JPH04299993A - Ｈｉｖ中和モノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ - Google Patents
Ｈｉｖ中和モノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマInfo
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- JPH04299993A JPH04299993A JP3145781A JP14578191A JPH04299993A JP H04299993 A JPH04299993 A JP H04299993A JP 3145781 A JP3145781 A JP 3145781A JP 14578191 A JP14578191 A JP 14578191A JP H04299993 A JPH04299993 A JP H04299993A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）の活性を実質的に中和し得るモノクローナル
抗体および該抗体を産生するハイブリドーマに関する。
（ＨＩＶ）の活性を実質的に中和し得るモノクローナル
抗体および該抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症候群
（ＡＩＤＳ）およびＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）など
の関連疾患の病因である。ＨＩＶは、Ｔリンパ球のヘル
パー／インデューサー部分集合に特異的なレセプター、
ＣＤ４を認識する［ダルグライシュ（Ｄａｌｇｌｅｉｓ
ｈ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：７６３〜６
７］。このリンパ球の部分集合は、ＡＩＤＳ患者には欠
失している。ＨＩＶにより誘発された免疫抑制のため、
ＡＩＤＳ患者はニューモシスティス・カリニ肺炎などの
日和見感染およびカポジ肉腫などの異常な新生物と闘う
能力をそがれてしまう。
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症候群
（ＡＩＤＳ）およびＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）など
の関連疾患の病因である。ＨＩＶは、Ｔリンパ球のヘル
パー／インデューサー部分集合に特異的なレセプター、
ＣＤ４を認識する［ダルグライシュ（Ｄａｌｇｌｅｉｓ
ｈ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：７６３〜６
７］。このリンパ球の部分集合は、ＡＩＤＳ患者には欠
失している。ＨＩＶにより誘発された免疫抑制のため、
ＡＩＤＳ患者はニューモシスティス・カリニ肺炎などの
日和見感染およびカポジ肉腫などの異常な新生物と闘う
能力をそがれてしまう。
【０００３】ＨＩＶの細胞レセプター（ＣＤ４）への結
合は、該ウイルスのエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子によ
りコードされるタンパク質によって媒介されている。Ｈ
ＩＶのウイルスエンベロープタンパク質は、前駆体タン
パク質であるｇｐ１６０として発現され、このタンパク
質がタンパク質加水分解により開裂されて外部エンベロ
ープ糖タンパク質であるｇｐ１２０と経膜エンベロープ
糖タンパク質であるｇｐ４１とを生じる。ｇｐ１２０は
、かなり糖付加されている。ラットナー（Ｒａｔｎｅｒ
）ら［Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：２７７〜８４
］は、Ｎ−糖付加部位として機能している可能性のある
２０以上のアスパラギン残基を同定した。オリゴマンノ
ース化およびフコース化し部分的にシアル酸化した二お
よび三分岐複合体炭水化物（ｂｉ−ａｎｄ ｔｒｉ−
ａｎｔｅｎｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａｔｅｓ）は、ｇｐ１２０の質量の約半分を占める
［ガイヤー（Ｇｅｙｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．（１９８８）２６３：１１７６０〜６７］。現在のと
ころ、ｇｐ１２０分子がＣＤ４レセプターに結合する際
のｇｐ１２０炭水化物の正確な役割は殆どわかっていな
い。しかしながら、マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら
のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１
９８７）８４：５４２４〜２８に記載されているように
、ＣＤ４結合には糖付加が必要であるという証拠はある
。
合は、該ウイルスのエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子によ
りコードされるタンパク質によって媒介されている。Ｈ
ＩＶのウイルスエンベロープタンパク質は、前駆体タン
パク質であるｇｐ１６０として発現され、このタンパク
質がタンパク質加水分解により開裂されて外部エンベロ
ープ糖タンパク質であるｇｐ１２０と経膜エンベロープ
糖タンパク質であるｇｐ４１とを生じる。ｇｐ１２０は
、かなり糖付加されている。ラットナー（Ｒａｔｎｅｒ
）ら［Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：２７７〜８４
］は、Ｎ−糖付加部位として機能している可能性のある
２０以上のアスパラギン残基を同定した。オリゴマンノ
ース化およびフコース化し部分的にシアル酸化した二お
よび三分岐複合体炭水化物（ｂｉ−ａｎｄ ｔｒｉ−
ａｎｔｅｎｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａｔｅｓ）は、ｇｐ１２０の質量の約半分を占める
［ガイヤー（Ｇｅｙｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．（１９８８）２６３：１１７６０〜６７］。現在のと
ころ、ｇｐ１２０分子がＣＤ４レセプターに結合する際
のｇｐ１２０炭水化物の正確な役割は殆どわかっていな
い。しかしながら、マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら
のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１
９８７）８４：５４２４〜２８に記載されているように
、ＣＤ４結合には糖付加が必要であるという証拠はある
。
【０００４】ｇｐ１２０分子の他の役割は、中和抗体を
誘発する能力に関係する。たとえば、ロビー（Ｒｏｂｅ
ｙ）ら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９８６）８３：７０２３〜２７］は、精製ｇｐ１
２０が実験動物においてポリクローナル中和抗体を誘発
したことを報告した。加えて、ｇｐ１２０タンパク質に
対するマウスのモノクローナル中和抗体を産生させるこ
とに成功している［スキナー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）ら、Ａ
ＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（１
９８８）６２：２１０７〜１４］。これら抗体は、Ｔ細
胞の感染性をインビトロで抑制することが示された。こ
れらモノクローナル抗体がｇｐ１２０の非糖付加組換え
タンパク質および合成ペプチドと結合するかどうかを決
定することにより、これら中和抗体と関係する主要なエ
ピトープがｇｐ１２０タンパク質のアミノ酸配列３０１
〜３４１に局在化された。ｇｐ１２０のシステイン残基
３０３および３３８により形成されるジスルフィドルー
プは、このエピトープのコンホメーションの完全性を維
持するのに必須であると思われる［ジャバヘリアン（Ｊ
ａｖａｈｅｒｉａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６７６８〜７２
］。既知のｇｐ１２０中和モノクローナル抗体は、非糖
付加ｇｐ１２０組換えタンパク質に結合する。それゆえ
、そのようなモノクローナル抗体はＨＩＶ ｇｐ１２０
タンパク質のポリペプチド鎖を認識するように思われる
。
誘発する能力に関係する。たとえば、ロビー（Ｒｏｂｅ
ｙ）ら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９８６）８３：７０２３〜２７］は、精製ｇｐ１
２０が実験動物においてポリクローナル中和抗体を誘発
したことを報告した。加えて、ｇｐ１２０タンパク質に
対するマウスのモノクローナル中和抗体を産生させるこ
とに成功している［スキナー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）ら、Ａ
ＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（１
９８８）６２：２１０７〜１４］。これら抗体は、Ｔ細
胞の感染性をインビトロで抑制することが示された。こ
れらモノクローナル抗体がｇｐ１２０の非糖付加組換え
タンパク質および合成ペプチドと結合するかどうかを決
定することにより、これら中和抗体と関係する主要なエ
ピトープがｇｐ１２０タンパク質のアミノ酸配列３０１
〜３４１に局在化された。ｇｐ１２０のシステイン残基
３０３および３３８により形成されるジスルフィドルー
プは、このエピトープのコンホメーションの完全性を維
持するのに必須であると思われる［ジャバヘリアン（Ｊ
ａｖａｈｅｒｉａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６７６８〜７２
］。既知のｇｐ１２０中和モノクローナル抗体は、非糖
付加ｇｐ１２０組換えタンパク質に結合する。それゆえ
、そのようなモノクローナル抗体はＨＩＶ ｇｐ１２０
タンパク質のポリペプチド鎖を認識するように思われる
。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、分子量が約１
２０，０００ダルトンのＨＩＶ糖タンパク質（ｇｐ１２
０）上のエピトープに特異的であることを特徴とするモ
ノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、およそ
アミノ酸３０１〜およそアミノ酸３５８の領域に局在す
るｇｐ１２０の炭水化物部分を認識する。本発明はまた
、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをも
提供する。
２０，０００ダルトンのＨＩＶ糖タンパク質（ｇｐ１２
０）上のエピトープに特異的であることを特徴とするモ
ノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、およそ
アミノ酸３０１〜およそアミノ酸３５８の領域に局在す
るｇｐ１２０の炭水化物部分を認識する。本発明はまた
、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをも
提供する。
【０００６】本発明は、ＨＩＶウイルスを実質的に中和
し得るモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを提供する。本発明のモノク
ローナル抗体は、実験室および臨床の両方における種々
広範囲のＨＩＶ株を中和する。本明細書において「中和
」とは、インビトロにおけるＨ９細胞でのＨＩＶ感染の
抑制を意味する。
し得るモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを提供する。本発明のモノク
ローナル抗体は、実験室および臨床の両方における種々
広範囲のＨＩＶ株を中和する。本明細書において「中和
」とは、インビトロにおけるＨ９細胞でのＨＩＶ感染の
抑制を意味する。
【０００７】本発明のモノクローナル抗体は、外部エン
ベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０およびその前駆
体タンパク質であるｇｐ１６０に特異的に結合すること
ができる。本発明のモノクローナル抗体は、ｇｐ１２０
タンパク質の中和領域におけるエピトープを認識するこ
とができることを特徴とする。本発明のモノクローナル
抗体はさらに、主要なｇｐ１２０中和領域の炭水化物部
分（およそアミノ酸３０１〜およそアミノ酸３４１の領
域に局在する）を認識することができることを特徴とす
る。
ベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０およびその前駆
体タンパク質であるｇｐ１６０に特異的に結合すること
ができる。本発明のモノクローナル抗体は、ｇｐ１２０
タンパク質の中和領域におけるエピトープを認識するこ
とができることを特徴とする。本発明のモノクローナル
抗体はさらに、主要なｇｐ１２０中和領域の炭水化物部
分（およそアミノ酸３０１〜およそアミノ酸３４１の領
域に局在する）を認識することができることを特徴とす
る。
【０００８】本発明の特に好ましい２つのモノクローナ
ル抗体は、モノクローナル抗体５２−５８１−２９０お
よび５２−６８４−２３８である。これらモノクローナ
ル抗体５２−５８１−２９０および５２−６８４−２３
８を産生するハイブリドーマは、それぞれＨＢ１０３９
９およびＨＢ１０４００の受託番号にてアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリー
ランド）に１９９０年３月２９日に寄託してある。
ル抗体は、モノクローナル抗体５２−５８１−２９０お
よび５２−６８４−２３８である。これらモノクローナ
ル抗体５２−５８１−２９０および５２−６８４−２３
８を産生するハイブリドーマは、それぞれＨＢ１０３９
９およびＨＢ１０４００の受託番号にてアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリー
ランド）に１９９０年３月２９日に寄託してある。
【０００９】本発明のモノクローナル抗体は、ＡＩＤＳ
の診断、予防および治療に用いることができる。本発明
の抗体は、ｇｐ１２０抗原を一層特徴付けるために用い
ることができる。該抗原は、感染経路の最初の出来事と
して感受性Ｔ細胞のＣＤ４レセプターと結合することが
知られている。本発明のモノクローナル抗体はさらに、
インビトロでのＨＩＶ感染の抑制能に基づき、ヒト宿主
においてウイルスの増殖を抑制したり、または非感染Ｔ
４細胞の感染を防御することによりさらに感染が進むこ
とを抑制するために用いることもできる。
の診断、予防および治療に用いることができる。本発明
の抗体は、ｇｐ１２０抗原を一層特徴付けるために用い
ることができる。該抗原は、感染経路の最初の出来事と
して感受性Ｔ細胞のＣＤ４レセプターと結合することが
知られている。本発明のモノクローナル抗体はさらに、
インビトロでのＨＩＶ感染の抑制能に基づき、ヒト宿主
においてウイルスの増殖を抑制したり、または非感染Ｔ
４細胞の感染を防御することによりさらに感染が進むこ
とを抑制するために用いることもできる。
【００１０】方法
天然ｇｐ１２０の精製
ロビーらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：７０２３〜２７］に
従い、ＨＩＶ ｇｐ１２０抗原を精製した。簡単に説明
すると、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ［ガロ（Ｒ．Ｇａｌｌｏ）
、国民健康機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、から得たＨＴＬＶ−ＩＩＩ
原型株］に感染したＨ９細胞を、０．５％トリトンＲＸ
−１００および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド（ＰＭＳＦ）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢ
Ｓ）中に再懸濁した。細胞ペレット１ｇに緩衝液約６ｍ
ｌ〜約１０ｍｌの比で細胞を再懸濁した。この再懸濁細
胞を５００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄み液を−
２０℃で一夜凍結し、解凍し、再凍結した。２回解凍し
た上澄み液を９０００ｒｐｍ（ＪＡ１０ローター）で２
０分間遠心分離にかけた。 この上澄み液を約２Ｌ／時〜約３Ｌ／時の流速で３０，
０００ｒｐｍにて連続流の高スピードローター（ＣＦ３
２）で遠心分離した。
Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：７０２３〜２７］に
従い、ＨＩＶ ｇｐ１２０抗原を精製した。簡単に説明
すると、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ［ガロ（Ｒ．Ｇａｌｌｏ）
、国民健康機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、から得たＨＴＬＶ−ＩＩＩ
原型株］に感染したＨ９細胞を、０．５％トリトンＲＸ
−１００および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド（ＰＭＳＦ）を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢ
Ｓ）中に再懸濁した。細胞ペレット１ｇに緩衝液約６ｍ
ｌ〜約１０ｍｌの比で細胞を再懸濁した。この再懸濁細
胞を５００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄み液を−
２０℃で一夜凍結し、解凍し、再凍結した。２回解凍し
た上澄み液を９０００ｒｐｍ（ＪＡ１０ローター）で２
０分間遠心分離にかけた。 この上澄み液を約２Ｌ／時〜約３Ｌ／時の流速で３０，
０００ｒｐｍにて連続流の高スピードローター（ＣＦ３
２）で遠心分離した。
【００１１】回収した上澄み液を１．０Ｍ ＫＣｌおよ
び０．０１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（トリス）、ｐＨ８．５に調節した。この上澄み液をｇ
ｐ４１モノクローナル抗体樹脂と混合し、カラムの流出
（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分（すなわち、ｇｐ４
１抗体に結合しなかった画分）をポリクローナルＡＩＤ
Ｓ抗体樹脂（主としてｅｎｖ遺伝子産物に対する抗体を
含有するように選択した）に加えた。この混合物をロー
ラーミル上で回転しながら室温で一夜インキュベートし
た。ついで、混合物をカラム中に注いだ。このカラムを
４Ｍ ＭｇＣｌ２で溶出した。溶出したｇｐ１２０を、
沈殿が生成するまで（約２日）、約４℃で貯蔵した水に
対して（水を１日に２回変えながら）透析した。透析し
たｇｐ１２０を１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離
にかけて清澄化した。得られた上澄み液を液体窒素で凍
結し、一夜凍結乾燥した。凍結乾燥したｇｐ１２０を水
中に再溶解したときに濁りが残っておれば、上記工程を
繰り返した。凍結乾燥したｇｐ１２０を水中に再溶解し
、濁りがある場合は混合物を清澄化した。
び０．０１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（トリス）、ｐＨ８．５に調節した。この上澄み液をｇ
ｐ４１モノクローナル抗体樹脂と混合し、カラムの流出
（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）画分（すなわち、ｇｐ４
１抗体に結合しなかった画分）をポリクローナルＡＩＤ
Ｓ抗体樹脂（主としてｅｎｖ遺伝子産物に対する抗体を
含有するように選択した）に加えた。この混合物をロー
ラーミル上で回転しながら室温で一夜インキュベートし
た。ついで、混合物をカラム中に注いだ。このカラムを
４Ｍ ＭｇＣｌ２で溶出した。溶出したｇｐ１２０を、
沈殿が生成するまで（約２日）、約４℃で貯蔵した水に
対して（水を１日に２回変えながら）透析した。透析し
たｇｐ１２０を１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離
にかけて清澄化した。得られた上澄み液を液体窒素で凍
結し、一夜凍結乾燥した。凍結乾燥したｇｐ１２０を水
中に再溶解したときに濁りが残っておれば、上記工程を
繰り返した。凍結乾燥したｇｐ１２０を水中に再溶解し
、濁りがある場合は混合物を清澄化した。
【００１２】酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ） ポリス
チレン９６−ウエルマイクロタイタープレートをウエル
当たり１００μｌのｇｐ１２０抗原溶液（１μｇ／ｍｌ
、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）で室温にて一夜コーティン
グした。ポリスチレンウエルの残りの結合部位をＰＢＳ
中の３％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ；アーマー・ファ
ーマシューティカル（Ａｒｍｏｕｒ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，）、カンカキー、ＩＬ］で室温
にて３０分間ブロッキングした。プレートを３回水洗し
た。該ウエル中で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ハイク
ローン、ローガン、ＵＴ）を含有するイスコーブ修正ダ
ルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ；ギブコ
、グランドアイランド、ＮＹ）中で作成したマウス血清
希釈液またはモノクローナル抗体組織培養上澄み液を室
温にて約２時間インキュベートし、ウエルを３回水洗し
た。ＰＢＳ中に１：１０００の濃度に希釈したヤギ抗マ
ウスＩｇＧ＋Ｍ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
Ｏ）［キルケガール−ペリー・ラボラトリーズ（Ｋｉｅ
ｋｅｇａａｒｄ−Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ；ＫＰＬ）、ガイセルスバーグ、ＭＤ］を用い、モノ
クローナル抗体結合を検出した。Ｏ−フェニレンジアミ
ン基質（ＯＰＤ；アボット・ラボラトリーズ、アボット
パーク、ＩＬ）を色原体として用い、プレートを４９０
ｎｍで読み取った。
チレン９６−ウエルマイクロタイタープレートをウエル
当たり１００μｌのｇｐ１２０抗原溶液（１μｇ／ｍｌ
、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）で室温にて一夜コーティン
グした。ポリスチレンウエルの残りの結合部位をＰＢＳ
中の３％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ；アーマー・ファ
ーマシューティカル（Ａｒｍｏｕｒ Ｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，）、カンカキー、ＩＬ］で室温
にて３０分間ブロッキングした。プレートを３回水洗し
た。該ウエル中で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ハイク
ローン、ローガン、ＵＴ）を含有するイスコーブ修正ダ
ルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ；ギブコ
、グランドアイランド、ＮＹ）中で作成したマウス血清
希釈液またはモノクローナル抗体組織培養上澄み液を室
温にて約２時間インキュベートし、ウエルを３回水洗し
た。ＰＢＳ中に１：１０００の濃度に希釈したヤギ抗マ
ウスＩｇＧ＋Ｍ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
Ｏ）［キルケガール−ペリー・ラボラトリーズ（Ｋｉｅ
ｋｅｇａａｒｄ−Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ；ＫＰＬ）、ガイセルスバーグ、ＭＤ］を用い、モノ
クローナル抗体結合を検出した。Ｏ−フェニレンジアミ
ン基質（ＯＰＤ；アボット・ラボラトリーズ、アボット
パーク、ＩＬ）を色原体として用い、プレートを４９０
ｎｍで読み取った。
【００１３】ウエスタンブロット
ＨＩＶ−１タンパク質をドデシル硫酸ナトリウムゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により電気泳動にかけ
、ついで製造業者の指示に従って［シュライヒャー＆シ
ュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）、キ
ーン、ＮＨ；ホーファー・サイエンティフィック・イン
スツルメンツ（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．，）、サンフランシス
コ、ＣＡ；バイオ−ラド、リッチモンド、ＣＡ］ニトロ
セルロースに移した。このニトロセルロースストリップ
をＰＢＳ中の１％ウシヘモグロブリン（シグマ・ケミカ
ル、セントルイス、ＭＯ）および０．５％ツイーン２０
［フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ピッツバーグ、ＰＡ］で室
温にて３０分間ブロッキングし、ついで組織培養上澄み
液またはブロッキング溶液中で調製した精製抗体の希釈
液とともにストリップをインキュベートした。インキュ
ベーション期間の後にストリップをＰＢＳで洗浄した。 色原体基質としてヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ−ＨＲＰＯお
よび４−クロロ−１−ナフトールを用いて視覚化を行っ
た。
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により電気泳動にかけ
、ついで製造業者の指示に従って［シュライヒャー＆シ
ュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）、キ
ーン、ＮＨ；ホーファー・サイエンティフィック・イン
スツルメンツ（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．，）、サンフランシス
コ、ＣＡ；バイオ−ラド、リッチモンド、ＣＡ］ニトロ
セルロースに移した。このニトロセルロースストリップ
をＰＢＳ中の１％ウシヘモグロブリン（シグマ・ケミカ
ル、セントルイス、ＭＯ）および０．５％ツイーン２０
［フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ピッツバーグ、ＰＡ］で室
温にて３０分間ブロッキングし、ついで組織培養上澄み
液またはブロッキング溶液中で調製した精製抗体の希釈
液とともにストリップをインキュベートした。インキュ
ベーション期間の後にストリップをＰＢＳで洗浄した。 色原体基質としてヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ−ＨＲＰＯお
よび４−クロロ−１−ナフトールを用いて視覚化を行っ
た。
【００１４】放射免疫沈降法
確立されたプロトコール［サン（Ｓｕｎ）ら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）６３：３５７９〜８５］に従
って、放射免疫沈降法（ＲＩＰＡ）を行った。簡単に説
明すると、［３５Ｓ］システインおよび［３５Ｓ］メチ
オニン（１００μＣｉ／ｍｌ；ＩＣＮファーマシューテ
ィカルズ、アーバイン、ＣＡ）を用いてＨ９細胞（ＨＩ
Ｖ単離物ＩＩＩＢ、ＲＦ、ＭＮ、ＡＬ、Ｚ３４、Ｚ８４
およびＡＣで感染させたもの）を代謝的に４時間標識し
、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ８
．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％トリトンＲＸ−１００
、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１ｍＭ ＰＭＳＦ）に
懸濁した。マウスκＬ鎖に対するウサギ抗血清（カッペ
ル・ラボラトリーズ、ウエストチェスター、ＰＡ）（ｋ
−ＰＡＳ）に結合したプロテインＡ−セファロース（シ
グマ）を用い室温で３時間、溶解液を前以て清澄化した
。
Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）６３：３５７９〜８５］に従
って、放射免疫沈降法（ＲＩＰＡ）を行った。簡単に説
明すると、［３５Ｓ］システインおよび［３５Ｓ］メチ
オニン（１００μＣｉ／ｍｌ；ＩＣＮファーマシューテ
ィカルズ、アーバイン、ＣＡ）を用いてＨ９細胞（ＨＩ
Ｖ単離物ＩＩＩＢ、ＲＦ、ＭＮ、ＡＬ、Ｚ３４、Ｚ８４
およびＡＣで感染させたもの）を代謝的に４時間標識し
、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ８
．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％トリトンＲＸ−１００
、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および１ｍＭ ＰＭＳＦ）に
懸濁した。マウスκＬ鎖に対するウサギ抗血清（カッペ
ル・ラボラトリーズ、ウエストチェスター、ＰＡ）（ｋ
−ＰＡＳ）に結合したプロテインＡ−セファロース（シ
グマ）を用い室温で３時間、溶解液を前以て清澄化した
。
【００１５】標識し清澄化した溶解液（２００μｌ）に
精製マウスモノクローナル抗体（３μｇ）およびｋ−Ｐ
ＡＳの１０％懸濁液（０．２ｍｌ）を加えることにより
ＲＩＰＡを行った。試料を４℃で１８時間インキュベー
トし、ビーズをＲＩＰＡ溶解緩衝液で洗浄した。ペレッ
トを電気泳動試料緩衝液中に懸濁し、３分間沸騰させた
。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ついでオートラジオグラフィーに
かけてタンパク質を分析した。
精製マウスモノクローナル抗体（３μｇ）およびｋ−Ｐ
ＡＳの１０％懸濁液（０．２ｍｌ）を加えることにより
ＲＩＰＡを行った。試料を４℃で１８時間インキュベー
トし、ビーズをＲＩＰＡ溶解緩衝液で洗浄した。ペレッ
トを電気泳動試料緩衝液中に懸濁し、３分間沸騰させた
。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ついでオートラジオグラフィーに
かけてタンパク質を分析した。
【００１６】ペプチド合成
バラリー（Ｂａｒａｒｙ）およびメリフィールド（
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）により記載された一般的手順［
グロス＆マイネホーファー（Ｇｒｏｓｓ＆Ｍｅｉｎｅｈ
ｏｆｅｒ）編、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ｖｏｌ．２
［アカデミックプレス、ニューヨーク、１９８０］］に
従い、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０エンベロープタンパク質
のペプチド配列を合成した。合成した配列は、ラットナ
ーら［Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：２７７〜８４
］による番号付けでアミノ酸３７〜５９、６８〜８５、
２７２〜３２３、３２９〜３８４、４６２〜５１８およ
び４９１〜５１８であった。
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）により記載された一般的手順［
グロス＆マイネホーファー（Ｇｒｏｓｓ＆Ｍｅｉｎｅｈ
ｏｆｅｒ）編、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ｖｏｌ．２
［アカデミックプレス、ニューヨーク、１９８０］］に
従い、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０エンベロープタンパク質
のペプチド配列を合成した。合成した配列は、ラットナ
ーら［Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：２７７〜８４
］による番号付けでアミノ酸３７〜５９、６８〜８５、
２７２〜３２３、３２９〜３８４、４６２〜５１８およ
び４９１〜５１８であった。
【００１７】ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０タンパク質の配列
２７２〜３２３に対応するペプチドを、カルボキシル末
端残基から開始して段階的固相合成法により樹脂支持体
上に組み立てた。ＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＣＨ２−Ｐａ
ｍ樹脂をアプライドバイオシステムズ合成機、モデル４
３０Ａの反応容器に移した。アルギニン、アスパラギン
およびグルタミンの付加の場合を除き［ケーニッヒ（Ｋ
ｏｎｉｇ）およびガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）によって記
載されたＤＣＣ／ＨＯＢＴプロトコールを用いた（Ｃｈ
ｅｍ．Ｂｅｒ．（１９７０）１０３：７８８〜７９８）
］、前以て生成した対称無水物化学により、保護アミノ
酸を樹脂支持体に段階的に二重カップリングした。すべ
てのα−アミノ酸残基をｔ−ブチルオキシカルボニル（
ｔ−ＢＯＣ）結合により保護し、種々アミノ酸残基の側
鎖を下記基で保護した：Ｇｌｕ、ＯＢｚｌ；Ａｒｇ、Ｔ
ｏｓ；Ｓｅｒ、Ｂｚｌ；Ｔｈｒ、Ｂｚｌ；Ａｓｐ、ＯＢ
ｚｌ；Ｌｙｓ、２−Ｃｌ−Ｚ；およびＣｙｓ、４−Ｍｅ
Ｂｚｌ。
２７２〜３２３に対応するペプチドを、カルボキシル末
端残基から開始して段階的固相合成法により樹脂支持体
上に組み立てた。ＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＣＨ２−Ｐａ
ｍ樹脂をアプライドバイオシステムズ合成機、モデル４
３０Ａの反応容器に移した。アルギニン、アスパラギン
およびグルタミンの付加の場合を除き［ケーニッヒ（Ｋ
ｏｎｉｇ）およびガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）によって記
載されたＤＣＣ／ＨＯＢＴプロトコールを用いた（Ｃｈ
ｅｍ．Ｂｅｒ．（１９７０）１０３：７８８〜７９８）
］、前以て生成した対称無水物化学により、保護アミノ
酸を樹脂支持体に段階的に二重カップリングした。すべ
てのα−アミノ酸残基をｔ−ブチルオキシカルボニル（
ｔ−ＢＯＣ）結合により保護し、種々アミノ酸残基の側
鎖を下記基で保護した：Ｇｌｕ、ＯＢｚｌ；Ａｒｇ、Ｔ
ｏｓ；Ｓｅｒ、Ｂｚｌ；Ｔｈｒ、Ｂｚｌ；Ａｓｐ、ＯＢ
ｚｌ；Ｌｙｓ、２−Ｃｌ−Ｚ；およびＣｙｓ、４−Ｍｅ
Ｂｚｌ。
【００１８】保護ペプチド−樹脂（３００ｍｇ）を塩化
メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）中で５分間膨潤させた。６０
％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２）洗浄、Ｃ
Ｈ２Ｃｌ２洗浄、１０％Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチル
アミン（ＤＩＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２）中和、および最後に
ＣＨ２Ｃｌ２洗浄することによりＮａ−ＢＯＣ保護基を
除去した。この樹脂を真空乾燥させた。かくして得られ
たペプチド−樹脂を、ｐ−クレゾール（０．５ｍｌ）お
よびｐ−チオクレゾール（０．５ｇ）を添加した無水フ
ッ化水素酸（ＨＦ）（ＨＦ「カクテル」；９ｍｌ）で０
°Ｃにて６０分間処理した。 ＨＦを０°Ｃにて真空留去した。解離した遊離のペプチ
ドおよび樹脂をジエチルエーテルの１５ｍｌアリコート
で３回洗浄した。ついで、このペプチドを４０％酢酸水
溶液の１０ｍｌアリコートで６回抽出した。コンバイン
した水性抽出物を凍結乾燥して精製用の粗製のペプチド
を得た。
メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）中で５分間膨潤させた。６０
％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２）洗浄、Ｃ
Ｈ２Ｃｌ２洗浄、１０％Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチル
アミン（ＤＩＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ２）中和、および最後に
ＣＨ２Ｃｌ２洗浄することによりＮａ−ＢＯＣ保護基を
除去した。この樹脂を真空乾燥させた。かくして得られ
たペプチド−樹脂を、ｐ−クレゾール（０．５ｍｌ）お
よびｐ−チオクレゾール（０．５ｇ）を添加した無水フ
ッ化水素酸（ＨＦ）（ＨＦ「カクテル」；９ｍｌ）で０
°Ｃにて６０分間処理した。 ＨＦを０°Ｃにて真空留去した。解離した遊離のペプチ
ドおよび樹脂をジエチルエーテルの１５ｍｌアリコート
で３回洗浄した。ついで、このペプチドを４０％酢酸水
溶液の１０ｍｌアリコートで６回抽出した。コンバイン
した水性抽出物を凍結乾燥して精製用の粗製のペプチド
を得た。
【００１９】この粗製のペプチドをＣ４カラム上の逆相
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、溶媒
系として０．１％ＴＦＡ／水（Ａ）および１００％アセ
トニトリル（Ｂ）の勾配を用い、分析カラム［Ｖｙｄａ
ｃ−２１４−ＴＰ５４、ビダック・セパレーション・グ
ループ（Ｖｙｄａｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕ
ｐ）、ヘスペリア、カリフォルニア］では１ｍｌ／分の
流速または半調製カラム（Ｖｙｄａｃ−２１４−ＴＰ１
０２２）では１２ｍｌ／分の流速にて精製した。勾配は
１７％Ｂから開始した。３分後、２０分間で勾配を６０
％Ｂまで直線的に増加させ、ついで２分間で１７％Ｂま
でもっていった。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、溶媒
系として０．１％ＴＦＡ／水（Ａ）および１００％アセ
トニトリル（Ｂ）の勾配を用い、分析カラム［Ｖｙｄａ
ｃ−２１４−ＴＰ５４、ビダック・セパレーション・グ
ループ（Ｖｙｄａｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕ
ｐ）、ヘスペリア、カリフォルニア］では１ｍｌ／分の
流速または半調製カラム（Ｖｙｄａｃ−２１４−ＴＰ１
０２２）では１２ｍｌ／分の流速にて精製した。勾配は
１７％Ｂから開始した。３分後、２０分間で勾配を６０
％Ｂまで直線的に増加させ、ついで２分間で１７％Ｂま
でもっていった。
【００２０】ペプチドの存在を２２５ｎｍおよび２８０
ｎｍでモニターした。ペプチドの組成は、６Ｎ塩酸／０
．３％フェノール中、１５０°Ｃで２時間、真空下で加
水分解し、ベックマン６３００アミノ酸分析機で分析す
ることにより確認した。
ｎｍでモニターした。ペプチドの組成は、６Ｎ塩酸／０
．３％フェノール中、１５０°Ｃで２時間、真空下で加
水分解し、ベックマン６３００アミノ酸分析機で分析す
ることにより確認した。
【００２１】同様にして他のｇｐ１２０ペプチドも上記
のようにして組み立てた。さらに、アミノ酸保護を基：
Ｔｙｒ、２−Ｂｒ−Ｚ；およびＨｉｓ、Ｔｏｓにより行
った。アミノ酸のトリプトファンおよびメチオニンは側
鎖の保護を行うことなく使用した。トリプトファンを組
み込んだ後、トリフルオロ酢酸にインドールを１％（ｗ
／ｖ）の濃度で添加してその後のすべてのＮａ−保護（
ＢＯＣ）基を除去した。メチオニンを組み込んだ後、ト
リフルオロ酢酸にエタンジオールをも０．２５％（ｖ／
ｖ）の濃度で加えた。ペプチド３７〜５９および４９１
〜５１８のためのＨＦカクテルは、ＨＦ（９ｍｌ）およ
びｐ−クレゾール（１ｍｌ）を含んでいた。ペプチド６
１〜７８のためのＨＦカクテルは、ＨＦ（９ｍｌ）、ｐ
−クレゾール（０．５ｍｌ）およびｐ−チオクレゾール
（０．５ｇ）を含んでいた。ペプチド３２２〜３７７お
よび４６２〜５１８のためのＨＦカクテルは、ＨＦ（１
０ｍｌ）、ｐ−クレゾール（１ｍｌ）およびジメチルス
ルフィド（１ｍｌ）を含んでいた。ペプチド３２２〜３
７７のためのＨＦカクテルも、ｐ−チオクレゾール（０
．２ｇ）を含んでいた。
のようにして組み立てた。さらに、アミノ酸保護を基：
Ｔｙｒ、２−Ｂｒ−Ｚ；およびＨｉｓ、Ｔｏｓにより行
った。アミノ酸のトリプトファンおよびメチオニンは側
鎖の保護を行うことなく使用した。トリプトファンを組
み込んだ後、トリフルオロ酢酸にインドールを１％（ｗ
／ｖ）の濃度で添加してその後のすべてのＮａ−保護（
ＢＯＣ）基を除去した。メチオニンを組み込んだ後、ト
リフルオロ酢酸にエタンジオールをも０．２５％（ｖ／
ｖ）の濃度で加えた。ペプチド３７〜５９および４９１
〜５１８のためのＨＦカクテルは、ＨＦ（９ｍｌ）およ
びｐ−クレゾール（１ｍｌ）を含んでいた。ペプチド６
１〜７８のためのＨＦカクテルは、ＨＦ（９ｍｌ）、ｐ
−クレゾール（０．５ｍｌ）およびｐ−チオクレゾール
（０．５ｇ）を含んでいた。ペプチド３２２〜３７７お
よび４６２〜５１８のためのＨＦカクテルは、ＨＦ（１
０ｍｌ）、ｐ−クレゾール（１ｍｌ）およびジメチルス
ルフィド（１ｍｌ）を含んでいた。ペプチド３２２〜３
７７のためのＨＦカクテルも、ｐ−チオクレゾール（０
．２ｇ）を含んでいた。
【００２２】
【実施例】つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。 実施例１（動物の免疫および融合） ＲＩＢＩアジュバント［ＲＩＢＩイムノケム・リサーチ
（ＲＩＢＩ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
，Ｉｎｃ．）、ハミルトン、ＭＴ］中の上記ウイルス性
ｇｐ１２０（５０μｇ）を用い、１週目、４週目、５週
目および７週目にＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下および腹腔
内にて免疫した。下記酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）法
で評価した応答動物を、融合３日前にＰＢＳ中のｇｐ１
２０抗原（１０μｇ）で静脈内ブースター投与した。マ
ウスを屠殺し、脾臓細胞を単離した。
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。 実施例１（動物の免疫および融合） ＲＩＢＩアジュバント［ＲＩＢＩイムノケム・リサーチ
（ＲＩＢＩ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
，Ｉｎｃ．）、ハミルトン、ＭＴ］中の上記ウイルス性
ｇｐ１２０（５０μｇ）を用い、１週目、４週目、５週
目および７週目にＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下および腹腔
内にて免疫した。下記酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）法
で評価した応答動物を、融合３日前にＰＢＳ中のｇｐ１
２０抗原（１０μｇ）で静脈内ブースター投与した。マ
ウスを屠殺し、脾臓細胞を単離した。
【００２３】ミエローマパートナー細胞としてＳＰ２／
Ｏ細胞を用い、公知の常法［コーラー（Ｇ．Ｋｏｈｌｅ
ｒ）およびミルシュテイン（Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、
Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５〜４９７；ゴ
ーディング（Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ）、モノクローナル・ア
ンタイボディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクテ
ィス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）［ニ
ューヨーク：アカデミックプレス、１９８３］］に従っ
て融合を行った。増殖培地にヒポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジンを添加してハイブリッドを選択し
た。ハイブリッドのスクリーニングは、下記のように、
免疫抗原に対するＥＩＡにより融合から７〜１０日後に
行い、ウエスタンブロッティングにより確認した。ハイ
ブリッドのクローニングは、標準法に従い（一般的には
上記ゴーディングの文献参照）、限界希釈法およびＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの所望のクローンから得た腹水により行
った。アイ（Ｅｙ）らのＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．（１９
７８）１５：４２９〜３６に記載されているように、プ
ロテインＡ−セファロースカラムクロマトグラフィーに
より腹水から抗体を精製した。
Ｏ細胞を用い、公知の常法［コーラー（Ｇ．Ｋｏｈｌｅ
ｒ）およびミルシュテイン（Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、
Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５〜４９７；ゴ
ーディング（Ｊ．Ｇｏｄｉｎｇ）、モノクローナル・ア
ンタイボディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクテ
ィス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）［ニ
ューヨーク：アカデミックプレス、１９８３］］に従っ
て融合を行った。増殖培地にヒポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジンを添加してハイブリッドを選択し
た。ハイブリッドのスクリーニングは、下記のように、
免疫抗原に対するＥＩＡにより融合から７〜１０日後に
行い、ウエスタンブロッティングにより確認した。ハイ
ブリッドのクローニングは、標準法に従い（一般的には
上記ゴーディングの文献参照）、限界希釈法およびＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの所望のクローンから得た腹水により行
った。アイ（Ｅｙ）らのＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．（１９
７８）１５：４２９〜３６に記載されているように、プ
ロテインＡ−セファロースカラムクロマトグラフィーに
より腹水から抗体を精製した。
【００２４】上記融合実験からのハイブリッドクローン
を上記ＥＩＡ法によりｇｐ１２０に対する反応性につい
てスクリーニングし、陽性の反応を示したハイブリッド
を拡張した。同じ融合からの２つのモノクローナル抗体
（「５２−５８１−２９０」および「５２−６８４−２
２８」と称する）が強い陽性の反応を示した。
を上記ＥＩＡ法によりｇｐ１２０に対する反応性につい
てスクリーニングし、陽性の反応を示したハイブリッド
を拡張した。同じ融合からの２つのモノクローナル抗体
（「５２−５８１−２９０」および「５２−６８４−２
２８」と称する）が強い陽性の反応を示した。
【００２５】実施例２（エピトープの同定）モノクロー
ナル抗体５２−５８１−２９０および５２−６８４−２
３８を上記ウエスタンブロッティング法によりさらに試
験したところ、これらモノクローナル抗体は免疫株（Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩＩＢ）のｇｐ１２０と特異的に反応した。 これら抗体を、代謝的に標識したＨＩＶ−１株ＩＩＩＢ
、ＲＦ、ＭＮ、ＡＬ、Ｚ３４、Ｚ８４およびＡＣに感染
したＨ９細胞を用いＲＩＰＡによっても調べた。各モノ
クローナル抗体は、免疫株ＩＩＩＢのｇｐ１２０および
ｇｐ１６０の両方を特異的に沈降させた。しかしながら
、これら２つの抗体は、ＨＩＶ−１の他の株との反応性
において異なっていた。
ナル抗体５２−５８１−２９０および５２−６８４−２
３８を上記ウエスタンブロッティング法によりさらに試
験したところ、これらモノクローナル抗体は免疫株（Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩＩＢ）のｇｐ１２０と特異的に反応した。 これら抗体を、代謝的に標識したＨＩＶ−１株ＩＩＩＢ
、ＲＦ、ＭＮ、ＡＬ、Ｚ３４、Ｚ８４およびＡＣに感染
したＨ９細胞を用いＲＩＰＡによっても調べた。各モノ
クローナル抗体は、免疫株ＩＩＩＢのｇｐ１２０および
ｇｐ１６０の両方を特異的に沈降させた。しかしながら
、これら２つの抗体は、ＨＩＶ−１の他の株との反応性
において異なっていた。
【００２６】
表１
Ｍａｂ ＩＩＩＢ ＲＦ ＭＮ
ＡＬ Ｚ３４ Ｚ８４ ＡＣ５２−５８１−２９
０ ＋ ＋ ＋
＋ − − −５２−６８
４−２３８ ＋ − −
− − − −（
注）Ｍａｂ：モノクローナル抗体 「＋」：ｇｐ１２０およびｇｐ１６０との反応
性を示す。 表１に示すように、抗体５２−５８１−２９０はＨＩＶ
株のＲＦ、ＭＮおよびＡＬと交差反応するが、抗体５２
−６８４−２３８は免疫株とのみ反応した。
ＡＬ Ｚ３４ Ｚ８４ ＡＣ５２−５８１−２９
０ ＋ ＋ ＋
＋ − − −５２−６８
４−２３８ ＋ − −
− − − −（
注）Ｍａｂ：モノクローナル抗体 「＋」：ｇｐ１２０およびｇｐ１６０との反応
性を示す。 表１に示すように、抗体５２−５８１−２９０はＨＩＶ
株のＲＦ、ＭＮおよびＡＬと交差反応するが、抗体５２
−６８４−２３８は免疫株とのみ反応した。
【００２７】さらに、モノクローナル抗体５２−５８１
−２９０および５２−６８４−２３８のいずれも組換え
タンパク質ｐＥ３、ｐＢ１またはｐｅｎｖ９［それぞれ
、グレーブ（Ｊ．Ｇｈｒａｙｅｂ）、セントコール（Ｃ
ｅｎｔｏｃｏｒ）；パットニー（Ｓ．Ｐｕｔｎｅｙ）、
レプリジェン（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）；およびペットウエ
イ（Ｓ．Ｐｅｔｔｅｗａｙ）、デュポンより入手］と反
応しなかった。組換えタンパク質ｐＥ３、ｐＢ１および
ｐｅｎｖ９は細菌中で発現させたため、糖付加していな
いタンパク質として発現された。これらタンパク質は、
エンベロープの８４％を越えて広がっていた。ｐＢ１は
、中和エピトープを含有するｇｐ１２０のカルボキシル
末端の半分からの断片である。この非反応性は、モノク
ローナル抗体５２−５８１−２９０およびモノクローナ
ル抗体５２−６８４−２３８によって認識されるエピト
ープがコンホメーション依存性のものであるかまたは実
質的にｇｐ１２０タンパク質の炭水化物残基からなって
いることを示唆している。
−２９０および５２−６８４−２３８のいずれも組換え
タンパク質ｐＥ３、ｐＢ１またはｐｅｎｖ９［それぞれ
、グレーブ（Ｊ．Ｇｈｒａｙｅｂ）、セントコール（Ｃ
ｅｎｔｏｃｏｒ）；パットニー（Ｓ．Ｐｕｔｎｅｙ）、
レプリジェン（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）；およびペットウエ
イ（Ｓ．Ｐｅｔｔｅｗａｙ）、デュポンより入手］と反
応しなかった。組換えタンパク質ｐＥ３、ｐＢ１および
ｐｅｎｖ９は細菌中で発現させたため、糖付加していな
いタンパク質として発現された。これらタンパク質は、
エンベロープの８４％を越えて広がっていた。ｐＢ１は
、中和エピトープを含有するｇｐ１２０のカルボキシル
末端の半分からの断片である。この非反応性は、モノク
ローナル抗体５２−５８１−２９０およびモノクローナ
ル抗体５２−６８４−２３８によって認識されるエピト
ープがコンホメーション依存性のものであるかまたは実
質的にｇｐ１２０タンパク質の炭水化物残基からなって
いることを示唆している。
【００２８】ＩｇＧのタイプ分け
モノクローナル抗体５２−５８１−２９０および５
２−６８４−２３８のアイソタイプは、それぞれＩｇＧ
２ａおよびＩｇＧ１と決定された。簡単に説明すると、
マイクロタイタープレートをヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ免
疫グロブリン（ＫＰＬ）でコーティングし、３％ＢＳＡ
でブロッキングした。ウエルに培養液試料を加え、プレ
ートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗
浄し、標識ヤギ抗マウスアイソタイプ結合体［サザーン
・バイオテク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、
バーミンガム、ＡＬ］を加え、プレートを室温にて３０
分間インキュベートした。過剰の結合体を洗浄して除去
し、ついでＯＰＤを加えた。マウス免疫グロブリンに結
合したヤギ抗マウスアイソタイプの量は、４９０ｎｍで
測定した吸光度と比例した。
２−６８４−２３８のアイソタイプは、それぞれＩｇＧ
２ａおよびＩｇＧ１と決定された。簡単に説明すると、
マイクロタイタープレートをヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ免
疫グロブリン（ＫＰＬ）でコーティングし、３％ＢＳＡ
でブロッキングした。ウエルに培養液試料を加え、プレ
ートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗
浄し、標識ヤギ抗マウスアイソタイプ結合体［サザーン
・バイオテク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、
バーミンガム、ＡＬ］を加え、プレートを室温にて３０
分間インキュベートした。過剰の結合体を洗浄して除去
し、ついでＯＰＤを加えた。マウス免疫グロブリンに結
合したヤギ抗マウスアイソタイプの量は、４９０ｎｍで
測定した吸光度と比例した。
【００２９】ペプチド抑制アッセイ
ＨＩＶ−１アミノ酸配列３７〜５９、６８〜８５、
２７２〜３２３、３２９〜３８４、４６２〜５１８およ
び４９１〜５１８［番号付けはラットナーらのＮａｔｕ
ｒｅ（１９８５）３１３：２７７〜８４による］につい
て上記方法に従って合成ペプチドを合成した。これらペ
プチドを、非標識抗体の代わりにペプチドの系列希釈を
用いる他は上記方法に従って競合アッセイに用いた。５
０μｌのモノクローナル抗体５２−５８１−２９０もし
くは５２−６８４−２３８またはコントロール抗体５２
−４４５−２２（アボット・ラボラトリーズ、アボット
パーク、ＩＬより３Ａ１８−５９として市販）もしくは
４４−３２２−５１を、直接ＥＩＡアッセイにおける最
大吸光度の５０％の値が得られるのと同じ希釈にて加え
た。これらペプチドおよびモノクローナル抗体は同時に
加えた。生成した免疫複合体を検出するため、ＨＲＰＯ
標識ヤギ抗マウス抗体結合体（ＫＰＬ）を用いた。
２７２〜３２３、３２９〜３８４、４６２〜５１８およ
び４９１〜５１８［番号付けはラットナーらのＮａｔｕ
ｒｅ（１９８５）３１３：２７７〜８４による］につい
て上記方法に従って合成ペプチドを合成した。これらペ
プチドを、非標識抗体の代わりにペプチドの系列希釈を
用いる他は上記方法に従って競合アッセイに用いた。５
０μｌのモノクローナル抗体５２−５８１−２９０もし
くは５２−６８４−２３８またはコントロール抗体５２
−４４５−２２（アボット・ラボラトリーズ、アボット
パーク、ＩＬより３Ａ１８−５９として市販）もしくは
４４−３２２−５１を、直接ＥＩＡアッセイにおける最
大吸光度の５０％の値が得られるのと同じ希釈にて加え
た。これらペプチドおよびモノクローナル抗体は同時に
加えた。生成した免疫複合体を検出するため、ＨＲＰＯ
標識ヤギ抗マウス抗体結合体（ＫＰＬ）を用いた。
【００３０】
表２
アミノ酸配列 抗体
３７−５９ ６８−８５ ２７２−３２３
３２９−３８４ ４６２−５１８ ４９１−５
１８５２−５８１−２９０ −
− − − −
−５２−６８４−２３８ −
− − −
− −５２−４４５−３３
− − ＋
− − −４４−３２２−５
１ − − ＋
− − −
アミノ酸配列 抗体
３７−５９ ６８−８５ ２７２−３２３
３２９−３８４ ４６２−５１８ ４９１−５
１８５２−５８１−２９０ −
− − − −
−５２−６８４−２３８ −
− − −
− −５２−４４５−３３
− − ＋
− − −４４−３２２−５
１ − − ＋
− − −
【００
３１】表２に示すように、モノクローナル抗体５２−５
８１−２９０および５２−６８４−２３８は中和領域を
カバーするペプチド２７２〜３２３を認識しなかったが
、モノクローナル抗体５２−４４５−３３および４４−
３２２−５１は両方ともペプチド２７２〜３２３を認識
した。このデータは、モノクローナル抗体５２−５８１
−２９０および５２−６８４−２３８が中和抗体である
ならば、これら抗体は中和領域のペプチド骨格を認識し
ないことを示唆している。
３１】表２に示すように、モノクローナル抗体５２−５
８１−２９０および５２−６８４−２３８は中和領域を
カバーするペプチド２７２〜３２３を認識しなかったが
、モノクローナル抗体５２−４４５−３３および４４−
３２２−５１は両方ともペプチド２７２〜３２３を認識
した。このデータは、モノクローナル抗体５２−５８１
−２９０および５２−６８４−２３８が中和抗体である
ならば、これら抗体は中和領域のペプチド骨格を認識し
ないことを示唆している。
【００３２】抗体競合結合研究
アボットおよび市販の（デュポン、ウイルミントン
、ＤＥ）抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体を本発明の標
識モノクローナル抗体とともに競合結合アッセイに用い
て反応性を決定した。非標識抗体が標識抗体の結合と競
合する能力を、該抗体が同一または隣接するエピトープ
を認識する能力とした。モノクローナル抗体５２−４４
５−２２は合成ペプチド（上記）と反応するが炭水化物
部分は認識しないことが知られている。モノクローナル
抗体４４−３２２−１５１もまた合成ペプチド２７２−
３２３と反応することが知られているが、５２−４４５
−２２とは異なるエピトープを認識することがわかった
。というのは、これら２つのモノクローナル抗体は互い
に競合しないからである。デュポンの９２８４抗体は、
アミノ酸残基３０７〜３１９の領域にあるエピトープを
認識することを特徴とする。この抗体は、ｇｐ１２０の
ポリペプチド骨格を認識することが決定された［スキナ
ー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）ら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９８８）４：１８７〜９
７］。
、ＤＥ）抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体を本発明の標
識モノクローナル抗体とともに競合結合アッセイに用い
て反応性を決定した。非標識抗体が標識抗体の結合と競
合する能力を、該抗体が同一または隣接するエピトープ
を認識する能力とした。モノクローナル抗体５２−４４
５−２２は合成ペプチド（上記）と反応するが炭水化物
部分は認識しないことが知られている。モノクローナル
抗体４４−３２２−１５１もまた合成ペプチド２７２−
３２３と反応することが知られているが、５２−４４５
−２２とは異なるエピトープを認識することがわかった
。というのは、これら２つのモノクローナル抗体は互い
に競合しないからである。デュポンの９２８４抗体は、
アミノ酸残基３０７〜３１９の領域にあるエピトープを
認識することを特徴とする。この抗体は、ｇｐ１２０の
ポリペプチド骨格を認識することが決定された［スキナ
ー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）ら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９８８）４：１８７〜９
７］。
【００３３】簡単に説明すると、モノクローナル抗体５
２−５８１−２９０および５２−６８４−２３８を製造
業者の教示に従ってＮＨＳ−ビオチン［ピアス・ケミカ
ル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ロッ
クビル、ＩＬ］で標識した。マイクロタイタープレート
を上記のようにしてｇｐ１２０抗原でコーティングした
。まず、非標識抗体の系列希釈をウエル中で１５分間プ
レインキュベートし、ついで所定量のビオチン化抗体（
最大吸光度値の５０％の値を与える直接ＥＩＡアッセイ
におけるビオチン化抗体単独の希釈液）を加えた。プレ
ートを３回水洗した。ウエルに希釈ストレプトアビジン
−ＨＲＰＯ［ザイムド（Ｚｙｍｅｄ）、サウスサンフラ
ンシスコ、ＣＡ］を加え、ウエルを３０分間インキュベ
ートした。プレートを再び洗浄し、ＯＰＤを加えた。発
色後、１Ｎ硫酸で反応停止させ、４９０ｎｍで吸光度を
読み取った。
２−５８１−２９０および５２−６８４−２３８を製造
業者の教示に従ってＮＨＳ−ビオチン［ピアス・ケミカ
ル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ロッ
クビル、ＩＬ］で標識した。マイクロタイタープレート
を上記のようにしてｇｐ１２０抗原でコーティングした
。まず、非標識抗体の系列希釈をウエル中で１５分間プ
レインキュベートし、ついで所定量のビオチン化抗体（
最大吸光度値の５０％の値を与える直接ＥＩＡアッセイ
におけるビオチン化抗体単独の希釈液）を加えた。プレ
ートを３回水洗した。ウエルに希釈ストレプトアビジン
−ＨＲＰＯ［ザイムド（Ｚｙｍｅｄ）、サウスサンフラ
ンシスコ、ＣＡ］を加え、ウエルを３０分間インキュベ
ートした。プレートを再び洗浄し、ＯＰＤを加えた。発
色後、１Ｎ硫酸で反応停止させ、４９０ｎｍで吸光度を
読み取った。
【００３４】
表３
非標識抗体 ５２−５８１
−２９０＊ ５２−６８４−２３８＊５２−５８１−
２９０ ＋
＋５２−６８４−２３
８ ＋
＋５２−４４５−２２
−
−４４−３２２−１５１
−
−９２８４（デュポン）
−
−（注）＊：ビオチン化抗体
−２９０＊ ５２−６８４−２３８＊５２−５８１−
２９０ ＋
＋５２−６８４−２３
８ ＋
＋５２−４４５−２２
−
−４４−３２２−１５１
−
−９２８４（デュポン）
−
−（注）＊：ビオチン化抗体
【００３５】表３に示すように、モノクローナル抗体５
２−５８１−２９０および５２−６８４−２３８はお互
いの間でのみ競合した。これら抗体のいずれも中和領域
のペプチド骨格にマッピングした抗体（５２−４４５−
２２、４４−３２２−１５１および９２８４）を含む他
のいずれの抗体とも競合しなかった。これらの結果は、
これら２つのモノクローナル抗体がｇｐ１２０抗原の同
じ領域内のエピトープを認識することを示している。
２−５８１−２９０および５２−６８４−２３８はお互
いの間でのみ競合した。これら抗体のいずれも中和領域
のペプチド骨格にマッピングした抗体（５２−４４５−
２２、４４−３２２−１５１および９２８４）を含む他
のいずれの抗体とも競合しなかった。これらの結果は、
これら２つのモノクローナル抗体がｇｐ１２０抗原の同
じ領域内のエピトープを認識することを示している。
【００３６】ｇｐ１２０のＶ８タンパク質加水分解
ニグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）に記載の方法に
従い、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８からのグルタメ
ート特異的プロテアーゼを用いて上記精製ｇｐ１２０を
消化した。ジスルフィド結合を還元した後、およその分
子質量が９５、６０、５０および２５キロダルトン（ｋ
Ｄａ）の断片を得た。ＣＤ４陽性細胞への結合について
試験したところ、ｇｐ１２０の選択結合能を保持した開
裂生成物中に２つの断片（９５ｋＤａペプチドおよび２
５ｋＤａペプチド）のみが観察された。下記位置は、シ
グナルペプチドを含むｇｐ１２０中のアミノ酸残基を示
す［ラットナーら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：
２７７〜８４］。ｇｐ１２０内の９５、５０および２５
ｋＤａ断片のニグレンの仮の地図に基づき、アミノ酸残
基１７９および３５８で開裂した、５０ｋＤａタンパク
質の一層大きな断片として６０ｋＤａ断片を位置付ける
ことが可能である。
ニグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）に記載の方法に
従い、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８からのグルタメ
ート特異的プロテアーゼを用いて上記精製ｇｐ１２０を
消化した。ジスルフィド結合を還元した後、およその分
子質量が９５、６０、５０および２５キロダルトン（ｋ
Ｄａ）の断片を得た。ＣＤ４陽性細胞への結合について
試験したところ、ｇｐ１２０の選択結合能を保持した開
裂生成物中に２つの断片（９５ｋＤａペプチドおよび２
５ｋＤａペプチド）のみが観察された。下記位置は、シ
グナルペプチドを含むｇｐ１２０中のアミノ酸残基を示
す［ラットナーら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：
２７７〜８４］。ｇｐ１２０内の９５、５０および２５
ｋＤａ断片のニグレンの仮の地図に基づき、アミノ酸残
基１７９および３５８で開裂した、５０ｋＤａタンパク
質の一層大きな断片として６０ｋＤａ断片を位置付ける
ことが可能である。
【００３７】ｇｐ１２０をグルタメート特異的Ｖ８プロ
テアーゼで消化した後、モノクローナル抗体５２−５８
１−２９０および５２−６８４−２３８の両方とも開裂
ｇｐ１２０の９５ｋＤａ断片および６０ｋＤａ断片とは
反応したが、５０ｋＤａ断片とは反応しなかった。この
データは、両モノクローナル抗体がアミノ酸残基３０１
〜３５８の領域中のｇｐ１２０タンパク質に結合するこ
とを示している。
テアーゼで消化した後、モノクローナル抗体５２−５８
１−２９０および５２−６８４−２３８の両方とも開裂
ｇｐ１２０の９５ｋＤａ断片および６０ｋＤａ断片とは
反応したが、５０ｋＤａ断片とは反応しなかった。この
データは、両モノクローナル抗体がアミノ酸残基３０１
〜３５８の領域中のｇｐ１２０タンパク質に結合するこ
とを示している。
【００３８】ｇｐ１２０のエンドグリコシダーゼＦおよ
びＨ処理 モノクローナル抗体５２−５８１−２９０および５
２−６８４−２３８がｇｐ１２０の炭水化物部分を認識
するかどうかを決定するため、特定のエンドグリコシダ
ーゼを用いてｇｐ１２０抗原からそのグリカンを選択的
に除去した。天然のｇｐ１２０をストレプトマイセス・
リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎ
ｓ）（カルバイオケム、ラジョラ、ＣＡ）由来の組換え
エンドグリコシダーゼＨで処理した。該酵素はＮ−結合
オリゴ糖を特異的に開裂する。０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．８）中、ｇｐ１２０抗原１００ｎｇ当たり１０−
３単位（Ｕ）の酵素の比で３７°Ｃにて３０分間用いた
。消化したｇｐ１２０抗原を電気泳動にかけ、ニトロセ
ルロースに移した。
びＨ処理 モノクローナル抗体５２−５８１−２９０および５
２−６８４−２３８がｇｐ１２０の炭水化物部分を認識
するかどうかを決定するため、特定のエンドグリコシダ
ーゼを用いてｇｐ１２０抗原からそのグリカンを選択的
に除去した。天然のｇｐ１２０をストレプトマイセス・
リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎ
ｓ）（カルバイオケム、ラジョラ、ＣＡ）由来の組換え
エンドグリコシダーゼＨで処理した。該酵素はＮ−結合
オリゴ糖を特異的に開裂する。０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．８）中、ｇｐ１２０抗原１００ｎｇ当たり１０−
３単位（Ｕ）の酵素の比で３７°Ｃにて３０分間用いた
。消化したｇｐ１２０抗原を電気泳動にかけ、ニトロセ
ルロースに移した。
【００３９】同様に、ｇｐ１２０抗原をエンドグリコシ
ダーゼＦ（ベーリンガー−マンハイム、インディアナポ
リス、ＩＮ）で処理してｇｐ１２０分子から複合炭水化
物を除去した。１％ＳＤＳ緩衝液中、ｇｐ１２０抗原１
００ｎｇ当たり０．１Ｕの酵素の濃度のエンドグリコシ
ダーゼＦを３７°Ｃにて２４時間用いた。
ダーゼＦ（ベーリンガー−マンハイム、インディアナポ
リス、ＩＮ）で処理してｇｐ１２０分子から複合炭水化
物を除去した。１％ＳＤＳ緩衝液中、ｇｐ１２０抗原１
００ｎｇ当たり０．１Ｕの酵素の濃度のエンドグリコシ
ダーゼＦを３７°Ｃにて２４時間用いた。
【００４０】上記方法に従い、ｇｐ１２０をエンドグリ
コシダーゼＨで処理してｇｐ１２０分子からアスパラギ
ン結合炭水化物の約６０％を除去し、約９５ｋＤａの糖
タンパク質を得た。ｇｐ１２０抗原をエンドグリコシダ
ーゼＦでも処理して、ｇｐ１２０分子に付随する複合炭
水化物を実質的に除去した。それゆえ、みかけの分子量
は５８〜６０ｋＤａに減少した。
コシダーゼＨで処理してｇｐ１２０分子からアスパラギ
ン結合炭水化物の約６０％を除去し、約９５ｋＤａの糖
タンパク質を得た。ｇｐ１２０抗原をエンドグリコシダ
ーゼＦでも処理して、ｇｐ１２０分子に付随する複合炭
水化物を実質的に除去した。それゆえ、みかけの分子量
は５８〜６０ｋＤａに減少した。
【００４１】モノクローナル抗体５２−５８１−２９０
はエンドグリコシダーゼＨ処理ｇｐ１２０とは反応した
が、エンドグリコシダーゼＦ処理ｇｐ１２０とは反応し
なかった。このことは、モノクローナル抗体５２−５８
１−２９０により認識されるエピトープはもっぱらｇｐ
１２０抗原の炭水化物部分にのみ向けられていることを
示唆している。一方、モノクローナル抗体５２−６８４
−２３８は、エンドグリコシダーゼＨ処理ｇｐ１２０お
よびエンドグリコシダーゼＦ処理ｇｐ１２０の両方と反
応した。このことは、モノクローナル抗体５２−６８４
−２３８によって認識されるエピトープが、炭水化物と
ペプチド骨格との組合せ領域に向けられたものであるこ
とを示唆している。
はエンドグリコシダーゼＨ処理ｇｐ１２０とは反応した
が、エンドグリコシダーゼＦ処理ｇｐ１２０とは反応し
なかった。このことは、モノクローナル抗体５２−５８
１−２９０により認識されるエピトープはもっぱらｇｐ
１２０抗原の炭水化物部分にのみ向けられていることを
示唆している。一方、モノクローナル抗体５２−６８４
−２３８は、エンドグリコシダーゼＨ処理ｇｐ１２０お
よびエンドグリコシダーゼＦ処理ｇｐ１２０の両方と反
応した。このことは、モノクローナル抗体５２−６８４
−２３８によって認識されるエピトープが、炭水化物と
ペプチド骨格との組合せ領域に向けられたものであるこ
とを示唆している。
【００４２】実施例３（レクチン競合結合研究）モノク
ローナル抗体５２−５８１−２９０および５２−６８４
−２３８をレクチントリチクム・ブルガリス（Ｔｒｉｔ
ｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（小麦麦芽）、テトラゴ
ノロブス・プルプレアス（Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕ
ｓ ｐｕｒｐｕｒｅａｓ）（アスパラガスエンドウ）、
グリシネ・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（大豆
）およびカナバリア・エンシフォルミス（Ｃａｎａｖａ
ｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）（タチナタマメ）コン
カナバリンＡに対して競合させた。マイクロタイタープ
レートを上記方法の欄に記載したようにして上記ｇｐ１
２０抗原でコーティングした。 製造業者の指示（ピアス）に従って、モノクローナル抗
体５２−５８１−２９０および５２−６８４−２３８の
Ｆａｂ断片を生成した。これらＦａｂ断片を開裂Ｆｃ断
片からプロテインＡクロマトグラフィーにより分離した
。 目的ｇｐ１２０抗原への結合についてビオチン標識レク
チン（シグマ）をＦａｂモノクローナル抗体と競合させ
た。
ローナル抗体５２−５８１−２９０および５２−６８４
−２３８をレクチントリチクム・ブルガリス（Ｔｒｉｔ
ｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（小麦麦芽）、テトラゴ
ノロブス・プルプレアス（Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕ
ｓ ｐｕｒｐｕｒｅａｓ）（アスパラガスエンドウ）、
グリシネ・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（大豆
）およびカナバリア・エンシフォルミス（Ｃａｎａｖａ
ｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）（タチナタマメ）コン
カナバリンＡに対して競合させた。マイクロタイタープ
レートを上記方法の欄に記載したようにして上記ｇｐ１
２０抗原でコーティングした。 製造業者の指示（ピアス）に従って、モノクローナル抗
体５２−５８１−２９０および５２−６８４−２３８の
Ｆａｂ断片を生成した。これらＦａｂ断片を開裂Ｆｃ断
片からプロテインＡクロマトグラフィーにより分離した
。 目的ｇｐ１２０抗原への結合についてビオチン標識レク
チン（シグマ）をＦａｂモノクローナル抗体と競合させ
た。
【００４３】簡単に説明すると、０．２％ＦＢＳを含有
するＰＢＳ中にＦａｂ断片を１００μｇ／ｍｌから約０
．４μｇ／ｍｌの濃度に系列希釈し、一方、レクチン濃
度は一定に保持した（トリチクム・ブルガリスおよびコ
ンカナバリンＡについては１２．５μｇ／ｍｌ、テトラ
ゴノロブス・プルプレアスおよびグリシネ・マックスに
ついては５０μｇ／ｍｌ）。これらＦａｂ断片希釈液を
ウエル中で１５分間インキュベートし、標識レクチンを
ウエルに加え、ウエルを３０分間インキュベートした。 マイクロタイタープレートを３回水洗した。希釈したス
トレプトアビジン−ＨＲＰＯをウエルに加え、上記のよ
うにして発色させた。レクチン結合部位についてのＦａ
ｂ断片による競合は、標識レクチンを単独で反応させた
場合と比較して４９０ｎｍにおける吸光度が少なくとも
５０％減少するものとして定義した。
するＰＢＳ中にＦａｂ断片を１００μｇ／ｍｌから約０
．４μｇ／ｍｌの濃度に系列希釈し、一方、レクチン濃
度は一定に保持した（トリチクム・ブルガリスおよびコ
ンカナバリンＡについては１２．５μｇ／ｍｌ、テトラ
ゴノロブス・プルプレアスおよびグリシネ・マックスに
ついては５０μｇ／ｍｌ）。これらＦａｂ断片希釈液を
ウエル中で１５分間インキュベートし、標識レクチンを
ウエルに加え、ウエルを３０分間インキュベートした。 マイクロタイタープレートを３回水洗した。希釈したス
トレプトアビジン−ＨＲＰＯをウエルに加え、上記のよ
うにして発色させた。レクチン結合部位についてのＦａ
ｂ断片による競合は、標識レクチンを単独で反応させた
場合と比較して４９０ｎｍにおける吸光度が少なくとも
５０％減少するものとして定義した。
【００４４】
表４
レクチン（特異性） ５２
−５８１−２９０ ５２−６８４−２３８
コントロールＴ．ブルガリス（Ｄ−ｇｌｃＮＡｃ）２
０．４ ０．４
ＮＣＴ．プルプレアス（ａ−Ｌ−ｆｕｃ
） ６．２５ ６．２５
ＮＣグリシネ・マックス（Ｄ−ｇａｌＮＡ
ｃ） ＮＣ ＮＣ
ＮＣコンカナバリンＡ（ａ−Ｄ−ｍａｎ）
ＮＣ ＮＣ
ＮＣ（注）ＮＣ＝競合なし。競合とは、吸光
度が５０％減少するモノクローナル抗体の最小濃度（μ
ｇ／ｍｌ）として定義される。コントロール抗体は５２
−４４５−２２である。
−５８１−２９０ ５２−６８４−２３８
コントロールＴ．ブルガリス（Ｄ−ｇｌｃＮＡｃ）２
０．４ ０．４
ＮＣＴ．プルプレアス（ａ−Ｌ−ｆｕｃ
） ６．２５ ６．２５
ＮＣグリシネ・マックス（Ｄ−ｇａｌＮＡ
ｃ） ＮＣ ＮＣ
ＮＣコンカナバリンＡ（ａ−Ｄ−ｍａｎ）
ＮＣ ＮＣ
ＮＣ（注）ＮＣ＝競合なし。競合とは、吸光
度が５０％減少するモノクローナル抗体の最小濃度（μ
ｇ／ｍｌ）として定義される。コントロール抗体は５２
−４４５−２２である。
【００４５】表４に示されるように、モノクローナル抗
体５２−５８１−２９０および５２−６８４−２３８の
両方ともＴ．ブルガリスおよびＴ．プルプレアスのレク
チンと競合したが、コントロール抗体である５２−４４
５−２２は競合しなかった。グリシネ・マックスおよび
コンカナバリンＡのレクチンとはいずれのモノクローナ
ル抗体も競合しなかった。このデータは、これら２つの
モノクローナル抗体がｇｐ１２０タンパク質のペプチド
骨格に近い炭水化物側鎖の一部を認識していることを示
唆している。
体５２−５８１−２９０および５２−６８４−２３８の
両方ともＴ．ブルガリスおよびＴ．プルプレアスのレク
チンと競合したが、コントロール抗体である５２−４４
５−２２は競合しなかった。グリシネ・マックスおよび
コンカナバリンＡのレクチンとはいずれのモノクローナ
ル抗体も競合しなかった。このデータは、これら２つの
モノクローナル抗体がｇｐ１２０タンパク質のペプチド
骨格に近い炭水化物側鎖の一部を認識していることを示
唆している。
【００４６】さらに、ｇｐ１２０を過ヨウ素酸ナトリウ
ム（ＮａＩＯ４）および水素化ホウ素ナトリウム（Ｎａ
ＢＨ４）で２サイクルの酸化／還元工程で処理して末端
シアル酸糖を対応グリコールに還元しても、モノクロー
ナル抗体５２−５８１−２９０または５２−６８４−２
３８と還元ｇｐ１２０との反応性は影響を受けないこと
がウエスタンブロッティングにより示された。簡単に説
明すると、ｇｐ１２０（１０μｇ）を０．１２Ｍ Ｎａ
ＩＯ４（１０μｌ）とともに室温にて１時間インキュベ
ートした。０．１％ＮａＢＨ４（２０μｌ）を加え、混
合物をさらに１時間インキュベートした。ＮａＩＯ４（
４０μｌ）およびＮａＢＨ４（８０μｌ）を用いて上記
サイクルを繰り返した。各モノクローナル抗体５２−５
８１−２９０および５２−６８４−２３８は還元ｇｐ１
２０と特異的に反応した。このデータは、これら２つの
モノクローナル抗体がエピトープを認識するにはｇｐ１
２０の炭水化物残基のシアル酸部分を必要としないこと
を示唆している。
ム（ＮａＩＯ４）および水素化ホウ素ナトリウム（Ｎａ
ＢＨ４）で２サイクルの酸化／還元工程で処理して末端
シアル酸糖を対応グリコールに還元しても、モノクロー
ナル抗体５２−５８１−２９０または５２−６８４−２
３８と還元ｇｐ１２０との反応性は影響を受けないこと
がウエスタンブロッティングにより示された。簡単に説
明すると、ｇｐ１２０（１０μｇ）を０．１２Ｍ Ｎａ
ＩＯ４（１０μｌ）とともに室温にて１時間インキュベ
ートした。０．１％ＮａＢＨ４（２０μｌ）を加え、混
合物をさらに１時間インキュベートした。ＮａＩＯ４（
４０μｌ）およびＮａＢＨ４（８０μｌ）を用いて上記
サイクルを繰り返した。各モノクローナル抗体５２−５
８１−２９０および５２−６８４−２３８は還元ｇｐ１
２０と特異的に反応した。このデータは、これら２つの
モノクローナル抗体がエピトープを認識するにはｇｐ１
２０の炭水化物残基のシアル酸部分を必要としないこと
を示唆している。
【００４７】実施例４（中和アッセイ）ホー（Ｈｏ）ら
により開示された方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２
３９：１０２１〜２３；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）
６１：２０２４〜２８］に従い、中和アッセイを行った
。簡単に説明すると、ウイルス接種物（１００μｌ；５
０ ５０％組織培養感染投与量）を異なる濃度の被験抗
体（１００μｌ）とともに３７°Ｃで１時間インキュベ
ートした。ついで、このウイルス−抗体混合物を用い、
ＲＰＭＩ １６４０培地（１．５ｍＬ；１５％ウシ胎仔
血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチ
ルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、１ｍＬ
当たり２５０Ｕのペニシリン、１ｍＬ当たり２５０μｇ
のストレプトマイシン、および２ｍＭ Ｌ−グルタミン
添加）中の０．７５×１０６個のＨ９細胞を完成させた
。７〜８日培養した後、ＥＩＡ（アボットＨＴＬＶ−Ｉ
ＩＩ抗原ＥＩＡ、アボット・ラボラトリーズ）によりＨ
ＩＶ ｐ２４抗原をアッセイするため細胞不含培養上澄
み液を回収した。
により開示された方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２
３９：１０２１〜２３；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）
６１：２０２４〜２８］に従い、中和アッセイを行った
。簡単に説明すると、ウイルス接種物（１００μｌ；５
０ ５０％組織培養感染投与量）を異なる濃度の被験抗
体（１００μｌ）とともに３７°Ｃで１時間インキュベ
ートした。ついで、このウイルス−抗体混合物を用い、
ＲＰＭＩ １６４０培地（１．５ｍＬ；１５％ウシ胎仔
血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチ
ルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、１ｍＬ
当たり２５０Ｕのペニシリン、１ｍＬ当たり２５０μｇ
のストレプトマイシン、および２ｍＭ Ｌ−グルタミン
添加）中の０．７５×１０６個のＨ９細胞を完成させた
。７〜８日培養した後、ＥＩＡ（アボットＨＴＬＶ−Ｉ
ＩＩ抗原ＥＩＡ、アボット・ラボラトリーズ）によりＨ
ＩＶ ｐ２４抗原をアッセイするため細胞不含培養上澄
み液を回収した。
【００４８】コントロールの感染Ｈ９細胞に比べてＨＩ
Ｖ ｐ２４抗原の発現が５０％抑制される濃度（ＩＤ５
０）にて、ＨＩＶの特定の株はモノクローナル抗体によ
り中和されると思われた。 表５
ＩＤ５０（μｇ）ウイルス単離物
５２−５８１−２９０ ５２−６８４−２
３８ 実験室株 ＩＩＩＢ ０
．８ ０．４ＲＦ
０．
７ ２．０Ｚ８４
０．１５
０．０５ＡＬ
＞１０
＞１０ 臨床株 Ｔ．Ｂ．
０．３ ＞１０Ｌ．Ｌ
． ＞１０
＞１０Ａ．Ｃ．
０．０４
０．０９Ｌ．Ｓ．
０．０４
０．０３Ｃ．Ｃ．
＞１０
０．２Ｒ．Ｐ．
０．０３
０．０７
Ｖ ｐ２４抗原の発現が５０％抑制される濃度（ＩＤ５
０）にて、ＨＩＶの特定の株はモノクローナル抗体によ
り中和されると思われた。 表５
ＩＤ５０（μｇ）ウイルス単離物
５２−５８１−２９０ ５２−６８４−２
３８ 実験室株 ＩＩＩＢ ０
．８ ０．４ＲＦ
０．
７ ２．０Ｚ８４
０．１５
０．０５ＡＬ
＞１０
＞１０ 臨床株 Ｔ．Ｂ．
０．３ ＞１０Ｌ．Ｌ
． ＞１０
＞１０Ａ．Ｃ．
０．０４
０．０９Ｌ．Ｓ．
０．０４
０．０３Ｃ．Ｃ．
＞１０
０．２Ｒ．Ｐ．
０．０３
０．０７
【００４９】表５に示すよ
うに、モノクローナル抗体５２−５８１−２９０および
５２−６８４−２３８は、実験室株および臨床株を含む
広範囲のＨＩＶ単離物を中和した。１０μｇのモノクロ
ーナル抗体でなおコントロールＨ９細胞の５０％を越え
るｐ２４発現を示した株は中和したとは思われなかった
。
うに、モノクローナル抗体５２−５８１−２９０および
５２−６８４−２３８は、実験室株および臨床株を含む
広範囲のＨＩＶ単離物を中和した。１０μｇのモノクロ
ーナル抗体でなおコントロールＨ９細胞の５０％を越え
るｐ２４発現を示した株は中和したとは思われなかった
。
Claims (10)
- 【請求項１】 分子量が約１２０，０００ダルトンの
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）糖タンパク質（ｇｐ１
２０）上のエピトープに特異的で、該ｇｐ１２０の炭水
化物部分を認識するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 およそアミノ酸３０１〜およそアミノ
酸３５８の領域に局在するエピトープと結合する特性を
さらに有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ＨＩＶを実質的に中和し得る特性をさ
らに有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ＨＩＶを実質的に中和し得る特性をさ
らに有する、請求項２に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 分子量が約１２０，０００ダルトンの
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）糖タンパク質（ｇｐ１
２０）上のエピトープに特異的で、およそアミノ酸３０
１〜およそアミノ酸３５８の領域に局在するｇｐ１２０
の炭水化物部分を認識し、かつＨＩＶを実質的に中和し
得る特性を有するモノクローナル抗体。 - 【請求項６】 アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションに寄託した試料の同定特性を有するハイブリ
ドーマ細胞株、ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ１０３９９によ
り産生されたモノクローナル抗体。 - 【請求項７】 アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションに寄託した試料の同定特性を有するハイブリ
ドーマ細胞株、ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ１０４００によ
り産生されたモノクローナル抗体。 - 【請求項８】 分子量が約１２０，０００ダルトンの
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）糖タンパク質（ｇｐ１
２０）の炭水化物部分を認識し、およそアミノ酸３０１
〜およそアミノ酸３５８の領域に局在するエピトープと
結合するモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドー
マ。 - 【請求項９】 分子量が約１２０，０００ダルトンの
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）糖タンパク質（ｇｐ１
２０）の炭水化物部分に対する抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞株ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ１０３９９。 - 【請求項１０】 分子量が約１２０，０００ダルトン
のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）糖タンパク質（ｇｐ
１２０）の炭水化物部分に対する抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞株ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ１０４００。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US54002590A | 1990-06-18 | 1990-06-18 | |
| US540,025 | 1990-06-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04299993A true JPH04299993A (ja) | 1992-10-23 |
Family
ID=24153675
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3145781A Pending JPH04299993A (ja) | 1990-06-18 | 1991-06-18 | Ｈｉｖ中和モノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0462551B1 (ja) |
| JP (1) | JPH04299993A (ja) |
| KR (1) | KR920000333A (ja) |
| AT (1) | ATE128733T1 (ja) |
| AU (1) | AU651113B2 (ja) |
| CA (1) | CA2044741A1 (ja) |
| DE (1) | DE69113520T2 (ja) |
| DK (1) | DK0462551T3 (ja) |
| ES (1) | ES2080193T3 (ja) |
| GR (1) | GR3018082T3 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AP237A (en) * | 1990-05-29 | 1993-04-29 | Cedars Sinai Medical Center | Immunoreagents reactive with a conserved epitope of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gp120 and methods of use. |
| WO1992007878A1 (en) * | 1990-10-26 | 1992-05-14 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Neutralizing human monoclonal antibodies specific for the v3 loop and cd-4 binding site of hiv-1 gp120 |
| US5556744A (en) * | 1992-05-29 | 1996-09-17 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions for diagnosing and treating certain HIV infected patients |
| EP4051318A4 (en) * | 2019-10-29 | 2023-10-11 | International AIDS Vaccine Initiative | ENGINEERED ANTI-ENV HIV ANTIBODIES |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69025629T2 (de) * | 1990-01-26 | 1996-07-04 | Bay Dev Corp Sa | Arzneimittel und verfahren zur behandlung von erworbenem immundefizienzsyndrom (aids) und aids-verwandtem komplex unter verwendung von karbohydratspezifischen antikörpern |
-
1991
- 1991-06-17 AU AU78475/91A patent/AU651113B2/en not_active Ceased
- 1991-06-17 CA CA002044741A patent/CA2044741A1/en not_active Abandoned
- 1991-06-17 KR KR1019910009944A patent/KR920000333A/ko not_active Withdrawn
- 1991-06-18 AT AT91109937T patent/ATE128733T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-06-18 ES ES91109937T patent/ES2080193T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-18 EP EP91109937A patent/EP0462551B1/en not_active Revoked
- 1991-06-18 JP JP3145781A patent/JPH04299993A/ja active Pending
- 1991-06-18 DK DK91109937.2T patent/DK0462551T3/da active
- 1991-06-18 DE DE69113520T patent/DE69113520T2/de not_active Revoked
-
1995
- 1995-11-15 GR GR950403200T patent/GR3018082T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7847591A (en) | 1991-12-19 |
| ES2080193T3 (es) | 1996-02-01 |
| AU651113B2 (en) | 1994-07-14 |
| EP0462551A1 (en) | 1991-12-27 |
| DE69113520D1 (de) | 1995-11-09 |
| GR3018082T3 (en) | 1996-02-29 |
| KR920000333A (ko) | 1992-01-29 |
| DE69113520T2 (de) | 1996-05-09 |
| ATE128733T1 (de) | 1995-10-15 |
| EP0462551B1 (en) | 1995-10-04 |
| DK0462551T3 (da) | 1996-02-12 |
| CA2044741A1 (en) | 1991-12-19 |
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