JPH04305531A - 治療抗凝血剤の投与方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】血栓症は先進諸国における主要な死因であ
る。現在の療法は非致死的血栓症状を予防しかつ処置す
るため抗凝血剤及び血栓溶解剤の使用に依存している。 最も広く用いられる抗凝血剤のヘパリンは抗トロンビン
ＩＩＩの効果を高め、それによりトロンビン活性を遮断
している〔ヘンカ−、血栓及び止血国際学会、ルベン大
学出版、ルベン、１９８７年（Ｈｅｍｋｅｒ，Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙ　　ｏｎ　　Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｓｉｓ　　ａｎｄ　　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ
，Ｌｅｕｖｅｎ　　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｌｅｕｖｅｎ（１９８７））〕。その使用はその広
範な結合特異性のために合併症をおこすことが多い〔ヒ
ュイッセら、トロンボシス・リサーチ、第２７巻、１９
８２年、第４８５−４９０頁（Ｈｕｉｓｓｅ　　ｅｔ　
　ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，２７（１９８２）
４８５−４９０）〕。

【０００２】血液凝固の役割は止血栓の硬化及び安定化
のために不溶性フィブリン基質を形成することである。 架橋フィブリン凝塊の形成はある範囲の十分に特徴付け
られた血漿タンパク質を伴う一連の生化学的相互作用に
起因している。

【０００３】その相互作用は、フィブリン形成に必要な
すべての物質が循環血漿中に前駆形で存在する“内在経
路”と称される経路と、組織に由来するトロンボプラス
チンがプロセスにおいていくつかのステップを迂回して
凝塊形成を促進させる外在経路とに分類される。２つの
経路は高度に相互依存的であり、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子
及びＸ因子が相互に活性化される〔Ｊ．Ｃ．ギジングス
、“血液凝固に関する分子遺伝学及び免疫分析”、エリ
ス・ホーウッド社、チチェスター、イングランド、１９
８８年、第１７頁〔Ｊ．Ｃ．Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，“Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ　　ａｎｄ　　Ｉｍｍ
ｕｎｏａｎａｌｙｓｉｓ　　ｉｎ　　Ｂｌｏｏｄ　　Ｃ
ｏａｇｕｌａｔｉｏｎ”、Ｅｌｌｉｓ　　Ｈｏｒｗｏｏ
ｄ　　Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎ
ｄ，１９８８，ｐ．１７）〕。

【０００４】凝固カスケードにおけるＸ因子の役割はズ
ーら、“血液凝固の組織因子経路”、止血及び血栓、第
１版（ブルームら編集）、チャーチル・リビングストー
ン、エジンバラ、第１２４・１３９頁、１９８１年〔Ｚ
ｕｒ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｔｉｓｓｕｅ　　ｆａｃｔ
ｏｒ　　ｐａｔｈｗａｙｓ　　ｏｆ　　ｂｌｏｏｄ，ｃ
ｏａｇｕｌａｔｉｏｎ”、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　　
ａｎｄ　　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ｌｓｔ　　Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ（Ｂｌｏｏｍ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｅｄｓ）、Ｃ
ｈｕｒｃｈｉｌｌ　　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉ
ｎｂｕｒｇｈ，ｐｐ．１２４−１３９（１９８１）〕；
ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、“プロトロンビン活性
化の生化学”（Ｔｈｅ　　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
　ｏｆ　　ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ　　ａｃｔｉｖａｔ
ｉｏｎ）、止血及び血栓、第２版（ブルームら編集）、
チャーチル・リビングストーン、エジンバラ、第１６５
−１９１頁１９８７年；スタインバーグら、“Ｘ因子の
活性化”、止血及び血栓、第１版（コールマンら編集）
、リピンコット、フィラデルフィア、第９１−１１１頁
、１９８２年〔Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ　　ｅｔ　　ａｌ．
，“Ｔｈｅ　　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｆａ
ｃｔｏｒＸ”、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　　ａｎｄ　　
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ＦｉｒｓｔＥｄｉｔｉｏｎ（Ｃ
ｏｌｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｅｄｓ．）Ｌｉｐｐｉ
ｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．９１−
１１１（１９８２）〕で考察されていた。

【０００５】Ｘａ因子は血液凝固カスケードにおいて中
枢的役割を果たす。それはトロンビンの上流における１
ステップで凝固カスケードをコントロールするため、Ｘ
ａ因子阻害剤はトロンビンで作用するものよりもより有
効な抗凝血剤であろう。主にトロンビン活性を遮断する
ヘパリンは、トロンビン産生が血栓の形成に関与してい
る症状で最も広く使用される。しかしながら、それは多
くの生物学的効果を有する不均一な物質であるため（ヒ
ュイッセら）、更に特異的かつ強力な物質の開発を必要
とする。アンチスタシンの特異性及び効力は血栓症の治
療用に更に有効な臨床剤としてその可能な使用に関し、
興味をおこさせた。Ｘａ因子阻害剤であることに加えて
、アンチスタシンは最初にそれが強い抗転移活性を有す
ると確認されたように、重要な生物学的機能を更に有し
ている〔ツジンスキーら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、第２６２巻、１９８７年、第９
７１８−９７２３頁（Ｔｕｓｚｉｎｓｋｙ　　ｅｔ　　
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２（１９８７
）９７１８−９７２３）〕。腫瘍細胞の転移拡散が異常
に促進された血液凝固によって一部媒介されるという証
拠は増えてきているが〔ガシックら、インターナショナ
ル・レビュー・オブ・エクスペリメンタル・パソロジー
、第２９巻、１９８６年、第１７３−２０８頁（Ｇａｓ
ｉｃ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｉｎｔ・Ｒｅｖ・Ｅｘｐ・Ｐ
ａｔｈ．，２９（１９８６）１７３−２０８）〕。その
場合に腫瘍細胞によるＸ因子の直接的活性化が主要原因
であると示唆された〔ファランガ及びゴードン、バイオ
ケミストリー、第２４巻、１９８５年、第５５５８−５
５６７頁（Ｆａｌａｎｇａ　　ａｎｄ　　Ｇｏｒｄｏｎ
，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４（１９８５）５５５
８−５５６７）〕。フィブリンの細胞周囲沈着は転移上
重要であると考えられ〔ウッド、ジャーナル・オブ・メ
ディシン、第５巻、１９７４年、第７−２２頁（Ｗｏｏ
ｄ，Ｊ．Ｍｅｄ．，５（１９７４）７−２２）〕、免疫
系に非浸透性の保護カバーを腫瘍細胞に与える〔ゴレリ
ックら、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャ
ンサー、第３０巻、１９８２年，第１０７−１１２頁（
Ｇｏｒｅｌｉｋ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ，３０（１９８２）１０７−１１２）〕。この
ためアンチスタシンのＸａ因子阻害活性はこのタンパク
質が腫瘍拡散を抑制することによるメカニズムであると
推測された。

【０００６】メキシコヒルヘメンテリア・アフィシナリ
ス（Ｈａｅｍｅｎｔｅｒｉａ　　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉ
ｓ）の唾液腺に存在するシスティンに富むタンパク質ア
ンチスタシンはヒト血液凝固カスケードにおいてＸａ因
子の強力な阻害剤であることが示された〔ツジンスキー
ら、１９８７年；ナット（Ｎｕｔｔ）ら、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６３巻、第
１０１６２−１０１６７頁、１９８８年；ダンウィッデ
ィ（Ｄｕｎｗｉｄｄｉｅ）ら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、第２６４巻、第１６６９４
−１６６９９頁、１９８９年〕。

【０００７】アンチスタシンのような大サイズ分子の治
療投与は困難である。一般に大分子の生体内吸収は小分
子の場合ほど効率的でない。血流中に存在すると、大分
子は望ましくない不活性化の化学的修飾をうけやすい。 したがってそれらは比較的短い半減期及び短い活性期間
を有すると予想される。患者血流中における大分子の治
療レベルは通常静脈内投与によって達成される。例えば
、ハレンバーグら、セミナーズ・イン・トロンボシス・
アンド・ヘモスタシス、第１５巻、第４号、１９８９年
、第４１４−４２３頁〔Ｈａｒｅｎｂｅｒｇ　　ｅｔ　
　ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ　　ｉｎ　　Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ　　ａｎｄ　　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｖｏｌ
．１５，Ｎｏ．４（１９８９）ｐｐ．４１４−４２３〕
では正常ヘパリン（分子量約１２，０００）と様々なよ
り低い分子量のヘパリン（分子量範囲２，３４０〜５，
０３０）とのバイオアベイラビリティを比較している。 小さなヘパリンは正常ヘパリンよりも皮下投与で有効で
ある。皮下投与は正常ヘパリンの投与に適した手段と考
えられる。 大分子アンチスタシンを投与する本出願人らの皮下手段
は血液凝固Ｘａ因子を阻害する上で意外にも有効な方法
であることが示された。

【０００８】本発明は血流中でアンチスタシンの長期間
治療有効レベルを持続する皮下ボーラス注射法に従いア
ンチスタシン医薬組成物を患者に投与することからなる
血液凝固Ｘａ因子の阻害方法である。本組成物及び注射
法によればＸａ因子血液凝固阻害を要する患者で有効か
つ都合よく治療することができる。

【０００９】本発明は血液凝固Ｘａ因子を阻害する上で
十分な適量の医薬アンチスタシン含有組成物を２４〜４
８時間に一回皮下ボーラス注射で患者に投与することか
らなる血液凝固阻害方法であって、その場合に組成物が
アンチスタシン／水溶液であり、注射されるアンチスタ
シンの量か約０．０５〜５．０ｍｇ／ｋｇ患者体重であ
る。その方法では長時間、例えば３０時間以内にわたり
約１０〜１００ｎＭの定常状態血漿濃度を保つ。この方
法によれば、凝塊形成時間は増加される。例えば、０．
２５ｍｇ／ｋｇにおける凝塊形成時間は無アンチスタシ
ン凝塊形成時間の１．５〜２倍である。

【００１０】下記方法に従い投与されるアンチスタシン
のアミノ酸配列は下記のとおりである：配列番号１参照

【００１１】本発明では前記配列を有する又は保存アミ
ノ酸置換をうけた配列番号１の配列を有するタンパク質
を血液凝固の阻害を必要とする患者に皮下ボーラス注射
によって２４〜４８時間毎に一回投与する。タンパク質
はタンパク質−水組成物のような適切な医薬組成物で投
与される。本組成物はいずれか適切なタンパク質・水濃
度、例えば１〜２０ｍｇ／ｍｌ及び例えばｐＨ７．４を
有する。患者体重ｋｇ当たりタンパク質約０．０５〜５
ｍｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇの量のボーラス注射で長
時間、例えば３０時間にわたり薬理学上有効な血漿アン
チスタシン濃度を保つ。薬理学上有効な濃度は約５〜１
００ｎＭ、好ましくは約４０〜８０ｎＭの範囲内である
。

【００１２】これらのタンパク質は多くのタンパク質と
同様にあらゆる無毒性の有機又は無機酸と薬学上許容さ
れる塩を形成することができる。適切な塩を形成する例
示無機酸としてはオルトリン酸一水素ナトリウム及び硫
酸水素カリウムのような塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリ
ン酸金属塩がある。適切な塩を形成する例示有機酸とし
てはモノ、ジ及びトリカルボン酸がある。このような酸
の例は、例えば酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸
、マロン酸、コハク酸、トリフルオロ酢酸、グルタル酸
、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビ
ン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、
ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチ
ル酸、２−フェノキシ安息香酸、メタンスルホン酸及び
２−ヒドロキシエタンスルホン酸のようなスルホン酸で
ある。カルボキシ末端アミノ酸部分の塩としてはあらゆ
る適切な無機又は有機塩基と形成された無毒性のカルボ
ン酸塩がある。例示として、これらの塩には例えばナト
リウム及びカリウムのようなアルカリ金属；カルシウム
及びマグネシウムのようなアルカリ土類金属；アルミニ
ウムを含めたＩＩＩＡ属の軽金属；例えばトリエチルア
ミンを含めたトリアルキルアミン、プロカイン、ジベン
ジルアミン、１−エテンアミン、Ｎ，Ｎ′−ジベンジル
エチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミン、Ｎ−低
級アルキルピペリジン及び他のいずれかの適切なアミン
のような有機一級、二級及び三級アミンの塩がある。

【００１３】抗凝血療法は様々な血栓症状、特に散在血
管内凝固に起因する冠状動脈、脳血管障害及び血栓塞栓
症の治療及び予防にとり望ましい。当業者であれば抗凝
血療法を要する情況について容易に気がつく。ここで用
いられる“患者”という用語はヒト、ヒツジ、ウマ、ウ
シ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット及びマウスを含めた霊長
類のような哺乳動物を意味する。

【００１４】タンパク質物質は界面活性剤及び他の薬学
上許容されるアジュバントの添加下又は非添加下におい
て水及び油のような無菌液体である製剤キャリアと共に
生理学上許容される希釈液中における物質の溶液又は懸
濁液の注射剤として投与される。これらの製剤で使用可
能な油の例は石油、動物、植物又は合成源の油、例えば
ピーナツ油、大豆油及び鉱油である。一般に塩水、水性
デキストロース及び関連糖溶液、エタノール並びにプロ
ピレングリコール又はポリエチレングリコールのような
グリコール類が特に注射溶液用に好ましい液体キャリア
である。

【００１５】データは、アンチスタシンの低用量皮下投
与が霊長類で血液凝固Ｘａ因子を阻害する驚くほど有効
な手段であることを示す。霊長類モデルにおける化合物
の分析ではヒトにおいてそれらの効果を強く示唆するこ
とが通常認められる。図３はヒト、アカゲザル、ウサギ
及びイヌ血漿に関するＡＰＴＴ凝固アッセイにおけるア
ンチスタシンの効力について示す。効力はヒトで最大で
あり、ウサギ又はイヌよりもアカゲザルの方が大きい。

【００１６】本タンパク質は単独でも又は他のタンパク
質と組合せてもよい。例えば、本タンパク質は組織プラ
スミノーゲンアクチベーター媒介血栓溶解再潅流の効力
を高める。本タンパク質は血栓形成後最初に投与され、
組織プラスミノーゲンアクチベーター又は他のプラスミ
ノーゲンアクチベーターがその後に投与される。

【００１７】前記操作に従い投与される抗凝血タンパク
質はハンら、ジーン、第７５巻、１９８９年、第４７−
５７頁〔Ｈａｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７５（
１９８９）４７−５７〕で記載されたようにアンチスタ
シンについてコードするｃＤＮＡをクローニングかつ発
現させるか又は一般にメリフィールド、ジャーナル・オ
ブアメリカン・ケミカル・ソサエティ、第８５巻、第２
１４９頁、１９６４年〔Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２１４９（１９６４）〕
、ホーテン、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス、第８２巻、第５１３２頁
、１９８５年〔ＨｏｕｇｈｔｅｎＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．８２、５１３２（１９８５）〕及び
リビアー（Ｒｉｖｉｅｒ）らの米国特許第４，２４４，
９４６号明細書で記載される当業界で周知の固相合成に
よりゲーシックら、キャンサー・リサーチ・第４３巻、
１９８３年、第１６３３−１６３６頁〔Ｇａｓｉｃ　　
ｅｔ　　ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４３（１９８
３）１６３３−１６３６〕及びゲーシックら、キャンサ
ー・リサーチ・第４４巻、１９８４年、第５６７０−５
６７６頁で記載される精製技術で製造することができる
。保存アミノ酸置換を有するこれらのタンパク質は本発
明の操作による投与に適している。

【００１８】アンチスタシンは２種のｃＤＮＡクローン
（ラムダ０−１３及びラムダ５Ｃ−４）から製造しても
よい（ハンら、ジーン、第７５巻、１９８９年、第４７
−５７頁参照）。導き出された配列は配列番号１及び６
で示されている。ｃＤＮＡのクローニング及び発現によ
るアンチスタシンの製造のために、すべての制限エンド
ヌクレアーゼ、ＤＮＡ修正酵素、逆転写酵素及びターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼはベー
リンガー・マンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎ
ｈｅｉｍ）、ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅ
ｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ）、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又はＰ
Ｌ−ファルマシア（ＰＬ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から、
ファージラムダパッケージング抽出物及びウサギ網状赤
血球溶離物はプロメガ・バイオテック（Ｐｒｏｍｅｇｅ
Ｂｉｏｔｅｃ）から、放射性同位元素はアマーシャム（
Ａｍｅｒｓｈａｍ）から、牛Ｘａ及びＶ因子はエンザイ
ム・リサーチ・ラブス（Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ　　Ｌａｂｓ）から、Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−
Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド
二塩酸（Ｓ２２３８）はヘレナ・ラブス（Ｈｅｌｅｎａ
　　Ｌａｂｓ）から、ナイロン膜（ジーンスクリーン・
プラス（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　　Ｐｌｕｓ＊　）〕は
ニューイングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　　Ｎｕｃｌｅａｒ）から入手した。

【００１９】唾液腺がＨ．オフィシナリスから摘出され
、液体窒素にいれ、使用時まで−７０℃で貯蔵された；
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは腺から抽出された（ハンら、バイ
オケミストリー、第２６巻、１９８７年、第１６１７−
１６２５頁）。ＤＮＡは〔マニアティスら、分子クロー
ニング：実験マニュアル、コールド・スプリング、ハー
バー、ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー
、ニューヨーク、１９８２年（Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅ
ｔ　　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏ
ｒ，ＮＹ（１９８２））で〕記載されるようにして成人
生殖腺又は全幼若動物から得た。ＲＮＡ及びＤＮＡのノ
ザン及びサザンブロット分析は標準的操作（マニアティ
スら、１９８２年）に従い行った。

【００２０】ラムダｇｔ２２ｃＤＮＡ発現ライブラリー
はハン及びラッター（Ｒｕｔｔｅｒ）〔ジェネティック
・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ）、第１０巻、プレナム・プレス（Ｐｌｅｎ
ｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８年〕に
従いヒル唾液腺ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから作製した。要約
すると、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはＮｏｔＩ部位、ＳＰ６プ
ロモーター及びｄＴのストレッチを含むプライマー−ア
ダプターを用いて第一鎖ｃＤＮＡに変換された：配列番
号２参照。得られた第一鎖ｃＤＮＡはｄＧ（約１５ｎｔ
）で尾部形成され、ＳａｌＩ部位、Ｔ７プロモーター及
びｄＣのストレッチを含む第二鎖プライマー−アダプタ
ーを用いてｄｓ　　ｃＤＮＡに変換された：配列番号３
参照。 ｄｓ　　ｃＤＮＡはＮｏｔＩ及びＳａｌＩで開裂され、
ラムダｇｔ２２の対応部位に組込んでクローニングされ
た。ライブラリーをスクリーニングするため、２種のオ
リゴが成熟タンパク質のａａ残基７０〜１０７に存在す
ることが現在知られているアンチスタシンの予備アミノ
酸配列に基づき合成された（ナットら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６３巻、１９
８８年、第１０１６２−１０１６７頁）。配列番号４及
び５参照。これら２種のオリゴは各３′末端において１
８ｂｐの相補的重複を有しており、それによりそれらは
４つの〔α−３２Ｐ〕ｄＮＴＰの存在下でアニーリング
され、ＰｏｌＩｋで修復された。これにより鎖長１１４
ｂｐ及び２５６倍縮重である比活性５×１０９　ｃｐｍ
／μｇのｄｓプローブを得た。ＤＮＡフィルターは２０
％ホルムアミド、６×ＳＳＣ（１×＝１５０ｍＭ　　Ｎ
ａｃｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中
４２℃でハイブリッド形成され、０．２×ＳＳＣ／０．
１％ＳＤＳ中４２℃で３０分間洗浄された。ライブラリ
ーはアンチスタシンに対するウサギ抗体（ツジンスキー
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
、第２６２巻、１９８７年、第９７１８−９７２３頁）
でもスクリーニングされた〔ヤング及びデービス、サイ
エンス、第２２２巻、１９８３年、第７７８−７８２頁
〔Ｙｏｕｎｇ　　ａｎｄ　　Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２２２（１９８３）７７８−７８２）〕。

【００２１】センス及びアンチセンスｍＲＮＡの双方が
オリゴ又は抗体プローブを用いて陽性であった単離ファ
ージＤＮＡから直接合成された。インビトロ転写が行わ
れ〔メルトンら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、
１９８４年、第７０３５−７０５７頁〔Ｍｅｌｔｏｎ　
　ｅｔ　　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ　　
Ｒｅｓ．（１９８４）７０３５−７０５７）〕、キャッ
プされた転写体がウサギ網状赤血球溶離物を用いて〔３
５Ｓ〕Ｍｅｔ存在下インビトロで翻訳された〔ペルハム
及びジャクソン、ヨーロピアン、ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー、第６７巻、１９７６年、第２４７−
２６６頁（Ｐｅｌｈａｍ　　ａｎｄ　　Ｊａｃｋｓｏｎ
，Ｅｕｒ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７（１９７６）２
４７−２６６）〕。標識されたタンパク質は免疫沈降さ
れ、０．１％ＳＤＳ−１５％ＰＡＧＥで分離された。

【００２２】ｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列は
ラムダＤＮＡ上で直接又はｐＵＣ１８に組込みサブクロ
ーニング後に決定された〔チェン（Ｃｈｅｎ）及びシー
バーグ（Ｓｅｅｂｕｒｇ）、ＤＮＡ、第４巻、１９８５
年、第１６５−１７６頁〕。

【００２３】アンチスタシンｃＤＮＡは２組の合成オリ
ゴを用いて発現プラスミドに組込み再構築された。要約
すれば、ラムダ０−１３からｃＤＮＡインサートがＡｖ
ａＩＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで切断され、しかる後ＢｇｌＩ
Ｉ末端を形成するオリゴに結合された。次いでこの再構
築ｃＤＮＡはバキュロウイルス発現ベクターｐＡｃ３７
３〔スミスら、モレキュラー・セル・バイオロ、第３巻
、１９８３年、第２１５６−２１６５頁（Ｓｍｉｔｈ　
　ｅｔ　　ａｌ．，Ｍｏｌ　　Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３
（１９８３）２１５６−２１６５）〕のＢａｍＨＩ部位
に挿入されたが、その場合において発現はウイルスポリ
ヘドリンプロモーターで行われる。組換えバキュロウイ
ルスはリン酸カルシウム法によりＳｆ９細胞中へのＡｃ
ＮＰＶ　　ＤＮＡと共に得られたプラスミド（ｐＢＤ８
８−００４−０５）の同時トランスフェクト後に単離さ
れた〔サマーズ及びスミス、バキュロウイルスベクター
及び昆虫細胞培養操作法のマニュアル、テキサス・アグ
リカルチュラル・エクスペリメント・セクション・ブレ
チン、第１５５５号、１９８７年（Ｓｕｍｍｅｒｓ　　
ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ａ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｂａｃａｌｏｖｉｒｕｓ　
　Ｖｅｃｔｏｒｓ　　ａｎｄ　　Ｉｎｓｅｃｔ　　Ｃｅ
ｌｌ　　Ｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔ
ｅｘａｓ　　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔ　　Ｓｅｃｔｉｏｎ　　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｎｏ
．１５５５（１９８７））〕。

【００２４】無細胞培地中のアンチスタシンがヘパリン
−セファロース上に吸着され、０．５５Ｍ　　ＮａＣｌ
で溶出された（ツジンスキーら、１９８７年）。溶出液
中のタンパク質は〔トービン（Ｔｏｗｂｉｎ）ら、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンスＵＳＡ、第７６巻、１９７９年、第４３５０
−４３５４頁で）記載されるようにセントリコン−１０
（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（商標））膜を用いて濃縮
され、０．１％ＳＤＳ−１１．５％ＰＡＧＥで分離され
、ナイロン膜上に電気ブロットされ、１：２５０希釈の
モルモット抗アンチスタシンと共にインキュベートされ
た。

【００２５】ラムダｇｔ２２ｃＤＮＡ発現ライブラリー
構築において、各ｃＤＮＡはＳＰ６及びＴ７ポリメラー
ゼプロモーターで隣接形成され、しかる後一方向でｌａ
ｃＺ遺伝子の３′末端に挿入された。このライブラリー
はＶ８プロテアーゼ開裂で形成されたアンチスタシンペ
プチドから選択されたアミノ酸配列に基づきデザインさ
れた数種の縮重オリゴプローブを用いてスクリーニング
された（ナットら、１９８８年）。各プローブにおける
配列縮重はＧ／Ｔミスマッチを行いかつショウジョウバ
エに関して公表されたコドン用法を利用して減少させた
（マルヤマら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第
１４巻、１９８６年、第１５１−１９７頁）。ノザンブ
ロット分析がこれらプローブのハイブリッド形成特異性
を試験しかつアンチスタシンｍＲＮＡのサイズを仮決定
するために行われた。唾液腺ＲＮＡとのハイブリッド形
成で、鎖長１１４ｂｐ及び２５６倍縮重である１つのプ
ローブは約７５０ｎｔの一本鎖ＲＮＡ種を検出した。同
サイズのＲＮＡバンドは後の実験で配列決定されたｃＤ
ＮＡプローブを用いて検出された。

【００２６】ラムダｇｔ２２ライブラリーから約２×１
０６　プラークのうち４０の陽性クローンが１１４ｂｐ
オリゴプローブを用いて確認された。アンチスタシンに
対するウサギ抗体で同数の組換えプラークをスクリーニ
ングすることにより、更に１０の陽性クローンが確認さ
れ、そのうち３つはオリゴプローブとハイブリッド形成
した。一部の候補アンチスタシンクローンは免疫反応性
タンパク質についてコードしうるそれらの能力に関しイ
ンビトロで試験された。Ｔ７　　ＲＮＡポリメラーゼに
よる２種の精製組換えファージＤＮＡ（ラムダ０−１３
及びラムダ５Ｃ−４）の転写、しかる後ウサギ網状赤血
球溶離物中における翻訳により、これらの抗体で特異的
に沈降する１７ｋＤａタンパク質を得た。ポリ（Ａ）＋
ＲＮＡを用いてインビトロ翻訳反応物に合成アンチセン
スＲＮＡ（ＳＰ７ポリメラーゼで同ファージＤＮＡの転
写により産生された）を加え、検出可能なアンチスタシ
ンを除去した。

【００２７】インビトロで免疫反応性タンパク質を産生
した２種のｃＤＮＡインサート（ラムダ０−１３及びラ
ムダ５Ｃ−４）のヌクレオチド配列はハンら、第５２頁
で示されている。ｃＤＮＡクローンラムダ５Ｃ−４から
導き出されたアンチスタシンｍＲＮＡ４１１ｎｔの非遮
断ＯＲＦを含んでいる。このＯＲＦは５９ｎｔのＡＴに
富む（９５％）５′非翻訳配列しかる後Ｇ又はＣ残基で
場合により遮断されたＴＡ反復からなる１９５ｎｔの３
′非翻訳領域で先行されている。ポリアデニル化に関す
るヘキサヌクレオチドＡＡＴＡＡＡコンセンサスシグナ
ルはポリ（Ａ）＋トラクトの１４ｎｔ前でみられる。 このため、このｃＤＮＡは約１００ｎｔとしてポリ（Ａ
）＋トラクトの鎖長を仮定した場合にサイズがノザンブ
ロット分析で７５０ｎｔサイズと一致するｍＲＮＡ配列
についてコードしている。

【００２８】ＯＲＦの翻訳で、最近解明された成熟タン
パク質の配列と非常によくマッチする１３７ａａ配列を
得た（ナットら、１９８８年）。成熟アンチスタシンの
Ｎ末端Ｇｌｎ残基は２連続Ｍｅｔ残基で始まる１８ａａ
プレペプチドにより先行されている。これらの１８ａａ
残基はシグナルペプチドで代表される２つの荷電残基で
隣接された１３ａａの疎水コアを含んでいる（ハンら、
第５２頁）。

【００２９】アンチスタシンのアミノ酸配列決定では２
残基で変異体の存在を示した：ａａ５（Ａｒｇ／Ｇｌｙ
）及びａａ３５（Ｍｅｔ／Ｖａｌ）（ナットら、１９８
８年）。独立ｃＤＮＡクローンの直接ヌクレオチド配列
分析ではａａ３５における変異を確認し、残基３０（Ｇ
ｌｙ／Ｇｌｕ）及び５４（Ａｒｇ／Ｉｌｅ）で更に変異
を示した。

【００３０】ヒルゲノムにおけるアンチスタシン座の複
雑性がサザンブロット分析で研究された。ヒルゲノムＤ
ＮＡは制限エンドヌクレアーゼで切断され、ラムダ０−
１３からのｃＤＮＡインサートとのハイブリッド形成に
より分析された。５種の制限エンドヌクレアーゼは個々
に又は４種の基本カッターと組合せでほとんどのケース
において単一バンドパターンを示した。この結果はヒル
ゲノムがアンチスタシン遺伝子の単一コピーを含むこと
を示唆している。

【００３１】完全アンチスタシンｃＤＮＡ配列は５′及
び３′末端で修正され、遺伝子カセットはｐＢＤ８８−
００４−５を得るためバキュロウイルス発現ベクターｐ
Ａｃ３７３に挿入された。このベクターはポリヘドリン
プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びＡｃＮＰＶ
との相同的組換え用に十分隣接したウイルス配列を含ん
でいる。このプラスミド及びウイルスＤＮＡは組換えウ
イルスの産生及び精製のため昆虫細胞系Ｓｆ９に同時ト
ランスフェクトされた。アンチスタシン活性はＸａ因子
によるプロトロンビンからトロンビンへの変換の阻害率
を調べることで測定された。抗Ｘａ因子活性はトランス
フェクト後５日目に培養上澄で検出された。１：４希釈
の増殖培地は擬トランスフェクト培養から採取された培
地と比較してＸａ因子活性の阻害を示した。この阻害は
１：５０希釈のモルモット抗アンチスタシン血清とのサ
ンプルのプレインキュベートで消失された。活性に基づ
き培地中における一過性発現アンチスタシンのレベルは
４０ｎｇ／ｍｌであった。免疫ブロット分析は３種の異
なる組換えバキュロウイルスでトランスフェクトされた
昆虫細胞から産生されたアンチスタシンに関して行われ
た。１５ｋＤａタンパク質がアンチスタシン特異抗体で
検出された。このタンパク質は電気泳動移動性に関して
天然タンパク質と区別できるが、但しＲＮＡのインビト
ロ翻訳から誘導され１７ａａプレペプチドのプロセッシ
ングと一致するタンパク質よりもやや速く移動した。

【００３２】図４は昆虫細胞におけるアンチスタシンｃ
ＤＮＡを発現する発現プラスミドの概略図である。上方
向矢印はシグナルペプチターゼで認識される推定開裂部
位を示す。完全アンチスタシンＯＲＦの５′及び３′末
端を再構築するために用いられた２つの制限部位（Ａｖ
ａＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）が示されている。５′及び
３′オリゴにおけるヌクレオチド配列の部分も示されて
いる。下部のケースにおけるヌクレオチド配列はＢａｍ
ＨＩクローニング部位のベクター配列を表す。

【表１】

【００３３】実施例１ 直接アミノ酸組成分析で二重に定量された水中１４．５
ｍｇ／ｍｌアンチスタシンストック溶液がこの研究で用
いられた物質源であった。アンチスタシンを上部背中の
肩甲骨間の大体中間の位置で２匹の覚醒アカゲザルに皮
下投与した。１ｍｇ／ｋｇの用量はサル＃８９−０４１
の場合ストック溶液０．１７５ｍｌ（２．５４ｍｇ）及
びサル＃８９−０４３の場合０．１９５ｍｌ（２．８３
ｍｇ）の注射で行った。血液サンプルはアンチスタシン
の投与前とアンチスタシン投与後０．５、１２、４６、
８、１２、２４及び３０時間目に３．８％クエン酸ナト
リウム（クエン酸ナトリウム最終濃度０．３８％）で集
めた。血漿を遠心分離で得て、分析前−７０℃で貯蔵し
た。生体外凝固時間は活性化部分トロンボプラスチン時
間及びプロトロンビン時間凝固アッセイの双方を用いて
調べた。

【００３４】活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰ
ＴＴ） 血液サンプルをクエン酸ナトリウム（最終濃度０．３８
％）で集め、血漿を１０〜１５分間の遠心分離で得た。 凝固時間はＭＬＡエレクトラ（Ｅｌｅｃｔｒａ）７００
装置で各サンプルに関して二重に測定した。要約すると
、血漿１００μｌを装置内のキュベットに直接加え、３
７℃で５分間インキュベートした。インキュベート後、
アクチン活性化セファロプラスチン試薬１００μｌしか
る後０．０２Ｍ　　ＣａＣｌ２　溶液１００μｌを加え
、凝固時間を秒単位で測定した。

【００３５】プロトロンビン時間（ＰＴ）血漿サンプル
を前記のように得た。血漿１００μｌをＭＬＡ７００内
のキュベットに直接加え、３７℃で３分間インキュベー
トした。インキュベート後トロンボプラスチンＣ試薬（
カルシウム含有ウサギ脳トロンボプラスチン）２００μ
ｌを加え、凝固時間を秒単位で測定した。 図１及び図２で示された生体外凝固時間データは、高ア
ンチスタシンレベルが長時間維持されることを示してい
る。図１及び２はＡＰＴＴ及びＰＴ凝固時間のピーク延
長がボーラス時の後約２〜４時間生じることを示す。ボ
ーラス時の後３０時間目におけるＡＰＴＴ凝固時間の増
加は１．８６倍である。ボーラス時の後３０時間目にお
けるＰＴ凝固時間の増加は１．６９倍である。高アンチ
スタシンレベルはサル＃８９−０４１及び＃８９−０４
３に関するＡＰＴＴの各々２．２３倍及び１．８１倍延
長で示されるようにボーラス時の後３０分間目で非常に
明確である。最大アンチスタシンレベルはボーラス時の
後２〜４時間で達し、ＡＰＴＴ及びＰＴ凝固時間の各々
５．７倍及び３．８倍のピーク延長と関連している。こ
れらの凝固時間増加は１００〜１２０ｎＭのピーク血漿
アンチスタシン濃度に対応している。３０時間後血漿ア
ンチスタシン濃度は２５〜３０ｎＭである。生体外組換
えアンチスタシン濃度はコントロールアカゲザル血漿で
測定された組換えアンチスタシン濃度対ＡＰＴＴ時間の
標準曲線から決定された。

【００３６】これらのデータは、臨床設定で標準ヘパリ
ンの効力（コントロールより１．５〜２倍増加）に必要
と思われるよりも十分多い凝固時間増加を得るためアン
チスタシンが１ｍｇ／ｋｇの比較的少ない用量で皮下ボ
ーラス注射投与から十分吸収されることを示している。 更に、血漿中で得られるアンチスタシンのレベルは３０
時間の全時間経過にわたりよく維持されている。

【配列表】配列番号：１

【化１】 配列番号：２

【化２】 配列番号：３

【化３】 配列番号：４

【化４】 配列番号：５

【化５】 配列番号：６

【化６】

【図面の簡単な説明】

【図１】生体外活性化部分トロンボプラスチン凝固時間

【図２】生体外プロトロンビン凝固時間

【図３】ヒト、
アカゲザル、ウサギ及びイヌ血漿に関するインビトロ活
性化部分トロンボプラスチン凝固時間

【図４】昆虫細胞
でアンチスタシンｃＤＮＡを発現する発現プラスミドの
概略図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　霊長類において血液凝固を阻害するた
   めの方法であって、Ｘａ因子を阻害する上で十分な適量
   の医薬アンチスタシン含有組成物を２４〜４８時間毎に
   一回皮下ボーラス注射で霊長類に投与し、その場合に組
   成物がアンチスタシン／水溶液であり、注射されるアン
   チスタシンの量が約０．０５〜５．０ｍｇ／ｋｇ患者体
   重であることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】　　約１〜１００ｎＭの定常状態血漿アン
   チスタシン濃度が３０時間にわたり達成される、請求項
   １記載の方法。
3. 【請求項３】　　濃度が約４０〜８０ｎＭである、請求
   項２記載の方法。
4. 【請求項４】　　血液凝固の阻害を必要とする霊長類へ
   のボーラス注射による投与に適し、水中に薬理学上許容
   される濃度のアンチスタシンを含有することを特徴とす
   る医薬組成物。