JPH0430810B2

JPH0430810B2 -

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Publication number: JPH0430810B2
Application number: JP62199147A
Authority: JP
Priority date: 1987-08-11
Filing date: 1987-08-11
Publication date: 1992-05-22
Also published as: JPS6443138A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上利用分野〕本発明は、木本性植物のプロトプラストから植
物体を再生する方法に関し、更に詳しくは、通常
の単独培養法では植物体に再生することが不可能
な種類の木本性植物のプロトプラストから、植物
体を再生する方法に関するものである。従つて、
本発明を応用することによつて単細胞から胚葉体
を作出する大量生産技術の開発が可能となる。さ
らに、変異体作出技術として重要な遺伝子組換え
および細胞融合によつて新規な植物体を創成しう
る可能性が生まれた。〔従来の技術〕植物細胞より作出したプロトプラストは細胞壁
を有しないために、細胞融合処理あるいは有用な
遺伝子等の導入が可能である。このようなプロト
プラストから植物体を再生することが可能になれ
ば、これまでになかつた全く新しい植物だけでな
く、我々人類の使用目的に合致した、例えば農作
物の場合には、収量の高い、味の良い、さらには
病虫害や気象害にも耐えることが可能な新種を作
り出すことが出来るようになる。これまでに、葉や茎等の植物の組織を酵素液等
で処理して得たプロトプラストから植物体を再生
する技術は、タバコやペチユニア、その他多くの
草本性植物で確立されつつある。しかしながら、
木本性植物においてはトロビタオレンジ（小林省
蔵等「育種学雑誌」34巻（別２）、32〜33、1984、
特開昭61−192283号公報）、コウゾ（岡成美、大
山勝夫「育種学雑誌」34巻（別２）26〜27、
1984）、本発明者等はポプラの例（伊藤一弥等、
特願昭61−64800号、Russell，Ｊ，A. and B.H.
McCown，Plant Sci，46，133−142，1986）、
Sandalwood（Rao，P.S.and P.Ozias−Akins，
Protoplasma，124，80−86，1985）、ニレ
（Sticklen，M.B.et al.Plant sci，47，29−34，
1986）など少数しか例がない。その原因として、植物組織から得られたプロト
プラストの場合、培養過程で培地の中に排出され
るポリフエノール等の物質や、プロトプラストの
凝集がその生存、分裂に阻害的に働いて、植物の
再生にまで至らなかつたことが挙げられる。このために最近では、プロトプラストの凝集回
避のために液体培地に代わつて固形培地を使用し
たり、未熟胚あるいは未熟種子等を材料に用い
て、より分化能の高いカルスを作出した後、これ
からプロトプラストを単離して培養しているが、
それでもまだ前記のように特に木本性植物におい
て完全な植物体を得た例は極めて少数のものしか
ない。従つて、本発明者等はこれらの問題点を解決し
て、プロトプラストから容易に木本性の植物体を
再生する方法について研究を重ねた結果、本発明
を完成させるに至つた。〔発明が解決しようとする問題点〕本発明は、木本性植物のプロトプラストに、プ
ロトプラストの分裂率の高い種類の草本性植物の
プロトプラストを培養の初期に共存させて、単独
のプロトプラストからでは植物体の再生が困難な
種類の木本性植物のプロトプラストから植物体を
再生させることを目的とする。〔問題点を解決するための手段〕本発明は、木本性植物のプロトプラストを草本
性植物のプロトプラストの共存下に培養した後分
化させることを特徴とする木本性植物のプロトプ
ラストから植物体を再生する方法である。本発明に使用する植物の種類は特に限定される
ものではないが、草本性植物の種類として、ケナ
フ、タバコ、ベチユニア等、一方、再生の目的と
する木本性植物として、ユーカリ、マングロー
ブ、アカシア、パラゴムノキ、コーヒー等の常緑
広葉樹類、ポプラ、キリ、コナラ、クヌギ、ウル
シ等の落葉広葉樹類、マツ、スギ、ヒノキ、モ
ミ、トウヒ、カラマツ等の有用針葉樹類、さらに
ミカン、ブドウ、イチジク、アーモンド、マンゴ
ウ等の果樹類や、バラ、ウメ、ツバキ、サクラ等
の花木類等である。以下、本発明に用いるカルスおよび苗条の作出
方法、プロトプラストの単離・調整方法、そして
プロトプラストの培養培地、ならびに培養条件等
について詳しく説明する。カルスおよび苗条の作出方法木本性植物、草本性植物の種子を殺菌した後、
植物の組織培養培地、例えばガンボーグ（Gam
−borg）のB5倍地、あるいはムラシゲ・スクー
グ（Murashige・Skoog）のMS倍地等の寒天培
地上にそれぞれに置床し、発芽させる。次に、生長した葉、茎、根の部分を切り取つて
B5倍地、MS倍地等に植物ホルモン類、例えばナ
フタレン酢酸（NAA）、２，４−ジクロロフエ
ノキシ酢酸（２，４−Ｄ）あるいはインドール酢
酸（IAA）等のオーキシン類およびベンジルア
デニン（BA）、カイネチン、KT−30あるいはゼ
アチン等のサイトカイニン類を添加した寒天倍地
に置床、あるいは挿木をする。これを20〜30℃の温度、2000〜5000ルクスの照
度で培養を行つて、カルスあるいは苗条を得る。また、木本性植物の場合には、茎を滅菌した後
形成層に達するまで環状剥皮をして、前記同様に
寒天倍地に挿木を行い、苗条を得る方法も可能で
ある。プロトプラストの単離・調整方法上記の方法で得たカルスあるいは苗条を材料
に、細胞間物質であるペクチンを分解する酵素と
してペクトリアーゼＹ−25、細胞壁を分解する酵
素としてセルラーゼ・オノズカRS、およびマニ
トールを含む酵素液を加えて、20〜30℃の温度で
６〜24時間、20〜30rpmの振盪速度で振盪処理し
てプロトプラストを単離する。次に、酵素液を除
いてプロトプラストを洗浄、遠心処理をしてプロ
トプラストを調整する。プロトプラストの混合酵素処理後、単離・調整して得た再生する目的
の木本性植物のプロトプラストと、これと共存さ
せて培養する草本性植物のプロトプラストを10⁴
ないし10⁵コ／mlの濃度に調整する。次に、両プロトプラストの混合割合を１：３〜
３：１の割合で混合して、植物の組織培養培地、
例えばカンボーグのB5倍地、ムラシゲ・スクー
グのMS倍地等をプロトプラストの性質に応じて
選択した後、植物ホルモン類、例えばナフタレン
酢酸（NAA）、２，４−ジクロロフエノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）、インドール酢酸（IAA）等の
オーキシン類またはベンジルアデニン（BA）、
KT−30、カイネチン、ゼアチン等のサイトカイ
ニン類を添加した寒天倍地あるいは液体培地で培
養する。プロトプラストの培養方法プロトプラストの培養は単離・調整したプロト
プラストを上記の組織培養培地で行う。しかしな
がら、さらに有効な方法として上記の組織培養培
地および植物ホルモン類の他にプロトプラストを
培養容器の中で支持するための支持体剤として
「ジエライト」を0.001〜0.05％の濃度範囲で添加
する方法がある。培養条件は初期は暗所で培養
し、プロトプラストの生育に伴つて徐々に明るく
するのが好適である。また、培養期間中の温度と
しては20℃ないしは30℃が好ましいが、特に25℃
ないし28℃の間の温度が好ましい。寒天培地による方法は、加温して溶融させた培
地に、別に調整したプロトプラストを添加、混合
し、温度の低下に伴つて固化していく培地の中
に、浮遊状態で固定して培養するものである。こ
の場合に、プロトプラストを加温状態の培地に入
れることはプロトプラストのその後の生存、生育
にとつて悪影響を及ぼす。また、液体培地で培養する場合にも、ポリフエ
ノールによる害作用を回避する必要があるだけで
なく、液体培地中に浮遊しているプロトプラスト
が凝集して、分裂や生存が阻害されるので、これ
を回避することが必要である。本発明において使用した「ジエライト」
（「GELRITE」、Kelco社製など、アメリカ）は、
細菌の一種であるPseudomonas elodeaが菌体外
に放出する多糖類を主成分とするもので、これを
低濃度で液体培地に添加することにより、培養容
器の底部にゲル化したジエライトの層が形成さ
れ、これにプロトプラストが接着、支持される。このために、培地液を交換する場合にもプロト
プラストはジエライト層に接着されて、培地液と
共に流出することなく交換を行なうことができ
る。このようにして植物体の再生を目的とする木
本性植物のカルスが形成される。植物体の再生方法プロトプラストを共存培養して得たカルスを、
苗条の再生する培地、例えばガンボーグのB5倍
地、ムラシゲ・スクーグのMS倍地等に植物ホル
モン類として、例えばナフタレン酢酸（NAA）、
２，４−ジクロロフエノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、
インドール酢酸（IAA）等のオーキシン類およ
びベンジルアデニン（BA）、KT−30、カイネチ
ン、ゼアチン等のサイトカイニン類を添加したも
のを用いることによつて容易に苗条を再生させ、
さらに発根させることが可能である。このように
して完全な植物体がプロトプラストから再生され
る。以下、実施例によつて本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。〔実施例〕供試植物再生させることを目的とする木本性植物とし
て、ポプラ（Populus charkowiensis×P.
caudina、OP−20）を、またこれと共存培養す
る草本性植物としてケナフ（Hibiscus
sabdariffa）を使用した。ポプラの苗条作出方法ポプラ成木の茎を70％エタノールで５分間殺菌
した後、無菌的に長さ約２cmに切断し、形成層に
達するまで表皮をむき、これを表−１に示す植物
の組織培養倍地であるガンボーグのB5倍地に植
物ホルモンとしてナフタレン酢酸を0.01mg／、
KT−30を0.02mg／の割合で添加し、PHを5.6に
調整した寒天倍地（寒天0.6％添加）に挿木をし
た。これを28℃の温度、3000ルクスの照度で培養
した。

【表】培養開始後、約40日で多数の不定芽形成を認
め、さらに培養して約１〜２cmの苗条を得た。な
お、この挿木をした茎は、新鮮な倍地に植え継ぎ
をすることで苗条の再生を繰り換し行うことが可
能である。ケフナのカルスの誘導ケナフの種子を70％エタノールおよび10倍に希
釈したアンチホルミン液で殺菌した後、無菌的に
植物の組織培養倍地であるガンボーグのB5倍地
にシヨ糖３％を加えた寒天倍地上で発芽させ、茎
項を含む茎を長さ約１cmに切断し、これをB5倍
地に植物ホルモンとして２，４−ジクロロフエノ
キシ酢酸２mg／、ベンジルアデニンを0.01mg／
の割合で添加した寒天倍地上に置床した。これ
を28℃の温度、3000ルクスの照度で培養した。培養開始後、約40日で黄白色のカルスを得た。
これをプロトプラストの単離・調整用の材料とし
た。プロトプラストの単離・調整上記の方法で得られたポプラの苗条およびケナ
フのカルス各１ｇに対して、各々20mlの酵素液
（１％セルラーゼ・オノズカRS、0.1％ペクトリ
アーゼＹ−23、13％マニトール、PH5.6）を加え
て20〜30℃の温度、振盪回数20〜30rpmで６〜24
時間の酵素処理を行つて、両植物のプロトプラス
トを別々に単離した。処理後、プロトプラスト懸
濁液をナイロンメツシユで過して末消化の細胞
塊等を除き、さらに遠心分離処理をして酵素液と
プロトプラストを分離し、洗い液（13％マニトー
ル、50mM CaCl₂）で２回洗浄した後に培養に供
試した。プロトプラストの培養と植物体の再生法プロトプラストの培養培地は、表−１に示した
ガンボーグのB5倍地において、マニトール以外
のものについて２倍濃度のものを調整し、一方、
９％のマニトール液（PH5.6）に0.05％の割合で
ジエライトを加えたジエライト液を調整し、両者
をオートクレープする。十分に液が冷えた後に、
ジエライト液にポプラとケナフのプロトプラスト
を３：１（ポプラ３、ケナフ１）の割合で混合し
たものを10⁵コ／ml濃度になるように懸濁せしめ
た。この混合したプロトプラスト懸濁液と前記培
養倍地とを１：１の割合で混合して、直径６cmの
シヤーレにプレートした。なお、プレートする量
は１シヤーレ当たり２mlとした。プレートしたプロトプラストを最初は暗条件で
培養し、プロトプラストの分裂に合わせてマニト
ールの濃度を培養開始後15日で６％、40日で３
％、50日で０％の順に下げ、一方シヨ糖は３％に
上げて温度は28℃で培養した。培養後、約30日目から明条件として、約50日目
からは表−１に示すガンボーグのB5倍地にNAA
を0.02mg／、BA0.2mg／、シヨ糖を３％加え
たものに寒天を0.6％加えて固めた苗条再生培地
に、目的の植物であるポプラのコロニーのみを取
り出し、移植した。これを28℃で16時間の日長条
件で培養した。苗条再生培地に移植して約30日後に苗条が再生
し、これをさらに表２に示した発根用の培地に移
植して同様の条件で培養したところ、発根して植
物体が再生された。この発根した植物体の状態を第１図に示す。

【表】〔発明の効果〕以上説明したように、これまでは植物、特に木
本性植物の組織から単離・調整したプロトプラス
トから植物体を再生することは極めて困難であつ
たが、木本性植物のプロトプラストに分裂活性の
高い草本性植物のプロトプラスト、あるいは植物
体再生をする能力のある草本性植物のプロトプラ
ストと混合して培養することによつて、容易に植
物体を再生させることが可能になり、植物の新品
種の創成にに極めて有力な方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ポプラのプロトプラストとケナフの
プロトプラストを共存培養して再生されたポプラ
のプロトプラストからの植物体を示す写真であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１木本性植物のプロトプラストを草本性植物の
プロトプラストの共存下に培養した後分化させる
ことを特徴とする木本性植物のプロトプラストか
ら植物体を再生する方法。２木本性植物および草本性植物のカルス、ある
いは苗条をそれぞれ単独に酵素処理してプロトプ
ラストを単離し、得られた両種類のプロトプラス
トを一定の割合で混合して無機塩類組成物、プロ
トプラストの支持体制および植物ホルモンを含む
人工液体培地の中で、20〜30℃の温度条件で培養
し、プロトプラストが生育分裂したカルス（細胞
塊）を形成させ、木本性植物のカルスのみを再分
化培地に移して苗条を再生させ、かつ発根させて
植物体を再生する特許請求の範囲第１項記載の方
法。３木本性植物のプロトプラストと草本性植物の
プロトプラストの混合割合が１：３〜３：１であ
る特許請求の範囲第１項または第２項記載の方
法。