JPH0430793A - ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株 - Google Patents
ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株Info
- Publication number
- JPH0430793A JPH0430793A JP13649690A JP13649690A JPH0430793A JP H0430793 A JPH0430793 A JP H0430793A JP 13649690 A JP13649690 A JP 13649690A JP 13649690 A JP13649690 A JP 13649690A JP H0430793 A JPH0430793 A JP H0430793A
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- JP
- Japan
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- adrenodoxin
- yeast
- bovine adrenal
- plasmid
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ｇｔｉ上Ω上月ｊ１
本発明は、ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子および該酵
素を大量生産するための発現プラスミド、該プラスミド
を保持する酵母菌株、および該酵母を用いることによる
該酵素の生産方法に関する。
素を大量生産するための発現プラスミド、該プラスミド
を保持する酵母菌株、および該酵母を用いることによる
該酵素の生産方法に関する。
本発明により得られる酵母菌株は、ウシ副腎アドレノド
キシンを大量生産しているので、該酵母菌株により生産
した該酵素と、チトクロムＰ４５０およびＮＡＤＰＨア
ドレノドキシン還元酵素とを用い、医薬品として有用な
ステロイド類を合成することができる。
キシンを大量生産しているので、該酵母菌株により生産
した該酵素と、チトクロムＰ４５０およびＮＡＤＰＨア
ドレノドキシン還元酵素とを用い、医薬品として有用な
ステロイド類を合成することができる。
従来技術および九題点
Ｐ２Ｓ５は微生物から哺乳動物にいたるまで広く生物界
に存在するヘムタンパク質であり、広範囲の脂溶性化合
物を基質として、ｌ原子酸素添加反応を触媒する。Ｐ２
Ｓ５の示すこうした広範囲な基質特異性はＰ２Ｓ５の分
子多様性に起因する。Ｐ２Ｓ５には多数の分子種が存在
しているが、各々のＰ２Ｓ５に電子を供給する経路は共
通であり、ミクロソームでは主として、フラビンアデニ
ンジヌクレオチドとフラビンモノヌクレオチドを分子内
に補酵素として含有するＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５
０還元酵素（還元酵素）がＮＡＤＰＨからの電子を、基
質を結合したＰ２Ｓ５へ供給する。一方、ミトコンドリ
アではフラビンアデニンジヌクレオチド、非ヘム鉄をそ
れぞれ補酵素として分子内に含有するＮＡロ円トフェレ
ドキシン還元酵素、フェレドキシンが、ＮＡＤＰＩ（か
らの電子を、基質を結合したＰ２Ｓ５へ供給する。
に存在するヘムタンパク質であり、広範囲の脂溶性化合
物を基質として、ｌ原子酸素添加反応を触媒する。Ｐ２
Ｓ５の示すこうした広範囲な基質特異性はＰ２Ｓ５の分
子多様性に起因する。Ｐ２Ｓ５には多数の分子種が存在
しているが、各々のＰ２Ｓ５に電子を供給する経路は共
通であり、ミクロソームでは主として、フラビンアデニ
ンジヌクレオチドとフラビンモノヌクレオチドを分子内
に補酵素として含有するＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５
０還元酵素（還元酵素）がＮＡＤＰＨからの電子を、基
質を結合したＰ２Ｓ５へ供給する。一方、ミトコンドリ
アではフラビンアデニンジヌクレオチド、非ヘム鉄をそ
れぞれ補酵素として分子内に含有するＮＡロ円トフェレ
ドキシン還元酵素、フェレドキシンが、ＮＡＤＰＩ（か
らの電子を、基質を結合したＰ２Ｓ５へ供給する。
本発明者らはすでに、酵素活性を有する数種のミクロソ
ーム型Ｐ４５０および還元酵素を酵母内で生産させるこ
とに成功した。すなわち、ラット肝Ｐ４５０遺伝子、ウ
シ副腎Ｐ４５０゜α遺伝子やＰ４５０ｃ ２ 、遺伝子
をそれぞれ単離しく特開昭６１−５６０７２ 、特願昭
６２−２０４１旧、特願昭６３−１８１５７１） 、こ
れらの遺伝子を含む発現プラスミドを作製し、これら発
現プラスミドで酵母を形質転換することにより、該酵素
を産生ずる酵母菌株を得た。これらの酵母菌株はＰ４５
０依存性のｌ原子酸素添加活性を示した。
ーム型Ｐ４５０および還元酵素を酵母内で生産させるこ
とに成功した。すなわち、ラット肝Ｐ４５０遺伝子、ウ
シ副腎Ｐ４５０゜α遺伝子やＰ４５０ｃ ２ 、遺伝子
をそれぞれ単離しく特開昭６１−５６０７２ 、特願昭
６２−２０４１旧、特願昭６３−１８１５７１） 、こ
れらの遺伝子を含む発現プラスミドを作製し、これら発
現プラスミドで酵母を形質転換することにより、該酵素
を産生ずる酵母菌株を得た。これらの酵母菌株はＰ４５
０依存性のｌ原子酸素添加活性を示した。
また、ラット肝還元酵素遺伝子や酵母還元酵素遺伝子を
単離し、Ｐ４５０還元能を有する該酵素の酵母的発現に
成功した（特開昭６２−１９０８５ 、特願昭６３２０
２７８５）。さらに、発明者らは、Ｐ２Ｓ５と還元酵素
の両酵素を生産する酵母菌株（特開昭６２−１０４５８
２）や両酵素の機能を１分子内に併せ持つ新規モノオキ
シゲナーゼの作出に成功した（特開昭６３４４８８８
、特願昭６３−１７３７６１、特願昭１−７１２５０）
。
単離し、Ｐ４５０還元能を有する該酵素の酵母的発現に
成功した（特開昭６２−１９０８５ 、特願昭６３２０
２７８５）。さらに、発明者らは、Ｐ２Ｓ５と還元酵素
の両酵素を生産する酵母菌株（特開昭６２−１０４５８
２）や両酵素の機能を１分子内に併せ持つ新規モノオキ
シゲナーゼの作出に成功した（特開昭６３４４８８８
、特願昭６３−１７３７６１、特願昭１−７１２５０）
。
以上のような技術により、本発明者らは医薬品として有
用な数種のステロイド類の合成を可能にしたが、コレス
テロールを出発物質としてこれらステロイドホルモンの
合成を行う場合には、ミトコンドリア型Ｐ４５０依存性
の１原子酸素添加活性を発揮する酵母菌株の創製が必要
である。
用な数種のステロイド類の合成を可能にしたが、コレス
テロールを出発物質としてこれらステロイドホルモンの
合成を行う場合には、ミトコンドリア型Ｐ４５０依存性
の１原子酸素添加活性を発揮する酵母菌株の創製が必要
である。
１皿五天皇王童
アドレノドキシンは、副腎ミトコンドリア型電子伝達系
の主要酵素の１つで、補酵素として非ヘム鉄を分子内に
含有する水溶性酵素である。アドレノドキシンはＮＡＤ
ＰＨ−アドレノドキシン還元酵素を介して受は取ったＮ
ＡＤＰＨからの電子を副腎ミトコンドリア電子伝達系の
末端酵素であるチトクロムＰ４５０に伝達する。副腎ミ
トコンドリア型Ｐ４５０は数種類存在するにもかかわら
ず、アドレノドキシンはいずれのチトクロムＰ４５０分
子種に対してもＮＡＤ円１−アドレノドキシン還元酵素
からの電子を供給することができる。
の主要酵素の１つで、補酵素として非ヘム鉄を分子内に
含有する水溶性酵素である。アドレノドキシンはＮＡＤ
ＰＨ−アドレノドキシン還元酵素を介して受は取ったＮ
ＡＤＰＨからの電子を副腎ミトコンドリア電子伝達系の
末端酵素であるチトクロムＰ４５０に伝達する。副腎ミ
トコンドリア型Ｐ４５０は数種類存在するにもかかわら
ず、アドレノドキシンはいずれのチトクロムＰ４５０分
子種に対してもＮＡＤ円１−アドレノドキシン還元酵素
からの電子を供給することができる。
アドレノドキシンは、１８６アミノ酸からなる前駆体（
分子量約１９ｋＤａ）として細胞質で合成されたのち、
そのアミノ末端部分に存在する移行シグナルが認識され
、ミトコンドリアへ取り込まれ、１２Ｂアミノ酸からな
る成熟型（分子量約１４ｋＤａ）になる。ウシ副腎アド
レノドキシン前駆体をコードするｃＤＮＡの全構造はす
でにＯｋａｍｕｒａらによって報告されている（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ８２．５
７０５（１９８５））。
分子量約１９ｋＤａ）として細胞質で合成されたのち、
そのアミノ末端部分に存在する移行シグナルが認識され
、ミトコンドリアへ取り込まれ、１２Ｂアミノ酸からな
る成熟型（分子量約１４ｋＤａ）になる。ウシ副腎アド
レノドキシン前駆体をコードするｃＤＮＡの全構造はす
でにＯｋａｍｕｒａらによって報告されている（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ８２．５
７０５（１９８５））。
本発明者らは、まず、ウシ副腎アドレノドキシン前駆体
を酵母内で発現させるプラスミドを構築した。このプラ
スミドにより形質転換した酵母のアドレノドキシン産生
量は低く、活性も検出されなかった。そこで本発明者ら
は、酵素活性を有するアドレノドキシンを酵母内で多量
に産生させるために、アミノ末端にＭｅｔを付加した成
熟型アドレノドキシン発現プラスミドおよびミトコンド
リア移行シグナル部分を酵母チトクロムＣ酸化酵素サブ
ユニット■のものに置き換えた、改変アドレノドキシン
発現プラスミドを構築した。これらのプラスミドにより
形質転換した酵母のアドレノドキシン産生量は上昇し、
産生されたアドレノドキシンは活性型であった。すなわ
ち、これらのアドレノドキシンはウシ副腎ＮＡＤＰＨ−
アドレノドキシン還元酵素精製標品との再構成系におい
てチトクロムＣに電子を伝達できた。また、酵母から部
分精製したアドレノドキシンは、ウシ副腎ＮＡＤＰ）Ｉ
−アドレノドキシン還元酵素精製標品およびウシ副腎Ｐ
４５０、ＣＣ精製標品とともに、コレステロールからプ
レグネノロンを生成することができた。今後、ミトコン
ドリア型Ｐ４５０およびＮＡＤＰＨ−アドレノドキシン
還元酵素との同時発現により、ステロイド化合物酸化反
応用バイオリアクターとしての利用が期待できる。
を酵母内で発現させるプラスミドを構築した。このプラ
スミドにより形質転換した酵母のアドレノドキシン産生
量は低く、活性も検出されなかった。そこで本発明者ら
は、酵素活性を有するアドレノドキシンを酵母内で多量
に産生させるために、アミノ末端にＭｅｔを付加した成
熟型アドレノドキシン発現プラスミドおよびミトコンド
リア移行シグナル部分を酵母チトクロムＣ酸化酵素サブ
ユニット■のものに置き換えた、改変アドレノドキシン
発現プラスミドを構築した。これらのプラスミドにより
形質転換した酵母のアドレノドキシン産生量は上昇し、
産生されたアドレノドキシンは活性型であった。すなわ
ち、これらのアドレノドキシンはウシ副腎ＮＡＤＰＨ−
アドレノドキシン還元酵素精製標品との再構成系におい
てチトクロムＣに電子を伝達できた。また、酵母から部
分精製したアドレノドキシンは、ウシ副腎ＮＡＤＰ）Ｉ
−アドレノドキシン還元酵素精製標品およびウシ副腎Ｐ
４５０、ＣＣ精製標品とともに、コレステロールからプ
レグネノロンを生成することができた。今後、ミトコン
ドリア型Ｐ４５０およびＮＡＤＰＨ−アドレノドキシン
還元酵素との同時発現により、ステロイド化合物酸化反
応用バイオリアクターとしての利用が期待できる。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明に用いるウシ副腎アドレノドキシンをコードする
ｃＤＮＡは前述のように既に公知であり、通常の操作法
でこれを単離することができる。
ｃＤＮＡは前述のように既に公知であり、通常の操作法
でこれを単離することができる。
本発明のアドレノドキシンを発現する発現プラスミドは
ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子を適当な発現プラスミ
ドに常法により挿入し構築することができる。発現プラ
スミドとしては、公知の発現ベクターを用いることがで
きる。例えば、酵母アルコール脱水素酵素（ＡＤＨＩ
）遺伝子のプロモーターおよび同ターミネータ−を保持
する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１．ｐａｒｔｃ、ｐ１
９２−２旧）が挙げられるが、ＰＧＫ プロモータ、
Ｇ３ＰＤＨプロモーター、 ＧＡＬＩＯプロモーター
を有する発現ベクターなど、宿主内で効率よく機能する
ものであればよく、特に、限定されるものではない。ま
た、発現プラスミドの構造も限定されるものでなく、酵
母内で安定に保持されるものであればよい。宿主として
酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエＡｌ２２株、
サッカロミセス・セレビシエ５ＨＹａ株やサッカロミセ
ス・セレビシエＮＡ３７−ＩＩＡ株などが、好都合に使
用することができる。
ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子を適当な発現プラスミ
ドに常法により挿入し構築することができる。発現プラ
スミドとしては、公知の発現ベクターを用いることがで
きる。例えば、酵母アルコール脱水素酵素（ＡＤＨＩ
）遺伝子のプロモーターおよび同ターミネータ−を保持
する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１．ｐａｒｔｃ、ｐ１
９２−２旧）が挙げられるが、ＰＧＫ プロモータ、
Ｇ３ＰＤＨプロモーター、 ＧＡＬＩＯプロモーター
を有する発現ベクターなど、宿主内で効率よく機能する
ものであればよく、特に、限定されるものではない。ま
た、発現プラスミドの構造も限定されるものでなく、酵
母内で安定に保持されるものであればよい。宿主として
酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエＡｌ２２株、
サッカロミセス・セレビシエ５ＨＹａ株やサッカロミセ
ス・セレビシエＮＡ３７−ＩＩＡ株などが、好都合に使
用することができる。
ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子を含む発現プラスミド
による宿主酵母の形質転換は、アルカリ金属（ＬｉＣｌ
）を用いる方法、プロトプラスト法など公知の方法で行
うことができる。このようにして得られた形質転換酵母
菌体を培養することによりアドレノドキシンを製造する
ことができる。本発明により得られる形質転換酵母の培
養は通常の培養方法により行うことができる。
による宿主酵母の形質転換は、アルカリ金属（ＬｉＣｌ
）を用いる方法、プロトプラスト法など公知の方法で行
うことができる。このようにして得られた形質転換酵母
菌体を培養することによりアドレノドキシンを製造する
ことができる。本発明により得られる形質転換酵母の培
養は通常の培養方法により行うことができる。
以下、実施例に基づき、本発明の詳細な説明する。本発
明は実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技
術分野における通常の変更をすることができる。
明は実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技
術分野における通常の変更をすることができる。
実施 ｌ ウシ副腎アドレノドキシン ｃＤＮＡの取得
ウシ副腎からグアニジンチオシアネート法によりＲＮＡ
画分を抽出し、さらにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム
にかけ、ポリ（Ａ）ＲＮＡを得た。
画分を抽出し、さらにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム
にかけ、ポリ（Ａ）ＲＮＡを得た。
さらにこのポリ（Ａ）ＲＮＡ画分を６５℃で５分間熱処
理した後、Ｉ Ｏ−３０％のショ糖密度勾配で超遠心分
離（２７０，０００ｘ ｇ 、 １時間）分画した。
理した後、Ｉ Ｏ−３０％のショ糖密度勾配で超遠心分
離（２７０，０００ｘ ｇ 、 １時間）分画した。
マーカーの１８Ｓ ｒＲＮＡよりもややサイズの大きい
画分を回収し、アマ−ジャム社製のｃＤＮＡ合成システ
ムを用いてｃＤＮＡを合成した。さらに、λｇｔｌｌを
ベクターとしたｃＤＮＡクローニングシステムを用いて
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。前述の、既報のウシ
副腎アドレノドキシンのｃＤＮＡの構造を基にして以下
の３種類、３０ｍｅｒのＤＮＡプローブを合成した。
画分を回収し、アマ−ジャム社製のｃＤＮＡ合成システ
ムを用いてｃＤＮＡを合成した。さらに、λｇｔｌｌを
ベクターとしたｃＤＮＡクローニングシステムを用いて
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。前述の、既報のウシ
副腎アドレノドキシンのｃＤＮＡの構造を基にして以下
の３種類、３０ｍｅｒのＤＮＡプローブを合成した。
■”ＴＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＡ
ＧＣＧＧＡＧＧ’■５ ＡＣＣＧＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡ
ＣＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＣＴ’■５ ＧＡＣＴＣ
ＧＣＡＴＡＧＣＣＣＣＧＣＴＣＧＣＧＴＣＴＣＧＴＣＧ
’これらをカイネーション法により（”Ｐ）ラベルし、
これをプローブとして前述のｃＤＮＡライブラリーの約
ｓｏ、 ｏｏｏプラークについてプラークハイブリダイ
ゼーションを行った。ハイブリダイゼーションおよび洗
浄は５０℃で行った。得られたポジティブクローンから
ファージＤＮＡを調製し、制限酵素により切断して解析
した。ついで、ダイデオキシ法によりｃＤＮＡの塩基配
列を決定した結果、このプラスミドがウシ副腎アドレノ
ドキシンのｃＤＮＡを含むことを確認した。得られたプ
ラスミドをｐＵＡＤＸと名付けた。 ｐＵＡＤＸハ約１
６０ｂｐ（７） ５°非翻訳領域、約５６０ｂｐのウシ
副腎アドレノドキシンコーディング領域、約２Ｋｂの３
°非翻訳領域を含むプラスミドであった。
ＧＣＧＧＡＧＧ’■５ ＡＣＣＧＣＣＧＡＡＧＡＧＣＡ
ＣＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＣＴ’■５ ＧＡＣＴＣ
ＧＣＡＴＡＧＣＣＣＣＧＣＴＣＧＣＧＴＣＴＣＧＴＣＧ
’これらをカイネーション法により（”Ｐ）ラベルし、
これをプローブとして前述のｃＤＮＡライブラリーの約
ｓｏ、 ｏｏｏプラークについてプラークハイブリダイ
ゼーションを行った。ハイブリダイゼーションおよび洗
浄は５０℃で行った。得られたポジティブクローンから
ファージＤＮＡを調製し、制限酵素により切断して解析
した。ついで、ダイデオキシ法によりｃＤＮＡの塩基配
列を決定した結果、このプラスミドがウシ副腎アドレノ
ドキシンのｃＤＮＡを含むことを確認した。得られたプ
ラスミドをｐＵＡＤＸと名付けた。 ｐＵＡＤＸハ約１
６０ｂｐ（７） ５°非翻訳領域、約５６０ｂｐのウシ
副腎アドレノドキシンコーディング領域、約２Ｋｂの３
°非翻訳領域を含むプラスミドであった。
施 ２ 発 プラスミド ＭＸの構築
以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターセによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合など反応は、特に断らない限
り、通常２０〜２００μｌの反応容積を用いて、これら
の酵素類を市販するメーカー（例えば、宝酒造■）が製
品に添付した反応条件で実施した。
リホスファターセによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合など反応は、特に断らない限
り、通常２０〜２００μｌの反応容積を用いて、これら
の酵素類を市販するメーカー（例えば、宝酒造■）が製
品に添付した反応条件で実施した。
ウシ副腎アドレノドキシン前駆体発現プラスミドｐＡＸ
（参考例１）により形質転換した酵母のアドレノドキ
シン産生量は非常に低かった（約１０′分子／菌体）。
（参考例１）により形質転換した酵母のアドレノドキ
シン産生量は非常に低かった（約１０′分子／菌体）。
ウシ副腎アドレノドキシン前駆体の移行シグナル部分を
コードする塩基配列は非常にＧ、Ｃリッチであり、この
ようにＧ、Ｃリッチなコドンは酵母ではあまり使用され
ていない。
コードする塩基配列は非常にＧ、Ｃリッチであり、この
ようにＧ、Ｃリッチなコドンは酵母ではあまり使用され
ていない。
そこで、アドレノドキシンの酵母内での産生量を上げる
ため、ミトコンドリアへの移行シグナル部分を除いた成
熟型ウシ副腎アドレノドキシン発現プラスミドｐＭＸを
構築した。第１図にその構築を示す。
ため、ミトコンドリアへの移行シグナル部分を除いた成
熟型ウシ副腎アドレノドキシン発現プラスミドｐＭＸを
構築した。第１図にその構築を示す。
ウシ副腎アトニットキシン遺伝子を含むプラスミドｐＬ
ＩＡＤＸを制限酵素旧ｎｄｎｌとＸｂａ Ｉで同時消化
し、約４９０ｂｐの旧ｎｄｌｎ −Ｘｂａ Ｉ断片を低
融点アガロースゲル電気泳動法により回収した。この断
片をさらにＡｌｕＩで消化し、目的とするＡｌｕ Ｉ
−Ｘｂａ Ｉ断片（約１００ｂｐ）を低融点アガロース
ゲル電気泳動法により回収した。この断片と合成リンカ
−ＬＡＤＸ２： ’ ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＡＧ ３”
ＡＴＴＴＴＴＴＴＡＣＴＣＧＴＣ５（左右両端にそれぞ
れ旧ｎｄｌＩ［、Ａｌｕ Ｉ認識部位を持つ）と、市販
のクローニングベクターｐＵｃ１９の旧ｎｄ ｍ −Ｘ
ｂａ Ｉ断片とのリガーゼ反応を行い、大腸菌■旧旧株
を形質転換した。それぞれの形質転換体から、Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙの方法にしたがい、プラスミドＤＮ
Ａを調製し、制限酵素消化による解析を行い、目的とす
る断片および合成リンカ−が挿入されたプラスミドを得
た。さらに、塩基配列を決定することにより、合成リン
カ一部分の配列を確認し、得られたプラスミドをｐＬＩ
ＭＸＮとした。
ＩＡＤＸを制限酵素旧ｎｄｎｌとＸｂａ Ｉで同時消化
し、約４９０ｂｐの旧ｎｄｌｎ −Ｘｂａ Ｉ断片を低
融点アガロースゲル電気泳動法により回収した。この断
片をさらにＡｌｕＩで消化し、目的とするＡｌｕ Ｉ
−Ｘｂａ Ｉ断片（約１００ｂｐ）を低融点アガロース
ゲル電気泳動法により回収した。この断片と合成リンカ
−ＬＡＤＸ２： ’ ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＡＧ ３”
ＡＴＴＴＴＴＴＴＡＣＴＣＧＴＣ５（左右両端にそれぞ
れ旧ｎｄｌＩ［、Ａｌｕ Ｉ認識部位を持つ）と、市販
のクローニングベクターｐＵｃ１９の旧ｎｄ ｍ −Ｘ
ｂａ Ｉ断片とのリガーゼ反応を行い、大腸菌■旧旧株
を形質転換した。それぞれの形質転換体から、Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙの方法にしたがい、プラスミドＤＮ
Ａを調製し、制限酵素消化による解析を行い、目的とす
る断片および合成リンカ−が挿入されたプラスミドを得
た。さらに、塩基配列を決定することにより、合成リン
カ一部分の配列を確認し、得られたプラスミドをｐＬＩ
ＭＸＮとした。
一方、ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子を含むプラスミ
ドｐｕＡＤＸをＸｍｎ Ｉで部分消化し、約５．４Ｋｂ
の１力ツト断片を低融点アガロースゲル電気泳動法によ
り回収した。この断片と市販の旧ｎｄｎｌリンカ−との
りガーゼ反応を行い、大腸菌Ｈ旧旧株を形質転換した。
ドｐｕＡＤＸをＸｍｎ Ｉで部分消化し、約５．４Ｋｂ
の１力ツト断片を低融点アガロースゲル電気泳動法によ
り回収した。この断片と市販の旧ｎｄｎｌリンカ−との
りガーゼ反応を行い、大腸菌Ｈ旧旧株を形質転換した。
形質転換からプラスミドＤＮＡを調製し、Ｘｍｎ Ｉ部
位が旧ｎｄＩｎ部位に置き換えられたプラスミドをｐＵ
ＸＩ＋とした。
位が旧ｎｄＩｎ部位に置き換えられたプラスミドをｐＵ
ＸＩ＋とした。
上述のプラスミドｐＵＭＸＮとｐＵＸＨからそれぞれ約
１３０ｂｐ、２９０ｂｐの旧ｎｄＩ［Ｉ −Ｘｂａ Ｉ
断片を低融点アガロースゲル電気泳動法により回収した
。これらの断片と市販のベクタープラスミドｐｕｃ１８
の旧ｎｄＩ［Ｉ断片にアルカリホスファターセ処理を施
したものとのりガーゼ反応を行った後、大腸菌Ｈ旧旧株
を形質転換した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを調
製し、ｐＵＭＸＮ、 ｐＵＸＨ由来１７）ＤＮＡ断片ヲ
ヒトつずつ含むプラスミドをｐＵＭＸとした。ｐＵＭＸ
をｔｌ ｉ ｎ ｄ■消化し、成熟型ウシ副腎アドレノ
ドキシンをコードする約４１０ｂｐのｃＤＮＡ断片を調
製し、これと、ｔｌｉｎｄＩＩＩ消化後アルカリフォス
ファターゼ処理を施した酵母発現ベクターｐＡＡ）１５
Ｎ （特願昭６３−２０２７８５）とのリガーゼ反応を
行った後、大腸菌１１旧ＯＩ株を形質転換した。形質転
換体からプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ構造を確認
し、ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子がＡＤＨプロモー
ターとターミネータ−に対して、順方向に挿入されたプ
ラスミドをｐＭＸとした。
１３０ｂｐ、２９０ｂｐの旧ｎｄＩ［Ｉ −Ｘｂａ Ｉ
断片を低融点アガロースゲル電気泳動法により回収した
。これらの断片と市販のベクタープラスミドｐｕｃ１８
の旧ｎｄＩ［Ｉ断片にアルカリホスファターセ処理を施
したものとのりガーゼ反応を行った後、大腸菌Ｈ旧旧株
を形質転換した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを調
製し、ｐＵＭＸＮ、 ｐＵＸＨ由来１７）ＤＮＡ断片ヲ
ヒトつずつ含むプラスミドをｐＵＭＸとした。ｐＵＭＸ
をｔｌ ｉ ｎ ｄ■消化し、成熟型ウシ副腎アドレノ
ドキシンをコードする約４１０ｂｐのｃＤＮＡ断片を調
製し、これと、ｔｌｉｎｄＩＩＩ消化後アルカリフォス
ファターゼ処理を施した酵母発現ベクターｐＡＡ）１５
Ｎ （特願昭６３−２０２７８５）とのリガーゼ反応を
行った後、大腸菌１１旧ＯＩ株を形質転換した。形質転
換体からプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ構造を確認
し、ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子がＡＤＨプロモー
ターとターミネータ−に対して、順方向に挿入されたプ
ラスミドをｐＭＸとした。
実施例３ 発現プラスミドＣＭＸの 築酵母ミトコンド
リアでウシ副腎アドレノドキシンを安定に高発現させる
ことを目的として、ウシ副腎アドレノドキシンの移行シ
グナルペプチド部分を酵母チトクロムＣ酸化酵素サブユ
ニットＩＶ（ＣＯｖ■）のものに置換したプラスミドｐ
ＣＭＸを構築した。図２に発現プラスミドｐＣＭＸの構
築を示す。
リアでウシ副腎アドレノドキシンを安定に高発現させる
ことを目的として、ウシ副腎アドレノドキシンの移行シ
グナルペプチド部分を酵母チトクロムＣ酸化酵素サブユ
ニットＩＶ（ＣＯｖ■）のものに置換したプラスミドｐ
ＣＭＸを構築した。図２に発現プラスミドｐＣＭＸの構
築を示す。
市販のクローニングプラスミドｐＵｃ］９の旧ｎｄＩ［
ＩＸｂａ Ｉ断片と、ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子
を含むプラスミドｐＵＡＤＸのＡｌｕ Ｉ −Ｘｂａ
Ｉ断片（約］００ｂｐ）と合成リンカ−ＬＣＸＩ：”
ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＡＣＴＡＣＧ
ＴＣＡＡＴＣＧＡＴＡ” ＡＴＴＴＴＴＴＴＡＣＧＡＡ
ＡＧＴＧＡＴＧＣＡＧＴＴＡＧＣＴＡＴＡＧＡＴＴＴＴ
ＴＣＡＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＧ
ＴＡＧＴＣＴＡＡＡＡＡＧＴＴＣＧＧＴＣＧＧＴＧＴＴ
ＣＴＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＣ（左右両端にそれぞれ旧ｎ
ｄＩＩＩ、Ａｌｕｌ認識部位を持ち、内側にＸｂａ Ｉ
認識部位を持つ）とのりガーゼ反応を行い、大腸菌８８
１旧株を形質転換した。
ＩＸｂａ Ｉ断片と、ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子
を含むプラスミドｐＵＡＤＸのＡｌｕ Ｉ −Ｘｂａ
Ｉ断片（約］００ｂｐ）と合成リンカ−ＬＣＸＩ：”
ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＡＣＴＡＣＧ
ＴＣＡＡＴＣＧＡＴＡ” ＡＴＴＴＴＴＴＴＡＣＧＡＡ
ＡＧＴＧＡＴＧＣＡＧＴＴＡＧＣＴＡＴＡＧＡＴＴＴＴ
ＴＣＡＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＧ
ＴＡＧＴＣＴＡＡＡＡＡＧＴＴＣＧＧＴＣＧＧＴＧＴＴ
ＣＴＴＧＡＡＡＣＡＣＡＴＣ（左右両端にそれぞれ旧ｎ
ｄＩＩＩ、Ａｌｕｌ認識部位を持ち、内側にＸｂａ Ｉ
認識部位を持つ）とのりガーゼ反応を行い、大腸菌８８
１旧株を形質転換した。
形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的とする
断片および合成リンカ−が挿入されたプラスミドを得た
。さらに、塩基配列を決定することにより、合成リンカ
一部分の配列を確認し、得られたプラスミドをｐＵｃＭ
ＸＮとした。ｐＵｃＭＸＮをＸｂａ Ｉで部分消化し、
約２．９Ｋｂの断片を得た。さらに旧ｎｄＩＩＩで消化
し、約２００ｂｐの断片を低融点アガロースゲル電気泳
動法により回収した。この旧ｎｄＩＩｌ−ＸｂａＩ断片
と、前述のｐＵＸｌ（のＸｂａｌ−旧ｎｄｌ［Ｉ断片（
約２９０ｂｐ ）と、市販のクローニングプラスミドｐ
Ｕｃ１８の旧ｎｄＩ［Ｉ断片とのトリプルライゲーショ
ンを行い大腸菌Ｈ２Ｏ２株を形質転換した。形質転換体
からプラスミドＤＮＡを調製し、両断片が挿入されたプ
ラスミドｐｔｌｃＭＸを得た。ρυＣＭＸを旧ｎｄｌｌ
Ｔ消化し、約４９０ｂｐの改変成熟型ウシ副腎アドレノ
ドキシンｃＤＮＡ断片を調製し、これと、ＨｉｎｄＩ［
ｌ消化後アルカリフォスファターゼ処理を施した酵母発
現ベクターｐＡＡＨ５Ｎ （特願昭６３−２０２７８５
）とのりガーゼ反応を行った後、大腸菌Ｈ旧旧株を形質
転換した。
断片および合成リンカ−が挿入されたプラスミドを得た
。さらに、塩基配列を決定することにより、合成リンカ
一部分の配列を確認し、得られたプラスミドをｐＵｃＭ
ＸＮとした。ｐＵｃＭＸＮをＸｂａ Ｉで部分消化し、
約２．９Ｋｂの断片を得た。さらに旧ｎｄＩＩＩで消化
し、約２００ｂｐの断片を低融点アガロースゲル電気泳
動法により回収した。この旧ｎｄＩＩｌ−ＸｂａＩ断片
と、前述のｐＵＸｌ（のＸｂａｌ−旧ｎｄｌ［Ｉ断片（
約２９０ｂｐ ）と、市販のクローニングプラスミドｐ
Ｕｃ１８の旧ｎｄＩ［Ｉ断片とのトリプルライゲーショ
ンを行い大腸菌Ｈ２Ｏ２株を形質転換した。形質転換体
からプラスミドＤＮＡを調製し、両断片が挿入されたプ
ラスミドｐｔｌｃＭＸを得た。ρυＣＭＸを旧ｎｄｌｌ
Ｔ消化し、約４９０ｂｐの改変成熟型ウシ副腎アドレノ
ドキシンｃＤＮＡ断片を調製し、これと、ＨｉｎｄＩ［
ｌ消化後アルカリフォスファターゼ処理を施した酵母発
現ベクターｐＡＡＨ５Ｎ （特願昭６３−２０２７８５
）とのりガーゼ反応を行った後、大腸菌Ｈ旧旧株を形質
転換した。
形質転換体から調製したプラスミドＤＮＡの構造を確認
し、改変成熟型ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子がＡＤ
Ｈプロモーターとターミネータ−に対して、順方向に挿
入されたプラスミドをｐＣＭＸとした。
し、改変成熟型ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子がＡＤ
Ｈプロモーターとターミネータ−に対して、順方向に挿
入されたプラスミドをｐＣＭＸとした。
実施 ４ 発現プラスミドによる酵母の形 転換
サツカロミセス・セレビシエＡＩ＋２２（ＡＴＣＣ３８
６２６）〔９０３株（ミトコンドリア様のオルガネラは
存在するが、ミトコンドリアＤＮＡを持たない株）、〔
ρ゛〕株（正常なミトコンドリアおよび、そのＤＮＡを
持つ株）を、５ｄのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％
ポリペプトン、２％グルコース）中で、３０℃、１８時
間培養したのち、ｌ艷の酵母培養液を遠心分離し、集菌
した。菌体を、０．２ＭＬｉＣｌ溶液ｌ−で洗浄したの
ち、ＩＭ ＬｉＣ１溶液２０μｌに懸濁した。これに、
７０％ポリエチレングリコール４０００溶液３０μ！、
発現プラスミド溶液１０μｌ （約１μｇ ＤＮＡ）を
添加して、充分に混合したのち、３０℃で１時間インキ
ュベートした。
６２６）〔９０３株（ミトコンドリア様のオルガネラは
存在するが、ミトコンドリアＤＮＡを持たない株）、〔
ρ゛〕株（正常なミトコンドリアおよび、そのＤＮＡを
持つ株）を、５ｄのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％
ポリペプトン、２％グルコース）中で、３０℃、１８時
間培養したのち、ｌ艷の酵母培養液を遠心分離し、集菌
した。菌体を、０．２ＭＬｉＣｌ溶液ｌ−で洗浄したの
ち、ＩＭ ＬｉＣ１溶液２０μｌに懸濁した。これに、
７０％ポリエチレングリコール４０００溶液３０μ！、
発現プラスミド溶液１０μｌ （約１μｇ ＤＮＡ）を
添加して、充分に混合したのち、３０℃で１時間インキ
ュベートした。
ついで、１４０μｌの水を加え、よく撹拌したのち、こ
の溶液をＳＤ合成培地プレート（２％グルコース、０．
６７％酵母窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／Ｔｎｌヒス
チジン、２％寒天）上にまき、３０℃で３日間インキュ
ベートすることにより、プラスミドを保持する形質転換
体を得た。プラスミドｐＭＸ、ｐＣＭＸで形質転換した
酵母を、それぞれ、Ａｌ２２ ［ρ’ ） （ｐＭＸ）
株、Ａｌ１２２ Ｃｏ ’ ） （ｐＣＭＸ）株、Ａｌ
１２２［ρ］ （ＩＩＣＭＸ）株とした。
の溶液をＳＤ合成培地プレート（２％グルコース、０．
６７％酵母窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／Ｔｎｌヒス
チジン、２％寒天）上にまき、３０℃で３日間インキュ
ベートすることにより、プラスミドを保持する形質転換
体を得た。プラスミドｐＭＸ、ｐＣＭＸで形質転換した
酵母を、それぞれ、Ａｌ２２ ［ρ’ ） （ｐＭＸ）
株、Ａｌ１２２ Ｃｏ ’ ） （ｐＣＭＸ）株、Ａｌ
１２２［ρ］ （ＩＩＣＭＸ）株とした。
実施例５ アドレノドキシンの生産
実施例４で得た酵母Ａｌ１２２ （ρ０］ （ｐＭＸ）
株、Ａｌ２２ Ｃｏ ’ ］ （ｐＣＭＸ）株、Ａｌ２
２ （ｏ ’ ］ （ｐＣＭＸ）株オヨび対照として、
発現ベクターｐＡＡＩ（５で形質転換した酵母Ａｌ２２
ＣＯ’ ） （ｐＡＡＨ５）株を、それぞれ、ＳＤ合
成培地（２％グルコース、０．６７％酵母窒素源アミノ
酸不含、２０μｇ／ｍ！ヒスチジン）で、約２ＸＩＯ’
菌体／−まで培養した。酵母培養液０．９ｍ／に、２
Ｎ Ｎａ０１１／ ８％、２−メルカプトエタノール
を０．１ｄ加え、水中で１０分間インキュベートしたの
ち、３０％トリクロロ酢酸０．２−を加え、さらに、水
中で１０分間インキュベートした。
株、Ａｌ２２ Ｃｏ ’ ］ （ｐＣＭＸ）株、Ａｌ２
２ （ｏ ’ ］ （ｐＣＭＸ）株オヨび対照として、
発現ベクターｐＡＡＩ（５で形質転換した酵母Ａｌ２２
ＣＯ’ ） （ｐＡＡＨ５）株を、それぞれ、ＳＤ合
成培地（２％グルコース、０．６７％酵母窒素源アミノ
酸不含、２０μｇ／ｍ！ヒスチジン）で、約２ＸＩＯ’
菌体／−まで培養した。酵母培養液０．９ｍ／に、２
Ｎ Ｎａ０１１／ ８％、２−メルカプトエタノール
を０．１ｄ加え、水中で１０分間インキュベートしたの
ち、３０％トリクロロ酢酸０．２−を加え、さらに、水
中で１０分間インキュベートした。
１２．００Ｏｒｐｍ ２分間の遠心分離により沈澱を集
め、水冷したアセトンで洗浄したのち、乾燥させた。
め、水冷したアセトンで洗浄したのち、乾燥させた。
調製した酵母全タンパク質は、ｔ ｏ ｏ ℃で５分間
加熱したサンプルバッファー（４％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、０．１６Ｍトリス−塩酸（ｐＨ６，８）、０．３
８Ｍ２−メルカプトエタノール、２０％グリセロール、
０．旧％ブロムフェノールブルー）５０μｌを加え、１
００℃でインキュベートすることにより溶解させた。こ
れを、７．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに供し
、Ｌａｅｍｍｌ ｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７．
６８０）に従って、電気泳動を行った。泳動後、アクリ
ルアミドゲルとニトロセルロースフィルターを重ね、プ
ロッティングバッファー（２５ｍＭ）リス−塩酸（ｐ）
１８．８）、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）
中で、３０Ｖの電圧をかけ、泳動したタンパク質をアク
リルアミドゲルからニトロセルロースフィルターへ移行
させた。ついでニトロセルロースフィルターをＴＢＳバ
ッファー（５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、２０
０ｎ＋Ｍ ＮａＣＩ）に浸した後、３％セラチン、０．
０５％ツイン２０を含むＴＢＳバッファー中で、３７８
Ｃ４０分間インキュベートした。
加熱したサンプルバッファー（４％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、０．１６Ｍトリス−塩酸（ｐＨ６，８）、０．３
８Ｍ２−メルカプトエタノール、２０％グリセロール、
０．旧％ブロムフェノールブルー）５０μｌを加え、１
００℃でインキュベートすることにより溶解させた。こ
れを、７．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに供し
、Ｌａｅｍｍｌ ｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７．
６８０）に従って、電気泳動を行った。泳動後、アクリ
ルアミドゲルとニトロセルロースフィルターを重ね、プ
ロッティングバッファー（２５ｍＭ）リス−塩酸（ｐ）
１８．８）、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）
中で、３０Ｖの電圧をかけ、泳動したタンパク質をアク
リルアミドゲルからニトロセルロースフィルターへ移行
させた。ついでニトロセルロースフィルターをＴＢＳバ
ッファー（５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、２０
０ｎ＋Ｍ ＮａＣＩ）に浸した後、３％セラチン、０．
０５％ツイン２０を含むＴＢＳバッファー中で、３７８
Ｃ４０分間インキュベートした。
つぎに抗ウシ副腎アドレノドキシン抗体（Ｋ、 ５ｕｈ
ａｒａ ｅｔ ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ａｃｔａ ２６３，２７２−２７８（１９７２）参
照）、１％セラチン、０．０５％ツイン２０を含むＴＢ
Ｓバッファー中で、３７６０３時間インキュベートした
。抗体との反応後、０．０５％ツイン２０を含むＴＢＳ
バッファー中で、３７℃３０分間ずつ４回洗浄を繰り返
したのち、３％ゼラチン、０．０５％ツイン２０を含む
ＴＢＳバッファー中で、３７°Ｃ２０分間インキュベー
トした。続いて、このニトロセルロースフィルターを、
２μ（ｉ（７）［１２５１〕 プロティンＡ（アマジャ
ム社より購入）、１％ゼラチン、０．０５％ツイン２０
を含むＴＢＳバッファー中に浸し、３７℃１時間インキ
ュベートした。０．０５％ツイン２０を含むＴＢＳ／＜
ソファ−中で、３７℃で３０分間ずつ４回洗浄したのち
、フィルターを風乾し、オートラジオグラフィーを行ツ
タ。Ａｌ２２ ［： ｏ ０） （ｐＭＸ）株、Ａｌ２
２ （ｏ ０） （ｐＣＭＸ）株、Ａｔ（２２ＣＤ ”
） （ｐｃＭＸ）株は、いずれも抗ウシ副腎アドレノ
ドキシン抗体と反応するタンパク質のバンドを示し、そ
の泳動位置は、ウシ副腎アドレノドキシン標品（Ｋ、５
ｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ ２６３，２７２−２７８（１９７２
）参照）の泳動位置とほぼ同じであった。Ａｌ２２ Ｃ
ρ” ） （ｐＡＡＨ５）およびＡｌ２２ （ρ０）
（ｐＡＡＨ５）株にウシ副腎アドレノドキシン標品を５
０ｎｇ添加したサンプルにおけるラン副腎アドレノドキ
シンのバントの黒化濃度と、Ａｌ２２ （ρ０］ （ｐ
ＭＸ）株におけるバンドの黒化濃度の比較から、Ａｌ２
２ ［ρ’ ） （ｐＭＸ）株における成熟型アドレノ
ドキシンの発現量は約１．３ＸｌＯ’分子／菌体と推定
された。これはＡｌ２２ ［ρ０） （ｐＡＸ）株（参
考例１）におけるアドレノドキシン前駆体の発現量の約
１３０倍に相当する。同様に、Ａｌ１２２ ＣＤ ’
） （ｐＣＭＸ）株、Ａｌ１２２ ＣＤ ” 〕（ｐＣ
ＭＸ）株における成熟型アドレノドキシンの発現量はそ
れぞれ、約２．５．４．９ＸｌＯ＠分子／菌体と推定さ
れた。
ａｒａ ｅｔ ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ａｃｔａ ２６３，２７２−２７８（１９７２）参
照）、１％セラチン、０．０５％ツイン２０を含むＴＢ
Ｓバッファー中で、３７６０３時間インキュベートした
。抗体との反応後、０．０５％ツイン２０を含むＴＢＳ
バッファー中で、３７℃３０分間ずつ４回洗浄を繰り返
したのち、３％ゼラチン、０．０５％ツイン２０を含む
ＴＢＳバッファー中で、３７°Ｃ２０分間インキュベー
トした。続いて、このニトロセルロースフィルターを、
２μ（ｉ（７）［１２５１〕 プロティンＡ（アマジャ
ム社より購入）、１％ゼラチン、０．０５％ツイン２０
を含むＴＢＳバッファー中に浸し、３７℃１時間インキ
ュベートした。０．０５％ツイン２０を含むＴＢＳ／＜
ソファ−中で、３７℃で３０分間ずつ４回洗浄したのち
、フィルターを風乾し、オートラジオグラフィーを行ツ
タ。Ａｌ２２ ［： ｏ ０） （ｐＭＸ）株、Ａｌ２
２ （ｏ ０） （ｐＣＭＸ）株、Ａｔ（２２ＣＤ ”
） （ｐｃＭＸ）株は、いずれも抗ウシ副腎アドレノ
ドキシン抗体と反応するタンパク質のバンドを示し、そ
の泳動位置は、ウシ副腎アドレノドキシン標品（Ｋ、５
ｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ ２６３，２７２−２７８（１９７２
）参照）の泳動位置とほぼ同じであった。Ａｌ２２ Ｃ
ρ” ） （ｐＡＡＨ５）およびＡｌ２２ （ρ０）
（ｐＡＡＨ５）株にウシ副腎アドレノドキシン標品を５
０ｎｇ添加したサンプルにおけるラン副腎アドレノドキ
シンのバントの黒化濃度と、Ａｌ２２ （ρ０］ （ｐ
ＭＸ）株におけるバンドの黒化濃度の比較から、Ａｌ２
２ ［ρ’ ） （ｐＭＸ）株における成熟型アドレノ
ドキシンの発現量は約１．３ＸｌＯ’分子／菌体と推定
された。これはＡｌ２２ ［ρ０） （ｐＡＸ）株（参
考例１）におけるアドレノドキシン前駆体の発現量の約
１３０倍に相当する。同様に、Ａｌ１２２ ＣＤ ’
） （ｐＣＭＸ）株、Ａｌ１２２ ＣＤ ” 〕（ｐＣ
ＭＸ）株における成熟型アドレノドキシンの発現量はそ
れぞれ、約２．５．４．９ＸｌＯ＠分子／菌体と推定さ
れた。
実施 ６ アドレノドキシンの酵母内局在外形質転換体
が産生ずるアドレノドキシンの酵母内局在外を調へるた
めに、酵母培養液から細胞小器官を調製し、各両分のチ
トクロムＣ還元活性を測定した。
が産生ずるアドレノドキシンの酵母内局在外を調へるた
めに、酵母培養液から細胞小器官を調製し、各両分のチ
トクロムＣ還元活性を測定した。
形質転換体を約２ＸＩＯ’菌体／−まで培養し、約２Ｘ
１０”菌体針を集菌し、サイモリアーセ溶液（ｌｏｍＭ
）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、２．０Ｍソルビトール、
０．１ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭＥＤＴＡ、
０．３＋ｎｇ／ ｍｌサイモ’） ７−セ’ １００．
０００） ＋、：ｊｌｌｉｉし、３０℃で１時間インキ
ュベートし、スフェロプラストを調製した。これを、ソ
ニケーションバッフｙ−（１０ｍＭ トリス−塩酸（
ｐｉｆ７．５） 、０．６５Ｍソルビトール、０．１ｍ
Ｍジチオスレイトール、０、 ］＋ｎＭ ＥＤＴＡ、
Ｉ ｔｎＭ フッ′化フェニルメチルスルホニル
［ＰＭＳＦ］ ）懸濁し、テフロンホモジナイザーでホ
モジナイズすることにより、菌体を破砕した、３０００
Ｘ ｇ、５分間の遠心分離により、沈澱ｌ（未破砕菌体
・各両分）を取り除き、上清ｌを得た。
１０”菌体針を集菌し、サイモリアーセ溶液（ｌｏｍＭ
）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、２．０Ｍソルビトール、
０．１ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭＥＤＴＡ、
０．３＋ｎｇ／ ｍｌサイモ’） ７−セ’ １００．
０００） ＋、：ｊｌｌｉｉし、３０℃で１時間インキ
ュベートし、スフェロプラストを調製した。これを、ソ
ニケーションバッフｙ−（１０ｍＭ トリス−塩酸（
ｐｉｆ７．５） 、０．６５Ｍソルビトール、０．１ｍ
Ｍジチオスレイトール、０、 ］＋ｎＭ ＥＤＴＡ、
Ｉ ｔｎＭ フッ′化フェニルメチルスルホニル
［ＰＭＳＦ］ ）懸濁し、テフロンホモジナイザーでホ
モジナイズすることにより、菌体を破砕した、３０００
Ｘ ｇ、５分間の遠心分離により、沈澱ｌ（未破砕菌体
・各両分）を取り除き、上清ｌを得た。
これを１０．ＯＯＯＸｇ、２０分間遠心分離し、沈澱２
（ミトコンドリア画分）と上清２を得た。上清２をさら
に＋２０，０００ｘ ｇ 、 ７０分間遠心分離し、沈
澱３（ミクロソーム画分）と上清３（細胞質両分）に分
けた。一方、チトクロムＣ還元活性は、３００１Ｍリン
酸カリウム（ｐｉｆ ７．４）、２００μＭチトクロム
ｃ ＸＩ ＯｍＭ ＫＣＮ、 ｌ ＯｍＭ ＮＡＤＰＨ
，３００，ｃｚＭアドレノドキシン還元酵素からなる反
応混液に、各細胞小器官画分を加え、全容を３−とし、
３０℃で５５０ｎｍの吸光度変化を測定した。その結果
、ＡＨ２２［ρ’ ） （ｐＭＸ）株では、活性のほと
んどが細胞質画分に存在していた。すなわち、本株が産
生ずる成熟型アドレノドキシンはミトコンドリアへの移
行シグナルを欠いているため、細胞質画分に局在すると
考えられた。Ａｌ２２ ［ρ’ ］ （ｐＣＭＸ）株、
Ａｌ１２２〔ρ＋） （ｐＣＭＸ）株では、ミトコンド
リア画分および細胞質画分がほぼ同程度の活性を示した
。しかし、細胞質画分の活性は、酵母細胞小器官の調製
時にミトコンドリア画分から漏出したアドレノドキシン
による可能性がある。従って、これらの株では、Ｃ０Ｘ
ＩＶ由来のミトコンドリア移行シグナルが酵母内で認識
され、大部分のアドレノドキシンがミトコンドリアへ取
り込まれたと考えられる。
（ミトコンドリア画分）と上清２を得た。上清２をさら
に＋２０，０００ｘ ｇ 、 ７０分間遠心分離し、沈
澱３（ミクロソーム画分）と上清３（細胞質両分）に分
けた。一方、チトクロムＣ還元活性は、３００１Ｍリン
酸カリウム（ｐｉｆ ７．４）、２００μＭチトクロム
ｃ ＸＩ ＯｍＭ ＫＣＮ、 ｌ ＯｍＭ ＮＡＤＰＨ
，３００，ｃｚＭアドレノドキシン還元酵素からなる反
応混液に、各細胞小器官画分を加え、全容を３−とし、
３０℃で５５０ｎｍの吸光度変化を測定した。その結果
、ＡＨ２２［ρ’ ） （ｐＭＸ）株では、活性のほと
んどが細胞質画分に存在していた。すなわち、本株が産
生ずる成熟型アドレノドキシンはミトコンドリアへの移
行シグナルを欠いているため、細胞質画分に局在すると
考えられた。Ａｌ２２ ［ρ’ ］ （ｐＣＭＸ）株、
Ａｌ１２２〔ρ＋） （ｐＣＭＸ）株では、ミトコンド
リア画分および細胞質画分がほぼ同程度の活性を示した
。しかし、細胞質画分の活性は、酵母細胞小器官の調製
時にミトコンドリア画分から漏出したアドレノドキシン
による可能性がある。従って、これらの株では、Ｃ０Ｘ
ＩＶ由来のミトコンドリア移行シグナルが酵母内で認識
され、大部分のアドレノドキシンがミトコンドリアへ取
り込まれたと考えられる。
実施 ７ 構成系におけるコレステロール鎖切断活性
Ａｌ２２ ［ρ“］ （ｐＣＭＸ）株から粗精製したア
ドレノドキシンとＰ４５０ｓＣＣ、ウシ副腎アドレノド
キシン還元酵素との再構成系において、Ｐ４５０ｓｅｃ
依存性コレステロール側鎖切断活性を測定した。
ドレノドキシンとＰ４５０ｓＣＣ、ウシ副腎アドレノド
キシン還元酵素との再構成系において、Ｐ４５０ｓｅｃ
依存性コレステロール側鎖切断活性を測定した。
２５ｐｍｏ ｌウシ副腎Ｐ４５０ｓｃｃ標品、５０ｐｍ
ｏ ｌウシ副腎アトＬ／／トキシン還元酵素、Ａｌ２２
Ｃｏ ” ） （ｐＣＭＸ）株から粗精製したアドレ
ノドキシン５００ｐｍｏ Ｉ、３０ｍＭリン酸カリウム
（ｐ１４７．４）、 ０．１Ｍ ＮａＣ１，０，３％ツ
イン２０．４３ｐｍｏｌ ［３Ｈ）コレステロール、０
．８ｓＭＮＡＤＰＩＩからなる反応混液０．６−を３７
℃でインキュベートした。０．８−メタノール、０．８
．ｎ！クロロホルムを添加することにより反応を停止し
、激しく撹拌したのち、クロロホルム層を分取した。こ
れを乾固したのち、１００μｌのエタノール：酢酸エチ
ル＝ｌ：ｌ溶液に溶解し、５０μｌをＨＰＬＣで分析し
た。ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
ｏ ｌウシ副腎アトＬ／／トキシン還元酵素、Ａｌ２２
Ｃｏ ” ） （ｐＣＭＸ）株から粗精製したアドレ
ノドキシン５００ｐｍｏ Ｉ、３０ｍＭリン酸カリウム
（ｐ１４７．４）、 ０．１Ｍ ＮａＣ１，０，３％ツ
イン２０．４３ｐｍｏｌ ［３Ｈ）コレステロール、０
．８ｓＭＮＡＤＰＩＩからなる反応混液０．６−を３７
℃でインキュベートした。０．８−メタノール、０．８
．ｎ！クロロホルムを添加することにより反応を停止し
、激しく撹拌したのち、クロロホルム層を分取した。こ
れを乾固したのち、１００μｌのエタノール：酢酸エチ
ル＝ｌ：ｌ溶液に溶解し、５０μｌをＨＰＬＣで分析し
た。ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
１、カラム； μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８（ウォータ
ーズ社製）２、溶媒；アセトニトリル ３、流速； １．０−／ｍ１ｎ ４、温度；５０℃ ５、検出； Ｔｒａｃｅ７１４０ （パラカード社製
）反応時間１０分で、約４％のコレステロールがプレグ
ネノロンに変換された。すなわち、酵母内で生産された
アドレノドキシンがウシ副腎アドレノドキシン精製標品
と同様に、Ｐ４５０ｓｅｃに対して電子を伝達できるこ
とが判った。
ーズ社製）２、溶媒；アセトニトリル ３、流速； １．０−／ｍ１ｎ ４、温度；５０℃ ５、検出； Ｔｒａｃｅ７１４０ （パラカード社製
）反応時間１０分で、約４％のコレステロールがプレグ
ネノロンに変換された。すなわち、酵母内で生産された
アドレノドキシンがウシ副腎アドレノドキシン精製標品
と同様に、Ｐ４５０ｓｅｃに対して電子を伝達できるこ
とが判った。
参考例１ 発現プラスミド ＡＸの構築第３図にプラス
ミドｐＡＸ構築の概要を示した。
ミドｐＡＸ構築の概要を示した。
プラスミドｐＵＸＨ（実施例２）を旧ｎｄｌｌｌで部分
消化し、約２．７Ｋｂの旧ｎｄｎｌ−旧ｎｄｌｌｌ断片
を低融点アガロースゲル電気泳動法により回収した。こ
れを、さらに、Ｅｃｏ５２１で消化し約２．４ｋｂの断
片を得た。
消化し、約２．７Ｋｂの旧ｎｄｎｌ−旧ｎｄｌｌｌ断片
を低融点アガロースゲル電気泳動法により回収した。こ
れを、さらに、Ｅｃｏ５２１で消化し約２．４ｋｂの断
片を得た。
この断片と、合成リンカ−ＬＡＤＸＩ：（左右両端にそ
れぞれ旧ｎｄＩ［Ｉ、Ｅｃｏ５２Ｉ認識部位を持つ）と
のりガーゼ反応を行い、大腸菌１１旧旧株を形質転換し
た。形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的と
する、合成リンカ−が挿入されたプラスミドを得た。さ
らに、塩基配列を決定することにより、合成リンカ一部
分の配列を確認し、得られたプラスミドをｐＵＬＸＨと
した。 ｐＵＬＸＨを旧ｎｄｎｌで消化し、約５９０ｂ
ｐのウシ副腎アドレノドキシン前駆体ｃ ＤＮＡ断片を
回収し、これと、旧ｎｄｌｌ＋消化後アルカリフォスフ
ァターセ処理を施した酵母発現ベクターｐＡＡ１１５Ｎ
とのりガーゼ反応を行った後、大腸菌１１旧旧株を形質
転換した。形質転換体から調製したプラスミドＤＮＡの
構造を確認し、ウシ副腎アドレノドキシン前駆体遺伝子
がＡＤ１１プロモーターとターミネータ−に対して、順
方向に挿入されたプラスミドをｐＡＸとした。
れぞれ旧ｎｄＩ［Ｉ、Ｅｃｏ５２Ｉ認識部位を持つ）と
のりガーゼ反応を行い、大腸菌１１旧旧株を形質転換し
た。形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的と
する、合成リンカ−が挿入されたプラスミドを得た。さ
らに、塩基配列を決定することにより、合成リンカ一部
分の配列を確認し、得られたプラスミドをｐＵＬＸＨと
した。 ｐＵＬＸＨを旧ｎｄｎｌで消化し、約５９０ｂ
ｐのウシ副腎アドレノドキシン前駆体ｃ ＤＮＡ断片を
回収し、これと、旧ｎｄｌｌ＋消化後アルカリフォスフ
ァターセ処理を施した酵母発現ベクターｐＡＡ１１５Ｎ
とのりガーゼ反応を行った後、大腸菌１１旧旧株を形質
転換した。形質転換体から調製したプラスミドＤＮＡの
構造を確認し、ウシ副腎アドレノドキシン前駆体遺伝子
がＡＤ１１プロモーターとターミネータ−に対して、順
方向に挿入されたプラスミドをｐＡＸとした。
このプラスミドを酵母ＡＩ＋２２ （００１株に導入し
て得た形質転換体の全菌体タンパク質を分析した結果、
菌体当たり約１０°分子のアドレノドキシン前駆体が発
現していたが、チトクロムＣ還元活性は検出されなかっ
た。
て得た形質転換体の全菌体タンパク質を分析した結果、
菌体当たり約１０°分子のアドレノドキシン前駆体が発
現していたが、チトクロムＣ還元活性は検出されなかっ
た。
発明の効果
本発明により提供されるアドレノドキシン生産酵母菌株
から粗精製したアドレノドキシンは、ウシ副腎Ｐ４５０
．。精製標品とウシ副腎アドレノドキシン還元酵素精製
標品との再構成系においてＰ４５０ｓｃｃに電子を伝達
することができた。すなわち、本発明により酵母内で生
産されたアドレノドキシンは、ウシ副腎由来のアドレノ
ドキシンと同等の機能を有する。従って、本発明により
提供されるアドレノドキシン生産酵母菌株は、今後、哺
乳動物のミトコンドリア型Ｐ４５０遺伝子を発現させる
宿主として有用である。
から粗精製したアドレノドキシンは、ウシ副腎Ｐ４５０
．。精製標品とウシ副腎アドレノドキシン還元酵素精製
標品との再構成系においてＰ４５０ｓｃｃに電子を伝達
することができた。すなわち、本発明により酵母内で生
産されたアドレノドキシンは、ウシ副腎由来のアドレノ
ドキシンと同等の機能を有する。従って、本発明により
提供されるアドレノドキシン生産酵母菌株は、今後、哺
乳動物のミトコンドリア型Ｐ４５０遺伝子を発現させる
宿主として有用である。
４、図面簡単な説明
第１図は、本発明の発現プラスミドｐＭＸの構築工程を
示す。
示す。
第２図は、本発明の発現プラスミドｐＣＭＸの構築工程
を示す。
を示す。
第３図は、参考例１のプラスミドｐＡＸの構築工程を示
す。
す。
制限酵素切断部位は、Ｈｄ：Ｈｉｎｄ ＩＩｌ、Ｅｃ：
ＥｃｏＲＩ。
ＥｃｏＲＩ。
Ｘｂ：Ｘｂａ １．Ｘｍ：Ｘｍｎ Ｉ、Ｎｔ：Ｎｏｔ
Ｉ、εｃ５２：Ｅｃｏ５２１を示す。また、Ｐ、Ｔはそ
れぞれＡＤＨプロモーターターミネータ−を示す。また
、図中のロ：＝コはウシ副腎アドレノドキシン翻訳領域
を、Ｍ■は酵母チトクロムＣ酸化酵素サブユニット■翻
訳領域を示す。
Ｉ、εｃ５２：Ｅｃｏ５２１を示す。また、Ｐ、Ｔはそ
れぞれＡＤＨプロモーターターミネータ−を示す。また
、図中のロ：＝コはウシ副腎アドレノドキシン翻訳領域
を、Ｍ■は酵母チトクロムＣ酸化酵素サブユニット■翻
訳領域を示す。
（完）
第１図（その２）
↓Ｈｉｎｄ ｌ、Ｘｂａｌ
ｌＸｂａ Ｉ 、Ｈｉｎｄ １
陣へ
′１゛
第２図（その１）
ｌＨｉｎｄ ＩｌＩ、Ｘｂａ ｌ
ＡＩｕｌ
Ｈｄ ＸｂＡＩ
ＵＣＭＸＮ
第２図（その２）
ｌＨｉｎｄ ［１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）成熟型ウシ副腎アドレノドキシンを酵母内で大量
生産させる発現プラスミド （２）酵母アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター
を含む特許請求の範囲第１項記載の発現プラスミド （３）ｐＭＸと命名した特許請求の範囲第２項記載のプ
ラスミド （４）改変ウシ副腎アドレノドキシンを酵母で大量生産
させる発現プラスミド （５）酵母アルコール脱水素酵母遺伝子のプロモーター
を含む特許請求の範囲第４項記載の発現プラスミド （６）ｐＣＭＸと命名した特許請求の範囲第５項記載の
プラスミド （７）成熟型ウシ副腎アドレノドキシンを大量生産する
酵母菌株 （８）酵母アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター
を有する発現プラスミドを保持する特許請求の範囲第７
項記載の酵母菌株 （９）プラスミドｐＭＸを保持する特許請求の範囲第８
項記載の酵母菌株 （１０）サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２／ｐＭＸ
と命名した特許請求の範囲第９項記載の酵母菌株 （１１）改変ウシ副腎アドレノドキシンを大量生産する
酵母菌株 （１２）酵母アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモータ
ーを有する発現プラスミドを保持する特許請求の範囲第
１１項記載の酵母菌株 （１３）プラスミドｐＣＭＸを保持する特許請求の範囲
第１２項記載の酵母菌株 （１４）サッカロミセス・セレビシエＡＨ２２／ｐＣＭ
Ｘと命名した特許請求の範囲第１３項記載の酵母菌株（
１５）成熟型ウシ副腎アドレノドキシンを大量生産する
酵母菌株を培養することを特徴とする成熟型ウシ副腎ア
ドレノドキシンの生産方法 （１６）改変ウシ副腎アドレノドキシンを大量生産する
酵母菌株を培養することを特徴とする成熟型ウシ副腎ア
ドレノドキシンの生産方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13649690A JPH0763374B2 (ja) | 1990-05-24 | 1990-05-24 | ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13649690A JPH0763374B2 (ja) | 1990-05-24 | 1990-05-24 | ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6193294A Division JPH0767667A (ja) | 1994-08-17 | 1994-08-17 | ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0430793A true JPH0430793A (ja) | 1992-02-03 |
| JPH0763374B2 JPH0763374B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=15176525
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13649690A Expired - Fee Related JPH0763374B2 (ja) | 1990-05-24 | 1990-05-24 | ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0763374B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5484223A (en) * | 1993-01-22 | 1996-01-16 | Yazaki Corporation | Double terminal stop connector |
| JP2008008961A (ja) * | 2006-06-27 | 2008-01-17 | Ricoh Co Ltd | 画像形成装置 |
-
1990
- 1990-05-24 JP JP13649690A patent/JPH0763374B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5484223A (en) * | 1993-01-22 | 1996-01-16 | Yazaki Corporation | Double terminal stop connector |
| JP2008008961A (ja) * | 2006-06-27 | 2008-01-17 | Ricoh Co Ltd | 画像形成装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0763374B2 (ja) | 1995-07-12 |
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