JPH04304891A - β−グルクロニダーゼ阻害物質の製造方法 - Google Patents
β−グルクロニダーゼ阻害物質の製造方法Info
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- JPH04304891A JPH04304891A JP3093138A JP9313891A JPH04304891A JP H04304891 A JPH04304891 A JP H04304891A JP 3093138 A JP3093138 A JP 3093138A JP 9313891 A JP9313891 A JP 9313891A JP H04304891 A JPH04304891 A JP H04304891A
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- Japan
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- glucuronidase
- culture supernatant
- molecular weight
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- glucuronidase inhibitor
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はβ−グルクロニダーゼ阻
害物質の新規製造方法に関する。
害物質の新規製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】β−グルクロニダーゼは動物細胞、微生
物に広く存在するが、癌細胞、特に膀胱癌にて強く発現
することが知られている。再発に関与し、さらには転位
にも影響を及ぼすと言われているが、β−グルクロニダ
ーゼ阻害物質についての研究は殆ど皆無と言える。僅か
にグルカロラクトン及びグルカロラクタムが合成阻害剤
として開発され、膀胱癌再発抑制剤として臨床に用いら
れており、天然物由来の阻害物質としては担子菌類由来
（特開昭５２−４４２９５） とマイコバクテリウム属
由来（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，６
９５（１９８３））のものが知られているに留まる。
物に広く存在するが、癌細胞、特に膀胱癌にて強く発現
することが知られている。再発に関与し、さらには転位
にも影響を及ぼすと言われているが、β−グルクロニダ
ーゼ阻害物質についての研究は殆ど皆無と言える。僅か
にグルカロラクトン及びグルカロラクタムが合成阻害剤
として開発され、膀胱癌再発抑制剤として臨床に用いら
れており、天然物由来の阻害物質としては担子菌類由来
（特開昭５２−４４２９５） とマイコバクテリウム属
由来（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，６
９５（１９８３））のものが知られているに留まる。
【０００３】一方、炎症等ではリソゾームよりβ−グル
クロニダーゼが遊離してくるとも言われており、炎症と
の関係も示唆されている。
クロニダーゼが遊離してくるとも言われており、炎症と
の関係も示唆されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】現在臨床で用いられて
いる合成阻害剤は生体内で容易に分解され阻害活性が投
与から数時間以内で消失するという問題点がある。一方
、天然物由来阻害物質については、分子量が１５０００
を越す高分子であり、生体に対し抗原性を示す可能性
が強い。さらに担子菌類については、培養日数が９〜２
６日間と一般の放線菌の培養日数と比べても著しく長い
。マイコバクテリウム属については、６週間を要すとさ
れている。
いる合成阻害剤は生体内で容易に分解され阻害活性が投
与から数時間以内で消失するという問題点がある。一方
、天然物由来阻害物質については、分子量が１５０００
を越す高分子であり、生体に対し抗原性を示す可能性
が強い。さらに担子菌類については、培養日数が９〜２
６日間と一般の放線菌の培養日数と比べても著しく長い
。マイコバクテリウム属については、６週間を要すとさ
れている。
【０００５】本発明の目的は、現在臨床で用いられてい
る合成のβ−グルクロニダーゼ阻害物質に比べ生体内で
より安定で、かつ生体に対する抗原性が低いと考えられ
るβ−グルクロニダーゼ阻害物質を、より短期間で提供
することにあり、この提供はより有効な膀胱癌再発抑制
剤の開発につながると思われる。さらに炎症過程におけ
るβ−グルクロニダーゼ阻害物質の関与を考えると本β
−グルクロニダーゼ阻害物質は抗炎症剤としての有用性
も併せ持つものと期待される。
る合成のβ−グルクロニダーゼ阻害物質に比べ生体内で
より安定で、かつ生体に対する抗原性が低いと考えられ
るβ−グルクロニダーゼ阻害物質を、より短期間で提供
することにあり、この提供はより有効な膀胱癌再発抑制
剤の開発につながると思われる。さらに炎症過程におけ
るβ−グルクロニダーゼ阻害物質の関与を考えると本β
−グルクロニダーゼ阻害物質は抗炎症剤としての有用性
も併せ持つものと期待される。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記のよう
な課題を解決するため微生物の培養上清からの検索を行
い、ストレプトバーチシリウム属菌株の培養上清中にβ
−グルクロニダーゼ阻害物質が蓄積していることを見い
出し、この知見に基づいて本発明を完成した。すなわち
、本発明はストレプトバーチシリウム属菌株の培養上清
液より、分子量５０００より上の分子を除去し、さらに
必要に応じ自由水を部分的にまたは可能な限り除去する
ことを特徴とするβ−グルクロニダーゼ阻害物質の製造
方法に関する。
な課題を解決するため微生物の培養上清からの検索を行
い、ストレプトバーチシリウム属菌株の培養上清中にβ
−グルクロニダーゼ阻害物質が蓄積していることを見い
出し、この知見に基づいて本発明を完成した。すなわち
、本発明はストレプトバーチシリウム属菌株の培養上清
液より、分子量５０００より上の分子を除去し、さらに
必要に応じ自由水を部分的にまたは可能な限り除去する
ことを特徴とするβ−グルクロニダーゼ阻害物質の製造
方法に関する。
【０００７】本発明においてはストレプトバーチシリウ
ム属に属し、β−グルクロニダーゼ阻害物質を生産する
能力を有する微生物であればいずれの微生物も使用し得
る。本発明の使用菌としては例えばストレプトバーチシ
リウム・ハチジョウエンスに属し、β−グルクロニダー
ゼ阻害物質を生産する能力を有する微生物が挙げられ、
具体的な菌株としてはストレプトバーチシリウム・ハチ
ジョウエンスＨ−２６０９株（ＩＦＯ １２７８２）
、Ｈ−２０７５株、Ｈ−３０３０株が挙げられる。スト
レプトバーチシリウム・ハチジョウエンスの菌学的性状
は、「抗トリコモナス・抗ガン作用を有する新抗生物質
、トリコマイシンについて」（ 細谷ら、ジャーナル・
オブ・アンチバイオテックス 第１０巻、第５６４
頁、１９５２年） において、ストレプトバーチシリウ
ム・ハチジョウエンスのＨ−２６０９株について述べら
れており、また「スタディーズ オン ザ アン
チバイオティクス サブスタンス プロデューシン
グ ストレインズＨ−２０７５，Ｈ−２６０９アンド
Ｈ−３０３０」（ ザ ジャーナル オブ アンチ
バイオティクス シリーズＡ，第７巻、第１号、第１
０頁、１９５４年） においてストレプトバーチシリウ
ム・ハチジョウエンスのＨ−２６０９株及びＨ−２０７
５株について述べられている。
ム属に属し、β−グルクロニダーゼ阻害物質を生産する
能力を有する微生物であればいずれの微生物も使用し得
る。本発明の使用菌としては例えばストレプトバーチシ
リウム・ハチジョウエンスに属し、β−グルクロニダー
ゼ阻害物質を生産する能力を有する微生物が挙げられ、
具体的な菌株としてはストレプトバーチシリウム・ハチ
ジョウエンスＨ−２６０９株（ＩＦＯ １２７８２）
、Ｈ−２０７５株、Ｈ−３０３０株が挙げられる。スト
レプトバーチシリウム・ハチジョウエンスの菌学的性状
は、「抗トリコモナス・抗ガン作用を有する新抗生物質
、トリコマイシンについて」（ 細谷ら、ジャーナル・
オブ・アンチバイオテックス 第１０巻、第５６４
頁、１９５２年） において、ストレプトバーチシリウ
ム・ハチジョウエンスのＨ−２６０９株について述べら
れており、また「スタディーズ オン ザ アン
チバイオティクス サブスタンス プロデューシン
グ ストレインズＨ−２０７５，Ｈ−２６０９アンド
Ｈ−３０３０」（ ザ ジャーナル オブ アンチ
バイオティクス シリーズＡ，第７巻、第１号、第１
０頁、１９５４年） においてストレプトバーチシリウ
ム・ハチジョウエンスのＨ−２６０９株及びＨ−２０７
５株について述べられている。
【０００８】本発明において、これらの放線菌を用いて
β−グルクロニダーゼ阻害物質を生産するにあたって用
いられる培地としては、放線菌培養用の通常の液体培が
用いられ、当該放線菌が資化し得る炭素源、窒素源及び
その放線菌に必要な無機、有機化合物を程よく含有する
ものであればよい。例えば炭素源としては、グルコース
、フラクトース、マルトース、スクロース、デキストリ
ン、澱粉及びその加水分解物、廃糖蜜等の炭水化物、ク
エン酸、コハク酸、フマル酸、酢酸などの有機酸類が用
いられる。又、窒素源の例としては、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム、硝酸カリウム、尿素、アミノ酸類、ペプトン、大
豆ホエー、大豆及びフレーク及びそれらの加水分解物、
米糖、肉抽出物などが用いられる。その他マグネシウム
塩、リン酸塩等の無機塩類、ビタミン、酵母エキスなど
の有機栄養物質を適宜存在せしめる。
β−グルクロニダーゼ阻害物質を生産するにあたって用
いられる培地としては、放線菌培養用の通常の液体培が
用いられ、当該放線菌が資化し得る炭素源、窒素源及び
その放線菌に必要な無機、有機化合物を程よく含有する
ものであればよい。例えば炭素源としては、グルコース
、フラクトース、マルトース、スクロース、デキストリ
ン、澱粉及びその加水分解物、廃糖蜜等の炭水化物、ク
エン酸、コハク酸、フマル酸、酢酸などの有機酸類が用
いられる。又、窒素源の例としては、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム、硝酸カリウム、尿素、アミノ酸類、ペプトン、大
豆ホエー、大豆及びフレーク及びそれらの加水分解物、
米糖、肉抽出物などが用いられる。その他マグネシウム
塩、リン酸塩等の無機塩類、ビタミン、酵母エキスなど
の有機栄養物質を適宜存在せしめる。
【０００９】培養は滅菌培地に種菌を加え、通気及び／
または攪拌下に、一般に２０〜３５℃、好ましくは２８
〜３０℃で、一般にｐＨ６〜９、好ましくは７〜８で行
う。この条件下で通常β−グルクロニダーゼ阻害物質の
生成が最大になった時点で培養を終了する。培養時間は
通常１〜１０日、好ましくは３〜５日である。
または攪拌下に、一般に２０〜３５℃、好ましくは２８
〜３０℃で、一般にｐＨ６〜９、好ましくは７〜８で行
う。この条件下で通常β−グルクロニダーゼ阻害物質の
生成が最大になった時点で培養を終了する。培養時間は
通常１〜１０日、好ましくは３〜５日である。
【００１０】培養終了後、培養液から菌体を除き、培養
上清を限外濾過、分子ふるい等既知の方法を組み合わせ
ることにより、分子量５０００より上の分子を取り除き
、水分を例えば凍結乾燥により除いて粉末とする。
上清を限外濾過、分子ふるい等既知の方法を組み合わせ
ることにより、分子量５０００より上の分子を取り除き
、水分を例えば凍結乾燥により除いて粉末とする。
【００１１】本β−グルクロニダーゼ阻害物質の治療へ
の適用については動物実験の結果から、常法により経口
、注射、坐薬等の剤形にして使用することができるが、
経口剤が有利である。経口剤としては種々の賦形剤を含
んでいてもよく、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤とす
ることができる。また、注射剤としては皮下、筋肉内注
射剤のいずれでもよく、懸濁液、溶液もしくは使用時溶
解させる粉末等の剤形が用いられる。なお、注射剤には
局所麻酔剤を含ませる必要はない。また、皮下注射によ
り生体内の網内系を刺激して免疫系を亢進させるように
することも好ましいと考えられる。
の適用については動物実験の結果から、常法により経口
、注射、坐薬等の剤形にして使用することができるが、
経口剤が有利である。経口剤としては種々の賦形剤を含
んでいてもよく、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤とす
ることができる。また、注射剤としては皮下、筋肉内注
射剤のいずれでもよく、懸濁液、溶液もしくは使用時溶
解させる粉末等の剤形が用いられる。なお、注射剤には
局所麻酔剤を含ませる必要はない。また、皮下注射によ
り生体内の網内系を刺激して免疫系を亢進させるように
することも好ましいと考えられる。
【００１２】本β−グルクロニダーゼ阻害物質の投与量
は患者の症状に応じて適宜選択されるが、一般に成人に
おいて１〜 １００ｍｇ／ｋｇ を１日１〜数回に分け
投与するのが好ましく、投与方法としては経口又は皮下
、筋肉内もしくは患部への注射によってなされるのが好
ましい。なお、本β−グルクロニダーゼ阻害物質は雄性
マウスに２５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した場合にも毒性
死は見られなかった。
は患者の症状に応じて適宜選択されるが、一般に成人に
おいて１〜 １００ｍｇ／ｋｇ を１日１〜数回に分け
投与するのが好ましく、投与方法としては経口又は皮下
、筋肉内もしくは患部への注射によってなされるのが好
ましい。なお、本β−グルクロニダーゼ阻害物質は雄性
マウスに２５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した場合にも毒性
死は見られなかった。
【００１３】
【実施例】次に本発明を実施例により具体的に説明する
。 実施例１ （１） 本酵素阻害剤物質の製造 水１Ｌ に対し、ポリペプトン４．２ｇ、ブロテオース
ペプトン８．３ｇ、グルコース４．２ｇ、ＮａＣｌ ７
．５ｇ 、ビーフエキストラクト２．５ｇ、デンプン１
６．７ｇ を含有する培地をｐＨ７．４ に調整後、１
２１ ℃で２０分滅菌し、あらかじめ蒸気滅菌してある
３０Ｌ ジャーファーメンターに１６Ｌ 入れ、この培
地の中に予め前培養したストレプトバーチシリウム・ハ
チジョウエンスＨ−２６０９の種菌を２００ｍｌ 加え
、２８℃、通気量１６Ｌ／ｍｉｎ で３日間培養する。 培養終了液を遠心操作（８０００ｒｐｍ 、２０分間）
に付して菌体を除き、さらに ０．７μｍ のグラス
フィルターを通し、培養上清１４Ｌ を得た。培養上清
は、１０ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥の後４℃
にて保存する。１０ｍｌの培養上清より乾燥粉末１７０
ｍｇ を得る。前記測定条件にて０．５ Ｆｉｓｍａｎ
ｕｎｉｔ のβ−グルクロニダーゼを５０％阻害する
濃度は、培養上清凍結乾燥重量０．８ｍｇ であった。 （ ただし反応液の全量は ５００μｌ のため最終濃
度は１．６ｍｇ／ｍｌである。）
。 実施例１ （１） 本酵素阻害剤物質の製造 水１Ｌ に対し、ポリペプトン４．２ｇ、ブロテオース
ペプトン８．３ｇ、グルコース４．２ｇ、ＮａＣｌ ７
．５ｇ 、ビーフエキストラクト２．５ｇ、デンプン１
６．７ｇ を含有する培地をｐＨ７．４ に調整後、１
２１ ℃で２０分滅菌し、あらかじめ蒸気滅菌してある
３０Ｌ ジャーファーメンターに１６Ｌ 入れ、この培
地の中に予め前培養したストレプトバーチシリウム・ハ
チジョウエンスＨ−２６０９の種菌を２００ｍｌ 加え
、２８℃、通気量１６Ｌ／ｍｉｎ で３日間培養する。 培養終了液を遠心操作（８０００ｒｐｍ 、２０分間）
に付して菌体を除き、さらに ０．７μｍ のグラス
フィルターを通し、培養上清１４Ｌ を得た。培養上清
は、１０ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥の後４℃
にて保存する。１０ｍｌの培養上清より乾燥粉末１７０
ｍｇ を得る。前記測定条件にて０．５ Ｆｉｓｍａｎ
ｕｎｉｔ のβ−グルクロニダーゼを５０％阻害する
濃度は、培養上清凍結乾燥重量０．８ｍｇ であった。 （ ただし反応液の全量は ５００μｌ のため最終濃
度は１．６ｍｇ／ｍｌである。）
【００１４】次に、こ
の阻害物質の大まかな大きさを知るために分子ふるいに
かける。分子ふるいとしてはミリポア社製モルカットＩ
Ｉ ＴＭＫ、ＴＨＫ、ＴＴＫ、ＴＧＣ、ＬＣＣ、グレ
ース社製アミコンＹＭ２を用いた。限外分画分子量は順
に３００，０００、１００，０００ 、３０，０００、
１０，０００、５，０００ 、１，０００ である。上
記の分子ふるいを通過した培養上清のβ−グルクロニダ
ーゼ阻害活性をもとの培養上清と比較した。阻害活性の
用量依存性を比べる限り、もとの培養上清と分子量５０
００以下の培養上清部分とでは差が現れない。さらに分
子ふるいＹＭ２で分画し分子ふるいを通過した分子量１
０００未満の培養上清部分と分子ふるいの上に濃縮され
た分子量１０００以上５０００以下の培養上清部分とを
同じくもとの培養上清と阻害活性の用量依存性を比べた
のが図１である。図１中β−グルクロニダーゼ阻害活性
はコントロール（阻害物質非含有）との相対値を示す。 １０００未満の培養上清部分の阻害活性は、もとの培養
上清に比べ減少し、１０００以上５０００以下の培養上
清部分に濃縮されていることが分る。
の阻害物質の大まかな大きさを知るために分子ふるいに
かける。分子ふるいとしてはミリポア社製モルカットＩ
Ｉ ＴＭＫ、ＴＨＫ、ＴＴＫ、ＴＧＣ、ＬＣＣ、グレ
ース社製アミコンＹＭ２を用いた。限外分画分子量は順
に３００，０００、１００，０００ 、３０，０００、
１０，０００、５，０００ 、１，０００ である。上
記の分子ふるいを通過した培養上清のβ−グルクロニダ
ーゼ阻害活性をもとの培養上清と比較した。阻害活性の
用量依存性を比べる限り、もとの培養上清と分子量５０
００以下の培養上清部分とでは差が現れない。さらに分
子ふるいＹＭ２で分画し分子ふるいを通過した分子量１
０００未満の培養上清部分と分子ふるいの上に濃縮され
た分子量１０００以上５０００以下の培養上清部分とを
同じくもとの培養上清と阻害活性の用量依存性を比べた
のが図１である。図１中β−グルクロニダーゼ阻害活性
はコントロール（阻害物質非含有）との相対値を示す。 １０００未満の培養上清部分の阻害活性は、もとの培養
上清に比べ減少し、１０００以上５０００以下の培養上
清部分に濃縮されていることが分る。
【００１５】この５０００以下の培養上清液部分（下記
（３） 、（４））、または１０００以上５０００以下
の培養上清液部分（ 下記（１） 、（２） 、（５）
）を凍結乾燥して得られたβ−グルクロニダーゼ阻害物
質の物性を以下に示す。 （１） 物質の色 ； 淡黄色 （２） 紫外線吸収スペクトル ； 図２のとおり（
３） 赤外線吸収スペクトル ； 図３のとおり（
ＫＢｒ錠剤法） ６１１、１０
４７、１０８２、１１１１、１４０２、１６００、１６
３７、３４３０、３６８５［ｃｍ−１］にピークが認め
られる。 （４） 元素分析 Ｃ；１６．２％
Ｈ； ２．７％ Ｎ； ５．４％ Ｏ；１７．４％ 灰分；５７．４％ （５） 分子量分布範囲 ； １０００ 〜５０００な
お、別に培養上清を東ソー社製カラムＧ２５００ＰＷＸ
Ｌ（１Ｄ ７．８ｃｍ ×３０ｃｍ） にてＨＰＬＣで
分子量分画し、それぞれの画分についてβ−グルクロニ
ダーゼ阻害活性を調べたところ、分子量１２５０前後に
阻害活性を認めた。
（３） 、（４））、または１０００以上５０００以下
の培養上清液部分（ 下記（１） 、（２） 、（５）
）を凍結乾燥して得られたβ−グルクロニダーゼ阻害物
質の物性を以下に示す。 （１） 物質の色 ； 淡黄色 （２） 紫外線吸収スペクトル ； 図２のとおり（
３） 赤外線吸収スペクトル ； 図３のとおり（
ＫＢｒ錠剤法） ６１１、１０
４７、１０８２、１１１１、１４０２、１６００、１６
３７、３４３０、３６８５［ｃｍ−１］にピークが認め
られる。 （４） 元素分析 Ｃ；１６．２％
Ｈ； ２．７％ Ｎ； ５．４％ Ｏ；１７．４％ 灰分；５７．４％ （５） 分子量分布範囲 ； １０００ 〜５０００な
お、別に培養上清を東ソー社製カラムＧ２５００ＰＷＸ
Ｌ（１Ｄ ７．８ｃｍ ×３０ｃｍ） にてＨＰＬＣで
分子量分画し、それぞれの画分についてβ−グルクロニ
ダーゼ阻害活性を調べたところ、分子量１２５０前後に
阻害活性を認めた。
【００１６】（２） 有機溶媒に対する安定性次にフェ
ノール、クロロホルム等の有機溶媒に対する安定性を調
べた。培養上清中には、多くのタンパク質が含まれるた
め、あらかじめ培養上清をミリポア社製モルカットＩＩ
ＬＣＣの分子ふるいを通し、５０００より上の分子を除
いておく。これは、次の手順のフェノール処理によりタ
ンパク質が変性する際、β−グルクロニダーゼ阻害物質
がタンパク質中に取り込まれる可能製を軽減するためで
ある。１．５ｍｌ のチューブに、あらかじめ生理食塩
水又は水で飽和させたフェノール／ クロロホルム（
フェノール／クロロホルムはクロロホルムで飽和させた
フェノール）を ７００μｌ 、５０００以下の培養上
清部分を ７００μｌ 入れ、５分間よく攪拌する。１
２０００ｒｐｍ（９０００ ×ｇ）で５分間遠心分離を
行い水層を取る。次にこの水層にクロロホルムを ７０
０μｌ 加え、再度５分間攪拌し１２０００ｒｐｍ（９
０００ ×ｇ）で５分間遠心分離を行い水層を取りβ−
グルクロニダーゼ阻害活性の用量依存性を調べた。水層
へのフェノール又はクロロホルムの残留の影響を調べる
ため、同様の処理を施した生理食塩水もコントロールと
する。もとの培養上清と比較したのが図４である。フェ
ノールクロロホルムで処理してもβ−グルクロニダーゼ
阻害活性が低下しないことから、培養上清中のこの物質
はタンパク性のものではないことが強く示唆される。図
４中β−グルクロニダーゼ阻害活性はコントロールとの
相対値を示す。
ノール、クロロホルム等の有機溶媒に対する安定性を調
べた。培養上清中には、多くのタンパク質が含まれるた
め、あらかじめ培養上清をミリポア社製モルカットＩＩ
ＬＣＣの分子ふるいを通し、５０００より上の分子を除
いておく。これは、次の手順のフェノール処理によりタ
ンパク質が変性する際、β−グルクロニダーゼ阻害物質
がタンパク質中に取り込まれる可能製を軽減するためで
ある。１．５ｍｌ のチューブに、あらかじめ生理食塩
水又は水で飽和させたフェノール／ クロロホルム（
フェノール／クロロホルムはクロロホルムで飽和させた
フェノール）を ７００μｌ 、５０００以下の培養上
清部分を ７００μｌ 入れ、５分間よく攪拌する。１
２０００ｒｐｍ（９０００ ×ｇ）で５分間遠心分離を
行い水層を取る。次にこの水層にクロロホルムを ７０
０μｌ 加え、再度５分間攪拌し１２０００ｒｐｍ（９
０００ ×ｇ）で５分間遠心分離を行い水層を取りβ−
グルクロニダーゼ阻害活性の用量依存性を調べた。水層
へのフェノール又はクロロホルムの残留の影響を調べる
ため、同様の処理を施した生理食塩水もコントロールと
する。もとの培養上清と比較したのが図４である。フェ
ノールクロロホルムで処理してもβ−グルクロニダーゼ
阻害活性が低下しないことから、培養上清中のこの物質
はタンパク性のものではないことが強く示唆される。図
４中β−グルクロニダーゼ阻害活性はコントロールとの
相対値を示す。
【００１７】（３） 熱安定性
同時に熱安定性について調べた。前記のように５０００
以上の分子を除いた培養上清部分を１．５ｍｌ チュー
ブに１ｍｌ 取りそれぞれ５０℃、６０℃、７０℃、８
０℃、９０℃で１０分間加熱した後、氷中に５分間置い
た後、１２０００ｒｐｍ（９０００ ×ｇ）５分間の遠
心操作を行い上清を取り、０．２２μｍ のフィルター
を通した後、そのβ−グルクロニダーゼ阻害活性の用量
依存性を調べた。５０〜９０℃処理のものについて同じ
用量依存性を示すため、９０℃処理の用量依存性を図４
にあわせて示す。このことからも、培養上清中のβ−グ
ルクロニダーゼ阻害物質がタンパク性のものではないと
考えられる。
以上の分子を除いた培養上清部分を１．５ｍｌ チュー
ブに１ｍｌ 取りそれぞれ５０℃、６０℃、７０℃、８
０℃、９０℃で１０分間加熱した後、氷中に５分間置い
た後、１２０００ｒｐｍ（９０００ ×ｇ）５分間の遠
心操作を行い上清を取り、０．２２μｍ のフィルター
を通した後、そのβ−グルクロニダーゼ阻害活性の用量
依存性を調べた。５０〜９０℃処理のものについて同じ
用量依存性を示すため、９０℃処理の用量依存性を図４
にあわせて示す。このことからも、培養上清中のβ−グ
ルクロニダーゼ阻害物質がタンパク性のものではないと
考えられる。
【００１８】（４） 酵素阻害活性の測定法本発明によ
る酵素阻害物質はβ−グルクロニダーゼ阻害活性を有す
るが、その測定法は次の通りである。試料溶液（２５ｍ
Ｍ 酢酸緩衝液 ｐＨ４．５）４８０μｌ 、β−グル
クロニダーゼ（ ベーリンガー・マンハイム製、Ｃａｔ
．１２７ ０６０． ０．５Ｆｉｓｈｍａｎ ｕｎｉｔ
）溶液（２５ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ４．５）１０μｌ
、４−メチルウンベリフェリル−β−グルクロニド（
モレキュラー・プローブ製．Ｃａｔ．ＮＯ．ＦＭ−０１
２４−９０）１ｍｇ／ｍｌ溶液（２５ｍＭ 酢酸緩衝液
、ｐＨ４．５）１０μｌ を加えよく混合した後、３７
℃で３０分反応させた後、停止緩衝液（ グリシン５０
ｍＭ 、ＥＤＴＡ・３Ｎａ ５ｍＭ 、ｐＨ１０．５
） を１ｍｌ 加えて反応を止め、ケイ光分光光度計に
て励起光３１５ｎｍ 、ケイ光４４０ｎｍ のケイ光強
度Ｉｓを測定する。一方、対照としてβ−グルクロニダ
ーゼ溶液の代わりに２５ｍＭ酢酸緩衝液１０μｌ を用
い、同様に処理してケイ光強度Ｉｂを測定する。
る酵素阻害物質はβ−グルクロニダーゼ阻害活性を有す
るが、その測定法は次の通りである。試料溶液（２５ｍ
Ｍ 酢酸緩衝液 ｐＨ４．５）４８０μｌ 、β−グル
クロニダーゼ（ ベーリンガー・マンハイム製、Ｃａｔ
．１２７ ０６０． ０．５Ｆｉｓｈｍａｎ ｕｎｉｔ
）溶液（２５ｍＭ 酢酸緩衝液、ｐＨ４．５）１０μｌ
、４−メチルウンベリフェリル−β−グルクロニド（
モレキュラー・プローブ製．Ｃａｔ．ＮＯ．ＦＭ−０１
２４−９０）１ｍｇ／ｍｌ溶液（２５ｍＭ 酢酸緩衝液
、ｐＨ４．５）１０μｌ を加えよく混合した後、３７
℃で３０分反応させた後、停止緩衝液（ グリシン５０
ｍＭ 、ＥＤＴＡ・３Ｎａ ５ｍＭ 、ｐＨ１０．５
） を１ｍｌ 加えて反応を止め、ケイ光分光光度計に
て励起光３１５ｎｍ 、ケイ光４４０ｎｍ のケイ光強
度Ｉｓを測定する。一方、対照としてβ−グルクロニダ
ーゼ溶液の代わりに２５ｍＭ酢酸緩衝液１０μｌ を用
い、同様に処理してケイ光強度Ｉｂを測定する。
【００１９】阻害剤の存在しないときの酵素活性は、試
料溶液の代わりに緩衝液 ４８０μｌ を用いてケイ光
強度Ｅｓ、対照Ｅｂを測定することにより、差Ｅｓ−Ｅ
ｂ として与えられる。酵素阻害率は｛１−（Ｉｓ−Ｉ
ｂ）／（Ｅｓ−Ｅｂ） ｝× １００［％］にて求める
が前記の測定条件では Ｅｓ 、Ｉｓ 》Ｅｂ、Ｉｂ
であるため阻害率は（１−Ｉｓ／Ｅｓ） × １００［
％］で近似できる。
料溶液の代わりに緩衝液 ４８０μｌ を用いてケイ光
強度Ｅｓ、対照Ｅｂを測定することにより、差Ｅｓ−Ｅ
ｂ として与えられる。酵素阻害率は｛１−（Ｉｓ−Ｉ
ｂ）／（Ｅｓ−Ｅｂ） ｝× １００［％］にて求める
が前記の測定条件では Ｅｓ 、Ｉｓ 》Ｅｂ、Ｉｂ
であるため阻害率は（１−Ｉｓ／Ｅｓ） × １００［
％］で近似できる。
【００２０】
【発明の効果】特定放線菌の培養によりβ−グルクロニ
ダーゼ阻害物質が従来より短期間で生産される。
ダーゼ阻害物質が従来より短期間で生産される。
【図１】ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエンス
Ｈ−２６０９の培養上清の分画度合いとβ−グルクロニ
ダーゼ活性との関係を示す。
Ｈ−２６０９の培養上清の分画度合いとβ−グルクロニ
ダーゼ活性との関係を示す。
【図２】本発明に係わるβ−グルクロニダーゼ阻害物質
の紫外部吸収スペクトルを示す。
の紫外部吸収スペクトルを示す。
【図３】本発明に係わるβ−グルクロニダーゼ阻害物質
の赤外部吸収スペクトルを示す。
の赤外部吸収スペクトルを示す。
【図４】ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエンス
Ｈ−２６０９の培養上清のフェノール／クロロホルム処
理、及び加熱処理が与えるβ−グルクロニダーゼ活性へ
の影響を示す。
Ｈ−２６０９の培養上清のフェノール／クロロホルム処
理、及び加熱処理が与えるβ−グルクロニダーゼ活性へ
の影響を示す。
図１中、黒丸は培養上清全体、四角は分子量５０００以
下の培養上清、三角は分子量１０００以下の培養上清、
白丸は分子量１０００〜５０００の培養上清を意味する
。図４中、黒丸は培養上清全体、四角は分子量５０００
以下の培養上清をフェノール／クロロホルムで処理した
もの、三角は分子量５０００以下の培養上清を５０℃で
１０分処理したもの、白丸は分子量５０００以下の培養
上清を９０℃で１０分処理したものを意味する。
下の培養上清、三角は分子量１０００以下の培養上清、
白丸は分子量１０００〜５０００の培養上清を意味する
。図４中、黒丸は培養上清全体、四角は分子量５０００
以下の培養上清をフェノール／クロロホルムで処理した
もの、三角は分子量５０００以下の培養上清を５０℃で
１０分処理したもの、白丸は分子量５０００以下の培養
上清を９０℃で１０分処理したものを意味する。
Claims (2)
- 【請求項１】 ストレプトバーチシリウム属菌株の培
養上清液より、分子量５０００より上の分子を除去し、
さらに必要に応じ自由水を部分的にまたは可能な限り除
去することを特徴とするβ−グルクロニダーゼ阻害物質
の製造方法。 - 【請求項２】 使用菌株がストレプトバーチシリウム
・ハチジョウエンスに属する菌株である請求項１の製造
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3093138A JPH04304891A (ja) | 1991-03-30 | 1991-03-30 | β−グルクロニダーゼ阻害物質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3093138A JPH04304891A (ja) | 1991-03-30 | 1991-03-30 | β−グルクロニダーゼ阻害物質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04304891A true JPH04304891A (ja) | 1992-10-28 |
Family
ID=14074168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3093138A Withdrawn JPH04304891A (ja) | 1991-03-30 | 1991-03-30 | β−グルクロニダーゼ阻害物質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04304891A (ja) |
-
1991
- 1991-03-30 JP JP3093138A patent/JPH04304891A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19980514 |