JPH0767667A - ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株 - Google Patents
ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株Info
- Publication number
- JPH0767667A JPH0767667A JP6193294A JP19329494A JPH0767667A JP H0767667 A JPH0767667 A JP H0767667A JP 6193294 A JP6193294 A JP 6193294A JP 19329494 A JP19329494 A JP 19329494A JP H0767667 A JPH0767667 A JP H0767667A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- adrenodoxin
- yeast
- bovine adrenal
- plasmid
- strain
- Prior art date
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- Pending
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】ウシ副腎アドレノドキシンを酵母内で発現させ
る発現プラスミド、該発現プラスミドを保持する酵母菌
株および該酵母により生産されたウシ副腎アドレノドキ
シン。 【効果】本発明により得られる酵母菌株は、ウシ副腎ア
ドレノドキシンを大量生産しているので、該酵母菌株に
より生産した該酵素と、チトクロムP450および NADPHア
ドレノドキシン還元酵素とを用い、医薬品として有用な
ステロイド類を合成することができる。
る発現プラスミド、該発現プラスミドを保持する酵母菌
株および該酵母により生産されたウシ副腎アドレノドキ
シン。 【効果】本発明により得られる酵母菌株は、ウシ副腎ア
ドレノドキシンを大量生産しているので、該酵母菌株に
より生産した該酵素と、チトクロムP450および NADPHア
ドレノドキシン還元酵素とを用い、医薬品として有用な
ステロイド類を合成することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウシ副腎アドレノドキ
シンを酵母内で発現させる発現プラスミド、該発現プラ
スミドを保持する酵母菌株および該酵母により生産され
たウシ副腎アドレノドキシンに関する。本発明により得
られる酵母菌株は、ウシ副腎アドレノドキシンを大量生
産しているので、該酵母菌株により生産した該酵素と、
チトクロムP450および NADPHアドレノドキシン還元酵素
とを用い、医薬品として有用なステロイド類を合成する
ことができる。
シンを酵母内で発現させる発現プラスミド、該発現プラ
スミドを保持する酵母菌株および該酵母により生産され
たウシ副腎アドレノドキシンに関する。本発明により得
られる酵母菌株は、ウシ副腎アドレノドキシンを大量生
産しているので、該酵母菌株により生産した該酵素と、
チトクロムP450および NADPHアドレノドキシン還元酵素
とを用い、医薬品として有用なステロイド類を合成する
ことができる。
【０００２】
【従来の技術】P450は微生物から哺乳動物にいたるまで
広く生物界に存在するヘムタンパク質であり、広範囲の
脂溶性化合物を基質として、１原子酸素添加反応を触媒
する。P450の示すこうした広範囲な基質特異性はP450の
分子多様性に起因する。P450には多数の分子種が存在し
ているが、各々のP450に電子を供給する経路は共通であ
り、ミクロソームでは主として、フラビンアデニンジヌ
クレオチドとフラビンモノヌクレオチドを分子内に補酵
素として含有するNADPH-チトクロムP450還元酵素（還元
酵素）が NADPHからの電子を、基質を結合したP450へ供
給する。一方、ミトコンドリアではフラビンアデニンジ
ヌクレオチド、非ヘム鉄をそれぞれ補酵素として分子内
に含有するNADPH-フェレドキシン還元酵素、フェレドキ
シンが NADPHからの電子を、基質を結合したP450へ供給
する。
広く生物界に存在するヘムタンパク質であり、広範囲の
脂溶性化合物を基質として、１原子酸素添加反応を触媒
する。P450の示すこうした広範囲な基質特異性はP450の
分子多様性に起因する。P450には多数の分子種が存在し
ているが、各々のP450に電子を供給する経路は共通であ
り、ミクロソームでは主として、フラビンアデニンジヌ
クレオチドとフラビンモノヌクレオチドを分子内に補酵
素として含有するNADPH-チトクロムP450還元酵素（還元
酵素）が NADPHからの電子を、基質を結合したP450へ供
給する。一方、ミトコンドリアではフラビンアデニンジ
ヌクレオチド、非ヘム鉄をそれぞれ補酵素として分子内
に含有するNADPH-フェレドキシン還元酵素、フェレドキ
シンが NADPHからの電子を、基質を結合したP450へ供給
する。
【０００３】本発明者らはすでに、酵素活性を有する数
種のミクロソーム型P450および還元酵素を酵母内で生産
させることに成功した。すなわち、ラット肝P450遺伝
子、ウシ副腎P45017α遺伝子やP450C21 遺伝子をそれぞ
れ単離し（特開昭61−56072 、特願昭62−204101、特願
昭63−181571）、これらの遺伝子を含む発現プラスミド
を作製し、これら発現プラスミドで酵母を形質転換する
ことにより、該酵素を産生する酵母菌株を得た。これら
の酵母菌株はP450依存性の１原子酸素添加活性を示し
た。また、ラット肝還元酵素遺伝子や酵母還元酵素遺伝
子を単離し、P450還元能を有する該酵素の酵母内発現に
成功した（特開昭62−19085 、特願昭63−202785）。さ
らに、発明者らは、P450と還元酵素の両酵素を生産する
酵母菌株（特開昭62−104582）や両酵素の機能を１分子
内に併せ持つ新規モノオキシゲナーゼの作出に成功した
（特開昭63−44888 、特願昭63−173761、特願昭１−71
250)。
種のミクロソーム型P450および還元酵素を酵母内で生産
させることに成功した。すなわち、ラット肝P450遺伝
子、ウシ副腎P45017α遺伝子やP450C21 遺伝子をそれぞ
れ単離し（特開昭61−56072 、特願昭62−204101、特願
昭63−181571）、これらの遺伝子を含む発現プラスミド
を作製し、これら発現プラスミドで酵母を形質転換する
ことにより、該酵素を産生する酵母菌株を得た。これら
の酵母菌株はP450依存性の１原子酸素添加活性を示し
た。また、ラット肝還元酵素遺伝子や酵母還元酵素遺伝
子を単離し、P450還元能を有する該酵素の酵母内発現に
成功した（特開昭62−19085 、特願昭63−202785）。さ
らに、発明者らは、P450と還元酵素の両酵素を生産する
酵母菌株（特開昭62−104582）や両酵素の機能を１分子
内に併せ持つ新規モノオキシゲナーゼの作出に成功した
（特開昭63−44888 、特願昭63−173761、特願昭１−71
250)。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】以上のような技術によ
り、本発明者らは医薬品として有用な数種のステロイド
類の合成を可能にしたが、コレステロールを出発物質と
してこれらステロイドホルモンの合成を行う場合には、
ミトコンドリア型P450依存性の１原子酸素添加活性を発
揮する酵母菌株の創製が必要である。
り、本発明者らは医薬品として有用な数種のステロイド
類の合成を可能にしたが、コレステロールを出発物質と
してこれらステロイドホルモンの合成を行う場合には、
ミトコンドリア型P450依存性の１原子酸素添加活性を発
揮する酵母菌株の創製が必要である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】アドレノドキシンは、副
腎ミトコンドリア型電子伝達系の主要酵素の１つで、補
酵素として非ヘム鉄を分子内に含有する水溶性酵素であ
る。アドレノドキシンはNADPH-アドレノドキシン還元酵
素を介して受け取った NADPHからの電子を副腎ミトコン
ドリア電子伝達系の末端酵素であるチトクロムP450に伝
達する。副腎ミトコンドリア型P450は数種類存在するに
もかかわらず、アドレノドキシンはいずれのチトクロム
P450分子種に対してもNADPH-アドレノドキシン還元酵素
からの電子を供給することができる。アドレノドキシン
は、１８６アミノ酸からなる前駆体（分子量約19kDa)と
して細胞質で合成されたのち、そのアミノ末端部分に存
在する移行シグナルが認識され、ミトコンドリアへ取り
込まれ、１２８アミノ酸からなる成熟型（分子量約14kD
a)になる。ウシ副腎アドレノドキシン前駆体をコードす
るcDNAの全構造はすでに Okamuraらによって報告されて
いる（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82、5705(1985)）。
腎ミトコンドリア型電子伝達系の主要酵素の１つで、補
酵素として非ヘム鉄を分子内に含有する水溶性酵素であ
る。アドレノドキシンはNADPH-アドレノドキシン還元酵
素を介して受け取った NADPHからの電子を副腎ミトコン
ドリア電子伝達系の末端酵素であるチトクロムP450に伝
達する。副腎ミトコンドリア型P450は数種類存在するに
もかかわらず、アドレノドキシンはいずれのチトクロム
P450分子種に対してもNADPH-アドレノドキシン還元酵素
からの電子を供給することができる。アドレノドキシン
は、１８６アミノ酸からなる前駆体（分子量約19kDa)と
して細胞質で合成されたのち、そのアミノ末端部分に存
在する移行シグナルが認識され、ミトコンドリアへ取り
込まれ、１２８アミノ酸からなる成熟型（分子量約14kD
a)になる。ウシ副腎アドレノドキシン前駆体をコードす
るcDNAの全構造はすでに Okamuraらによって報告されて
いる（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82、5705(1985)）。
【０００６】本発明者らは、まず、ウシ副腎アドレノド
キシン前駆体を酵母内で発現させるプラスミドを構築し
た。このプラスミドにより形質転換した酵母のアドレノ
ドキシン産生量は低く、活性も検出されなかった。そこ
で本発明者らは、酵素活性を有するアドレノドキシンを
酵母内で多量に産生させるために、アミノ末端に Metを
付加した成熟型アドレノドキシン発現プラスミドおよび
ミトコンドリア移行シグナル部分を酵母チトクロムｃ酸
化酵素サブユニットIVのものに置き換えた、改変アドレ
ノドキシン発現プラスミドを構築した。これらのプラス
ミドにより形質転換した酵母のアドレノドキシン産生量
は上昇し、産生されたアドレノドキシンは活性型であっ
た。すなわち、これらのアドレノドキシンはウシ副腎NA
DPH-アドレノドキシン還元酵素精製標品との再構成系に
おいてチトクロムｃに電子を伝達できた。また、酵母か
ら部分精製したアドレノドキシンは、ウシ副腎NADPH-ア
ドレノドキシン還元酵素精製標品およびウシ副腎P450
SCC 精製標品とともに、コレステロールからプレグネノ
ロンを生成することができた。今後、ミトコンドリア型
P450およびNADPH-アドレノドキシン還元酵素との同時発
現により、ステロイド化合物酸化反応用バイオリアクタ
ーとしての利用が期待できる。
キシン前駆体を酵母内で発現させるプラスミドを構築し
た。このプラスミドにより形質転換した酵母のアドレノ
ドキシン産生量は低く、活性も検出されなかった。そこ
で本発明者らは、酵素活性を有するアドレノドキシンを
酵母内で多量に産生させるために、アミノ末端に Metを
付加した成熟型アドレノドキシン発現プラスミドおよび
ミトコンドリア移行シグナル部分を酵母チトクロムｃ酸
化酵素サブユニットIVのものに置き換えた、改変アドレ
ノドキシン発現プラスミドを構築した。これらのプラス
ミドにより形質転換した酵母のアドレノドキシン産生量
は上昇し、産生されたアドレノドキシンは活性型であっ
た。すなわち、これらのアドレノドキシンはウシ副腎NA
DPH-アドレノドキシン還元酵素精製標品との再構成系に
おいてチトクロムｃに電子を伝達できた。また、酵母か
ら部分精製したアドレノドキシンは、ウシ副腎NADPH-ア
ドレノドキシン還元酵素精製標品およびウシ副腎P450
SCC 精製標品とともに、コレステロールからプレグネノ
ロンを生成することができた。今後、ミトコンドリア型
P450およびNADPH-アドレノドキシン還元酵素との同時発
現により、ステロイド化合物酸化反応用バイオリアクタ
ーとしての利用が期待できる。
【０００７】以下、本発明をさらに詳細に説明する。本
発明に用いるウシ副腎アドレノドキシンをコードするｃ
ＤＮＡは前述のように既に公知であり、通常の操作法で
これを単離することができる。本発明のアドレノドキシ
ンを発現する発現プラスミドはウシ副腎アドレノドキシ
ン遺伝子を適当な発現プラスミドに常法により挿入し構
築することができる。発現プラスミドとしては、公知の
発現ベクターを用いることができる。例えば、酵母アル
コール脱水素酵素(ADH１) 遺伝子のプロモーターおよび
同ターミネーターを保持する酵母発現ペクターpAAH５(M
ethods in Enzymology,101,partC,p192-201)が挙げられ
るが、ＰＧＫ プロモーター，G3PDH プロモーター，GA
L10 プロモーターを有する発現ベクターなど、宿主内で
効率よく機能するものであればよく、特に、限定される
ものではない。また、発現プラスミドの構造も限定され
るものでなく、酵母内で安定に保持されるものであれば
よい。宿主として酵母、例えばサッカロミセス・セレビ
シエAH22株、サッカロミセス・セレビシエSHY3株やサッ
カロミセス・セレビシエNA87−11A 株などが、好都合に
使用することができる。ウシ副腎アドレノドキシン遺伝
子を含む発現プラスミドによる宿主酵母の形質転換は、
アルカリ金属(LiCl)を用いる方法、プロトプラスト法な
ど公知の方法で行うことができる。このようにして得ら
れた形質転換酵母菌体を培養することによりアドレノド
キシンを製造することができる。本発明により得られる
形質転換酵母の培養は通常の培養方法により行うことが
できる。
発明に用いるウシ副腎アドレノドキシンをコードするｃ
ＤＮＡは前述のように既に公知であり、通常の操作法で
これを単離することができる。本発明のアドレノドキシ
ンを発現する発現プラスミドはウシ副腎アドレノドキシ
ン遺伝子を適当な発現プラスミドに常法により挿入し構
築することができる。発現プラスミドとしては、公知の
発現ベクターを用いることができる。例えば、酵母アル
コール脱水素酵素(ADH１) 遺伝子のプロモーターおよび
同ターミネーターを保持する酵母発現ペクターpAAH５(M
ethods in Enzymology,101,partC,p192-201)が挙げられ
るが、ＰＧＫ プロモーター，G3PDH プロモーター，GA
L10 プロモーターを有する発現ベクターなど、宿主内で
効率よく機能するものであればよく、特に、限定される
ものではない。また、発現プラスミドの構造も限定され
るものでなく、酵母内で安定に保持されるものであれば
よい。宿主として酵母、例えばサッカロミセス・セレビ
シエAH22株、サッカロミセス・セレビシエSHY3株やサッ
カロミセス・セレビシエNA87−11A 株などが、好都合に
使用することができる。ウシ副腎アドレノドキシン遺伝
子を含む発現プラスミドによる宿主酵母の形質転換は、
アルカリ金属(LiCl)を用いる方法、プロトプラスト法な
ど公知の方法で行うことができる。このようにして得ら
れた形質転換酵母菌体を培養することによりアドレノド
キシンを製造することができる。本発明により得られる
形質転換酵母の培養は通常の培養方法により行うことが
できる。
【０００８】以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説
明する。本発明は実施例のみに限定されるものではな
く、本発明の技術分野における通常の変更をすることが
できる。
明する。本発明は実施例のみに限定されるものではな
く、本発明の技術分野における通常の変更をすることが
できる。
【実施例】以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明
する。しかし、本発明は本実施例にのみ限定されないこ
とはいうまでもない。
する。しかし、本発明は本実施例にのみ限定されないこ
とはいうまでもない。
【０００９】実施例１ ウシ副腎アドレノドキシン cD
NAの取得 ウシ副腎からグアニジンチオシアネート法によりＲＮＡ
画分を抽出し、さらにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム
にかけ、ポリ（Ａ）ＲＮＡを得た。さらにこのポリ
（Ａ）ＲＮＡ画分を６５℃で５分間熱処理した後、１０
−３０％のショ糖密度勾配で超遠心分離(270,000×ｇ、
１時間) 分画した。マーカーの18S rRNAよりもややサイ
ズの大きい画分を回収し、アマーシャム社製のcDNA合成
システムを用いてcDNAを合成した。さらに、λgt11をベ
クターとしたcDNAクローニングシステムを用いてcDNAラ
イブラリーを作製した。前述の、既報のウシ副腎アドレ
ノドキシンのcDNAの構造を基にして以下の３種類、30me
r の DNAプローブ（配列番号１から３に示す。）を合成
した。
NAの取得 ウシ副腎からグアニジンチオシアネート法によりＲＮＡ
画分を抽出し、さらにオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム
にかけ、ポリ（Ａ）ＲＮＡを得た。さらにこのポリ
（Ａ）ＲＮＡ画分を６５℃で５分間熱処理した後、１０
−３０％のショ糖密度勾配で超遠心分離(270,000×ｇ、
１時間) 分画した。マーカーの18S rRNAよりもややサイ
ズの大きい画分を回収し、アマーシャム社製のcDNA合成
システムを用いてcDNAを合成した。さらに、λgt11をベ
クターとしたcDNAクローニングシステムを用いてcDNAラ
イブラリーを作製した。前述の、既報のウシ副腎アドレ
ノドキシンのcDNAの構造を基にして以下の３種類、30me
r の DNAプローブ（配列番号１から３に示す。）を合成
した。
【００１０】
【化１】 5' TACCGGCGTGCGGAGGACGCGCAGCGGAGG 3'（配列番号１）
【００１１】
【化２】 5' ACCGCCGAAGAGCACGCTGGCGCGCGCCCT 3'（配列番号２）
【００１２】
【化３】 5' GACTCGCATAGCCCCGCTCGCGTCTCGTCG 3'（配列番号３）
【００１３】これらをカイネーション法により〔32Ｐ〕
ラベルし、これをプローブとして前述のcDNAライブラリ
ーの約50,000プラークについてプラークハイブリダイゼ
ーションを行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄
は５０℃で行った。得られたポジティブクローンからフ
ァージＤＮＡを調製し、制限酵素により切断して解析し
た。ついで、ダイデオキシ法によりcDNAの塩基配列を決
定した結果、このプラスミドがウシ副腎アドレノドキシ
ンのcDNAを含むことを確認した。得られたプラスミドを
pUADXと名付けた。 pUADXは約 160bpの５’非翻訳領
域、約 560bpのウシ副腎アドレノドキシンコーディング
領域、約２Kbの３’非翻訳領域を含むプラスミドであっ
た。
ラベルし、これをプローブとして前述のcDNAライブラリ
ーの約50,000プラークについてプラークハイブリダイゼ
ーションを行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄
は５０℃で行った。得られたポジティブクローンからフ
ァージＤＮＡを調製し、制限酵素により切断して解析し
た。ついで、ダイデオキシ法によりcDNAの塩基配列を決
定した結果、このプラスミドがウシ副腎アドレノドキシ
ンのcDNAを含むことを確認した。得られたプラスミドを
pUADXと名付けた。 pUADXは約 160bpの５’非翻訳領
域、約 560bpのウシ副腎アドレノドキシンコーディング
領域、約２Kbの３’非翻訳領域を含むプラスミドであっ
た。
【００１４】実施例２ 発現プラスミドｐＭＸの構築 以下の実施例で、制限酵素によるＤＮＡの切断、アルカ
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合など反応は、特に断らない限
り、通常２０〜 200μl の反応容積を用いて、これらの
酵素類を市販するメーカー（例えば、宝酒造（株））が
製品に添付した反応条件で実施した。ウシ副腎アドレノ
ドキシン前駆体発現プラスミドｐＡＸ（参考例１）によ
り形質転換した酵母のアドレノドキシン産生量は非常に
低かった（約１０4 分子／菌体）。ウシ副腎アドレノド
キシン前駆体の移行シグナル部分をコードする塩基配列
は非常にＧ、Ｃリッチであり、このようにＧ、Ｃリッチ
なコドンは酵母ではあまり使用されていない。そこで、
アドレノドキシンの酵母内での産生量を上げるため、ミ
トコンドリアへの移行シグナル部分を除いた成熟型ウシ
副腎アドレノドキシン発現プラスミドｐＭＸを構築し
た。第１図にその構築を示す。ウシ副腎アドニノドキシ
ン遺伝子を含むプラスミド pUADXを制限酵素HindIIIと
XbaI で同時消化し、約 490bpのHindIII-Xba I 断片を
低融点アガロースゲル電気泳動法により回収した。この
断片をさらに AluI で消化し、目的とする AluI -XbaI
断片（約 100bp）を低融点アガロースゲル電気泳動法に
より回収した。この断片と合成リンカーLADX２（配列番
号４：左右両端にそれぞれHindIII 、 AluI 認識部位を
持つ）：
リホスファターゼによるＤＮＡの脱リン酸化、ＤＮＡリ
ガーゼによるＤＮＡの結合など反応は、特に断らない限
り、通常２０〜 200μl の反応容積を用いて、これらの
酵素類を市販するメーカー（例えば、宝酒造（株））が
製品に添付した反応条件で実施した。ウシ副腎アドレノ
ドキシン前駆体発現プラスミドｐＡＸ（参考例１）によ
り形質転換した酵母のアドレノドキシン産生量は非常に
低かった（約１０4 分子／菌体）。ウシ副腎アドレノド
キシン前駆体の移行シグナル部分をコードする塩基配列
は非常にＧ、Ｃリッチであり、このようにＧ、Ｃリッチ
なコドンは酵母ではあまり使用されていない。そこで、
アドレノドキシンの酵母内での産生量を上げるため、ミ
トコンドリアへの移行シグナル部分を除いた成熟型ウシ
副腎アドレノドキシン発現プラスミドｐＭＸを構築し
た。第１図にその構築を示す。ウシ副腎アドニノドキシ
ン遺伝子を含むプラスミド pUADXを制限酵素HindIIIと
XbaI で同時消化し、約 490bpのHindIII-Xba I 断片を
低融点アガロースゲル電気泳動法により回収した。この
断片をさらに AluI で消化し、目的とする AluI -XbaI
断片（約 100bp）を低融点アガロースゲル電気泳動法に
より回収した。この断片と合成リンカーLADX２（配列番
号４：左右両端にそれぞれHindIII 、 AluI 認識部位を
持つ）：
【００１５】
【化４】
【００１６】と、市販のクローニングベクター pUC19の
HindIII-Xba I 断片とのリガーゼ反応を行い、大腸菌 H
B101株を形質転換した。それぞれの形質転換体から、Bi
rnboim-Doly の方法にしたがい、プラスミドＤＮＡを調
製し、制限酵素消化による解析を行い、目的とする断片
および合成リンカーが挿入されたプラスミドを得た。さ
らに、塩基配列を決定することにより、合成リンカー部
分の配列を確認し、得られたプラスミドを pUMXNとし
た。一方、ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子を含むプラ
スミド pUADXを XmnI で部分消化し、約 5.4Kbの１カッ
ト断片を低融点アガロースゲル電気泳動法により回収し
た。この断片と市販のHindIII リンカーとのリガーゼ反
応を行い、大腸菌 HB101株を形質転換した。形質転換か
らプラスミドＤＮＡを調製し、Xmn I 部位がHindIII 部
位に置き換えられたプラスミドをpUXHとした。上述のプ
ラスミド pUMXNとpUXHからそれぞれ約 130bp、 290bpの
HindIII-XbaI 断片を低融点アガロースゲル電気泳動法
により回収した。これらの断片と市販のベクタープラス
ミド pUC18のHindIII 断片にアルカリホスファターゼ処
理を施したものとのリガーゼ反応を行った後、大腸菌 H
B101株を形質転換した。形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを調製し、 pUMXN、pUXH由来のＤＮＡ断片をひとつず
つ含むプラスミドをpUMXとした。pUMXをHindIII 消化
し、成熟型ウシ副腎アドレノドキシンをコードする約 4
10bpのcDNA断片を調製し、これと、HindIII 消化後アル
カリフォスファターゼ処理を施した酵母発現ベクターpA
AH5N（特願昭63−202785）とのリガーゼ反応を行った
後、大腸菌 HB101株を形質転換した。形質転換体からプ
ラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ構造を確認し、ウシ副
腎アドレノドキシン遺伝子がＡＤＨプロモーターとター
ミネーターに対して、順方向に挿入されたプラスミドを
ｐＭＸとした。
HindIII-Xba I 断片とのリガーゼ反応を行い、大腸菌 H
B101株を形質転換した。それぞれの形質転換体から、Bi
rnboim-Doly の方法にしたがい、プラスミドＤＮＡを調
製し、制限酵素消化による解析を行い、目的とする断片
および合成リンカーが挿入されたプラスミドを得た。さ
らに、塩基配列を決定することにより、合成リンカー部
分の配列を確認し、得られたプラスミドを pUMXNとし
た。一方、ウシ副腎アドレノドキシン遺伝子を含むプラ
スミド pUADXを XmnI で部分消化し、約 5.4Kbの１カッ
ト断片を低融点アガロースゲル電気泳動法により回収し
た。この断片と市販のHindIII リンカーとのリガーゼ反
応を行い、大腸菌 HB101株を形質転換した。形質転換か
らプラスミドＤＮＡを調製し、Xmn I 部位がHindIII 部
位に置き換えられたプラスミドをpUXHとした。上述のプ
ラスミド pUMXNとpUXHからそれぞれ約 130bp、 290bpの
HindIII-XbaI 断片を低融点アガロースゲル電気泳動法
により回収した。これらの断片と市販のベクタープラス
ミド pUC18のHindIII 断片にアルカリホスファターゼ処
理を施したものとのリガーゼ反応を行った後、大腸菌 H
B101株を形質転換した。形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを調製し、 pUMXN、pUXH由来のＤＮＡ断片をひとつず
つ含むプラスミドをpUMXとした。pUMXをHindIII 消化
し、成熟型ウシ副腎アドレノドキシンをコードする約 4
10bpのcDNA断片を調製し、これと、HindIII 消化後アル
カリフォスファターゼ処理を施した酵母発現ベクターpA
AH5N（特願昭63−202785）とのリガーゼ反応を行った
後、大腸菌 HB101株を形質転換した。形質転換体からプ
ラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ構造を確認し、ウシ副
腎アドレノドキシン遺伝子がＡＤＨプロモーターとター
ミネーターに対して、順方向に挿入されたプラスミドを
ｐＭＸとした。
【００１７】実施例３ 発現プラスミドpCMXの構築 酵母ミトコンドリアでウシ副腎アドレノドキシンを安定
に高発現させることを目的として、ウシ副腎アドレノド
キシンの移行シグナルペプチド部分を酵母チトクロムｃ
酸化酵素サブユニットIV(CO X IV) のものに置換したプ
ラスミドpCMXを構築した。図２に発現プラスミドpCMXの
構築を示す。 市販のクローニングプラスミド pUC19の
HindIII-Xba I 断片と、ウシ副腎アドレノドキシン遺伝
子を含むプラスミド pUADXの AluI -XbaI 断片（約 100
bp）と合成リンカー LCX１（配列番号５：左右両端にそ
れぞれHindIII 、 AluI 認識部位を持ち、内側に XbaI
認識部位を持つ）
に高発現させることを目的として、ウシ副腎アドレノド
キシンの移行シグナルペプチド部分を酵母チトクロムｃ
酸化酵素サブユニットIV(CO X IV) のものに置換したプ
ラスミドpCMXを構築した。図２に発現プラスミドpCMXの
構築を示す。 市販のクローニングプラスミド pUC19の
HindIII-Xba I 断片と、ウシ副腎アドレノドキシン遺伝
子を含むプラスミド pUADXの AluI -XbaI 断片（約 100
bp）と合成リンカー LCX１（配列番号５：左右両端にそ
れぞれHindIII 、 AluI 認識部位を持ち、内側に XbaI
認識部位を持つ）
【００１８】
【化５】 5' AGCTTAAAAAAATGCTTTCACTACGTCAATCGATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTT 3' ATTTTTTTACGAAAGTGATGCAGTTAGCTATTCTAAAAAGTTCGGTCGGTGTTCTTGAA TGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAGCAAAAACCCAGCAT 3' ACACATCGAGATCTATAGACGAAGTCGTTTTTGGGTCGTA 5'
【００１９】とのリガーゼ反応を行い、大腸菌 HB101株
を形質転換した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを調
製し、目的とする断片および合成リンカーが挿入された
プラスミドを得た。さらに、塩基配列を決定することに
より、合成リンカー部分の配列を確認し、得られたプラ
スミドをpUCMXNとした。pUCMXNを XbaI で部分消化し、
約 2.9Kbの断片を得た。さらにHindIII で消化し、約 2
00bpの断片を低融点アガロースゲル電気泳動法により回
収した。このHindIII-Xba I 断片と、前述のpUXHの Xba
I-HindIII 断片 (約 290bp) と、市販のクローニングプ
ラスミド pUC18のHindIII 断片とのトリプルライゲーシ
ョンを行い大腸菌 HB101株を形質転換した。形質転換体
からプラスミドＤＮＡを調製し、両断片が挿入されたプ
ラスミド pUCMXを得た。 pUCMXをHindIII 消化し、約 4
90bpの改変成熟型ウシ副腎アドレノドキシンcDNA断片を
調製し、これと、HindIII 消化後アルカリフォスファタ
ーゼ処理を施した酵母発現ベクターpAAH5N（特願昭63−
202785）とのリガーゼ反応を行った後、大腸菌 HB101株
を形質転換した。形質転換体から調製したプラスミドＤ
ＮＡの構造を確認し、改変成熟型ウシ副腎アドレノドキ
シン遺伝子がＡＤＨプロモーターとターミネーターに対
して、順方向に挿入されたプラスミドをpCMXとした。
を形質転換した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを調
製し、目的とする断片および合成リンカーが挿入された
プラスミドを得た。さらに、塩基配列を決定することに
より、合成リンカー部分の配列を確認し、得られたプラ
スミドをpUCMXNとした。pUCMXNを XbaI で部分消化し、
約 2.9Kbの断片を得た。さらにHindIII で消化し、約 2
00bpの断片を低融点アガロースゲル電気泳動法により回
収した。このHindIII-Xba I 断片と、前述のpUXHの Xba
I-HindIII 断片 (約 290bp) と、市販のクローニングプ
ラスミド pUC18のHindIII 断片とのトリプルライゲーシ
ョンを行い大腸菌 HB101株を形質転換した。形質転換体
からプラスミドＤＮＡを調製し、両断片が挿入されたプ
ラスミド pUCMXを得た。 pUCMXをHindIII 消化し、約 4
90bpの改変成熟型ウシ副腎アドレノドキシンcDNA断片を
調製し、これと、HindIII 消化後アルカリフォスファタ
ーゼ処理を施した酵母発現ベクターpAAH5N（特願昭63−
202785）とのリガーゼ反応を行った後、大腸菌 HB101株
を形質転換した。形質転換体から調製したプラスミドＤ
ＮＡの構造を確認し、改変成熟型ウシ副腎アドレノドキ
シン遺伝子がＡＤＨプロモーターとターミネーターに対
して、順方向に挿入されたプラスミドをpCMXとした。
【００２０】実施例４ 発現プラスミドによる酵母の形
質転換 サッカロミセス・セレビシエAH22(ATCC 38626)〔ρ0 〕
株（ミトコンドリア様のオルガネラは存在するが、ミト
コンドリアＤＮＡを持たない株）、〔ρ+ 〕株（正常な
ミトコンドリアおよび、そのＤＮＡを持つ株）を、５ml
のＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２
％グルコース）中で、３０℃、１８時間培養したのち、
１mlの酵母培養液を遠心分離し、集菌した。菌体を、0.
2M LiCl溶液１mlで洗浄したのち、1M LiCl 溶液２０μl
に懸濁した。これに、７０％ポリエチレングリコール4
000溶液３０μl 、発現プラスミド溶液１０μl (約１
μｇDNA)を添加して、充分に混合したのち、３０℃で１
時間インキュベートした。ついで、 140μl の水を加
え、よく撹拌したのち、この溶液をＳＤ合成培地プレー
ト（２％グルコース, 0.67％酵母窒素源アミノ酸不含、
２０μｇ／mlヒスチジン、２％寒天）上にまき、３０℃
で３日間インキュベートすることにより、プラスミドを
保持する形質転換体を得た。プラスミド pMX、pCMXで形
質転換した酵母を、それぞれ、AH22〔ρ0 〕(pMX) 株、
AH22〔ρ0 〕(pCMX)株、AH22〔ρ+ 〕(pCMX)株とした。
質転換 サッカロミセス・セレビシエAH22(ATCC 38626)〔ρ0 〕
株（ミトコンドリア様のオルガネラは存在するが、ミト
コンドリアＤＮＡを持たない株）、〔ρ+ 〕株（正常な
ミトコンドリアおよび、そのＤＮＡを持つ株）を、５ml
のＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２
％グルコース）中で、３０℃、１８時間培養したのち、
１mlの酵母培養液を遠心分離し、集菌した。菌体を、0.
2M LiCl溶液１mlで洗浄したのち、1M LiCl 溶液２０μl
に懸濁した。これに、７０％ポリエチレングリコール4
000溶液３０μl 、発現プラスミド溶液１０μl (約１
μｇDNA)を添加して、充分に混合したのち、３０℃で１
時間インキュベートした。ついで、 140μl の水を加
え、よく撹拌したのち、この溶液をＳＤ合成培地プレー
ト（２％グルコース, 0.67％酵母窒素源アミノ酸不含、
２０μｇ／mlヒスチジン、２％寒天）上にまき、３０℃
で３日間インキュベートすることにより、プラスミドを
保持する形質転換体を得た。プラスミド pMX、pCMXで形
質転換した酵母を、それぞれ、AH22〔ρ0 〕(pMX) 株、
AH22〔ρ0 〕(pCMX)株、AH22〔ρ+ 〕(pCMX)株とした。
【００２１】実施例５ アドレノドキシンの生産 実施例４で得た酵母AH22〔ρ0 〕(pMX) 株、AH22
〔ρ0 〕(pCMX)株、AH22〔ρ + 〕(pCMX)株および対照と
して、発現ベクターpAAH５で形質転換した酵母AH22〔ρ
0 〕(pAAH5) 株を、それぞれ、ＳＤ合成培地（２％グル
コース，0.67％酵母窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／ml
ヒスチジン）で、約２×１０7 菌体／mlまで培養した。
酵母培養液 0.9mlに、２Ｎ NaOH／８％、２−メルカプ
トエタノールを0.1ml加え、氷中で１０分間インキュベ
ートしたのち、３０％トリクロロ酢酸 0.2mlを加え、さ
らに、氷中で１０分間インキュベートした。12,000rpm
２分間の遠心分離により沈澱を集め、氷冷したアセトン
で洗浄したのち、乾燥させた。調製した酵母全タンパク
質は、 100℃で５分間加熱したサンプルバッファー（４
％ドデシル硫酸ナトリウム、0.16Ｍトリス−塩酸 (pH6.
8)、0.38Ｍ ２−メルカプトエタノール、２０％グリセ
ロール、0.01％ブロムフェノールブルー）50μl を加
え、 100℃でインキュベートすることにより溶解させ
た。これを、 7.5％ SDS−ポリアクリルアミドゲルに供
し、Laemmli の方法（Nature,227,680）に従って、電気
泳動を行った。泳動後、アクリルアミドゲルとニトロセ
ルロースフィルターを重ね、ブロッティングバッファー
（２５mMトリス−塩酸(pH 8.8)、１９２mMグリシン、２
０％メタノール）中で、３０Ｖの電圧をかけ、泳動した
タンパク質をアクリルアミドゲルからニトロセルロース
フィルターへ移行させた。ついでニトロセルロースフィ
ルターをＴＢＳバッファー（５０mMトリス−塩酸(pH 7.
5)、200mM NaCl）に浸した後、３％ゼラチン、0.05％ツ
ィン２０を含むＴＢＳバッファー中で、３７℃４０分間
インキュベートした。つぎに抗ウシ副腎アドレノドキシ
ン抗体（K.Suhara et al.,Biochim.Biophys.Acta 263,2
72-278(1972)参照）、１％ゼラチン、0.05％ツィン２０
を含むＴＢＳバッファー中で、３７℃３時間インキュベ
ートした。抗体との反応後、0.05％ツィン２０を含むＴ
ＢＳバッファー中で、３７℃３０分間ずつ４回洗浄を繰
り返したのち、３％ゼラチン、0.05％ツィン２０を含む
ＴＢＳバッファー中で、３７℃２０分間インキュベート
した。続いて、このニトロセルロースフィルターを、２
μCiの〔125I〕プロテインＡ（アマシャム社より購
入）、１％ゼラチン、0.05％ツィン２０を含むＴＢＳバ
ッファー中に浸し、３７℃１時間インキュベートした。
0.05％ツィン２０を含むＴＢＳバッファー中で、３７℃
で３０分間ずつ４回洗浄したのち、フィルターを風乾
し、オートラジオグラフィーを行った。AH22〔ρ0 〕(p
MX) 株、AH22〔ρ0 〕(pCMX)株、AH22〔ρ+ 〕(pCMX)株
は、いずれも抗ウシ副腎アドレノドキシン抗体と反応す
るタンパク質のバンドを示し、その泳動位置は、ウシ副
腎アドレノドキシン標品（K.Suhara et al.,Biochim.Bi
ophys.Acta 263,272-278(1972)参照）の泳動位置とほぼ
同じであった。AH22〔ρ0 〕(pAAH5) およびAH22
〔ρ0 〕(pAAH5) 株にウシ副腎アドレノドキシン標品を
５０ng添加したサンプルにおけるウシ副腎アドレノドキ
シンのバンドの黒化濃度と、AH22〔ρ0 〕(pMX) 株にお
けるバンドの黒化濃度の比較から、AH22〔ρ0 〕(pMX)
株における成熟型アドレノドキシンの発現量は約 1.3×
１０6 分子／菌体と推定された。これはAH22〔ρ0 〕(p
AX) 株（参考例１）におけるアドレノドキシン前駆体の
発現量の約１３０倍に相当する。同様に、AH22〔ρ0 〕
(pCMX)株、AH22〔ρ+ 〕(pCMX)株における成熟型アドレ
ノドキシンの発現量はそれぞれ、約 2.5、 4.9×１０6
分子／菌体と推定された。
〔ρ0 〕(pCMX)株、AH22〔ρ + 〕(pCMX)株および対照と
して、発現ベクターpAAH５で形質転換した酵母AH22〔ρ
0 〕(pAAH5) 株を、それぞれ、ＳＤ合成培地（２％グル
コース，0.67％酵母窒素源アミノ酸不含、２０μｇ／ml
ヒスチジン）で、約２×１０7 菌体／mlまで培養した。
酵母培養液 0.9mlに、２Ｎ NaOH／８％、２−メルカプ
トエタノールを0.1ml加え、氷中で１０分間インキュベ
ートしたのち、３０％トリクロロ酢酸 0.2mlを加え、さ
らに、氷中で１０分間インキュベートした。12,000rpm
２分間の遠心分離により沈澱を集め、氷冷したアセトン
で洗浄したのち、乾燥させた。調製した酵母全タンパク
質は、 100℃で５分間加熱したサンプルバッファー（４
％ドデシル硫酸ナトリウム、0.16Ｍトリス−塩酸 (pH6.
8)、0.38Ｍ ２−メルカプトエタノール、２０％グリセ
ロール、0.01％ブロムフェノールブルー）50μl を加
え、 100℃でインキュベートすることにより溶解させ
た。これを、 7.5％ SDS−ポリアクリルアミドゲルに供
し、Laemmli の方法（Nature,227,680）に従って、電気
泳動を行った。泳動後、アクリルアミドゲルとニトロセ
ルロースフィルターを重ね、ブロッティングバッファー
（２５mMトリス−塩酸(pH 8.8)、１９２mMグリシン、２
０％メタノール）中で、３０Ｖの電圧をかけ、泳動した
タンパク質をアクリルアミドゲルからニトロセルロース
フィルターへ移行させた。ついでニトロセルロースフィ
ルターをＴＢＳバッファー（５０mMトリス−塩酸(pH 7.
5)、200mM NaCl）に浸した後、３％ゼラチン、0.05％ツ
ィン２０を含むＴＢＳバッファー中で、３７℃４０分間
インキュベートした。つぎに抗ウシ副腎アドレノドキシ
ン抗体（K.Suhara et al.,Biochim.Biophys.Acta 263,2
72-278(1972)参照）、１％ゼラチン、0.05％ツィン２０
を含むＴＢＳバッファー中で、３７℃３時間インキュベ
ートした。抗体との反応後、0.05％ツィン２０を含むＴ
ＢＳバッファー中で、３７℃３０分間ずつ４回洗浄を繰
り返したのち、３％ゼラチン、0.05％ツィン２０を含む
ＴＢＳバッファー中で、３７℃２０分間インキュベート
した。続いて、このニトロセルロースフィルターを、２
μCiの〔125I〕プロテインＡ（アマシャム社より購
入）、１％ゼラチン、0.05％ツィン２０を含むＴＢＳバ
ッファー中に浸し、３７℃１時間インキュベートした。
0.05％ツィン２０を含むＴＢＳバッファー中で、３７℃
で３０分間ずつ４回洗浄したのち、フィルターを風乾
し、オートラジオグラフィーを行った。AH22〔ρ0 〕(p
MX) 株、AH22〔ρ0 〕(pCMX)株、AH22〔ρ+ 〕(pCMX)株
は、いずれも抗ウシ副腎アドレノドキシン抗体と反応す
るタンパク質のバンドを示し、その泳動位置は、ウシ副
腎アドレノドキシン標品（K.Suhara et al.,Biochim.Bi
ophys.Acta 263,272-278(1972)参照）の泳動位置とほぼ
同じであった。AH22〔ρ0 〕(pAAH5) およびAH22
〔ρ0 〕(pAAH5) 株にウシ副腎アドレノドキシン標品を
５０ng添加したサンプルにおけるウシ副腎アドレノドキ
シンのバンドの黒化濃度と、AH22〔ρ0 〕(pMX) 株にお
けるバンドの黒化濃度の比較から、AH22〔ρ0 〕(pMX)
株における成熟型アドレノドキシンの発現量は約 1.3×
１０6 分子／菌体と推定された。これはAH22〔ρ0 〕(p
AX) 株（参考例１）におけるアドレノドキシン前駆体の
発現量の約１３０倍に相当する。同様に、AH22〔ρ0 〕
(pCMX)株、AH22〔ρ+ 〕(pCMX)株における成熟型アドレ
ノドキシンの発現量はそれぞれ、約 2.5、 4.9×１０6
分子／菌体と推定された。
【００２２】実施例６ アドレノドキシンの酵母内局在
性 形質転換体が産生するアドレノドキシンの酵母内局在性
を調べるために、酵母培養液から細胞小器官を調製し、
各画分のチトクロムｃ還元活性を測定した。形質転換体
を約２×１０7 菌体／mlまで培養し、約２×１０10菌体
分を集菌し、ザイモリアーゼ溶液（１０mM トリス−塩
酸(pH 7.5)、 2.0Ｍソルビトール、0.1mMジチオスレイ
トール、 0.1mMEDTA、 0.3mg／mlザイモリアーゼ 100,0
00）に懸濁し、３０℃で１時間インキュベートし、スフ
ェロプラストを調製した。これを、ソニケーションバッ
ファー（１０mM トリス−塩酸(pH7.5) 、0.65Ｍソルビ
トール、 0.1mMジチオスレイトール、 0.1mM EDTA、１
mM フッ化フェニルメチルスルホニル〔PMSF〕）懸濁
し、テフロンホモジナイザーでホモジナイズすることに
より、菌体を破砕した、3000×ｇ、５分間の遠心分離に
より、沈澱１（未破砕菌体・各画分）を取り除き、上清
１を得た。これを10,000×ｇ、２０分間遠心分離し、沈
澱２（ミトコンドリア画分）と上清２を得た。上清２を
さらに 120,000×ｇ、７０分間遠心分離し、沈澱３（ミ
クロソーム画分）と上清３（細胞質画分）に分けた。一
方、チトクロムｃ還元活性は、３０mMリン酸カリウム(p
H 7.4)、 200μＭチトクロムｃ、１０mM KCN、１０mM N
ADPH、 300μＭアドレノドキシン還元酵素からなる反応
混液に、各細胞小器官画分を加え、全容を３mlとし、３
０℃で 550nmの吸光度変化を測定した。その結果、AH22
〔ρ0 〕(pMX) 株では、活性のほとんどが細胞質画分に
存在していた。すなわち、本株が産生する成熟型アドレ
ノドキシンはミトコンドリアへの移行シグナルを欠いて
いるため、細胞質画分に局在すると考えられた。AH22
〔ρ0 〕(pCMX)株、AH22〔ρ+ 〕(pCMX)株では、ミトコ
ンドリア画分および細胞質画分がほぼ同程度の活性を示
した。しかし、細胞質画分の活性は、酵母細胞小器官の
調製時にミトコンドリア画分から漏出したアドレノドキ
シンによる可能性がある。従って、これらの株では、Ｃ
ＯＸIV由来のミトコンドリア移行シグナルが酵母内で認
識され、大部分のアドレノドキシンがミトコンドリアへ
取り込まれたと考えられる。
性 形質転換体が産生するアドレノドキシンの酵母内局在性
を調べるために、酵母培養液から細胞小器官を調製し、
各画分のチトクロムｃ還元活性を測定した。形質転換体
を約２×１０7 菌体／mlまで培養し、約２×１０10菌体
分を集菌し、ザイモリアーゼ溶液（１０mM トリス−塩
酸(pH 7.5)、 2.0Ｍソルビトール、0.1mMジチオスレイ
トール、 0.1mMEDTA、 0.3mg／mlザイモリアーゼ 100,0
00）に懸濁し、３０℃で１時間インキュベートし、スフ
ェロプラストを調製した。これを、ソニケーションバッ
ファー（１０mM トリス−塩酸(pH7.5) 、0.65Ｍソルビ
トール、 0.1mMジチオスレイトール、 0.1mM EDTA、１
mM フッ化フェニルメチルスルホニル〔PMSF〕）懸濁
し、テフロンホモジナイザーでホモジナイズすることに
より、菌体を破砕した、3000×ｇ、５分間の遠心分離に
より、沈澱１（未破砕菌体・各画分）を取り除き、上清
１を得た。これを10,000×ｇ、２０分間遠心分離し、沈
澱２（ミトコンドリア画分）と上清２を得た。上清２を
さらに 120,000×ｇ、７０分間遠心分離し、沈澱３（ミ
クロソーム画分）と上清３（細胞質画分）に分けた。一
方、チトクロムｃ還元活性は、３０mMリン酸カリウム(p
H 7.4)、 200μＭチトクロムｃ、１０mM KCN、１０mM N
ADPH、 300μＭアドレノドキシン還元酵素からなる反応
混液に、各細胞小器官画分を加え、全容を３mlとし、３
０℃で 550nmの吸光度変化を測定した。その結果、AH22
〔ρ0 〕(pMX) 株では、活性のほとんどが細胞質画分に
存在していた。すなわち、本株が産生する成熟型アドレ
ノドキシンはミトコンドリアへの移行シグナルを欠いて
いるため、細胞質画分に局在すると考えられた。AH22
〔ρ0 〕(pCMX)株、AH22〔ρ+ 〕(pCMX)株では、ミトコ
ンドリア画分および細胞質画分がほぼ同程度の活性を示
した。しかし、細胞質画分の活性は、酵母細胞小器官の
調製時にミトコンドリア画分から漏出したアドレノドキ
シンによる可能性がある。従って、これらの株では、Ｃ
ＯＸIV由来のミトコンドリア移行シグナルが酵母内で認
識され、大部分のアドレノドキシンがミトコンドリアへ
取り込まれたと考えられる。
【００２３】実施例７ 再構成系におけるコレステロー
ル側鎖切断活性 AH22〔ρ+ 〕(pCMX)株から粗精製したアドレノドキシン
とP450SCC 、ウシ副腎アドレノドキシン還元酵素との再
構成系において、P450SCC 依存性コレステロール側鎖切
断活性を測定した。25pmolウシ副腎P450SCC 標品、50pm
olウシ副腎アドレノドキシン還元酵素、AH22〔ρ+ 〕(p
CMX)株から粗精製したアドレノドキシン 500pmol、30mM
リン酸カリウム(pH 7.4)、 0.1M NaCl、 0.3％ツィン2
0、43pmol[3 H〕コレステロール、 0.8mM NADPHからな
る反応混液 0.6mlを３７℃でインキュベートした。 0.8
mlメタノール、 0.8mlクロロホルムを添加することによ
り反応を停止し、激しく撹拌したのち、クロロホルム層
を分取した。これを乾固したのち、 100μl のエタノー
ル：酢酸エチル＝１：１溶液に溶解し、50μl をHPLCで
分析した。HPLCの条件を以下に示す。 1.カラム；μBondapak C18 (ウォーターズ社製） 2.溶媒；アセトニトリル 3.流速； 1.0ml/min 4.温度； 50 ℃ 5.検出； Trace7140（パッカード社製） 反応時間１０分で、約４％のコレステロールがプレグネ
ノロンに変換された。すなわち、酵母内で生産されたア
ドレノドキシンがウシ副腎アドレノドキシン精製標品と
同様に、P450SCC に対して電子を伝達できることが判っ
た。
ル側鎖切断活性 AH22〔ρ+ 〕(pCMX)株から粗精製したアドレノドキシン
とP450SCC 、ウシ副腎アドレノドキシン還元酵素との再
構成系において、P450SCC 依存性コレステロール側鎖切
断活性を測定した。25pmolウシ副腎P450SCC 標品、50pm
olウシ副腎アドレノドキシン還元酵素、AH22〔ρ+ 〕(p
CMX)株から粗精製したアドレノドキシン 500pmol、30mM
リン酸カリウム(pH 7.4)、 0.1M NaCl、 0.3％ツィン2
0、43pmol[3 H〕コレステロール、 0.8mM NADPHからな
る反応混液 0.6mlを３７℃でインキュベートした。 0.8
mlメタノール、 0.8mlクロロホルムを添加することによ
り反応を停止し、激しく撹拌したのち、クロロホルム層
を分取した。これを乾固したのち、 100μl のエタノー
ル：酢酸エチル＝１：１溶液に溶解し、50μl をHPLCで
分析した。HPLCの条件を以下に示す。 1.カラム；μBondapak C18 (ウォーターズ社製） 2.溶媒；アセトニトリル 3.流速； 1.0ml/min 4.温度； 50 ℃ 5.検出； Trace7140（パッカード社製） 反応時間１０分で、約４％のコレステロールがプレグネ
ノロンに変換された。すなわち、酵母内で生産されたア
ドレノドキシンがウシ副腎アドレノドキシン精製標品と
同様に、P450SCC に対して電子を伝達できることが判っ
た。
【００２４】参考例１ 発現プラスミドｐＡＸの構築 第３図にプラスミド pAX構築の概要を示した。プラスミ
ドpUXH（実施例２）をHindIII で部分消化し、約 2.7Kb
のHindIII −HindIII 断片を低融点アガロースゲル電気
泳動法により回収した。これを、さらに、Eco 52Ｉで消
化し約 2.4kbの断片を得た。この断片と、合成リンカー
LADX１（配列番号５：左右両端にそれぞれHindIII 、Ec
o 52Ｉ認識部位を持つ）
ドpUXH（実施例２）をHindIII で部分消化し、約 2.7Kb
のHindIII −HindIII 断片を低融点アガロースゲル電気
泳動法により回収した。これを、さらに、Eco 52Ｉで消
化し約 2.4kbの断片を得た。この断片と、合成リンカー
LADX１（配列番号５：左右両端にそれぞれHindIII 、Ec
o 52Ｉ認識部位を持つ）
【００２５】
【化６】 5'AGCTTAAAAAAATGGCCGCACGCCTCCTGCGCGTCGCCTCCGCCGCCCTCGGCGACACGGCC 3' 3'ATTTTTTTACCGGCGTGCGGAGGACGCGCAGCGGAGGCGGCGGGAGCCGCTGTGCCGGCCGG 5'
【００２６】とのリガーゼ反応を行い、大腸菌 HB101株
を形質転換した。形質転換体からプラスミドDNA を調製
し、目的とする、合成リンカーが挿入されたプラスミド
を得た。さらに、塩基配列を決定することにより、合成
リンカー部分の配列を確認し、得られたプラスミドを p
ULXHとした。 pULXHをHindIII で消化し、約 590bpのウ
シ副腎アドレノドキシン前駆体ｃDNA 断片を回収し、こ
れと、HindIII 消化後アルカリフォスファターゼ処理を
施した酵母発現ベクターpAAH5Nとのリガーゼ反応を行っ
た後、大腸菌 HB101株を形質転換した。形質転換体から
調製したプラスミドDNA の構造を確認し、ウシ副腎アド
レノドキシン前駆体遺伝子が ADHプロモーターとターミ
ネーターに対して、順方向に挿入されたプラスミドを p
AXとした。このプラスミドを酵母AH22〔ρ0 〕株に導入
して得た形質転換体の全菌体タンパク質を分析した結
果、菌体当たり約１０4 分子のアドレノドキシン前駆体
が発現していたが、チトクロムｃ還元活性は検出されな
かった。
を形質転換した。形質転換体からプラスミドDNA を調製
し、目的とする、合成リンカーが挿入されたプラスミド
を得た。さらに、塩基配列を決定することにより、合成
リンカー部分の配列を確認し、得られたプラスミドを p
ULXHとした。 pULXHをHindIII で消化し、約 590bpのウ
シ副腎アドレノドキシン前駆体ｃDNA 断片を回収し、こ
れと、HindIII 消化後アルカリフォスファターゼ処理を
施した酵母発現ベクターpAAH5Nとのリガーゼ反応を行っ
た後、大腸菌 HB101株を形質転換した。形質転換体から
調製したプラスミドDNA の構造を確認し、ウシ副腎アド
レノドキシン前駆体遺伝子が ADHプロモーターとターミ
ネーターに対して、順方向に挿入されたプラスミドを p
AXとした。このプラスミドを酵母AH22〔ρ0 〕株に導入
して得た形質転換体の全菌体タンパク質を分析した結
果、菌体当たり約１０4 分子のアドレノドキシン前駆体
が発現していたが、チトクロムｃ還元活性は検出されな
かった。
【００２７】
【発明の効果】本発明により提供されるアドレノドキシ
ン生産酵母菌株から粗精製したアドレノドキシンは、ウ
シ副腎P450SCC 精製標品とウシ副腎アドレノドキシン還
元酵素精製標品との再構成系においてP450SCC に電子を
伝達することができた。すなわち、本発明により酵母内
で生産されたアドレノドキシンは、ウシ副腎由来のアド
レノドキシンと同等の機能を有する。従って、本発明に
より提供されるアドレノドキシン生産酵母菌株は、今
後、哺乳動物のミトコンドリア型P450遺伝子を発現させ
る宿主として有用である。
ン生産酵母菌株から粗精製したアドレノドキシンは、ウ
シ副腎P450SCC 精製標品とウシ副腎アドレノドキシン還
元酵素精製標品との再構成系においてP450SCC に電子を
伝達することができた。すなわち、本発明により酵母内
で生産されたアドレノドキシンは、ウシ副腎由来のアド
レノドキシンと同等の機能を有する。従って、本発明に
より提供されるアドレノドキシン生産酵母菌株は、今
後、哺乳動物のミトコンドリア型P450遺伝子を発現させ
る宿主として有用である。
【００２８】
配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プローブ 配列 1 TACCGGCGTG CGGAGGACGC GCAGCGGAGG 30
【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成プローブ 配列 1 ACCGCCGAAG AGCACGCTGG CGCGCGCCCT 30
【００３０】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成リンカー 配列 1 GACTCGCATA GCCCCGCTCG CGTCTCGTCG 30
【００３１】配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成リンカー
【００３２】配列番号：５ 配列の長さ：１０３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成リンカー 配列 1 AGCTTAAAAA AATGCTTTCA CTACGTCAAT CGATAAGATT TTTCAAGCCA GCCACAAGAA 60 ATTTTT TTACGAAAGT GATGCAGTTA GCTATTCTAA AAAGTTCGGT CGGTGTTCTT CTTTGTGTAG CTCTAGATAT CTGCTTCAGC AAAAACCCAG CAT 103 GAAACACATC GAGATCTATA GACGAAGTCG TTTTTGGGTC GTA
【図１】本発明の発現プラスミド pMXの構築工程（その
１）を示す。制限酵素切断部位は、Hd:Hind III,Ec:Eco
R I,Xb:Xba I,Xm:Xmn I,Nt:Not I,Ec52:Eco52 I を示
す。また、Ｐ、Ｔはそれぞれ ADHプロモーター、ターミ
ネーターを示す。また、図中の白抜きで示される遺伝子
はウシ副腎アドレノドキシン翻訳領域を示す。
１）を示す。制限酵素切断部位は、Hd:Hind III,Ec:Eco
R I,Xb:Xba I,Xm:Xmn I,Nt:Not I,Ec52:Eco52 I を示
す。また、Ｐ、Ｔはそれぞれ ADHプロモーター、ターミ
ネーターを示す。また、図中の白抜きで示される遺伝子
はウシ副腎アドレノドキシン翻訳領域を示す。
【図２】本発明の発現プラスミド pMXの構築工程（その
２）を示す。制限酵素切断部位は、Hd:Hind III,Ec:Eco
R I,Xb:Xba I,Xm:Xmn I,Nt:Not I,Ec52:Eco52 I を示
す。また、Ｐ、Ｔはそれぞれ ADHプロモーター、ターミ
ネーターを示す。また、図中の白抜きで示される遺伝子
はウシ副腎アドレノドキシン翻訳領域をを示す。
２）を示す。制限酵素切断部位は、Hd:Hind III,Ec:Eco
R I,Xb:Xba I,Xm:Xmn I,Nt:Not I,Ec52:Eco52 I を示
す。また、Ｐ、Ｔはそれぞれ ADHプロモーター、ターミ
ネーターを示す。また、図中の白抜きで示される遺伝子
はウシ副腎アドレノドキシン翻訳領域をを示す。
【図３】本発明の発現プラスミドpCMXの構築工程（その
１）を示す。制限酵素切断部位は、Hd:Hind III,Ec:Eco
R I,Xb:Xba I,Xm:Xmn I,Nt:Not I,Ec52:Eco52 I を示
す。また、Ｐ、Ｔはそれぞれ ADHプロモーター、ターミ
ネーターを示す。また、図中の白抜きで示される遺伝子
はウシ副腎アドレノドキシン翻訳領域を、斜線で示され
る遺伝子は酵母チトクロムｃ酸化酵素サブユニットIV翻
訳領域を示す。
１）を示す。制限酵素切断部位は、Hd:Hind III,Ec:Eco
R I,Xb:Xba I,Xm:Xmn I,Nt:Not I,Ec52:Eco52 I を示
す。また、Ｐ、Ｔはそれぞれ ADHプロモーター、ターミ
ネーターを示す。また、図中の白抜きで示される遺伝子
はウシ副腎アドレノドキシン翻訳領域を、斜線で示され
る遺伝子は酵母チトクロムｃ酸化酵素サブユニットIV翻
訳領域を示す。
【図４】本発明の発現プラスミドpCMXの構築工程（その
２）を示す。制限酵素切断部位は、Hd:Hind III,Ec:Eco
R I,Xb:Xba I,Xm:Xmn I,Nt:Not I,Ec52:Eco52 I を示
す。また、Ｐ、Ｔはそれぞれ ADHプロモーター、ターミ
ネーターを示す。また、図中の白抜きで示される遺伝子
はウシ副腎アドレノドキシン翻訳領域を、斜線で示され
る遺伝子は酵母チトクロムｃ酸化酵素サブユニットIV翻
訳領域を示す。
２）を示す。制限酵素切断部位は、Hd:Hind III,Ec:Eco
R I,Xb:Xba I,Xm:Xmn I,Nt:Not I,Ec52:Eco52 I を示
す。また、Ｐ、Ｔはそれぞれ ADHプロモーター、ターミ
ネーターを示す。また、図中の白抜きで示される遺伝子
はウシ副腎アドレノドキシン翻訳領域を、斜線で示され
る遺伝子は酵母チトクロムｃ酸化酵素サブユニットIV翻
訳領域を示す。
【図５】参考例１のプラスミド pAXの構築工程を示す。
制限酵素切断部位は、Hd:Hind III,Ec:EcoR I,Xb:Xba
I,Xm:Xmn I,Nt:Not I,Ec52:Eco52 I を示す。また、
Ｐ、Ｔはそれぞれ ADHプロモーター、ターミネーターを
示す。また、図中の白抜きで示される遺伝子はウシ副腎
アドレノドキシン翻訳領域を示す。
制限酵素切断部位は、Hd:Hind III,Ec:EcoR I,Xb:Xba
I,Xm:Xmn I,Nt:Not I,Ec52:Eco52 I を示す。また、
Ｐ、Ｔはそれぞれ ADHプロモーター、ターミネーターを
示す。また、図中の白抜きで示される遺伝子はウシ副腎
アドレノドキシン翻訳領域を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 村上 裕子 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内 (72)発明者 大川 秀郎 兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号 住友化 学工業株式会社内
Claims (8)
- 【請求項１】成熟型ウシ副腎アドレノドキシンを酵母内
で発現させる発現プラスミド - 【請求項２】酵母アルコール脱水素酵母遺伝子のプロモ
ーターを含む請求項１記載の発現プラスミド - 【請求項３】ｐＭＸと命名した請求項２記載のプラスミ
ド - 【請求項４】請求項１記載の発現プラスミドを保持する
酵母菌株 - 【請求項５】請求項２記載の発現プラスミドを保持する
酵母菌株 - 【請求項６】請求項３記載の発現プラスミドを保持する
酵母菌株 - 【請求項７】サッカロミセス・セレビシエAH22/pMXと命
名した請求項６記載の酵母菌株 - 【請求項８】請求項４記載の酵母菌株により生産された
成熟型ウシ副腎アドレノドキシン
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6193294A JPH0767667A (ja) | 1994-08-17 | 1994-08-17 | ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6193294A JPH0767667A (ja) | 1994-08-17 | 1994-08-17 | ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13649690A Division JPH0763374B2 (ja) | 1990-05-24 | 1990-05-24 | ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767667A true JPH0767667A (ja) | 1995-03-14 |
Family
ID=16305528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6193294A Pending JPH0767667A (ja) | 1994-08-17 | 1994-08-17 | ウシ副腎アドレノドキシン産生菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0767667A (ja) |
-
1994
- 1994-08-17 JP JP6193294A patent/JPH0767667A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J BIOL CHEM=1984 * |
| PROC NATL ACAD SCI USA=1985 * |
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