JPH0430960B2 - - Google Patents

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JPH0430960B2
JPH0430960B2 JP59122967A JP12296784A JPH0430960B2 JP H0430960 B2 JPH0430960 B2 JP H0430960B2 JP 59122967 A JP59122967 A JP 59122967A JP 12296784 A JP12296784 A JP 12296784A JP H0430960 B2 JPH0430960 B2 JP H0430960B2
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は牛の脳から単離された、創傷の治癒を
促進するのに役立つ成長因子に関するものであ
る。分画塩析、イオン交換、ゲル濾過、等電点電
気泳動、C4逆相HPLカラムによる疎水性クロマ
ドクラフイの組み合わせにより、酸性繊維芽細胞
成長因子は少なくとも35000倍、見掛け上単一に
まで精製された。分子には見掛けの分子サイズが
16600と16800ダルトンである２つの微小不均一形
が存在した。 脳の抽出液に繊維芽細胞の細胞分裂を誘起する
活性があることは40年以上も前に、Trowellら、
（1939）J.Exp.Biol.16，60−70およびHoffmann
（1940）Growth，４，361−376により見出され
た。脳由来の成長因子を単一にまで生成したと報
告したのはGospodarowicaら（第３回成長ホル
モンと関連ペプチドに関する国際シンポジウム
（1975年９月17−20日、ミラノ、イタリー、
Excerpta Medica／Elsevier，NewYork，
pp141−165、J.Biol.Chem.253、37363−3743）
で、彼等の種々の分裂促進活性とその標的細胞に
ついて記載している（Gospodarowiczら、
（1975）Adv.in Metabolic Disoroders Luft，R.
＆ Hall、K.編（Academic Press，New
York）第８巻、301−355）。牛脳ホモジネートの
粗抽出液から約1000倍にまで精製した後、活性蛋
白質すなわち繊維芽細胞成長因子（FGF）がミ
エリン塩基性蛋白質の３種の蛋白分解フラグメン
トであるという報告がなされた（Westallら、
（1978）Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 75，4675−
4678）。ミエリン塩基性蛋白質は多くの脳および
抹消神経を囲んでいるミエリン鞘の鋼製物質であ
る。マイトジエン（分裂促進因子）がミエリン塩
基性蛋白質の分解産物であるとの同定は論議を巻
き起こし（Thomasら、（1982）J.Biol.Chem.255
5517−5520、Lemmonら、（1982）J.Cell Biol.
95 162−169）、最終的にはミエリン塩基性蛋白
質はこれらの標品における主な蛋白質種ではある
が活性マイドジエンではないことが確認された。 本発明は酸性法繊維芽細胞成長因子を35000倍
にまで精製する方法およびこの蛋白質の特性を提
供するものである。 さらに本発明は、新規の成長因子を活性成分と
して含む医薬組成物、このような治療を必要とす
るほ乳動物（人間を含む）に新規の成長因子を投
与して治療する方法を提供するものである。 本発明の新規成長因子は、分子サイズが16600
と16800ダルトンである２つの微小不均一形とし
て存在する実質的に単一にまで精製された酸性脳
繊維芽細胞成長因子であつて、そのアミノ酸組成
物は表に示すものである。 表 アミノ酸 単位 アスパラギン酸 アスパラギン 14 スレオニン ９ セリン 10 グルタミン酸 グルタンミン 16 プロリン ７ グリシン 14 アラニン ５ システイン ４ バリン ５ メチオニン １ イソロイシン ６ ロイシン 19 チロシン ７ フエニルアラニン ７ ヒスチジン ５ リシン 13 アルギニン ６ トリプトフアン １ BALB／ｃ 3T3細胞に対する細胞分裂促進活性
の１単位、すなわちDNA合成促進の最大値の２
分の１にまで促進するのに必要な精製蛋白質量は
成長因子40pg／m1に相当する。 本発明の酸性脳繊維芽細胞成長因子は牛の脳か
ら単離されたものであるが、同一あるいは実質的
に同一の成長因子はヒトを含めた他のほ乳類の脳
からも単離できるであろう。本発明における酸性
脳繊維芽細胞成長因子の上記ほ乳動物組織から単
離する新規なプロセスは以下の工程からなる。 １ 原料組織からの抽出および分別塩析 ２ イオン交換 ３ ゲル濾過 ４ イオン交換 ５ 等電点電気泳動 ６ 疎水性逆相クロマドクラフイ 抽出および分別塩析は、順番に0.15M硫酸アン
モニウム（PH4.5）、1.52M硫酸アンモニウム（PH
6.75）、3.41M硫酸アンモニウム（PH6.75）で処理
して行なつた。次いで高い塩濃度における沈殿物
を透析し、凍結乾燥した。 イオン交換のステツプはカルボキシメチル−セ
フアデツクス（フアルマシア）樹脂にPH６でバツ
チ吸着させ、次いで0.15Mの塩化ナトリウムを含
む0.1Mリン酸ナトリウムバツフア、0.60Mの塩
化ナトリウムを含む0.1Mリン酸ナトリウムバツ
フアで順に溶出し、0.60M塩化ナトリウムで溶出
してきた画分を透析し、凍結乾燥した。 ゲル濾過のステツプはセフアデツクスＧ−75
（商品名、フアルマシア社製）カラムを用いて行
ない、0.1M重炭酸アンモニウム（PH8.5）で溶出
した。もつとも活性の高い画分を集め凍結乾燥し
た。 ２回目のイオン交換のステツプはカルボキシメ
チル−セルロースカラムに0.1Mギ酸アンモニウ
ム（PH6.0）を用いて吸着させ、0.2Mおよび0.6M
のギ酸アンモニウム（PH6.0）で順次溶出した。
活性区分をプールして凍結乾燥した。 等電点電気泳動はウルトロデツクス（商品名、
LKB社製、メリーランド USA）内で行なつ
た。疎水性逆相高速液体クロマトグラフイによる
酸性分裂促進因子の精製はバイダツクC4シリカ
ベースHPLCカラム（The Separation Group社
製、カリホルニア、USA）を用いて行なつた。 実施例 ステツプ１：抽出および塩析 牛の脳は地方の屠殺場から入手し、氷詰めにし
て運んだ。目に見える血の塊と脳髄のの外膜は構
成血管とともに除いた。脳は２cm角に角切りにし
液体窒素中で急速凍結して−70℃で保存した。溶
液はすべて蒸留水を用いて調製し、PHはその使用
温度において標準液に対して校正した。全工程は
特に記載しない限り４℃で行なつた。 ４Kgの組織（約12個の成牛の脳）を４の
0.15M（NH4）2SO4溶液中で解凍し、ワーリング
ブレンダーでホモジナイズした後、6NHClを用
いて直径６インチ（18cm）のプロペラ撹拌機で勢
いよく撹拌しながらPHを4.5に調整した。１時間
後、ホモジネートを13800xgで40分間遠心して、
上清をとり、PHを1MHaOHを用いて6.75に調整
した後、撹拌しながら200ｇ／の（NH4）2SO4
（1.25M）を徐々に加えた。13800xgで30分間遠心
した後、上清１あたり250ｇの（NH4）2SO4
（3.41M）を加えた。混合液を再度遠心し、生じ
たペレツトをとり、200mlの水に溶解し、分画範
囲6000−8000Mrの透析チユーブ（スペクトラム、
メデイカル インダストリーズ、ロサンジエル
ス）に入れて14の水に対して透析した後、凍結
乾燥した。 ステツプ２：カルボキシメチルセフアデツクスク
ロマトグラフイ 16Kgの脳の塩析物から得た凍結乾燥蛋白質を
900mlの0.05Mリン酸ナトリウム（PH6.0）溶液に
溶解し、混合物を1NNaOHでPH6.0に再調整し、
23300xg 30分の遠心により清澄化した。上清を
0.1Mリン酸バツフアーで平衡化した水和カルボ
キシメチルセフアデツクスＣ−50（商品名、フア
ルマシア社製、ニユージヤージー、USA）800ml
と15分間撹拌した。吸着しなかつた蛋白は荒い焼
結ガラスフイルターで吸引して除き、樹脂を３
の0.1Mリン酸バツフアーで洗浄した後、直径8.3
cmのカラムに充填した。蛋白質は、流速30ml／
minで0.15Mおよび0.6Mの塩化ナトリウムを含む
0.1Mリン酸バツフアーで順次溶出させた。
0.6MNaClで溶出した蛋白質のピークを回収した
もの約500mlを、6000−8000Mr（分画分子量）の
透析チューブに入れ、14の水に対して18時間透
析し、その後凍結乾燥した。 ステツプ３：Ｃ−50カラムで得られた蛋白質の４
分の１に20mlの0.1M中炭酸アンモニウム溶液
（PH8.5）に溶解し、27000xgで15分遠心して清澄
化したのちセフアデツクスＧ−75（40−120μm粒
径）のカラム（5x90cm）により、流速74ml／hr
で、１フラクシヨン17.5mlで分画した。最も活性
の高い画分（約875mlから1050mlの溶出液）をプ
ールし凍結乾燥した。 ステツプ４：カルボキシメチル セルロース ク
ロマトグラフイ セフアデツクスＧ−75カラムで得られた蛋白質
を10mlの0.1M重炭酸アンモニウム（PH6.0）に溶
解し、PHをギ酸でPH6.0に調整した。27000xg、15
分の遠心で清澄化し上清をCM52カルボキシメチ
ルセルロース（ワツトマン、Clifton，N.J.）の
カラム（1.5x6.5cm）に負荷した。蛋白は0.2Mの
ギ酸アンモニウム溶液を用い、流速10ml／minで
溶出し、清澄因子は0.6Mギ酸アンモニウム（PH
6.0）で溶出された。活性画分を合し、直接凍結
乾燥した。 ステツプ５：等電点電気泳動 上記の蛋白標品をウルトロデツクス（商品名、
Geithersburg社製、メリーランド、USA）内で、
縮小した泳動レーンを有する改良型LKBマルチ
フオフラツトベツドフオーカシングプレート（商
品名、LKB社製）を用い、等電点電気泳動を行
なつた。通常等電点電気泳動は0.5x10cmのレーン
を３つ有するプレート上で行ない、各レーンには
126μlのPH３−10フアルマライト（商品名、フア
ルマシア社製）と47μlのPH９−11アンフオライン
（商品名、LKB社製）を含む1.9mlの水に懸濁し
た75mgのウルトロデツクスを入れた。液体は重
量で32％を蒸発させた。FGFサンプルあるいは
チトクロームｃとヘモグロビン（シグマ社製、ミ
ズーリ、USA）の各1mgを、上述のアンフオラ
イト希釈液100μlに加えて、チヤージした。電流
の安定性、チトクロームｃ、ヘモグロビンの位置
をモニターすることによつてPH勾配が平衡に達し
たことを確認した。ゲルを10個の１cm幅にスライ
スし、各切片を1μmポアサイズの再生セルロース
RC−60フイルター（Bioanalytic Systems Inc.
社製、インデイアナ、USA）の入つたMF−１ミ
クロフイルトレーシヨンチユーブ中で333μlの
0.6MNaClとともに200xgで５分間の遠心を３回
繰り返すことにより溶出を行なつた。各1mlの溶
出液のPHは０−５℃の標準液を対照として測定し
た。 ステツプ６：逆相HPLCクロマトグラフイ 最終的な精製は、前以てC18調製用逆相HPLC
を通してUV吸収夾雑物を除いた10mMトリフル
オロ酢酸で平衡化したVydacC4（シリカベース
HPLCカラム（4.6×50mm）（The Separation
Group社製）で行なつた。等電点電気泳動のゲル
から溶出させた細胞分裂促進活性のある酸性画分
（PH＝５−７）を直接カラムに注入した。カラム
は０−67％のアセトニトリル勾配で展開し、活性
画分は約30−35％アセトニトリルで溶出してき
た。 細胞分裂促進活性測定 BALB／c3T3 A13繊維芽細胞（アメリカン
タイプカルチヤー コレクシヨン）を、Thomas
ら（J.Biol.Chem.5517−5520（1980））の方法に従
つて直径35mmのウエルあたり2x104細胞をまき、
７％CO2（PH7.35±0.05）でインキユベートした。
インキユベート６時間後に培地を0.5％熱非働化
子牛血清に置換し、さらに24時間後もう１度同じ
0.5％血清で置換することにより細胞は完全に休
止状態になつた。培養開始後55時間後にテストサ
ンプル1.1μgとデキサメタゾンを添加し、15時間
後に各ウエルに2μCiの［メチル−3Ｈ］チミジン
（20 Ci／mmole，New England Nuclear）と
3μgのラベルしていないチミジン（Sigma）を加
え、さらに25時間後に細胞を処理して、取り込ま
れた放射標識を測定した（Thomasら、J.Biol.
Chem.5517−5520 1980）。用量−反応の各点は、
３連の測定値の平均をとつた。クロマトグラフイ
のプール画分中の分裂促進活性因子の量は試料の
蛋白濃度の10倍濃度段階希釈の各点において４連
以上で測定を行なつて作成した用量−反応曲線か
ら求めた。この方法は通常使用される単一濃度ア
ツセイより正確で再現性がある。分裂促進活性の
１ユニツトは最大取り込み活性の２分の１にあた
る取り込みを起こすのに必要な蛋白質の量と規定
され、これから画分あたりの活性ユニツトの総量
が求められた。 分子サイズの測定 精製された成長因子を還元剤（β−メルカプト
エタノール）の存在、非存在下で変性剤（ドデシ
ル硫酸ナトリウム）とともにポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行なうと、16600と16800の２つの
極めて近接したバンドが検出された。アミノ酸組
成分析により、これらは同一の蛋白質の微小不均
一態であることが示された。 アミノ酸分析 HPLCカラムから溶出された蛋白質試料は蒸発
乾固し、２％フエノールを含む6N HCl（商品名
Ultrex、Baker Chemical社製、ニユージヤージ
ー、USA）中で、24時間、48時間および72時間
分解をおこなつた。システインの含量は、ギ酸酸
化を行なつてシステイン酸として定量した
（Moore，J.Biol.Chem.238 235−237 1963）。ト
リプトフアンは4N メタンスルホン酸（Pierce
社製、イリノイ、USA）中で加水分解したのち
定量した（Simpsonら、J.Biol.Chem.，251
1936−1940 1976）。分析はすべてベツクマン
121MBアミノ酸アナライザーでおこなつた。 上述の生化学的手法および分析技術を用い、表
に要約を示した段階的精製を行なつた。最終
的な精製倍率は35000倍であつた。 【表】 【表】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ SDSゲル電気泳動による分子サイズが16600
    と16800ダルトンであり、比活性が2.5×107（ユニ
    ツト／mg）以上である、下記アミノ酸組成を有す
    る脳の酸性繊維芽細胞成長因子： アミノ酸 単位 アスパラギン酸 アスパラギン 14 スレオニン ９ セリン 10 グルタミン酸 グルタンミン 16 プロリン ７ グリシン 14 アラニン ５ システイン ４ バリン ５ メチオニン １ イソロイシン ６ ロイシン 19 チロシン ７ フエニルアラニン ７ ヒスチジン ５ リシン 13 アルギニン ６ トリプトフアン １ ２ 脳がウシの脳である、特許請求の範囲第１項
    の酸性繊維芽細胞成長因子。 ３ SDSゲル電気泳動による分子サイズが16600
    と16800ダルトンであり、比活性が2.5×107（ユニ
    ツト／mg）以上である、下記アミノ酸組成を有す
    る脳の酸性繊維芽細胞成長因子： アミノ酸 単位 アスパラギン酸 アスパラギン 14 スレオニン ９ セリン 10 グルタミン酸 グルタンミン 16 プロリン ７ グリシン 14 アラニン ５ システイン ４ バリン ５ メチオニン １ イソロイシン ６ ロイシン 19 チロシン ７ フエニルアラニン ７ ヒスチジン ５ リシン 13 アルギニン ６ トリプトフアン １ を、下記の一連のステツプからなる方法で精製す
    る方法： (1) （）0.15M硫酸アンモニウム処理（PH4.5） （）1.52M硫酸アンモニウム処理（PH6.75） （）3.41M硫酸アンモニウム処理（PH6.75） （）高塩濃度での沈殿物の透析と凍結乾燥 の順に行なわれる脳からの抽出および分別塩
    析、 (2) （）カルボキシメチルセフアデツクス（商品
    名、フアルマシア社製）にPH６でバツチ法で吸
    着させ、 （）0.15Mから0.60Mの塩化ナトリウムを含
    むリン酸緩衝液で段階的に溶出させ、 （）ついで透析、凍結乾燥する ことを特徴とするイオン交換による精製、 (3) （）0.1M重炭酸アンモニウム（PH8.5）で溶
    出するセフアデツクスG75（商品名、フアルマ
    シア社製）カラムによるゲル濾過を行ない、 （）ついで高活性画分をプールし、凍結乾燥
    する、ゲル濾過による精製、 (4) （）カルボキシチルセルロースカラムに
    0.1Mギ酸アンモニウム（PH6.0）で吸着させ、 （）0.2Mおよび0.6Mのギ酸アンモニウム
    （PH6.0）で溶出し、 （）ついで活性画分を合して凍結乾燥するイ
    オン交換による精製、 (5) ウルトロデツクス（商品名、LKB社製）中で
    の等電点電気泳動による精製 (6) バイダツクC4シリカベースHPLCカラム（商品
    名、テパレーシヨングループ社製）を用いた疎
    水性逆相高速液体クロマトグラフイによる精
    製。 ４ 抽出源がウシの脳であることを特徴とする特
    許請求の範囲第３項の精製方法。
JP59122967A 1983-06-17 1984-06-16 繊維芽細胞成長因子の精製および特性表示 Granted JPS6011424A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

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US06/505,553 US4444760A (en) 1983-06-17 1983-06-17 Purification and characterization of a protein fibroblast growth factor

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Publication Number Publication Date
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EP (1) EP0131150B1 (ja)
JP (1) JPS6011424A (ja)
CA (1) CA1241639A (ja)
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