）５　　　　　　（５’
）ｄ−ＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＣＴＴＧＧＣ　（３’）…
…（ｄ）　　　　　　および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＡ
ＧＧＡＧ　　（３’）……（ｆ）６　　　　　　（５’
）ｄ−ＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＣＴＴＧＧＣ　（３’）…
…（ｄ）　　　　　　　　（５’）ｄ−ＣＧＣＣＴＧＧ
ＣＧＧＡＴＡＡＧ　　（３’）……（ｅ）　　　　　　
および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＡ
ＧＧＡＧ　　（３’）……（ｆ）７　　　　　　（５’
）ｄ−ＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴ　（３’）…
…（ａ）　　　　　　および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＡ
ＧＧＡＧ　　（３’）……（ｆ）８　　　　　　（５’
）ｄ−ＣＧＣＡＣＧＡＣＣＣＡＴＴＧＧ　　（３’）…
…（ｂ）　　　　　　および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＣＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡ
ＴＡＡＧ　　（３’）……（ｅ）の８組を選出し、それ
と同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、そ
れぞれプライマー（ａ）からプライマー（ｆ）とした。 化学合成にはＭＩＬＬＩＰＯＲＥ　社のＣｙｃｌｏｎ　
ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用い、ホ
スフォネイト法により行った。合成したオリゴヌクレオ
チドの精製にはＣ１８　逆相カラムを用いた。

【００２２】ＰＣＲ 前記の試料液　３μｌ　を用い、それに滅菌蒸留水　１
４．５５μｌ　、１０×反応用緩衝液３　μｌ　、ｄＮ
ＴＰ溶液　４．８μｌ　、ＮＰ４０溶液　３μｌ　、プ
ライマー（ａ）０．７５μｌ　、プライマー（ｃ）０．
７５μｌ　、そして耐熱性ＤＮＡ　ポリメラーゼ０．１
５μｌ　を加え、３０μｌの反応液を調製した。プライ
マー（ｂ）およびプライマー（ｃ），プライマー（ｄ）
およびプライマー（ｅ），プライマー（ｄ）およびプラ
イマー（ｆ）についても同様の反応液を調整した。３種
類のプライマーの組合わせには、前記の試料液　３μｌ
　に滅菌蒸留水　１３．８　μｌ　、１０×反応用緩衝
液３　μｌ　、ｄＮＴＰ溶液　４．８μｌ　、ＮＰ４０
溶液　３μｌ　、プライマー（ａ）０．７５μｌ　、プ
ライマー（ｂ）０．７５μｌ　、プライマー（ｃ）０．
７５μｌ　、そして耐熱性ＤＮＡ　ポリメラーゼ０．１
５μｌ　を加え、３０μｌ　の反応液を調製した。プラ
イマー（ｄ）、プライマー（ｅ）およびプライマー（ｆ
）に関しても同様に行った。

【００２３】この反応液の入った容器にミネラルオイル
（ＳＩＧＭＡ　社）を５０μｌ　重層した。添加液の詳
細は下記の通りである。 １０×反応用緩衝液；５００ｍＭ　ＫＣｌ，　１００ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．３），　１５ｍＭ　Ｍ
ｇＣ１２，　０．１　％（ｗ／ｖ）ゼラチンＮＰ４０溶
液；ＮＯＮＩＤＥＴ　Ｐ−４０，　Ｔｗｅｅｎ　２０を
混合したもの（終濃度何れも０．０５％） ｄＮＴＰ溶液；ｄＡＴＰ，　ｄＣＴＰ，　ｄＧＴＰ，　
ｄＴＴＰを混合したもの（終濃度何れも１．２５ｍＭ） プライマー（ａ）及び（ｂ）　；前述した化学合成精製
品の各水溶液（５ＯＤＵ／ｍｌ） 耐熱性ＤＮＡ　ポリメラーゼ；Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメ
ラーゼ（５　ｕｎｉｔ／ｍｌ；　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍ
ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）　。

【００２４】反応条件は、次の通りである。 熱変性；９４℃　　１分 アニーリング；５５℃　　１分 重合反応；７２℃　　１分。

【００２５】熱変性からアニーリングを経て重合反応に
至る過程を１サイクル（所用時間５．７　分）とし、こ
れを４２サイクル（総所用時間約４時間）反復した。こ
れらの操作は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ
社製ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒに上記反応
条件をプログラムして行った。

【００２６】検出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下の条件で行った。

【００２７】アガロースゲルはゲル濃度　２％（ｗ／ｖ
）とし、臭化エチジウム（０．５μｇ　／ｍｌ）　を含
むものを用いた。泳動は定電圧１５０Ｖで３５分行った
。なお、操作方法ならびに他の条件は、ｍａｎｉａｔｉ
ｓなどによるＭｏｌｅｃｕｌａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９
８２）に記載されていた技法で行った。反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
より、ゲル中、紫外線光などで検出されたヌクレオチド
断片の長さを算出した。

【００２８】結果 前述したように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉ
ｚｏｇｅｎｅｓ　ｓｔｒａｉｎ　Ａ４のＤＮＡ　におけ
る植物への遺伝子導入に関する遺伝子は、すでに塩基配
列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、す
なわち、ＰＣＲ　によってプライマーが増幅させるヌク
レオチドの大きさは推定できる。それによると、プライ
マー（ａ）とプライマー（ｃ）を用いた場合、推定３０
０　塩基対のヌクレオチドが，プライマー（ｂ）とプラ
イマー（ｃ）を用いた場合、推定１９５　塩基対のヌク
レオチドが，プライマー（ｄ）とプライマー（ｅ）を用
いた場合、推定１５６　塩基対のヌクレオチドが，プラ
イマー（ｄ）とプライマー（ｆ）を用いた場合、推定２
５４　塩基対のヌクレオチドが，プライマー（ａ）とプ
ライマー（ｆ）を用いた場合、推定５３８　塩基対のヌ
クレオチドが，プライマー（ｂ）とプライマー（ｅ）を
用いた場合、推定３３５　塩基対のヌクレオチドが，プ
ライマー（ａ）とプライマー（ｂ）とプライマー（ｃ）
を用いた場合、推定３００　塩基対と推定１９５塩基対
のヌクレオチドが，プライマー（ｄ）とプライマー（ｅ
）とプライマー（ｆ）を用いた場合、推定２５４　塩基
対と推定１５６　塩基対のヌクレオチドが，増幅された
はずである。この推定はアガロースゲル電気泳動の結果
とよく一致した。

【００２９】図１は、増幅されたヌクレオチド断片のア
ガロースゲル電気泳動の結果を示す。図中、（イ）はマ
ーカー（φ×　１７４／ＨｉｎＣ　ＩＩ）を、（ロ）か
ら（リ）はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇ
ｅｎｅｓ　ｓｔｒａｉｎ　Ａ４であり各々用いたプライ
マーは順にａ−ｃ，ｂ−ｃ，ａ−ｂ−ｃ，ｄ−ｅ，ｄ−
ｆ，ｄ−ｅ−ｆ，ａ−ｆ，ｂ−ｅである。

【００３０】（実験例２） 試料の調整 タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ．
Ｓａｍｓｕｎ　）の展開葉を取り、流水および中性洗剤
で充分に洗浄した。次に７０％　エタノール溶液で３０
秒間、２％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に２０分間浸し
、滅菌を行った。滅菌した展開葉を滅菌水で充分に洗浄
し、ペーパータオル上で水分をよくきった後、ペーパパ
ンチを用いて葉脈を含むようにして円盤状のディスクを
打ち抜き、リーフディスクを作製した。アグロバクテリ
ウム培養培地（１％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ，０．
５％Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，１％ｓｕｃｒｏｓｅ
，１０ｍＭＭＭＥＳ，ｐＨ５．２）で一晩培養したＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ｓｔ
ｒａｉｎ　Ａ４培養液に作製したリーフディスクをアグ
ロバクテリウム培養液から取りだし、ディスク表裏面に
付着した余分な培養液を滅菌したろ紙で除いた後、滅菌
水のみを含む培養容器（プラステックス、東洋紡社）に
移植し、２５℃、２０００ｌｕｘ（１２ｈｒ／ｄａｙ）
　で３日間静置培養した。３％のショ糖、５００　μｇ
／ｍｌクラフォラン（ヘキスト社）を含むＬＳ液体倍地
を入れたプランテックスにディスクを移植し、同条件下
で培養を行ったところ、約２週間後に葉脈の切断面より
カルス状組織が現れ、約３週間目にそのカルス状組織よ
り毛状根の分化が認められた。

【００３１】得られた多数の毛状根の先端組織をそれぞ
れ約５ｍｍ　ずつ切取り、ＬＳ寒天倍地に移植、培養し
た。 生育が良い毛状根を１５回以上選抜することにより、無
菌の毛状根を得ることに成功した。

【００３２】タバコ毛状根約１０ｍｍを１．５ｍｌ　容
のエッペンドルフチューブにとり、緩衝液４０μｌ（０
．１ＭＰｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐＨ
７．０）を加え０．５ｍｌ　容のエッペンドルフチュー
ブで粉砕した。そこにＬｙｓｏｚｙｍｅ　（１０ｍｇ／
ｍｌ）　を　２μｌ　加え２５℃で１５分間インキュー
ベートした。続いてＡｌｋ−ＳＤＳ　溶液（０．２Ｎ　
ＮａＯＨ　，１％　ＳＤＳ）を５０μｌ　加え、２５℃
で１０分間静置した。次に３Ｍ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　
ａｃｅｔａｔｅを３７．５μｌ　加え２５℃で１０分間
静置した。

【００３３】４　℃１５，０００ｒｐｍ　で２０分間遠
心分離を行って上清を回収し、０．５　容の２−ｐｒｏ
ｐａｎｏｌを加え、２０℃１５，０００ｒｐｍ　で２分
間遠心分離を行った。得られた沈澱を７５％　ｅｔｈａ
−ｎｏｌで洗浄し乾燥後１ｍｌ　の蒸留水を加えて試料
液とした プライマーの合成 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが
保有する矮化に関する遺伝子の塩基配列から、 （５’）ｄ−ＧＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧ
ＡＧ　（３’）……（ｇ）および （５’）ｄ−ＣＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡＧＴＣＡＣＡＴＣ
　　　（３’）……（ｈ）を選び、実験例１と同様の手
法で合成を行った。

【００３４】ＰＣＲ 上記プライマー（ｇ），（ｈ）　を０．７５μｌ　加え
た以外は、実験例１と同様の手法で行った。

【００３５】検出 実験例１と同様の手法で行った。

【００３６】結果 前述したように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉ
ｚｏｇｅｎｅｓのＤＮＡ　における矮化に関する遺伝子
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、ＰＣＲ　によってプライマー
が増幅させるヌクレオチドの大きさは推定できる。それ
によると、プライマー（ｇ）とプライマー（ｈ）を用い
た場合、推定２６２　塩基対のヌクレオチドが増幅され
たはずである。この推定はアガロースゲル電気泳動の結
果とよく一致した。

【００３７】図２は、増幅されたヌクレオチド断片のア
ガロースゲル電気泳動の結果を示す。図中、（イ）はマ
ーカー（φ×　１７４／ＨｉｎＣ　ＩＩ）を、（ロ）は
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　
ｓｔｒａｉｎ　Ａ４を、（ハ）はタバコ葉（対照）を、
（ニ）はタバコ毛状根を示す。

【００３８】（実験例３） 試料の調整 ＬＢ培地にて振とう培養したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ培養懸濁液５０μｌ　を、実
験例１と同様の手法で調整した。

【００３９】プライマーの合成 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが
保有する矮化に関する遺伝子の塩基配列から、 １　　　　　　（５’）ｄ−ＧＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣ
ＡＧＣＧＡＴＧＡＧ　（３’）……（ｇ）　　　　およ
び 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＣＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡ
ＧＴＣＡＣＡＴＣ　　　（３’）……（ｈ）２　　　　
　　（５’）ｄ−ＧＣＣＴＡＣＴＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴ
ＴＴＣ　　（３’）……（ｉ）　　　　および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＣＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣ
ＴＴＧＣＡＣＴＣＧ　　（３’）……（ｊ）３　　　　
　　（５’）ｄ−ＧＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＡ
ＴＧＡＧ　（３’）……（ｋ）　　　　および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＣＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣ
ＧＴＣＡＡＴＡＴＣＣ　（３’）……（ｌ）４　　　　
　　（５’）ｄ−ＣＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡＧＴＣＡＣＡ
ＴＣ　　　（３’）……（ｍ）　　　　および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＧＡＴＡＴＴＧＡＣＧ
ＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧ　（３’）……（ｎ）５　　　　
　　（５’）ｄ−ＣＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＴＧＣＡＣ
ＴＣＧ　　（３’）……（ｏ）　　　　および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＧＧＡＴＡＴＴＧＡＣＧ
ＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧ　（３’）……（ｐ）６　　　　
　　（５’）ｄ−ＧＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＡ
ＴＧＡＧ　（３’）……（ｑ）　　　　および 　　　　　　　　（５’）ｄ−ＣＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣ
ＴＴＧＣＡＣＴＣＧ　　（３’）……（ｒ）の６組を選
出し、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学
合成し、それぞれプライマー（ｇ）からプライマー（ｒ
）とした。化学合成にはＭＩＬＬＩＰＯＲＥ　社のＣｙ
ｃｌｏｎ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ
を用い、ホスフォネイト法により行った。合成したオリ
ゴヌクレオチドの精製にはＣ１８　逆相カラムを用いた
。

【００４０】ＰＣＲ プライマーとして、前記（ｇ）から（ｒ）を用いた以外
は、実験例１と同様の手法により行った。

【００４１】検出 実験例１と同様の手法で行った。

【００４２】結果 前述したように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉ
ｚｏｇｅｎｅｓのＤＮＡ　における矮化に関する遺伝子
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、ＰＣＲ　によってプライマー
が増幅させるヌクレオチドの大きさは推定できる。それ
によると、プライマー（ｇ）とプライマー（ｈ）を用い
た場合、推定２６２　塩基対のヌクレオチドが、プライ
マー（ｉ）とプライマー（ｊ）を用いた場合、推定１６
９　塩基対のヌクレオチドが、プライマー（ｋ）とプラ
イマー（ｌ）を用いた場合、推定１１３　塩基対のヌク
レオチドが、プライマー（ｍ）とプライマー（ｎ）を用
いた場合、推定１７０　塩基対のヌクレオチドが、プラ
イマー（ｏ）とプライマー（ｐ）を用いた場合、推定３
９８　塩基対のヌクレオチドが、プライマー（ｑ）とプ
ライマー（ｒ）を用いた場合、推定４９０　塩基対のヌ
クレオチドが増幅されたはずである。この推定はアガロ
ースゲル電気泳動の結果とよく一致した。

【００４３】図３は、増幅されたヌクレオチド断片のア
ガロースゲル電気泳動の結果を示す。図中、（イ）はマ
ーカー（φ×　１７４／ＨｉｎＣ　ＩＩ）を、（ロ）か
ら（ト）はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇ
ｅｎｅｓ　ｓｔｒａｉｎ　Ａ４であり各々用いたプライ
マーは順にｇ−ｈ，ｉ−ｊ，ｋ−ｌ，ｍ−ｎ，ｏ−ｐ，
ｑ−ｒである。

【００４４】（実験例４） 試料の調整 タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ．
　Ｓａｍｓｕｎ）展開葉の表面に、一晩ＬＢ培地にて振
とう培養したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏ
ｇｅｎｅｓ　ｓｔｒａｉｎ　Ｍ１２３培養懸濁液　２μ
ｌ　を塗布した。　　菌体懸濁液を塗布した中心点から
半径２．５ｍｍ　の円盤状に葉を打ち抜き、１．５ｍｌ
　容のエッペンドルフチューブにとり、緩衝液４０μｌ
　（０．１Ｍ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ　ｐＨ７．０）を加え０．５ｍｌ　容のエッペンドル
フチューブで粉砕した。

【００４５】そこにＬｙｓｏｚｙｍｅ　（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）　を　２μｌ　加え２５℃で１５分間インキューベ
ートした。続いてＡｌｋ−ＳＤＳ　溶液（０．２Ｎ　Ｎ
ａＯＨ　，１％　ＳＤＳ）を５０μｌ　加え、２５℃で
１０分間静置した。次に３Ｍ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ａ
ｃｅｔａｔｅを３７．５μｌ　加え２５℃で１０分間静
置した。

【００４６】４　℃１５，０００ｒｐｍ　で２０分間遠
心分離を行って上清を回収し、０．５　容の２−ｐｒｏ
ｐａｎｏｌを加え、２０℃１５，０００ｒｐｍ　で２分
間遠心分離を行った。得られた沈澱を７５％　ｅｔｈａ
−ｎｏｌで洗浄し乾燥後１ｍｌの蒸留水を加えて試料液
とした。

【００４７】プライマーの合成 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが
保有する矮化に関する遺伝子の塩基配列から、 （５’）ｄ−ＧＣＣＴＡＣＴＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＴ
Ｃ　　（３’）……（ｉ）および （５’）ｄ−ＣＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＴＧＣＡＣＴＣ
Ｇ　　（３’）……（ｊ）を選び、それと同じ配列を持
つオリゴヌクレオチドを化学合成し、それぞれプライマ
ー（ｉ）からプライマー（ｊ）とした。化学合成にはＭ
ＩＬＬＩＰＯＲＥ社のＣｙｃｌｏｎｐｌｕｓ　ＤＮＡ　
ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　を用い、ホスフォネイト法に
より行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製にはＣ
１８　逆相カラムを用いた。

【００４８】ＰＣＲ プライマーとして、前記（ｉ）から（ｊ）を用いた以外
は、実験例１と同様の手法により行った。

【００４９】検出 実験例１と同様の手法で行った。

【００５０】結果 前述したように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉ
ｚｏｇｅｎｅｓのＤＮＡ　における矮化に関する遺伝子
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、ＰＣＲ　によってプライマー
が増幅させるヌクレオチドの大きさは推定できる。それ
によると、プライマー（ｉ）とプライマー（ｊ）を用い
た場合、推定１６９　塩基対のヌクレオチドが増幅され
たはずである。この推定はアガロースゲル電気泳動の結
果とよく一致した。

【００５１】図４は、増幅されたヌクレオチド断片のア
ガロースゲル電気泳動の結果を示す。図中、（イ）はマ
ーカー（φ×　１７４／ＨｉｎＣ　ＩＩ）を、（ロ）は
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　
ｓｔｒａｉｎ　Ｍ１２３を、（ハ）はタバコ葉（対照）
を、（ニ）はタバコ感染葉を示す。

【００５２】

【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ　の採用によりプラ
イマーが植物体の標的ヌクレオチドのコピー数を増幅す
る。 しかも増幅されるヌクレオチド配列は２本以上のプライ
マーの反応によって規定できるので、本発明に従えば形
質転換体から特定の外来遺伝子を高感度で容易に検出で
きるし、検出に際しては高い選択性が得られる。

【００５３】本発明では、高い検出感度が得られるにも
かかわらず検出には多量の材料を必要とせず、材料の前
処理も簡便である。しかも、反応時間が短く、検出も簡
単な機材で済み、操作もまた容易なため、結果を得るま
での時間を大幅に短縮できる。　　また、本発明では検
出にアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核
酸染色法を用いることで、プライマーなどに標識をせず
に検出が行え、しかもヌクレオチド断片の長さが確認で
きるので、結果の信頼性が高くなる。

【００５４】さらに、標的ヌクレオチドを持つ微生物の
検出に関しては、標的ヌクレオチドに高い選択性を持つ
ので、例えば組換え微生物による植物の形質転換実験な
どにおいて、微生物に標的ヌクレオチドを組み込んでい
れば植物体における微生物の存在指標として利用するこ
とが可能である。

【００５５】

【配列表】

配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　：１配列の長さ
　　　　　　　　　　１６塩基配列の型　　　　　　　
　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　　　　　一
本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状配列の種類
　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡハイポセ
ティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス　　　　　
　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＧＣ
ＡＧＴ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　：２配列
の長さ　　　　　　　　　　１５塩基配列の型　　　　
　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　　　
　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状配列
の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡハ
イポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス　　
　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＣＧＣＡＣＧＡＣＣＣＡＴＴ
ＧＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　：３配列の
長さ　　　　　　　　　　１６塩基配列の型　　　　　
　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　　　　
　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状配列の
種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡハイ
ポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス　　　
　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＧＣＣＡＡＧＣＡＡＧＧＴＴ
ＧＴＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　：４配列
の長さ　　　　　　　　　　１６塩基配列の型　　　　
　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　　　
　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状配列
の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡハ
イポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス　　
　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＣＴＴ
ＧＧＣ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　：５配列
の長さ　　　　　　　　　　１５塩基配列の型　　　　
　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　　　
　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状配列
の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡハ
イポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス　　
　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＣＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＡ
ＡＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　：６配列の
長さ　　　　　　　　　　１５塩基配列の型　　　　　
　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　　　　
　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状配列の
種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡハイ
ポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス　　　
　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＡＧＧ
ＡＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　：７配列の
長さ　　　　　　　　　　２１塩基配列の型　　　　　
　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　　　　　
　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖状配列の
種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡハイ
ポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセンス　　　
　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＧＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡ
ＧＣＧＡＴＧＡＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）
　：８配列の長さ　　　　　　　　　　１９塩基配列の
型　　　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　
　　　　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　
直鎖状配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ
　ＤＮＡハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチ
センス　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＣＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡＧＴ
ＣＡＣＡＴＣ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　：
９配列の長さ　　　　　　　　　　２０塩基配列の型　
　　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　　
　　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直鎖
状配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｄ
ＮＡハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセン
ス　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＧＣＣＴＡＣＴＴＣＧＣＴＧ
ＣＡＴＴＴＴＣ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　
：１０配列の長さ　　　　　　　　　　２０塩基配列の
型　　　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　
　　　　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　
直鎖状配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ
　ＤＮＡハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチ
センス　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＣＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＣＡＣＴＣＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　
：１１配列の長さ　　　　　　　　　　２１塩基配列の
型　　　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　
　　　　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　
直鎖状配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ
　ＤＮＡハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチ
センス　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＧＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡ
ＧＣＧＡＴＧＡＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）
　：１２配列の長さ　　　　　　　　　　２１塩基配列
の型　　　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　
　　　　　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　
　直鎖状配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ　ＤＮＡハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアン
チセンス　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＣＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴ
ＣＡＡＴＡＴＣＣ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）
　：１３配列の長さ　　　　　　　　　　１９塩基配列
の型　　　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　
　　　　　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　
　直鎖状配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ　ＤＮＡハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアン
チセンス　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＣＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡＧＴ
ＣＡＣＡＴＣ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　：
１４配列の長さ　　　　　　　　　　２１塩基配列の型
　　　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　　
　　　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　直
鎖状配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　
ＤＮＡハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチセ
ンス　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＧＧＡＴＡＴＴＧＡＣＧＡＡ
ＧＡＡＧＧＡＧＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）
　：１５配列の長さ　　　　　　　　　　２０塩基配列
の型　　　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　
　　　　　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　
　直鎖状配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ　ＤＮＡハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアン
チセンス　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＣＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＣＡＣＴＣＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）　
：１６配列の長さ　　　　　　　　　　２１塩基配列の
型　　　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　　
　　　　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　　
直鎖状配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉｃ
　ＤＮＡハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアンチ
センス　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＧＧＡＴＡＴＴＧＡＣＧＡＡ
ＧＡＡＧＧＡＧＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）
　：１７配列の長さ　　　　　　　　　　２１塩基配列
の型　　　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　
　　　　　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　
　直鎖状配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ　ＤＮＡハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアン
チセンス　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＧＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡ
ＧＣＧＡＴＧＡＧ配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）
　：１８配列の長さ　　　　　　　　　　２０塩基配列
の型　　　　　　　　　　　　核酸鎖の数　　　　　　
　　　　　　　　一本鎖トポロジー　　　　　　　　　
　直鎖状配列の種類　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ　ＤＮＡハイポセティカル配列　　　　　　ＮＯアン
チセンス　　　　　　　　ＮＯ 起源　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ配列の特徴　　　
　　　　　　　特徴を決定した方法　　Ｓ配列　　　　
　　　　　　　　　　　　ＣＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＴ
ＧＣＡＣＴＣＧ

【図面の簡単な説明】

【図１】増幅された実験例１のヌクレオチド断片のアガ
ロースゲル電気泳動図である。

【図２】増幅された実験例２のヌクレオチド断片のアガ
ロースゲル電気泳動図である。

【図３】増幅された実験例３のヌクレオチド断片のアガ
ロースゲル電気泳動図である。

【図４】増幅された実験例４のヌクレオチド断片のアガ
ロースゲル電気泳動図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉ
   ｚｏｇｅｎｅｓのＤＮＡ　にコードされている遺伝子で
   あって、植物への遺伝子導入に関する遺伝子を標的とし
   、該遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な下記の（ａ）
   〜（ｆ）配列を有するオリゴヌクレオチド。 （５’）ｄ−ＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴ　（３
   ’）……（ａ）（５’）ｄ−ＣＧＣＡＣＧＡＣＣＣＡＴ
   ＴＧＧ　　（３’）……（ｂ）（５’）ｄ−ＧＣＣＡＡ
   ＧＣＡＡＧＧＴＴＧＴＧ　（３’）……（ｃ）（５’）
   ｄ−ＣＡＣＡＡＣＣＴＴＧＣＴＴＧＧＣ　（３’）……
   （ｄ）（５’）ｄ−ＣＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＡＡＧ　
   　（３’）……（ｅ）（５’）ｄ−ＧＧＣＴＣＣＧＧＴ
   ＧＡＧＧＡＧ　　（３’）……（ｆ）
2. 【請求項２】　　
   Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの
   ＤＮＡ　にコードされている遺伝子であって、矮化に関
   する遺伝子を標的とし、該遺伝子のヌクレオチド配列に
   相補的な下記の（ｇ）〜（ｒ）配列を有するオリゴヌク
   レオチド。 （５’）ｄ−ＧＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧ
   ＡＧ　（３’）……（ｇ）（５’）ｄ−ＣＣＴＣＡＴＣ
   ＧＡＧＡＧＴＣＡＣＡＴＣ　　　（３’）……（ｈ）（
   ５’）ｄ−ＧＣＣＴＡＣＴＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＴＣ
   　　（３’）……（ｉ）（５’）ｄ−ＣＧＡＴＴＧＣＡ
   ＡＡＣＴＴＧＣＡＣＴＣＧ　　（３’）……（ｊ）（５
   ’）ｄ−ＧＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧ
   　（３’）……（ｋ）（５’）ｄ−ＣＣＴＣＣＴＴＣＴ
   ＴＣＧＴＣＡＡＴＡＴＣＣ　（３’）……（ｌ）（５’
   ）ｄ−ＣＣＴＣＡＴＣＧＡＧＡＧＴＣＡＣＡＴＣ　　　
   （３’）……（ｍ）（５’）ｄ−ＧＧＡＴＡＴＴＧＡＣ
   ＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧ　（３’）……（ｎ）（５’）
   ｄ−ＣＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＴＧＣＡＣＴＣＧ　　（
   ３’）……（ｏ）（５’）ｄ−ＧＧＡＴＡＴＴＧＡＣＧ
   ＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧ　（３’）……（ｐ）（５’）ｄ
   −ＧＡＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧ　（３
   ’）……（ｑ）（５’）ｄ−ＣＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴ
   ＴＧＣＡＣＴＣＧ　　（３’）……（ｒ）
3. 【請求項３】
   　　植物細胞付近に存在する請求項１，２に記載のいず
   れかの遺伝子を検出する方法であって、■試料中の一本
   鎖状態の標的ヌクレオチド配列に、請求項１，２に記載
   のいずれかのオリゴヌクレオチド（プライマー）をハイ
   ブリダイズさせて、四種のヌクレオチドの重合反応によ
   り鎖長反応を行い、■得られた二本鎖ヌクレオチド配列
   を一本鎖に分離し、その相補鎖を他方のプライマーによ
   る鎖長反応の鋳型として機能させ、■これら二つのプラ
   イマーによる同時の鎖長反応および鎖長反応生成物の鋳
   型からの分離操作を繰り返すことにより、特定のヌクレ
   オチド断片のコピー数を増幅し、■増幅された該ヌクレ
   オチド断片を電気泳動またはクロマトグラフィーにより
   検出し、および、■該断片の分子量の決定および／また
   は核酸染色により、前記の試料中に認識されるべきヌク
   レオチド配列が存在しているか否かを判定することの工
   程を包含することを特徴とする形質転換体の検出法。