JPH0430799A - 毛髪分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔関連出願に対するクロス・リファレンス〕本出願は、
１９８８年７月６日出願の同時係属米国出願第２１５．
５９１号の一部継続出願であり、これは特に１９８７年
１２月２８日出願の同時係属米国出願第１３８、５１５
号の一部継続出願である。

〔産業上の利用分野〕

本発明は、分析物（ａｎａｌｙｔｅ）の構造に影響を及
ぼしたり、または生物学的分析用プローブ、例えば抗体
、ＲＮＡ／ＤＮＡおよびハイオリアククープローブに対
して不利になることなく、毛髪および他の角質化構造物
、例えば指爪および足指爪巾に存在する有機分析物、例
えば乱用薬物の比較的迅速な可溶化および直接分析を果
たす改良された分析法に関する。分析用プローブを、可
溶化された分析物含有溶液に直接添加し、分析物の正体
並びに被検者による消費の程度および持続期間を測定す
ることにより直接分析することができる。

〔従来の技術〕

従来、微量金属の検出のための毛髪分析技術は個体の栄
養状態に基づく情報を提供するという趣旨で開発された
。これらの技術の使用の難点は、血流から毛髪中に沈着
された微量金属と、例えば水や化粧品剤との外的接触を
通じて留められるようになった金属とを識別することの
難しさである。

結果として、これらの技術は栄養上の問題を診断するた
めの医療団体によっては有用とみなされず、従って被験
者により消費された特定の微量金属のレベルを充分に正
確に決定すると考えられていない。

従来の毛髪分析技術に伴う問題点のために、被検者中に
摂取された化学物質、例えば乱用薬物、薬剤および毒性
化学物質の検出のための尿および血液分析を頼みにして
いた。しかしながら、これらの技術もまた、使用または
暴露の持続期間および強度を確かめることができないと
いう欠点があることが知られている。尿および血液分析
は、せいぜい摂取された薬物または化学物質、例えば乱
用薬物に関する短期情報を提供できるに過ぎない。

加えて、そのような結果の解釈に伴う問題点も存在する
。例えば、尿中の摂取された化学物質の低レベルの検出
は、被検者が最近に少量の薬剤もしくは化学物質を摂取
したか、または数日前に多量を摂取したことを意味し得
る。従って、テストを繰返さずにこれらの方法を使って
慢性的薬物使用を測定することはできない。

乱用薬物、薬剤、毒性化合物等の使用の持続期間および
強度を共に測定でき、信頼性があり且つ正確な方法を確
立する課題に応答して、Ｏｒ、　ＷｅｒｎｅｒＡ、　Ｂ
ａｕｍｇａｒｔｎｅｒにより行われた研究は、［アヘン
製剤乱用経歴を測定するための毛髪のラジオイムノアッ
セイＪ　Ｊ、Ｎｕｃｌ　Ｍｅｄ　　２０ニア４９−７５
２（１９７９）において報告されたように、薬物が毛髪
の合成の間に個体の毛髪線維内部に“トラップ″される
ので、哺乳類の体毛の分析を通して乱用薬物への暴露の
長期経歴が得られることを決定づけた。この点で、毛髪
はテープレコーダーのように働き、即ち、毛髪試料の区
間分析を通して過去の暴露経歴を判断できることが示さ
れた。前に血流中にあったヘロインは、毛髪が合成され
る時に毛髪中に沈着することがわかった。

従って、様々な化学物質、例えば乱用薬物、薬剤、毒性
化学物質等（以後ひとまとめにして゛分析物′″と称す
る）が毛髪の合成の間に毛髪によりトラップされること
、およびそれら物質は本質的に毛髪の存続期間の間は毛
髪中に゛閉じ込められる″ことがこの研究により発見さ
れそして次なる研究により（？［、Ｒされた。このこと
は頭髪および体毛並びに指爪などの他の角質化構造物に
ついて当てはまることがわかった（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｆ
ｏｒｅｎｓｉｃＳｃｉ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、
２４：９−１６．１９８４）　ｏ　これらのトラップさ
れた物質は毛髪の外に洗い出すことが不可能であり、そ
して毛髪線維の完全な破壊によってのみ放出される。

毛髪から分析物を抽出する従来技術の方法は、熱メタノ
ール溶液に毛髪を何すること（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ
ら、Ｊ、Ｎｕｃｌ　Ｍｅｄ　２０．７４８．１９７９）
およびアルカリ性または酸性媒質中での毛髪の一晩のイ
ンキュベーンヨン（Ｄ、Ｖａｌｅｎｔｅ　ら、Ｃ１１ｎ
ｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１９５２、第２７巻、第１１号、１９８１年）を含んで
いた。

従来方法はまた、溶媒と共同してトラップされた分析物
を放出させるための乳鉢および乳棒の使用を含む。

しかしながら、溶媒抽出法は、摂取された分析物の存否
および量を正確に測定することにおいて幾つかの問題を
かかえている。この問題の１つは、溶媒抽出法がしばし
ば毛髪試料中に存在する全分析物のうち未知で且つ不定
の少量の部分しか取り出さないことである。更にそのよ
うな方法は時間を浪費しがちであり、そして通常高い温
度を必要とし、分析物に損傷を与えるがもじれない。別
の欠点は、分析物が異なると異なる抽出溶媒を必要とす
ることである。例えば、モルヒネ、フェンンクリジン（
”ＰＣＰ”）、コカインおよびマリファナを含有する毛
髪試料は、幾つかの異なる溶媒を用いて連続的に抽出し
なければならず、特に、分析におもむく前に溶媒を蒸発
させなければならないので、非常に時間のかかる作業で
ある。

毛髪の分解および毛髪分析に関連する他の方法および研
究は次のものを含む： Ｄ、　５ｕｚｕｋｉらは、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ　ＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＩｒｅｌａｎｄ　
Ｌｔｄ、、　　による刊行物の中で、切り取った爪また
は毛髪中のメタアンフェタミンおよびアンフェタミンを
検出する方法を開示しており、この方法では該物質をま
ずメタノールと水の混合物中で洗浄し、そして水酸化ナ
トリウム中に溶解し、次いで抽出された薬剤を分析した
。

、Ａ、　１１．　）Ｉｏｌｍｌｓは、Ｔｅｘｔｉｌｅ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ、７Ｑ６７１２、１
９６４年８月の中で、酵素活性化剤として亜硫酸ナトリ
ウムを使ったパパインによるヒトの毛髪の分解を開示し
ている。

Ａｎｎｅｔｔｅ　Ｍ、Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ　　らは
、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＮｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ、　２０ニア４８−７５２．１９７９の中で、毛髪
を乳鉢と乳棒で粉砕し次いでメタノールで処理すること
による毛髪からのモルヒネおよびヘロインの抽出法を開
示している。

Ｄ、Ｖａｌｅｎｔｅ　らは、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、第２７巻、第１１号、１９８１年の中で
、毛髪を熱メタノールの処理にかけ、乱用薬物の抽出を
果たすＯｒ、Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒの技術並びに酸ま
たはアルカリ性媒質中でモルヒネを抽出する著者の技術
を開示している。

Ａ、　Ｍ、　Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ　　らは、Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　ＦｏｒｅｎｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅｓ、
　ｐ、　５７６−８１．１９８１年７月の中で、乳鉢と
乳棒を用い続いてメタノールで処理することによるＰＣ
Ｐの抽出を開示している。次いで抽出されたＰＣＰをＲ
ＩＡで分析した。

Ｓｍ１ｔｈ　　らは、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｒｅ
ｎｓ＋ｃ　５ｃｉｅｎｃｅｓ。

第２６巻、第３号、１９８１年７月、ｐ、　５８２−５
８６の中で、フェノバルビクールの存在についての毛髪
の試験法を開示しており、この方法では、１本の太い毛
髪を洗浄し、乾燥し、２關の長さに切り、そして０．２
ｄの０．１％ＳＯ３／塩溶液に添加し、そしてラジオイ
ムノアッセイにより試料を分析した。

ＬＬ　Ａ、　Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ、　Ｂｌａｃｋ　
らは、Ｊ、Ｎｕｃｌ　Ｍｅｄ　２３ニア９０−８９２．
１９８２年の中で、毛髪試料をエタノール中で還流する
ことによる毛髪試料からのコカインの抽出次いでＲＩＡ
分析を開示している。

Ｉｓｈｉｙａｍａらは、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｒ
ｅｎｓ＋ｃ　Ｓｃ＋ｅｎｃｅｓ。

第２８巻、第２号、１９８３年４月、ｐ、　３８０−３
８５の中で、１〜２のｐＨで１．５Ｎ塩酸を使ってメタ
アンフェタミン常用者からの毛髪を溶解せしめ、次いで
ガスクロマトグラフィーとマススペクトロメトリーを使
って分析する方法を開示している。

に、　Ｐｕ５ｃｈｅｌ　　らは、Ｆｏｒｅｎｓ＋ｃ　５
ｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａ−ｔｉｏｎａｌ、　２１
（１９８３）１８１−１８６の中で、水酸化ナトリウム
と熱への暴露による毛髪試料の溶解に続きＲＩＡによる
モルヒネの存在についての分析を開示している。

０、５ｕｚｕｋｉらは、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｒ
ｅｎｓｉｃ　Ｓｃ＋ｅｎｃｅｓ。

第２９巻、第２号、１９８４年４月、ｐ、　６１１−６
１７の中で、ガスクロマトグラフィーおよび化学的イオ
ン化マススペクトロメトリーによる一本のヒト毛髪中の
メタアンフェタミンおよびアンフェタミンの検出法を開
示している。

Ｎ、　Ｊ、　Ｈａｌｅｙ　らは、ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｅｍ
、３１　／　１０．１５９８−１６００（１９８５）の
中で、ニコチンおよびコチニンについての毛髪の分析を
開示しており、ここでは洗浄した毛髪試料を、ゼラチン
、塩化ナトリウム、トリスおよびＥＤＴＡを含む緩衝液
中に溶解し、そしてｐ＋−＋７．４に調整した。次いで
ラジオイムノアッセイにより試料を分析した。

Ｓｒａｍｌｋ、　Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒらは、Ａ、Ｍ
、　Ｊ、　Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ１４２：８．１９８５
年８月の中で、メタノール抽出およびラジオイムノアッ
セイを用いる精神医学患者の毛髪の分析を開示している
。

ＢａＵｍｇａｒｔｎｅｒ　らは、Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｎ
ｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。

第１０巻、１９８５年９月の中で、トラップされた乱用
薬物の毛髪からの抽出に続＜Ｒ１Δ分析の恩典を開示し
ている。

Ｇ１１ｌらは、ＮａｔＵｒｅ、第３１８巻、ｐ、　５７
７　（１９８５）の中で、全血、全精液、膣液、毛根、
血痕および精液痕からＤＮＡを抽出するためのＳＤＳ／
プロテイナーゼに／ジチオトレイトール混合物の利用を
開示している。

３＋ｒ＋＋ｔｈ　　らは、Ｊ、　Ｆｏｒｅｎｓｉｃ　Ｓ
ｃｉ、　１９８６．３１　（４）、　１２６９７３中で
、ＲＩＡを使った汗、経血痕および毛髪中のコカインの
検出を開示している。

Ｍ、Ｍａｒｇｉｏらは、１９８６年６月２５−２６日Ｖ
ｅｒｏｎａ大学の国際会議で”　ＨＰ　Ｌ　ＣとＭＳ／
ＭＳによるヘロイン常用者の毛髪中のモルヒネおよび他
のオピオイドの測定”において、毛髪試料からモルヒネ
をアッセイする種々の方法を開示している。

Ｍ、Ｍａｒｇｉｏらは、ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、第１０
巻、１９８６年７月／り月の中で、熱−酸加水分解、プ
レカラムダンシル誘導体化、順相液体クロマトクラフィ
ーおよび蛍光検出による、ヘロイン常用者の毛髪中に含
まれるモルヒネの定量方法を開示している。

Ｓｍ１ｔｈ　らは、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｎ
ｓ＋ｃ　５ｃｉｅｎｃｅｓ。

第３１巻、第４号、１９８６年１０月、ｐ、　１２６９
−１２７３において、毛髪試料をまず洗浄し、小断片に
切り、機械的に６分間粉砕し、エタノール中で還流しそ
してラジオイムノアッセイを使って試料を分析すること
による、薬物の存在についての毛髪の分析方法を開示し
ている。

Ｍ、　Ｍｉｃｈａｌｏｄｉｎｉｔｒａｋｉｓは、Ｍｅｄ
、　Ｓｃｉ、Ｌａｗ　（１９８７）第２７巻、第１号に
おいて、１．５Ｎ　　ＨＣｊｌ！へ暴露し、ｐＨ値を１
−２に調整し、続いて０．０ＩＮ　　ＨＣＩと共に３７
℃にて１時間インキュベートすることで溶解された毛髪
試料の分析からラット中のコカインを検出する方法を開
示している。

Ｐｅ１ｌｉ　　らは、Ｂｉｏｍｌｄｉｃａｌ　ａｎｄ　
Ｅｎｖ＋ｒｏｎｍｌｎｔａ１Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏ
ｍｌｔｒｙ　、第１４巻、６３−６８　（１９８７）の
中で、ヘロイン常用者の毛髪中のモルヒネの同定方法を
開示しており、この方法では毛髪をジエチルエーテルと
塩酸で処理し、次いで乾燥した抽出物をメタノール中に
溶解する。

旧ｇｕｃｈ　ｉ　　らは、Ｎａｔｕｒｅ、第３３２巻、
ｐ、　５４３　（１９８８）の中で、複雑な化学的抽出
法により消化物からＤＮＡを抽出するために、ジチオト
レイトーノペブロテイナーゼにおよび２％ドデシル硫酸
ナトリウムの作用によりｐＨ８にて毛髪を溶解せしめる
方法を開示している。

獣皮の製革用の脱毛剤に関連し、そして脱毛工程におけ
る幾つかの酵素（パパインを含む）の利用を開示してい
る幾つかの特許、例えば、米国特許第３．９８６．９２
９号、第３．９６６、５５１号、第３．９３９．０４０
号および第３．６２３．９５０号の存在も注目される。

〔発明が解決しようとする課題〕 しかしながら、前記および他の従来方法は上記に記載さ
れた理由でそして／または生物学的分析法の分析物プロ
ーブ（例えば抗体）を劣化させるため不利であることが
わかり、それによりそういった高感度の分析技術を使用
することができない。

従って、被検者の毛髪、指爪、足指爪および皮膚など身
体の角質化構造物から成る種の分析物を迅速に且つ完全
に可溶化でき、そして着目の分析物および／または生物
学的分析法の分析物プローブを破壊することなく、被検
者における分析物の使用または暴露の持続期間および分
析物の正体の直接分析を可能にする分析物検出方法に対
する要望が存在する。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の目的は、薬物および化学物質の検出方法を提供
することである。

本発明の別の目的は、薬物および化学物質の毛髪分析法
を提供することである。

本発明の別の目的は、頭髪および体毛並びに身体の他の
角質化構造物中の分析物を可溶化し、その正体を直接分
析し、そして適当であれば、被検者中の分析物の存続期
間および暴露の程度を測定する方法を提供することであ
る。

本発明の更にもう１つの目的は、分析物に損傷を与える
ことなく毛髪の内部コアから分析物を可溶化する毛髪分
析法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、非常に正確な生物学的分析法
の利用を実際上可能にするような信頼できる可溶化方法
および直接分析物検出方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、既知の毛髪分析法よりもずっ
と短時間で実施できる信頼できる毛髪分析法を提供する
ことである。

上記および他の目的は、新規角質化構造物分析法により
達成され、該方法は、低酸化還元電位化合物、例えばジ
チオトレイトール（ＤＴＴ）またはジチオエリトリトー
ル（ＤＴＥ）　、角質化構造物の溶解に適する酵素およ
び角質化構造物の試料を含有する混合物を調製し、ＤＴ
ＴまたはＤＴＥが角質化構造物および／または酵素を活
性化するのを可能にし；酵素が角質化構造物の試料を少
なくとも実質的に溶解して角質消化溶液を形成せしめる
のを可能にし；そして角質消化溶液の一部を分析にかけ
、存在するのであれば、角質化構造物試料中の分析物の
正体および量を検出する；ことを含んで成る。

好ましい角質化構造物は毛髪である。酵素は、ペプチダ
ーゼ、エンドペプチダーゼおよびプロテアーゼから成る
群から選択され得、好ましくはパパイン、キモパパイン
またはブロテイナーゼにである。分析過程を加速するた
めに、消化溶液に硫酸第二銅または亜ヒ酸す）　ＩＪウ
ム（Ｎａ２ＡｓＯ２）を添加し、混合物中の干渉する過
剰のジチオトレイトールまたはジチオエリトリトールを
不活性化することができる。好ましくは、可溶化された
分析物の分析はイムノアッセイのような生物学的分析法
により行われる。

〔作　用〕

本発明によれば、前に分析物に暴露されていた個体、例
えば分析物を摂取していた個体の頭髪もしくは体毛また
は他の角質化構造物がらの成る種の分析物の迅速且つ完
全な可溶化、次いで既知の生物学的分析用プローブ、例
えば迅速で且つ高感度のイムノアッセイによる分析物の
同定を可能にする方法が提供される。毛髪の内部からの
分析物の可溶化は、分析することになっている毛髪線維
の有機基質の内部にトラップされた分析物を損傷させる
ことなく達成され、そして生物学的分析法の逐次的利用
されるプローブ（例えば抗体）に影響することもない。

本発明に係る毛髪分析法は更に、血液または尿試料中の
分析物の程度を測定する従来の分析物検出法において必
要とされるような繰返し試験を行うことなく、長期間に
渡る被検者における過去の使用パターンの検出を可能に
する。

更に詳しくは、本発明は、毛髪または他の角質化構造物
試料を構成しているタンパク質の迅速な酵素消化、次い
で酵素および関連酵素／基質活性化剤（ＤＴＴおよびＤ
ＴＥ）の効果的不活性化を含んで成る。得られた毛髪消
化溶液中に可溶化された分析物は、既知の生物学的分析
用プローブにより、好ましくはイムノアッセイのような
高感度のタンパク質ベースの分析技術により分析され得
る。毛髪中にトラップされた分析物の量は摂取した分析
物の量に正比例することがわかった。

本発明によれば、角質化構造物、例えば毛髪試料を、特
定の分析物に暴露されているかまたは摂取していると疑
われる被検者から回収する。好ましくは、毛髪試料をま
ず既知の方法により洗浄し、実際の消費よりもむしろ外
的接触により毛髪表面に付着しているであろう分析物ま
たは他の薬物もしくは化学物質を除去する。次いで毛髪
試料を特定の酵素／基質活性化剤と共に特定の酵素によ
り処理し、ケラチンとして知られる毛髪線維の有機基質
の完全なまたは完全に近い溶解を達成させる。

次いて毛髪の有機基質内部に゛トラップ°′されている
目的分析物が溶液中に放出され、またはたとえタンパク
質が結合していたとしても、該分析物はタンパク質を基
礎にした分析法において使われる抗体を取得しやすい。

本発明の方法を充分に且つ正確に実施するために、角質
化構造物の完全な溶解が好ましい。

毛髪試料の溶解に好ましい酵素は、ペプチダーゼ、エン
ドペプチダーゼおよびプロテアーゼの酵素分類のもので
ある。最も活性であり、従って本発明における使用に好
ましいのは、パパイン、キモパパインおよびプロテア−
ゼに酵素である。

多くの他のプロテアーゼが低ｐＨＭ’（例え１ｆｐＨ７
−９）において本発明に従った方法に有効であることが
わかった。特に、プロテアーゼのタイプ■〔細菌性、ス
トレプトマイセス・セスピトサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）　由来〕、タイプ■
〔バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ）由来〕、タイプＸＩ　ＣブロテイナーゼＫ、
真菌性、トリチラキウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃ
ｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）由来〕、タイプＸｒＶ　［ブロ
ナーセ、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）由来〕タイ−ｊＸＶＩ
＜ハンラス・サブチリス由来）、タイプＸ■〔ニューラ
ーゼ、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種由来〕、クイツ
ブＸＩＸ　［アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ　５ｏｊａｅ）由来〕、タイプＸＸＩ（ストレ
プトマイセス・グリセウス由来）、タイプＸＸｒＶ（細
菌性）、タイプｘｘ■（ナガラーゼ）、タイプ■（プロ
ラーゼ）、タイプＸ（好熱性細菌プロテアーゼ、サーモ
ライシン）、およびタイプｘＸ■〔アスペルギルス・オ
リザエ（Ａｓｐｅｒｇ　＋　Ｉ　１ｕｓｏｒｙｚａｅ）
由来〕が有効である。

上記に記載したように、幾つかの当業界で知られる方法
は脱毛剤として使用するためのパパインの使用に備える
。これらの脱毛法は、そり落としくｓｃｒａｐｐｉｎｇ
）または他の機械的手段による容易な除去を可能にする
程充分に柔軟にすることにより獣皮または皮膚から毛髪
を除去し、そして安くあまり効果的でないスルフヒドリ
ル酵素とチオグリコール酸またはシスティンのような基
質活性化剤とを使用する。従って、これらの方法は部分
的にしか毛髪を分解せず、毛髪の完全な化学的溶解には
向かない。毛髪の単なる柔軟化は、分析物の検出のため
の毛髪分析を考慮に入れた方法において受は入れられな
かった。何故なら゛トラップされた”分析物の完全な放
出を獲得するためには完全なまたはほとんど完全な毛髪
溶解だけが受は入れられるからである。更に、これらの
脱毛法において使われるスルフヒドリル酵素は、抗体の
ようなある種の生物学的分析用プローブにとって有害で
ある。

これらの脱毛法と異なり、本発明の方法は、基質および
スルフヒドリル（ＳＨ）酵素活性化剤としてジチオトレ
イトール（”ＤＴＴ”または２゜３−ジヒドロキシブタ
ン−１，４−ジチオール）またはそれの異性体であるジ
チオエリトリトール（”ＤＴＥ”または２．３−ジヒド
ロキンブタン−１，４−ジチオール）を使う。驚（べき
ことに、ＤＴＴおよびＤＴＥが比較的短時間内で、例え
ば約３時間で毛髪を溶解させることができる高活性の酵
素をもたらし、毛髪消化溶液中への分析物の放出をもた
らすことがわかった。この酵素の高活性は、少なくとも
部分的には、ＤＴＴおよびＤＴＥによる角質化構造物基
質自体の活性化によるものであり、おそらく角質化構造
物中のジスルフィド結合の開裂におけるＤＴＴおよびＤ
ＴＥの作用により酵素のアタックを促進するためである
ことがわかった。

角質化構造物のタンパク質が完全にまたは少なくとも実
質的に溶解され、それにより溶液混合物中に分析物が放
出されたならば、抗体のような生物学的分析用プローブ
に分析物をかけるために酵素および酵素／基質活性化剤
を不活性化することが必要であることがわかった。何故
なら、酵素および酵素／基質活性剤は、前に記載したよ
うに、分析法に関与するタンパク質物質の構造的完全性
を妨害し得るからである。

パパインのようなスルフヒドリル（ＳＨ）−依存性酵素
を活性化する仕事は困難である。何故なら、毛髪消化段
階の後に酵素が放出された毛髪タンパク質および酵素／
基質活性化剤に存在しているスルフヒドリル基のパ海（
ｓｅａ）　’″の中に埋もれる′からである。既知のス
ルフヒドリル遮断剤は、分解された髪クンバク質および
ＤＴＴまたはＤＴＥと結合しがちであり、そして酵素の
活性を遮断するのに重要な酵素のスルフヒドリル部位に
必ずしも結合するとは限らないので、酵素を不活性化す
ることにおいて効果的でない。従って、酵素のスルフヒ
ドリル基がまだ活性であるならばタンパク質ベースの分
析法を効果的に利用することはできない。

驚くべきことに、ＤＴＴおよびＤＴＥは、酵素および／
または角質化構造物基質を活性化し、予想外に高い毛髪
消化活性を生じさせるだけてなく、酵素が毛髪タンパク
質の完全なまたはほとんど完全な溶解を果たした後で直
接的または間接的（酵素の自己不活性化）メカニズムに
より酵素を不活性化しようと自発的に作用することが発
見された。

典型的には、ＤＴＴまたはＤＴＥの酵素不活性化作用は
、酵素への暴露後約４〜５時間以内に起こり、これは酵
素が毛髪試料の溶解を果たすのに充分な時間の量である
。酵素は一度不活性化されれば、新しいＤＴＴまたはＤ
ＴＥへの暴露によって再び活性化したり復活したりでき
ないことがわかっている。

少なくともｉつかの非−スルフヒドリル依存性酵素、例
えばプロテイナーゼにの、阻害剤フェニルメチルスルホ
ニルクロライドによる不活性化は、該酵素がタンパク質
をベースにしたイムノア・ンセイ゛法に使われる抗体に
対して活性でないことがわかっているので通常必要とさ
れない。

毛髪消化溶液中に存在する活性なりＴＴおよびＤＴＥは
、暴露される他のタンパク質、例えばラジオイムノアッ
セイにおいて使われる抗体、の構造および活性に対する
危険要素となることもまたわかっている。従って、反応
混合物中のＤＴＴまたはＤＴＥが自発的に酵素を不活性
しようと働くだけでなくそれ自体が消化溶液中で自発的
に不活性化されることは更に驚くべき結果であった。典
型的には、ＤＴＴまたはＤＴＥの自発的不活性化は、酵
素への最初の暴露の一約１４時間後に紀こるが、これは
使用する酵素およびＤＴＴまたはＤＴＥの種々の濃度お
よび量、ｐＨ１温度、毛髪試料の量などに依存するであ
ろう。

このように、本発明の方法によれば、比較的短時間、例
えば−晩で完全な毛髪消化が達成でへ、そして放出され
た着目の分析物を含む毛髪消化溶液を翌朝タンパク質ベ
ースのりガントアッセイ分析法に有効に且つ正確に直接
かけることができる。

典型的には、毛髪試料の洗浄から分析物の同定までの全
方法は、約１６−２０時間もかからないであろう。−度
酵素およびＤＴＴまたはＤＴＥが毛髪試料と接触状態に
なれば、毛髪試料から分析物を放出させるのに、該方法
を行う個人による介入をほとんどまたは全く必要としな
い。

あるいは、スルフヒドリル基に富む毛髪消化溶液への硫
酸第二銅の添加がＤＴＴまたはＤＴＥのスルフヒドリル
基をより迅速に不活性化させる作用をすることが発見さ
れた。よって、毛髪試料の消化およびＤＴＴまたはＤＴ
Ｅによる酵素の不活性化後の毛髪消化混合物への少量の
硫酸第二銅の添加は、毛髪消化混合物を分析法にかける
ことができる時間を有意に加速する。というのは、溶液
への添加後約１４時間で起こるＤＴＴまたはＤＴＥの自
己不活性化を待つ必要がないからである。典型的には、
酵素が毛髪試料を溶解するのに充分な時間をもたせるよ
うに、酵素およびＤＴＴまたはＤＴＥを毛髪試料と接触
せしめてから約４〜５時間後に、約１００１ｄの硫酸第
二銅（１０ｍｇ／ｍｌ）が毛髪消化混合物ｌ−に添加さ
れる。

同様に、本発明において亜ヒ酸ナトリウム（ＮａＡｓ０
２）を利用して沈澱性化合物の形成により残りのＤＴＴ
またはＤＴＥを除去してもよい。典型的には、亜ヒ酸ナ
トリウムの１００ｍｇ／−溶液１００μ！を毛髪消化物
溶液１ｍｐに添加し、ＤＴＴおよびＤＴＥの不活性化を
行う。

トラップされた分析物を放出させるための迅速で且つ効
果的な毛髪の可溶化が前記のようにして達成されたなら
ば、次いで分析物混合物を当業界で知られているタンパ
ク質ベースの分析方法、例えばラジオイムノアッセイ　
（”Ｒ１Δ″°）による直接分析にかけることができる
。そのような方法は、ＲＩＡおよび関連するイムノアッ
セイまたはりガントアッセイが毛髪試料中に含まれる低
濃度の分析物を測定するのに必要な感度および簡便さを
有している現在唯一の既知の量産方法であるので、本発
明における適用に好ましい。これらの方法を使うことは
、ＲＩＡおよび他のタンパク質ペースの分析法による分
析にはわずか約０．５〜１．０［［１ｇの毛髪が必要で
あるため好ましい。実際、ある種の乱用薬物については
、長さが約１インチの１本または２本の毛髪はどで本発
明に係る方法による分析が効果的に実施できることがわ
かった。

タンパク質をベースにした分析法の代わりに、クロマト
グラフィー、マススペクトロメトリー等の機器手段を含
む別の分析法を利用することもてきろ。これらの分析法
はタンパク質ベースのものではないため、非タンパク質
ベースの分析技術を使う場合は酵素およびＤＴＴまたは
ＤＴＥの不活性化の段階は必要でない。しかしながら、
本発明に従った抽出方法の速度および穏やかさ並びに“
′スパイク（ｓｐｉｋｅ）°の混入、即ち既知量の分析
物の混入により抽出効率を定量できることで、目下開示
している抽出方法がガスクロマトグラフィーやマススペ
クトロメトリーなどの機器分析法の選択方法にもなる。

本発明に係る方法は、コカイン、モルヒネ／ヘロイン、
マリファナ、７エンシクリジンまたは“Ｐ　ＣＰ　”お
よびメタクワロンといった乱用薬物の使用または過去の
使用を検出するのに有効であることがわかった。更に、
本発明に係る方法は、ジゴキンンおよびアンフェタミン
のような指定薬物並びにニコチンのような毒性化学物質
の事前使用を調べるのに有効であることがわかった。個
体の血流中に存在し、そして毛髪の合成の間１こ毛髪に
運ばれるいずれの有機物質でも本発明の方法（こ従って
抽出されそして分析され得ることが予想される。

本発明に係る方法を実施する上で、約５０−２００ｍｇ
　／　１０−水のＤＴＴまたはＤＴＥ濃度が本発明にお
いて有効であることが示されたが、約１１０ｍｇのＤＴ
ＴまたはＤＴＥ／１０ｒｄの水の水性溶液を使うのが好
ましい。ＤＴＴまたはＤＴＥ対パパインまたはキモパパ
インの重量比は約１１０：２（酵素純度が１６−４０　
ＢＡＥＥ単位／ｍｇタンパク質である時）であるのが好
ましいが、約１１０　：　１〜約１１０　：　４の範囲
内のＤＴＴまたはＤＴＥ対パパインまたはキモパパイン
の重量比において効果的な結果が観察された。プロテア
−ゼにおよび他のプロテアーゼについては、ＤＴＴまた
はＤＴＥ対プロテイナーゼＫ（または他のプロテアーゼ
）の重量比が約１２００　：　１　　（酵素純度が１０
−２０単位／ｍｇタンパク質である時）であるのが好ま
しいが、約１２００　：０５〜約１２００　：　２の重
量比も有効であろう。

毛髪タンパク質の濃度は、好ましくは、その後に使用す
るタンパク質ベースの分析法において様々なマ）　ＩＪ
ソクス効果を防くように約１０ｍｇ毛髪／ｃｃ消化溶液
で一定に維持される。

毛髪の酵素的消化は、本発明によれば、低温および中性
付近のｐ＋＋にて行われるのが好ましい。この事につい
ては、酵素としてパパインまたはキモパパインを使う場
合には、約り０℃〜約４０℃の温度でそして約８８〜Ｉ
Ｏ３５のｐＨで該方法を行うのが好ましい。好ましくは
、ｐ＋＋が約８８〜９．５である。

最も好ましい態様においては、温度が約３７℃でありそ
してｐＨが約９．１である。

酵素としてプロテア−ゼＫまたは他のプロテアーゼを使
用する場合には、約２０〜４０℃および約７〜９のｐＨ
にて該方法を行うのが好ましい。最も好ましい態様にお
いては、温度が約３７℃でありそしてｐｌ＋が約７であ
る；この条件下で、特定の分析物を損傷する危険が最小
になる。中性条件下で毛髪を溶解する他の酵素には、プ
ロテアーゼのタイプＸｒＶ　（プロナーゼ）、タイプ■
、タイプ■、タイプＸＸ■（ナガラーセ）、タイプ×■
にューラセ）、タイプ××■、タイプＸＶＩ、タイプＸ
ＸＩおよびタイプＸＸＩＩＩが含まれる。

尿および血液分析のような他の利用可能な分析物検出方
法に対比して、本発明に係る方法は、ある期間に渡る分
析物への暴露の検出を可能にし、従って習慣的薬物使用
を検出する際に非常に有利である。毛髪は約０．３−０
．４＋＋＋ｎ＋／日または約１０１．３ｃｍ／月の速度
で成長することが知られているので、種々の長さの毛髪
断片を評価することにより、毛髪の長さと同じ位昔に遡
って消費または暴露を測定することが可能であり、そし
て高感度のタンパク質ベースの分析法を使うことにより
毛髪の小断片中に含まれる少量の分析物試料の分析が可
能になる。

区分分析により、本発明の方法は、最後の使用後数日か
ら数ケ月または数年にさえも及ぶ期間の間の薬物使用の
バクーンまたは他の物質の事前摂取の比較的不変の記録
および証拠を提出する。そのような暴露の経歴は、種々
の成長期間を表わす適当な毛髪小切片を分析することに
より、望み通り詳細に作られ得る。こうして、ある期間
に渡る事前使用およびそのような使用の程度が決定され
得る。

本発明における使用には、その長さおよび入手しやすさ
の点から頭髪が好ましいけれども、他のいずれの体毛で
も本発明の方法に使用することができる。従って、頭を
そることにより本発明の方法によるテストを回避するこ
とはほとんど不可能である。

しかしながら、パーマや毛染などの処理は本発明に係る
方法にかける毛髪の溶解速度を増加させ得る。ある場合
には、そのような処理のために、該方法を実施する前に
幾らか分析物が消失してしまうかもしれない。問題の毛
髪がそのように改質されている場合、消化速度の増加が
明らかになるので、既知の正常な毛髪溶解速度に基づい
て適当な補正因子を適用し得る。

幾つかの他の化粧品剤、例えば幾つかの柔軟剤は毛髪を
消化に対して耐性にさせ得る。そのような耐性は使用さ
れる酵素の量を増やすことにより克服できる。好ましく
は、そういった消化に対する耐性に遭遇する時は酵素と
してプロテイナーゼＫが使われる。

あるいは、体毛を使用することが不可能である場合、ま
たは毛髪の使用が望ましくない場合には、指爪、足指爪
および皮膚などの他の角質化組織を本発明に使用しても
よい。この事については、分析物を放出させるために指
爪および足指爪を溶解するのに必要とされるＤＴＴまた
はＤＴＥ対酵素の有効比率は、上記で検討したような毛
髪に用いるものとほぼ同じである。本明細書中に記載の
方法に従って指爪または足指爪試料が溶解されたならば
、所望の分析法により、放出された分析物が分析され得
る。

、本発明の別の観点によれば、驚くべきことに毛髪中に
含まれるメラニン粒子を酵素（好ましくはパパイン）　
、ＤＴＴまたはＤＴＥおよびエチレンジアミン四酢酸（
ＥＤＴＡ）の共同作用により溶解できることが発見され
た。後者は約５　ｍｇ　ＥＤＴＡ　／　ｍｌ消化溶液の
濃度である。ある種の分析物またはＰＣＰなどの乱用薬
物がメラニン粒子中に蓄積することが発見されたので、
毛髪の消化溶液中に存在する該粒子の溶解を果たすこと
により、該粒子中に含まれる分析物を同定できる。

本発明のこの観点によれば、上記のようにして毛髪消化
溶液を得、そして毛髪消化溶液から例えば遠心によりメ
ラニン粒子を回収する。次いでこのメラニン粒子をＥＤ
ＴＡ、酵素およびＤＴＴまたはＤＴＥと接触せしめメラ
ニン粒子から分析物を遊離させ、そして前記方法により
分析物を分析する。

本発明に係る方法の使用から得られる恩恵は多数ある。

本方法は特定の分析物への過去の暴露の迅速で且つ正確
な診断を提供する。問題の毛髪または角質化構造物分析
法は、非常に長期間に渡る消費または非消費の記録を提
供する。血液または尿分析の本当の意味を考える推測作
業は削除されるだろう。毛髪の収集は血液または尿の収
集よりも押しつけがましくなく且つ身体的に嫌悪を起こ
させることもな（、そして試料を変更または置換するこ
ともてきないし、予定されたテスト、例えば採用時テス
トまたは年１回の身体検査の前の短期間の慎みまたは“
洗浄（ｆ　ｌｕｓｉｎｇ）　”　（過剰な液体の摂取）
により検出をくぐり抜けることもてきない。試料は冷却
しないで無限に保存することができる。

本発明に係る方法は、角質化構造物、例えば毛髪の溶解
に有用であり、ＤＮＡのような天然に存在する毛髪の成
分の存在および構造を確かめるためにも利用することが
できる。

次の例は本発明の幾つかの観点を説明するものであり、
明細書および特許請求の範囲において示される本発明を
限定するものではない。

〔実施例〕

例１：毛髪試料からのコカインの抽出 コカイン常用者の疑いのある被検者からｌ０ｍｇの毛髪
を取り、そして３７℃にて３０分間水中で振とうするこ
とにより洗浄した。１０ｍ１！の蒸留水、１１０＋ｎｇ
のジチオトレイトール（２，３−ジヒドロキンブタン−
１，４−ジチオール、クリ−ランド試薬、Ｓｉｇｍａ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、
　＃ＪＯ，から入手）を添加した。ＤＴＴ溶液を撹拌さ
せながら１５％水酸化カリウムを滴加することにより溶
液のｐＨを９．１に調整した。８０ｄのタイプ■パパイ
ン溶液（パパイナーゼＥＣ３，４，２２，２）　（Ｓｉ
ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から入手、タンパク
質ｍｇ当り１６−４０８ＡＥＥ単位の活性）を添加しな
がら撹拌を続けた。該酵素溶液は酵素タンパク質３０ｍ
ｇ／ｍｌ！水の濃度であり、ここで酵素タンパク質１　
ｍｇは１６−４０８ＡＥＥ単位の活性を有する（Ｉ　Ｂ
ＡＢＥ単位は、ｐＨ６，２，２５℃にてｌ、　Ｑ　μｍ
ｏｌのベンゾイル−し−アルギニンエチルエステルナト
リウム塩を加水分解するだろう）。

１３Ｘ７５闘のポリカーボネート試験管中でこの溶液１
ｄに１０ｍｇの毛髪試料を添加した。この溶液を振とう
させながら３７℃の湯浴中で２時間インキュベートし、
そして振とうを止めて３７℃で一晩放置しておいた。溶
解した毛髪試料を含む溶液を２．００Ｏｒｐｍで遠心し
くＤａｍｏｎ　ＩＥＣモデルＣＲＵ　５，０００遠心機
）メラニン顆粒を除去した。ｌ　ｃｃの毛髪消化溶液に
１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ５，５）２００−Ｚを添加
した。

この溶液１００Ｉをコカイン（ベンゾイルエクゴニン等
価物、または’ＢＥＥ″′）の存在についてＲＩＡによ
りアッセイした。ＲＩＡ分析は８３．６ｎｇＢＥＢ／１
０ｍｇ毛髪を示した。

例２ニジチオエリトリトールの添加 例１に記載の消化およびアッセイ方法を使って例１の毛
髪試料を分析した。ただしジチオトレイトール（ＤＴＴ
）をジチオエリトリトール（ＤＴＥ）に置き換えた。試
料をＲＩＡによりアッセイすると、８２ｎｇのコカイン
／１０ｍｇの毛髪を示した。

例３：硫酸第二銅の添加 毛髪試料を湯浴中で４時間消化した後、例１に記載した
ようにして調製した毛髪消化溶液１ｍｌに１０ｍｇ／ｉ
の硫酸第二銅溶液１００１１’を添加した。この溶液を
３７℃で約３０分間振とうした後にリン酸緩衝液を添加
しそしてＲＩＡによりアッセ−ｆ　した。

毛髪消化溶液１００ＩｄをＲＩＡ分析にかけると、８５
、Ｑｎｇのコカイン（ＢＥＥ）　／　１０　ｍｇの毛髪
を示した。

例４：亜ヒ酸す）　ＩＪウムの添加 毛髪試料を湯浴中で４時間消化した後、例１に記載した
ようにして調製した毛髪消化溶液１艷に１００ｍｇ／ｍ
７！の亜ヒ酸ナトリウム溶液１００Ｉを添加した。この
溶液を３７℃にて３０分間振とうした。

ＲＩＡによるアッセイの前にＩＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
６，５）２００ｕを添加した。毛髪消化溶液１００＃を
ＲＩＡ分析にかけると、８２ｎｇのコカイン（ＢＥＥ）
／　１０　ｍｇの毛髪を示した。

例５ニジチオトレイトール（ＤＴＴ）による基質活性化 ＩＯＩＤｇの毛髪をｐＨ９，１にて２０時間の間１１ｍ
ｇのＤＴＴにａ露した。ＤＴＴ溶液を除去し、そして例
１に記載のＤＴＴおよびパパインで置き換えた。

ＤＴＴで前処理されずそして例１のようにして消化され
た対照の検体が１時間以内であるのに比べて、この毛髪
検体は１０分以内に溶解した。このことにより、ＤＴＴ
はスルフヒドリル−依存性酵素のパパインだけてな（、
酵素基質である毛髪も同様に活性化することが証明され
た。

例６　プロテア−ゼＫを使った毛髪の消化および分析 コカイン常用者の疑いのある被検者から１０ｍｇの毛髪
を取り、そして水中で３７℃にて６０分間振とうするこ
とにより洗浄した。１０ｍ１の０．０５Ｍ１［ス援衝液
（ｐＨ７，０）に６０ｍｇのジチオトレイトール（ＤＴ
Ｔ）および２（１ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ラウ
リル硫酸ナトリウム）を添加した。溶液がｐＨ７，０に
援衝化されたことを確かめるために溶液のｐＨをチェ７
クした。この溶液に０．５　ｍｇのプロテア−ゼＫ〔プ
ロテアーゼタイプＸＩ、 Ｔｒｉｔ＋ｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ由来、Ｓｉｇｍ
ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏから入手；酵素タンパク質
１ｎ＋ｇは１０−２０単位の活性を有する；１単位は、
３７℃、ｐＨ７，５にて１分間当り１μｍｏｌ　（１８
１ｆｆ）のチロシンに相当する発色をもたらすカセイン
を加水分解する（Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬
による発色）〕を添加した。

この溶液１ｍｌに１３Ｘ７５ｍｍのポリカーボネート試
験管中の毛髪試料１１０ｆｆ１を添加した。この溶液を
振とうしながら３７℃の湯浴中で１時間インキュベート
し、次いで振とうを止めて３７℃にて一晩放置しておい
た。溶解した毛髪試料を含む溶液を２．００Ｏｒｐｍで
遠心し、メラニン顆粒を除去した。ｌ　ｃｃの毛髪消化
溶液に１００ｐｌの硫酸第二銅（１０ｍｇ／ｍｌ）を添
加し、そしてこの溶液を３７℃にて３０分分間上うした
。次いでＩＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞を添加した
。

この溶液をＲＩＡによりコカイン（ペンゾイルエクゴニ
ン等価物、またはＢＥＥ）の存在についてアッセイした
。ＲＩＡ分析は３１．２ｎｇのＢＥＥ／１０ｍｇの毛髪
を示した。

ＤＴＴを削除したこと以外は例６に記載したのと同じ溶
液中で１０ｍｇの毛髪をインキュベートした。

２４時間の酵素暴露の間に毛髪の消化が全く起こらなか
った。それにより、基質活性化剤ＤＴＴによる毛髪試料
の酵素活性化の必要性が証明された。

例８：指爪の溶解 被検者から切り取った指爪試料１０ｍｇを得、そして洗
剤洗浄した。２２０ｍｇのＤＴＴを試験管中のｌ〇−の
水に添加し、そして例１のようにｐＨを９．１に調整し
た。次に１６０４のパパイン懸濁液を添加した。そして
この溶液１．０ｍｌを試験管中の１Ｏｎ＋ｇの切り爪に
加え、そして溶解するまで３７℃にて２４時間振とうし
た。次いて上記のようにして消化溶液をＲＩＡにより分
析した。

例９：区分分析の実施 ヘロイン常用者であると疑われる個体から長さ約５ｃｍ
の毛髪試料を得た。試料を注意深く３つの２ｃ［１１切
片に切り分け、対応する切片を３本の別々の試験管に加
えそして洗浄した。この毛髪試料を例１に記載の方法に
かけた。ただし酵素としてパパインの代わりにキモパパ
イン（ＥＣ３，４，２２，６）を使った。上記のように
して試料を一晩振とうさせた。

、ＲＩＡ分析は３つの切片において、それぞれ１３．５
．５．７およびＯｎｇ／１０ｍｇ毛髪のモルヒネ含量を
示した。

例１０：消化耐性毛髪の溶解 柔軟剤で処理されている毛髪１０ｍｇを例６に記載の溶
液中で一晩インキユベートした。この毛髪試料は通常の
２０時間では溶解しなかった。そこでより多い追加の量
のプロテイナーゼＫ、即ち１　ｍｇを、部分的に消化さ
れた試料に添加した。試料は次の２４時間内で溶解した
。消化物を遠心し、そして１００−’のＣｕＳ［］、溶
液（１０ｍｇ／ｍｌ）を１−〇上清に加え、これを３７
℃にて３０分分間上うした。次いてＩＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ７）２００＃を添加した。生じた消化物中に多量
のブロテイナーセ゛Ｋがあるため、プロテイナーゼ阻害
剤としてエタノール中のフェニルメチルスルホニルクロ
ライド２０ｓをｔ加した後ＲＩＡによりアッセイした。

Ｒ１Δ分析は７．４０ｇのコカイン（ＢＥＥ）　／　１
０　ｍｇの毛髪を示した。

現在本発明の好ましい態様であると思われるものを記載
してきたが、明細書中に記載されそして特許請求の範囲
で定義されるような本発明から逸脱することなく、上記
態様において示された成分、条件および比率において様
々な変更を行い得ることは当業者にとって明らかであろ
う。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被検者の角質化構造物の分析物の直接分析方法であ
   って、 （ａ）低い酸化還元電位を有する薬剤、角質の溶解に適
   当な酵素および角質化構造物の試料を含んで成る混合物
   を調製し； （ｂ）前記酵素が前記角質化構造物試料を少なくとも実
   質的に溶解することを可能にして角質消化溶液を形成せ
   しめ； （ｃ）前記角質消化溶液の一部を直接分析にかけ、存在
   するのであれば、前記角質化構造物中の分析物の正体お
   よび量を検出する； ことを含んで成る方法。 ２、前記角質化構造物が毛髪、指爪および足指爪から成
   る群から選択される、請求項１に記載の方法。 ３、前記低酸化還元電位薬剤がジチオトレイトールおよ
   びジチオエリトリトールから成る群から選択される、請
   求項１に記載の方法。 ４、前記角質化構造物を溶解した後そして角質消化溶液
   を直接分析にかける前に、前記溶液に硫酸第二銅および
   亜ヒ酸ナトリウムから成る群から選択された第二の薬剤
   を添加する段階を更に含んで成る、請求項１に記載の方
   法。 ５、前記酵素がペプチダーゼ、エンドペプチダーゼおよ
   びプロテアーゼから成る群から選択される、請求項１に
   記載の方法。 ６、前記酵素がパパイン、キモパパインおよびプロテイ
   ナーゼＫから成る群から選択される、請求項１に記載の
   方法。 ７、前記直接分析が生物学的分析用プローブにより行わ
   れる、請求項１に記載の方法。 ８、前記生物学的分析用プローブが抗体である、請求項
   ７に記載の方法。 ９、前記薬剤の濃度が約５０〜２００ｍｇ／１０ｍｌ水
   であり、そして前記薬剤対前記酵素の重量比が約１１０
   ：１〜約１１０：４である、請求項１に記載の方法。 １０、前記薬剤の濃度が約１１０ｍｇ薬剤／１０ｍｌ水
   であり、そして前記薬剤対前記酵素の重量比が約１１０
   ：２である、請求項１に記載の方法。 １１、前記酵素がプロテイナーゼＫであり、そして前記
   薬剤対プロテイナーゼＫの重量比が約１２００：０．５
   〜１２００：２である、請求項１に記載の方法。 １２、前記角質化構造物試料が約２０℃〜４０℃の温度
   および約８．８〜１０．５のｐＨで溶解される、請求項
   １に記載の方法。 １３、前記角質化構造物試料が約９．１のｐＨおよび約
   ３７℃の温度で溶解される、請求項１に記載の方法。 １４、前記角質化構造物試料が約８．８〜９．５のｐＨ
   で溶解される、請求項１に記載の方法。 １５、前記角質化構造物試料が約７〜９のｐＨおよび約
   ２０〜４０℃の温度で溶解される、請求項１１に記載の
   方法。 １６、前記角質化構造物が毛髪であり、そして前記試料
   が少なくとも１本の長い毛髪ストランドの一部分である
   ため、前記毛髪部分が成長した時間の長さに相当する与
   えられた時間における被検者の分析物の摂取を測定でき
   る、請求項１に記載の方法。 １７、前記酵素が、プロテアーゼのタイプIV〔細菌性、
   ストレプトマイセス・セスピトサス （￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｃａｅｓｐｉｔｏｓ
   ｕｓ）由来〕、タイプVIII〔バシラス・サブチリス（￥
   Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥￥ｓｕｂｔｉｌｉｓ￥）由来〕、タ
   イプＸ I 〔プロテイナーゼＫ、真菌性、トリチラキウ
   ム・アルブム（￥Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ￥￥ａｌｂ
   ｕｍ￥）由来〕、タイプＸIV〔プロナーゼ、ストレプト
   マイセス・グリセウス（￥Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ￥￥
   ｇｒｉｓｅｕｓ￥）由来〕、タイプＸVI（バシラス・サ
   ブチリス由来）、タイプＸVIII〔ニューラーゼ、リゾプ
   ス（￥Ｒｈｉｚｏｐｕｓ￥）種由来〕、タイプＸIX〔ア
   スペルギルス・ソヤエ（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ￥￥
   ｓｏｊａｅ￥）由来〕、タイプＸＸ I （ストレプトマ
   イセス・グリセウス由来）タイプＸＸIV（細菌性）、タ
   イプＸＸVII（ナガラーゼ）、タイプIII（プロラーゼ）
   、タイプＸ（好熱性細菌プロテアーゼ、サーモライシン
   ）、およびタイプＸＸIII〔アスペルギルス・オリザエ
   （￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ￥￥ｏｒｙｚａｅ￥）〕か
   ら成る群から選択される、請求項１に記載の方法。 １８、毛髪中の分析物の検出方法であって、（ａ）ジチ
   オトレイトールおよびジチオエリトリトールから成る群
   から選択された薬剤、毛髪の分解に適当な酵素並びに毛
   髪の試料を含んで成る混合物を調製し； （ｂ）前記酵素が前記毛髪試料を少なくとも、実質的に
   溶解することを可能にして毛髪消化溶液を形成せしめ；
   そして （ｃ）前記毛髪消化溶液の一部を直接分析にかけ、存在
   するのであれば、前記毛髪試料中の分析物の正体および
   量を検出する； ことを含んで成る方法。 １９、前記酵素がペプチダーゼ、エンドペプチダーゼお
   よびプロテアーゼから成る群から選択される、請求項１
   ８に記載の方法。 ２０、前記酵素がパパイン、キモパパインおよびプロテ
   イナーゼＫから成る群から選択される、請求項１８に記
   載の方法。 ２１、前記分析が生物学的分析用プローブにより行われ
   る、請求項１８に記載の方法。 ２２、前記生物学的分析用プローブが抗体である、請求
   項２１に記載の方法。 ２３、前記毛髪試料を溶解した後そして前記毛髪消化溶
   液を分析にかける前に、前記溶液に硫酸第二銅および亜
   ヒ酸ナトリウムから成る群から選択された第二の薬剤を
   添加する段階を更に含んで成る、請求項１８に記載の方
   法。 ２４、前記第二の薬剤が、前記毛髪試料の溶解開始の少
   なくとも４時間後に添加される、請求項２３に記載の方
   法。 ２５、前記毛髪試料が少なくとも１本の長い毛髪ストラ
   ンドの一部分であるため、前記毛髪の部分が成長した時
   間の長さに相当する与えられた時間における被検者の分
   析物の摂取を測定することができる、請求項１８に記載
   の方法。 ２６、毛髪中の分析物の検出方法であって、（ａ）ジチ
   オトレイトールおよびジチオエリトリトールから成る群
   から選択された薬剤、毛髪の溶解に適当な酵素並びに毛
   髪の試料を含んで成る混合物を調製し； （ｂ）前記酵素が前記毛髪試料を溶解するのを可能にし
   ； （ｃ）前記毛髪試料が溶解された後、前記混合物に硫酸
   第二銅および亜ヒ酸ナトリウムから成る群から選択され
   た第二の薬剤を添加し；そして（ｄ）前記毛髪消化溶液
   の一部を直接分析にかけ、存在するのであれば、前記毛
   髪試料中の分析物の同定および量を測定する； ことを含んで成る方法。 ２７、前記酵素がペプチダーゼ、エンドペプチダーゼお
   よびプロテアーゼから成る群から選択される、請求項２
   ６に記載の方法。 ２８、前記酵素がパパイン、キモパパインおよびプロテ
   イナーゼＫから成る群から選択される、請求項２６に記
   載の方法。 ２９、前記分析が生物学的分析用プローブにより行われ
   る、請求項２６に記載の方法。 ３０、前記生物学的分析用プローブが抗体である、請求
   項２９に記載の方法。 ３１、前記薬剤の濃度が約５０〜２００ｍｇ／１０ｍｌ
   水であり、そして前記薬剤対前記酵素の重量比が約１１
   ０：１〜約１１０：４である、請求項２６に記載の方法
   。 ３２、前記薬剤の濃度が約１１０ｍｇ薬剤／１０ｍｌ水
   であり、そして前記薬剤対前記酵素の重量比が約１１０
   ：２である、請求項２６に記載の方法。 ３３、前記毛髪試料が約２０℃〜４０℃の温度および約
   ８．８〜１０．５のｐＨで分解される、請求項２６に記
   載の方法。 ３４、前記毛髪試料が約９．１のｐＨおよび約３７℃の
   温度で分解される、請求項２６に記載の方法。 ３５、前記毛髪試料が少なくとも１本の長い毛髪ストラ
   ンドの一部分であるため、前記毛髪の部分が成長した時
   間の長さに相当する与えられた時間における被検者の分
   析物の摂取を測定することができる、請求項２６に記載
   の方法。 ３６、メラニン顆粒中の分析物の検出方法であって、 （ａ）ジチオトレイトールおよびジチオエリトリトール
   から成る群から選択された薬剤、メラニン顆粒を含む毛
   髪の溶解に適当な酵素並びに毛髪の試料を含んで成る混
   合物を調製し； （ｂ）前記酵素が前記毛髪試料を実質的に溶解するのを
   可能にしてメラニン顆粒を含む毛髪消化溶液を形成せし
   め； （ｃ）前記毛髪消化溶液から前記メラニン顆粒を分離し
   ； （ｄ）前記薬剤、毛髪の溶解に適当な酵素、エチレンジ
   アミン四酢酸および前記メラニン顆粒を含んで成る第二
   の混合物を調製し； （ｅ）前記メラニン顆粒の溶解を可能にし；そして （ｆ）前記第二の混合物を分析にかけ、存在するのであ
   れば、メラニン顆粒中の分析物の正体および量を検出す
   る； ことを含んで成る方法。 ３７、前記酵素がパパインおよびキモパパインから成る
   群から選択される、請求項３３に記載の方法。 ３８、前記分析がイムノアッセイ法により行われる、請
   求項３３に記載の方法。