JPH04309864A

JPH04309864A - 抗原又は抗体の定量法

Info

Publication number: JPH04309864A
Application number: JP7295591A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Ito; 博伊藤; Takeo Yamagata; 山県　武夫; Mitsuo Yamaki; 山木　光男
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1991-04-05
Filing date: 1991-04-05
Publication date: 1992-11-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原又は抗体の定量法
に関する。更に詳しくは、本発明は抗原抗体反応混合物
に光を照射して光学的強度を測定し、抗原又は抗体を定
量する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、医療分野において、免疫の診断の
ため、検体中の微量物質、特に抗体及び／又は抗原を迅
速、簡便にしかも精度よく定量することが非常に重要と
なってきた。このため抗体又は抗原などを不溶性担体粒
子に支持（感作）し、これと抗原又は抗体を反応させて
体液成分中の抗原又は抗体の存在を検査する、免疫血清
学的検査が広く利用されている。従来は、抗体又は抗原
が支持（感作）されたラテックス粒子（感作ラテックス
）と検体とをガラス板上で混合し、検体中の抗原又は抗
体と抗原抗体反応を起こさせ、この凝集状態を肉眼で観
察することにより検体中の抗原又は抗体を半定量的に測
定する方法がとられていた。そこで、抗体又は抗原を感
作したラテックス粒子を使用し、ラテックスと検体中の
抗原又は抗体との反応凝集物を光学的に測定する方法が
提案されている（特公昭５８−１１５７５号公報、特公
昭６２−４３１３８号公報、特公昭６２−５５１０３号
公報）。この方法により、最近では、専用の分析装置を
用いて抗原又は抗体を定量的に測定することも行われる
ようになってきている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし上記の方法は、
専用分析装置を用いるため高価となり、検体数の比較的
少ない免疫血清検査室等で使用するには不向きであった
。このため、一般の生化学分析装置に適応できる試薬も
最近研究されている。しかしながら、生化学検査用に開
発された自動分析装置への適応には種々の問題がある。例えば、通常の生化学項目と同時に測定するため、セル
や分注ノズル等からの試薬汚染（キャリーオバ）によっ
て測定値が変動すること、光学的、電気的ノイズ及び攪
拌効率の影響を受けやすく測定精度が悪くなること等の
問題があった。また、ラテックス凝集法は迅速性及び簡
便性に優れた精度のよい方法であるが検体中の干渉物質
に起因する非特異反応が問題であった。かくして、本発
明の目的は、免疫ラテックス凝集法を利用するが特殊な
専用装置を必要とせずに安定かつ良好な精度が得られる
抗原又は抗体の定量法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、測定
しようとする抗原又は抗体を含有する試料と、該抗原又
は抗体と免疫学的反応を生じない物質を感作した不溶性
担体粒子を混合して光学的強度Ａ１を測定し、次いで、
該抗原又は抗体と免疫学的反応を生じる抗体又は抗原を
感作した不溶性担体粒子を添加し、免疫学的反応による
凝集をさせた後、光学的強度Ａ２を測定し、この光学的
強度Ａ２から前記光学的強度Ａ１を差引いた値から前記
試料中の抗原又は抗体を定量することを特徴とする抗原
又は抗体の定量法に関する。

【０００５】本発明において、不溶性担体粒子としては
、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体のよう
な有機高分子のラテックスやシリカ、アルミナのような
無機酸化物等が用いられる。その平均粒径は、０．０５
〜０．５μｍの範囲が好ましい。担体の粒径が大きすぎ
ると免疫学的反応前の試薬自体の光学的強度が高すぎて
測定が困難となりやすく、小さすぎると感度が低くなる
傾向にある。また、これらの不溶性担体粒子の媒体とし
ては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、
グッド緩衝液等を使用するのが好ましい。

【０００６】本発明においてはまず、測定しようとする
抗原又は抗体を含む試料（以下、検体試料とする）と該
抗原又は抗体と免疫学的反応を生じない物質を感作した
不溶性担体粒子を混合するが、このときに用いる、不溶
性担体粒子に感作する、測定しようとする抗体及び抗原
と免疫学的反応を生じない物質としては、アルブミン、
グロブリン、カゼイン及びゼラチンが好ましいものとし
て用いられる。これらの物質は動物などの起源に関係な
く使用できる。また、免疫グロブリンのＦｃ断片のよう
な免疫学的反応を生じないように加工した物質も使用で
きる。これらを不溶性担体上に感作する方法としては、
通常行われているように、物理的に吸着させてもよいし
、化学的に結合させてもよいし、両者を併用してもよい
。

【０００７】本発明においては、次いで、免疫学的反応
を生じさせるための感作不溶性担体粒子を添加するが、
このときに用いる不溶性担体粒子に感作する、測定対象
が抗体の場合の免疫学的反応を生じる抗原としては、蛋
白質、ポリペプチド、多糖類、脂質等があり特に制限は
なく、測定対象が抗原の場合の免疫学的反応を生じる抗
体としては通常は免疫グロブリン等の蛋白質が用いられ
るが、場合によっては、そのＦａｂ′断片、Ｆ（ａｂ′
）２断片、Ｆａｂ断片等を用いることもできる。これら
を不溶性担体上に感作する方法としては、通常行われて
いるように、物理的に吸着させてもよいし、化学的に結
合させてもよいし、両者を併用してもよい。

【０００８】感作された不溶性担体粒子は、免疫学的反
応時まで媒体分散液として保持されるが、その際は、媒
体中に０．１〜１．０重量％の濃度になるように分散し
ておくのが保存の面で好ましく、一般的に使用しやすい
。またこの媒体中に適宜、牛血清アルブミン、ＮａＣｌ
等を溶解させてもよい。

【０００９】また、感作された不溶性担体粒子は、免疫
学的反応時には、媒体中に適宜の濃度で分散され、使用
されるが光学的強度測定の容易さから濃度が０．５重量
％以下になるようにして使用されるのが好ましく、感作
量の点から０．０１重量％以上が好ましい。この際には
、前記媒体中、必要に応じて牛血清アルブミン、ＮａＣ
ｌ等を溶解した液（希釈液）を液量調整のために使用し
てもよい。

【００１０】本発明において凝集反応の反応性を調節す
るため、反応を抑制する物質や反応を促進する物質が使
用できる。使用される凝集反応を抑制する物質としては
、トリアルキルアミン、その塩類、第４級アンモニウム
塩及び糖類等が使用できる。トリアルキルアミンとして
はトリエチルアミン等、トリアルキルアミンの塩類とし
てはトリエチルアミンの塩酸塩等、第４級アンモニウム
塩としては塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリ
ン、臭化アセチルコリン、塩酸ベタイン等、糖類として
はショ糖等がある。これらの化合物は一種又は二種以上
使用される。

【００１１】凝集反応を抑制する物質は緩衝液に溶解し
、不溶性担体粒子分散液と別に検体試料と混合しても良
いし、上記の不溶性担体粒子の分散液中に溶解させても
よいし、分散液の液量調整用の希釈液中に溶解し使用時
に分散液と混合して用いてもよい。また、感作した抗体
又は抗原と検体試料中の測定しようとする抗原又は抗体
との反応性が低い場合には、このような凝集反応を抑制
する物質を入れることなく測定を行うことができる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス緩衝液、グッド緩衝液等を使用するのが好ましい。ま
た、この媒体中に適宜、牛血清アルブミン、ＮａＣｌ等
を溶解させてもよい。

【００１２】凝集反応を促進する物質としては、ポリエ
チレングリコ−ル等が用いられ、ポリエチレングリコ−
ルの平均分子量としては１，０００以上のものが好まし
い。分子量が大きくなると凝集反応の促進効果が大きく
なるが、小さすぎると効果が小さい。ポリエチレングリ
コ−ルは最終反応液中の濃度で０．１〜１０．０重量％
の範囲で存在させるのが好ましい。ポリエチレングリコ
ールの濃度が高くなりすぎると感作された不溶性担体粒
子の非特異的な凝集が起こりやすくなり、少なすぎると
反応促進の効果が小さい。凝集反応を促進する物質は緩
衝液中に溶解されるのが好ましい。

【００１３】次に、実際の定量の方法について詳述する
。まず、測定しようとする抗原又は抗体を含有する試料
と、該抗原又は抗体と免疫学的反応を生じない物質を感
作した不溶性担体粒子の媒体分散液を混合攪拌し、混合
後５秒〜１５分間インキュベーションした後、光学的強
度Ａ１を測定する。次に上記の測定しようとする抗原又
は抗体と免疫学的反応を生じる抗体又は抗原を感作した
不溶性担体粒子の媒体分散液を混合攪拌し免疫反応させ
、混合後５秒〜１５分間インキュベーションした後光学
的強度Ａ２を測定する。これらの反応は２０〜５０℃で
行うのが好ましく、反応は恒温にするのが好ましい。反応時の温度がこの範囲を外れると抗原−抗体反応が不
安定になりやすい。更に、これらの反応はそれぞれ混合
後５秒〜１５分間行われるのが好ましいが、特に１０秒
〜５分間行われるのが好ましい。５秒未満では上記反応
が不十分となりやすく、１５分を越えると迅速測定に不
向きとなる。

【００１４】また、測定しようとする抗原又は抗体を含
有する試料と、まず上記の反応の抑制物質及び／又は促
進物質を含有する緩衝液を混合した後、該抗原又は抗体
と免疫学的反応を生じない物質を感作した不溶性担体粒
子を混合し光学的強度Ａ１を測定することもできる。

【００１５】ここで、測定しようとする抗原又は抗体と
免疫学的反応を生じない物質を感作した不溶性担体粒子
の媒体分散液（前者）と、測定しようとする抗原又は抗
体と免疫学的反応を生じる抗体又は抗原を感作した不溶
性担体粒子の媒体分散液（後者）の光学的強度は、等し
ければ分注誤差等の影響を受けにくくより精度が向上す
る。この分散液の光学的強度の比率は、前者／後者で０
．１〜１０が好ましく、特に０．２〜５が好ましく、約
１であることが最も好ましい。

【００１６】本発明において光学的強度とは、吸光度又
は散乱光強度を意味する。測定波長は、通常４００〜１
２００ｎｍの範囲から適宜選択される。測定波長が１２
００ｎｍを越えると感度が低下する傾向にあり、測定波
長が４００ｎｍ未満であると媒体分散液自体の光学的強
度が大きくなり、測定範囲が狭くなる。

【００１７】次に、前記の検体試料の代わりに精製水、
緩衝液又は生理食塩水を用いて、全く同様に操作し光学
的強度Ａ１及びＡ２に対応した測定値（媒体分散液に起
因する光学的強度を意味する）Ａ１′及びＡ２′を求め
る。検体試料を用いて測定した光学的強度Ａ１及びＡ２と媒
体分散液に起因する光学的強度Ａ１′及びＡ２′から算
出光学的強度Ａを式（１）Ａ＝Ａ２−Ａ１−（Ａ２′−Ａ１′）………（１）によ
って算出する。

【００１８】一方、検体試料として、既知濃度の試料（
既知量の測定しようとする抗原又は抗体を含む試料）を
用い前記と同様にして算出光学的強度を求め、これを下
式（２）に当てはめることにより、検体試料中の未知量
の抗原又は抗体量（ＣＸ）を求めることができる。ＣＸ＝ＡＸ×ＣＳ／ＡＳ………（２）（但し、式中、ＡＸは未知量の抗原又は抗体を含む試料
の算出光学的強度並びにＣＳは既知量の抗原又は抗体を
含む試料の抗原又は抗体の量及びＡＳはその試料の算出
光学的強度である。）ここで、ＣＸは抗原−抗体反応を
行った時の光学的強度Ａ２から感作された担体粒子の分
注時における誤差の要因となる、分注誤差、セルの汚れ
、光学系のノイズ、検体に起因する濁度及び非特異反応
等に由来する光学的強度Ａ１を差し引いて求めてあるた
め測定精度が良く、特に低濃度領域の測定値の信頼性に
優れている。

【００１９】なお、既知濃度の試料を多種類の濃度で調
整して前記と同様に測定し、検量線を作成しておき、こ
の検量線を用いて検体試料の定量をすることもできる。さらに、より測定精度を上げるために、光学的強度を前
述のようにして同時に２波長の光で測定して求め、その
２波長間の光学的強度の差から、定量することもできる
。

【００２０】

【実施例】次に、実施例によって、本発明を詳細に説明
する。以下、％は重量％を意味する。実施例１（１）試薬の調製（ａ）ラテックス液０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ及び１．０％牛血清アルブミン
を含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５０）に
、牛血清アルブミンを感作した平均粒径約０．１μｍの
ポリスチレン系ラテックス粒子をラテックス濃度０．１
％となるように分散させラテックス液とした。（ｂ）ラテックス試液０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ及び１．０％牛血清アルブミン
を含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５０）に
、抗ヒトＣ反応性蛋白（以下ＣＲＰと略す）抗体を感作
した平均粒径約０．１μｍの診断薬用ポリスチレン系ラ
テックス粒子をラテックス濃度０．１％となるように分
散させ、ラテックス試液を調製した。（Ｃ）緩衝液０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ及び１．０％牛血清アルブミン
を含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５０）を
調製し、緩衝液とする。

【００２１】（２）測定方法ラテックス液２５０μｌと検体試料３μｌを反応キュベ
ットに分注し攪拌した後、３７℃で５分間加温し、波長
５７０ｎｍにおける吸光度（Ａ１）を求める。次に、ラ
テックス試液２５０μｌを添加攪拌し、３７℃で５分間
保持した後、波長５７０ｎｍにおける吸光度（Ａ２）を
求め、吸光度の差（Ａ２−Ａ１×２５０／５０３）（２
５０／５０３は緩衝液添加前後の容量差を補正する為の
係数、係数＝ラテックス試液量／全体量）を求めた。比
較のための従来法として、上記ラテックス液の代わりに
上記緩衝液を用い、上記と同様に操作する方法を行った
。

【００２２】（３）実測結果検体試料として生理食塩水及びＣＲＰ含有血清の希釈系
列（１／１０〜１０／１０）を用い、生理食塩水を用い
たときの測定値（Ａ１′、Ａ２′）を試薬ブランクとし
希釈直線性を検討した。本測定法における結果を図１に
示すが、図１のように良好な希釈直線性が得られた。な
お、従来法ともほぼ同様であった。

【００２３】実施例２実施例１と同様の試薬を用い、同様に操作し同時再現性
を検討した。検体試料として生理食塩水を用いたときの
吸光度差をＡＢとし、ＣＲＰ濃度５．３ｍｇ／ｄｌの試
料を用いたときの吸光度差をＡＳとし求めた。ＣＲＰ濃
度未知の試料を１０回繰り返し測定し求めた吸光度差Ａ
Ｘを下式に当てはめ濃度ＣＸを算出して同時再現性をみ
た。また、従来法、すなわちラテックス液の代わりに緩
衝液を用いる測定方法で行った場合の同時再現性をとり
本発明と比較した。ＣＸ＝（ＡＸ−ＡＢ）×５．３／（ＡＳ−ＡＢ）表１の
ように本発明の測定方法による同時再現性は通常の測定
方法に比較しＣ．Ｖ．（変動係数）で約３倍良かった。なお、本実施例における測定は、日立製作所（株）製の
自動分析装置である日立７１５０形を用いた。本装置で
は分析プログラムにより上記演算を自動的に行い、測定
結果を算出することができる。

【００２４】

【表１】

【発明の効果】以上のように、本発明の定量法によれば
、特殊な専用装置を必要とせずに、安定かつ良好な精度
の抗原又は抗体の定量を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１の測定結果（濃度換算値）と
ＣＲＰ含有血清の希釈系列との関係（希釈直線性）を示
すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　測定しようとする抗原又は抗体を含有
する試料と、該抗原又は抗体と免疫学的反応を生じない
物質を感作した不溶性担体粒子を混合して光学的強度Ａ
１を測定し、次いで、該抗原又は抗体と免疫学的反応を
生じる抗体又は抗原を感作した不溶性担体粒子を添加し
、免疫学的反応による凝集をさせた後、光学的強度Ａ２
を測定し、この光学的強度Ａ２から前記光学的強度Ａ１
を差引いた値から、前記試料中の抗原又は抗体を定量す
ることを特徴とする抗原又は抗体の定量法。
【請求項２】　　測定しようとする抗原又は抗体と免疫
学的反応を生じない物質を感作した不溶性担体粒子を混
合し光学的強度Ａ１を測定する前に、まず、測定しよう
とする抗原又は抗体を含有する試料と免疫学的反応の抑
制物質又は促進物質を含有する緩衡液とを混合する請求
項１記載の抗原又は抗体の定量法。
【請求項３】　　測定しようとする抗原又は抗体と免疫
学的反応を生じない物質が、アルブミン、グロブリン、
カゼイン又はゼラチンである請求項１又は２記載の抗原
又は抗体の定量法。
【請求項４】　　光学的強度が吸光度である請求項１、
２又は３記載の抗原又は抗体の定量法。
【請求項５】　　２波長の光の吸光度を測定する請求項
４記載の抗原又は抗体の定量法。