JPH04316599A - シクロスポリン免疫アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】１．発明の分野体は、自分と他とを区別す
る複雑な免疫応答系に頼っている。免疫系が正常に機能
することは、体の長期にわたる健康のために肝要である
。

【０００２】欠陥ある免疫応答は、自己を他者から護る
体の能力の欠失を招き得る。過大な免疫応答は、他の場
合は無害なものに対する体の過剰な反応を招き得る。時
に応じ、体の免疫系は欠足する応答を増大させるか、あ
るいは過大な応答を抑制するために制御されなければな
らない。例えば、腎臓、心臓、心肺、骨髄および肝臓等
の器官をヒトに移植した場合、時により体は、同種移植
片拒絶と称される工程により移植組織を拒絶する。同種
移植片拒絶の治療において、しばしば免疫系が、薬剤処
置を通して制御された様式で抑制される。免疫抑制薬は
、他者組織の同種移植片拒絶を防止するために、移植受
容者に対して注意深く投与される。

【０００３】米国および他の国々において免疫抑制剤と
しての用途が見出されているシクロスポリン薬の一つは
、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）である。ＣｓＡは、一般
構造

【化１１】 を有する環状ウンデカペプチドであり、式中のシクロス
ポリンＡの環状骨格を形成しているすべてのα−アミノ
酸残基は、Ｄ−配置であるα−アミノ酸８を除いてＬ−
配置である。アミノ酸残基１は、通常９個の炭素のアミ
ノ酸である〔２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｅ〕−３−ヒドロキ
シ−４−メチル−２−メチルアミノ−６−オクテン酸か
ら誘導される。アミノ酸残基１、３、４、６、９、１０
、および１１は、シクロスポリンＡの環状骨格のアミド
窒素原子においてＮ−メチル化されている。シクロスポ
リンＡは、米国特許第４，１１７，１１８号（１９７８
）および４，３９６，５４２号（１９８３）に記述され
ている。

【０００４】ＣｓＡは、抗菌性、抗関節炎および抗炎症
活性等の他の有用な性質を有し、また糖尿症、マラリア
および自己免疫疾患等の他の症状の治療における用途も
見出されるであろう。ウンデカペプチド環を保持してい
る多数のＣｓＡ代謝産物が同定され、報告されている（
Ｍａｕｒｅｒ，Ｇ．；Ｌｏｏｓｌｉ，Ｈ．Ｒ．；Ｓｃｈ
ｒｅｉｅｒ，Ｅ．；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｂ．のＤｒｕｇ　　
Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　　ａｎｄ　　Ｄｉｓｐｏｓｉｔ
ｉｏｎ，１９８４，１２（１），１２０−１２６，該代
謝産物の構造、命名および分析データを、ここに参考と
して取入れる）。ＣｓＡが同種移植片拒絶の防止のため
に使用された場合に、これらの代謝産物が所望の免疫抑
制活性または何らかの望ましからぬ不利益な反応のいず
れかにおいてどのような役割を演ずるものかは知られて
いない。

【０００５】ＣｓＡは、極めて効果的な免疫抑制剤では
あるが、有効投与量の範囲が狭く、また過剰投与は深刻
な副作用を生じるため、その使用は注意深く管理されな
ければならない。ＣｓＡ治療を受け、過少なＣｓＡが移
植片拒絶を起こすであろう腎臓、心臓または肝臓移植患
者において、腎機能不全、高血圧、心臓血管痙攣、多毛
症、にきび、振せん、痙攣、頭痛、ガム質過形成、下痢
、悪心、嘔吐、肝毒性、腹部不快感、感覚異常、潮紅、
白血球減少、リンパ腫、静脈洞炎、および女性化乳房等
が観察されている。

【０００６】ＣｓＡ投与の管理は、患者内の該薬剤の存
在水準の注意深い制御を含む。ＣｓＡの分布および代謝
は、患者毎に大きく異なり、また逆反応の広い範囲およ
び重篤さゆえに、薬物水準の正確な監視が基本的である
と考えられる。

【０００７】シクロスポリン検出のための実験室的方法
が開発されたきた。これらの技術は、典型的には高速液
体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、放射免疫アッセイ（
ＲＩＡ）、または螢光偏光性免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）
に関する。例えば、Ｗｏｌｆ，Ｂ．Ａ．らのＣｌｉｎｉ
ｃａｌ　　Ｃｈｅｍ．１９８９，３５（１），１２０−
１２４；Ｖｅｒｎｉｌｌｅｔ，Ｌ．らのＣｌｉｎｉｃａ
ｌ　　Ｃｈｅｍ．１９８９，３５（４），６０８−６１
１；Ｂａｌｌ，Ｐ．Ｅ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ　　Ｃｈ
ｅｍ．１９８８，３４（２）２５７−２６０；Ｓｃｈｒ
ａｎ，Ｈ，Ｆ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍ．１
９８７．３３（１２），２２２５−２２２９；Ｓａｎｇ
ｈｖｉ，Ａ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍ．１９
８８，３４（９），１９０４−１９０６；ＭｃＢｒｉｄ
ｅ，Ｊ．Ｈ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍ．１９
８９，３５（８），１７２６−１７３０；Ｑｕｓｎｉａ
ｕｘ，Ｖ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍ．１９８
７，３３（１），３２−３７参照。

【０００８】これらの技術のそれぞれは、手法の安全性
および複雑さ、ならびに興味あるシクロスポリンに対す
る特異性の程度等においてある程度制限がある。例えば
、ＨＰＬＣは、長い試料調製および／または操作時間を
、高いコストの労力集中的方法を用いながら要求し、Ｒ
ＩＡは、放射性材料の取扱いについて周知の危険性を与
え、またＦＰＩＡは、非特異的モノーまたはポリクロー
ナル抗体に基づく場合には、しばしばＣｓＡとその代謝
産物との間の区別がつかない。選択されたシクロスポリ
ン類に対して特異的な単純な分析方法が、シクロスポリ
ン治療の管理に使用するために必要とされる。

【０００９】免疫アッセイは、シクロスポリンを含むと
考えられる試料中のシクロスポリン量の単純な測定方法
の要求には合致した技術である。しかしながら、興味あ
るシクロスポリンを認識し得る利用可能な抗体類のほと
んどは、シクロスポリン代謝産物等の密接に関連する化
合物をも認識し、交差反応を起こす。この交差反応のた
めに、これらの抗体に依存する免疫アッセイは、興味あ
るシクロスポリンに対する特異性が、望まれる程度より
低い。興味あるシクロスポリン以外の化合物と交差反応
を起こす抗体に依存するシクロスポリン免疫アッセイは
、交差反応性化合物が、興味あるシクロスポリンを認識
する抗体による認識に対して実質的に不活性化された場
合には改善され得るであろう。

【００１０】本発明の方法および組成物は、シクロスポ
リン類についての単純な特異的免疫アッセイに関連する
。本発明の方法および組成物は、シクロスポリンの免疫
アッセイ方法における交差反応性化合物の不活性化方法
にも関連するものである。

【００１１】２．関連技術の簡単な説明国際特許出願第
８，６０２，０８０（１９８６）は、ある種のシクロス
ポリンに対して選択的なモノクローナル抗体を記述して
いる。これらの抗体は、抗原性担体に対して８位の（Ｄ
）−リジンまたは２位の（Ｌ）−スレオニン等の修飾ア
ミノ酸残基を介して結合されたシクロスポリン類に対す
る応答において調製される。

【００１２】ヨーロッパ特許出願第２８３，８０１号（
１９８８）は、螢光免疫アッセイ法および抗体産生に使
用するシクロスポリンＡ誘導体を記述している。シクロ
スポリンＡは、第１のアミノ酸残基のアミノ酸側鎖を介
して免疫原性担体に連結されている。Ｃａｃａｌａｎｏ
，Ｎ．Ａ．；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｗ．Ｌ．；Ｅｒｌａ
ｎｇｅｒ，Ｂ．Ｆ．のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．
１９８９，１１８，２５７−２６３は、確かではないが
多分、４−ベンゾイル安息香酸上のシクロスポリンＡア
ルキル側鎖の無作為の光化学的結合を記述している。こ
れらの結合は、抗体調製用の免疫原性担体への結合のた
めに使用される。

【００１３】米国特許第４，７２７，０３５号（１９８
８）は、シクロスポリンの免疫アッセイ方法を記述して
いる。該方法は、放射性ヨウ素または螢光免疫アッセイ
のいずれかに関連する。Ｑｕｅｓｎｉａｕｘ，Ｖ．Ｆ．
Ｊ．；Ｔｅｅｓ，Ｒ．；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，Ｍ．Ｈ．；
Ｗｅｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．；Ｖａｎ　　Ｒｅｇｅｎｍｏｒ
ｔｅｌ，Ｍ．Ｈ．Ｖ．らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ　　１９８７，２４（１１），１１５
９−１１６８は、シクロスポリン−免疫原接合体に対す
る応答において生成する抗体を記述している。該接合体
は、シクロスポリンに対して２または８のアミノ酸上の
修飾側鎖を介して結合されている。

【００１４】米国特許第４，７６４，５０３号（１９８
８）、第４，６３９，４３４号（１９８７）および第４
，３８４，９９６号（１９８３）は、第８のアミノ酸残
基において修飾されたシクロスポリン類を記述している
。これらのシクロスポリンは、アミノ酸側鎖においてヒ
ドロキシル化され、免疫抑制剤として有用である。

【００１５】発明の要約本発明は一局面において、シク
ロスポリンを含むと考えられる試料中のシクロスポリン
量の測定に有用な方法に関する。該方法は、ａ）水性媒
質中に、１）シクロスポリンを含むと考えられる試料、
２）シクロスポリンの環状骨格の一部であるアラニン窒
素原子の一つにおいて、場合により連結基を介して標識
に接合されるシクロスポリン、および３）該シクロスポ
リン標識接合体に結合可能な抗体類を合し；ならびに、
場合によりｂ）該抗体類に結合する該シクロスポリン標
識接合体の量を測定する工程を含む。

【００１６】本発明の他の局面は、シクロスポリンを含
むと考えられる試料中のシクロスポリン量測定アッセイ
において、妨害交差反応物質を不活性化するために有用
な方法に関する。該方法は、試料を含むアッセイ媒質を
、該妨害交差反応物質を認識可能であってシクロスポリ
ン量測定アッセイを実質的に妨害しない抗体と合する工
程を含む。

【００１７】本発明の他の局面は、シクロスポリンの環
状骨格の一部であるアラニン窒素原子の一つにおいて、
場合により連結基を介して標識に接合されるシクロスポ
リンに関するものである。これらの接合体は、本発明の
アッセイ方法において有用である。

【００１８】本発明の他の局面は、シクロスポリンの環
状骨格の一部であるアラニン窒素原子の一つにおいて、
場合により連結基を介して免疫原性担体に接合されるシ
クロスポリンに関する。これらの接合体は、本発明のア
ッセイ方法において使用するための抗体類の生成に有用
である。

【００１９】本発明の他の局面は、場合により連結基を
介して標識に結合されるアチオシクロスポリンに関する
。

【００２０】本発明の他の局面は、場合により連結基を
介して免疫原性担体に結合されるアチオシクロスポリン
に関する。

【００２１】本発明の他の局面は、シクロスポリンの環
状骨格の一部であるアラニン窒素原子の一つにおいて、
場合により連結基を介して免疫原性担体に接合されるシ
クロスポリンに対する応答により生成される抗体類に関
する。これらの抗体は、本発明のアッセイ方法において
有用である。

【００２２】本発明の他の局面は、場合により連結基を
介して免疫原性担体に接合されるアチオシクロスポリン
に対する応答により生成される抗体類に関する。これら
の抗体は、妨害的交差反応物質の低減において有用であ
る。

【００２３】本発明の他の局面は、シクロスポリンの環
状骨格の一部であるアラニン窒素原子の一つにおいて、
場合により連結基を介して免疫原性担体または標識に接
合されるシクロスポリンの調製方法に関する。

【００２４】本発明の他の局面は、場合により連結基を
介して免疫原性担体または標識に接合されるアチオシク
ロスポリンの調製方法に関する。

【００２５】本発明の他の局面は、本発明のアッセイ方
法の遂行に有用な試薬類に関する。

【００２６】本発明の他の局面は、シクロスポリンのア
ッセイにおける妨害的交差反応物質の不活性化方法の遂
行に有用な試薬類に関する。

【００２７】本発明の他の局面は、本発明のアッセイ方
法を都合良く遂行するために有用なキットに関する。

【００２８】本発明の他の局面は、シクロスポリンのア
ッセイにおける妨害的交差反応物質の不活性化方法を都
合良く遂行するために有用なキットに関する。

【００２９】特定の実施態様の記述シクロスポリン免疫
アッセイにおいて有用な方法、組成物、試薬およびキッ
トが提供される。特定の実施態様の記述に先立って、多
くの用語を定義しておく。

【００３０】定　　義連結基−連結基は、２つ以上の準
構造を連結している構造中の部位である。連結基は、準
構造間に張り渡る水素（または他の一価原子）以外の原
子の少なくとも一つの連続鎖を有している。連結基の原
子および連結基内の鎖の原子は、それら自体化学結合に
より結合されている。連結基内の原子数は、水素以外の
原子を計数することにより決定される。連結基内の鎖の
原子数は、連結される準構造間の最短経路に沿った水素
原子以外の原子数を計数することによって決定される。 例えば、ジフェニルメタンは、１個の原子の鎖を含む１
原子の連結基により連結された２個のベンゼン環を有し
、スチルベンは、２個の原子の鎖を含む２原子の連結基
により連結された２個のベンゼン環を有し、１，２−ジ
フェニル−３−エチルシクロヘキサンは、２個の原子の
鎖を含む８原子の連結基により連結された２個のベンゼ
ン環を有する。

【００３１】カルボキサミド基−カルボキサミド基は、
式：

【化１２】 式中、Ｘは、水素、アルキル（約９個未満の炭素原子）
、またはヒドロキシアルキル（約９個未満の炭素原子）
である、を有する準構造を含んだ構造中の一部である。 Ｘは、好ましくは水素または水素原子以外に主として約
９個未満の炭素原子、好ましくは約７個未満の炭素原子
、更に好ましくは約５個未満の炭素原子を含む、場合に
よりヒドロキシル基で置換されていてもよい直鎖または
分枝状アルキル基である。カルボキサミドは、典型的に
はアルキレン鎖により互いに連結され、ポリ（ペプチド
類）とも称されるポリ（カルボキサミド）を形成する。 該アルキレン鎖は、好ましくは水素原子以外に主として
約１１個未満の炭素原子、好ましくは約９個未満の炭素
原子、更に好ましくは約７個未満の炭素原子を含む、場
合によりヒドロキシル基で置換されていてもよい直鎖ま
たは分枝状アルキル鎖である。

【００３２】非−オキソカルボニル−式：

【化１３】 の一般構造を有するケトンまたはアルデヒド以外の基で
あって、式中、Ｔ１はカルコゲン（酸素または硫黄）ま
たは置換窒素であり、窒素の置換基は、例えばＨまたは
アルキルであってよい。非−オキソカルボニル基の例は
、カルボン酸（エステル類、アミド類、カルバメート類
、カルボネート類、尿素類等）であり、また、それらの
硫黄および窒素類似体も含む。

【００３３】シクロスポリン−本発明との関連において
、シクロスポリン基は、天然または合成シクロスポリン
または誘導体である。シクロスポリン基は、一般式：

【
化１４】

【００３４】式中、Ｒは、水素原子以外に主として約９
個未満の炭素原子、好ましくは約７個未満の炭素を含む
、場合によりヒドロキシル基で置換されていてもよい直
鎖または分枝状アルキル基である、を有する環状のウン
デカペプチドである。

【００３５】例えば、シクロスポリンＡにおいてＲは、
−ＣＨ２ＣＨ３であり、シクロスポリンＢにおいてＲは
、−ＣＨ３であり、シクロスポリンＣにおいてＲは、−
ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３であり、およびシクロスポリンＤに
おいてＲは、−ＣＨ（ＣＨ３）２である。好適なシクロ
スポリン類は、シクロスポリンＡ、シクロスポリンＢ、
シクロスポリンＣ、シクロスポリンＤ、シクロスポリン
Ｅ、シクロスポリンＦ、シクロスポリンＧ、シクロスポ
リンＨ、およびシクロスポリンＩを含む。

【００３６】シクロスポリンの厳密な構造は、例毎に非
主要部分で変わり得る。例えば、アミノ酸残基２−６、
および９−１１の側鎖構造の変化は、本発明の範囲にお
いて熟考される。更に、アミノ酸残基２−６、および９
−１１のアミド窒素原子上の付属置換基の構造変化は、
本発明の範囲において熟考される。また更に、アミノ酸
残基２−１１のα−炭素の立体化学的絶対配置の変化は
、本発明の範囲において、熟考される。

【００３７】本発明の範囲内において、第１のアミノ酸
残基は、実質的に修飾されずに保たれるであろう。更に
、第７および第８のアミノ酸残基の一方または両者は、
ｄ−アラニン、ｌ−アラニンまたはそれらの混合物であ
ろう。

【００３８】シクロスポリンのアラニン窒素原子−シク
ロスポリン分子の各環状ペプチド単位は、該シクロスポ
リン環の骨格の部分としてアミド窒素原子を含んでいる
。本発明の範囲において、アラニン残基のアミド窒素原
子は、シクロスポリンのアラニン窒素原子である。例え
ば、これらはシクロスポリンＡ、ＣおよびＤにおける第
７および第８のアミノ酸残基、ならびにシクロスポリン
Ｄにおける第２、第７および第８のアミノ酸残基の窒素
原子である。

【００３９】シクロスポリン第１アミノ酸残基の第６炭
素原子−シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の第１のアミノ酸
残基は、遊離のアミノ酸〔２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｅ〕−
３−ヒドロキシ−４−メチル−２−メチルアミノ−６−
オクテン酸の縮合形態である。　　Ｗｅｎｇｅｒ，Ｒ．
の米国特許第４，３９６，５４２号（１９８３）；Ｗｅ
ｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．のＨｅｌｖｅｔｉｃａ　　Ｃｈｉｍ
．Ａｃｔａ．１９８３，６６（７），２３０８−２３２
１参照。この固有なアミノ酸は、Ｎ−メチル−（４Ｒ）
−４−ブト−２Ｅ−エン−１−イル−４−メチル（Ｌ）
スレオニン（ＭｅＢｍｔ）とも称される。Ｗｅｇｎｅｒ
，Ｒ．らの米国特許第４，６３９，４３４号（１９８７
）参照。ＭｅＢｍｔの縮合および遊離形態の両者の構造
および番号付けは、式：

【化１５】 に示される。

【００４０】アチオシクロスポリン−その組成の面の一
つにおいて、本発明は、第１のシクロスポリンアミノ酸
残基を第６および第７の炭素原子を連結している結合で
開裂させ、得られた開裂生成物を、場合により連結基を
介して、標識、免疫原性担体、小有機分子等に接合する
ことにより調製される化合物に関する。第１のアミノ酸
の側鎖が、第６の炭素−第７の炭素結合において開裂さ
れる場合には、第７および第８の炭素原子は除去され、
第６の炭素原子に官能基が導入される。

【００４１】第６の炭素原子上の新たな官能基は、第６
の炭素原子の連結基、標識、免疫原性担体、小有機分子
等への結合を許容するいずれの官能基でもよい。このよ
うな官能基は、複素原子含有基、好ましくはオキソカル
ボニルまたは非−オキソカルボニルを含む。第１のシク
ロスポリンアミノ酸残基の第７および第８の炭素原子が
除去され、第６の炭素原子に官能基が導入されて得られ
たシクロスポリンを、アチオシクロスポリンと称する。

【００４２】アチオシクロスポリンカルボキシアルデヒ
ド−本発明の範囲において、シクロスポリンの第１のア
ミノ酸残基の側鎖が、第６および第７の炭素原子を連結
しているオレフィン性結合において酸化的に開裂され、
第１のアミノ酸残基の側鎖の第７および第８の炭素原子
が除去されて該第１のシクロスポリンアミノ酸残基の第
６の炭素原子においてアルデヒド官能基を形成するよう
に酸素原子により置換されたシクロスポリンを形成する
ことが好ましい。

【００４３】上述の好ましい化合物は、アチオシクロス
ポリンカルボキシアルデヒドと称され、その構造は、式
：

【化１６】 により示される。

【００４４】Ｒ１Ｒ２およびＲ３は、Ｈまたはヒドロキ
シルであり、少なくとも一つがヒドロキシルである。Ｒ
４は、Ｈまたはメチルである。Ｒ５は、ヒドロキシル、
トリアルキルシロキシまたはアシロキシであり、Ｒ６は
、Ｈである。更に好ましくは、Ｒ１およびＲ５はヒドロ
キシルであり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ６はＨであり、Ｒ４
はメチルである。この最も好ましい実施態様は、シクロ
スポリンＡ代謝産物Ｍ−１から形成されるアチオシクロ
スポリンカルボキシアルデヒドである。

【００４５】妨害的交差反応性物質−興味あるシクロス
ポリンを認識し得る抗体類によって認識されるであろう
興味あるシクロスポリン以外の物質は、妨害的交差反応
性物質である。そのような物質は、興味あるシクロスポ
リンに関連する化合物を含み得る。特に、ウンデカペプ
チド環を保存しているシクロスポリンの代謝産物は、共
通する妨害的交差反応性物質である。Ｍａｕｒｅｒらの
前述に取入れた業績は、多くのシクロスポリン代謝産物
を記述している。８種類の共通代謝産物の構造を下記に
示す。これらの８種類の代謝産物は例示的なものであっ
て排他的ではない妨害的交差反応性物質の例である。本
発明は、その最も好ましい面における一つにおいて、妨
害的交差反応性物質としてシクロスポリンＡ代謝産物Ｍ
−１に関連する。

【００４６】

【化１７】

【００４７】

【００４８】有機基−有機基は、大有機分子の残基であ
るか、または小有機分子の残基である。有機基は、好ま
しくは免疫原性担体および標識をいずれかの連結基と共
に含んでなる。有機基は、任意の数の原子を有してもよ
いが、好ましくは水素を含めて少なくとも５個の原子を
含む。

【００４９】小有機分子の残基−小有機分子の残基は、
小有機分子の結合により誘導される基である。小有機分
子は、ビオチン、フルオレセイン、ローダミンおよび他
の染料、テトラサイクリンおよび他の蛋白質結合性分子
、ならびにハプテン類等の分子量が約２０００未満、好
ましくは約１００−１０００、更に好ましくは約３００
−６００の化合物である。該小有機分子は、シクロスポ
リンのアラニン窒素原子の一つにおいて、場合により連
結基を介してシクロスポリンに結合（接合）可能である
。該小有機分子がこのように結合した場合に、これは小
有機分子の残基になる。

【００５０】大有機分子の残基−大有機分子の残基は、
分子量が２０００を越える分子を有する基であり、ポリ
（アミノ酸）、リポポリサッカライド類、粒状物等を含
む。このような基は、他の物のうちで標識または免疫原
性担体であり得る。

【００５１】ポリ（アミノ酸）−ポリ（アミノ酸）は、
アミノ酸から形成されるポリアミドである。ポリ（アミ
ノ酸）は、ポリペプチドとも称され、一般的には約２，
０００からの分子量範囲にわたり、分子量の上限はない
が通常１０，０００，０００未満、普通には６００，０
００ダルトンを越えない。また、通常は、抗原性担体で
あるか、または酵素が関与するかに依存して、異なる範
囲となるであろう。

【００５２】免疫原性担体一免疫原性担体は、シクロス
ポリンのアラニン窒素原子に対して場合により連結基を
介して接合され、哺乳動物に注射された場合に、免疫応
答を誘発し、シクロスポリンに結合する抗体類の産生を
引起こす基である。免疫原性担体は、抗原性担体とも称
され、またこの技術で一般的な他の同義語により称され
る。

【００５３】抗原性担体の分子量は、典型的には約２，
０００から１０７の範囲、通常は約２０，０００〜６０
０，０００、より普通には約２５，０００〜２５０，０
００の範囲である。通常、１５０，０００の分子量あた
り少なくとも約１個のシクロスポリン基、更に通常には
、５０，０００分子量あたり少なくとも約１個、好まし
くは２５，０００の分子量あたり少なくとも１個が存在
する。

【００５４】ポリ（アミノ酸）抗原性物質として種々の
型の蛋白質が使用されてよい。これらの型は、アルブミ
ン類、グロブリン等の血清蛋白質類、水晶体蛋白質類、
リポ蛋白質等を含む。例示的な蛋白質は、ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）、卵アルブミン、ウシガンマークロブリン（
ＢＧＧ）等を含む。別法として、合成ポリ（アミノ酸）
を使用してもよい。

【００５５】該免疫原性担体は、モノサッカライドの反
復する縮合により構築される高分子量ポリマーであるポ
リサッカライドであってもよい。ポリサッカライドの例
は、デンプン、グリコーゲン、セルロース、アラビアゴ
ム等の炭化水素ゴム、寒天等である。ポリサッカライド
は、ポリアミノ酸残基および／または脂質残基を含んで
いてもよい。該免疫原性担体は、単独または上述のポリ
（アミノ酸）もしくはポリサッカライドの一つに接合す
るポリ（核酸）であってもよい。

【００５６】該免疫原性担体は、粒状物であってもよい
。該粒状物は、少なくとも約０．０２ミクロンであるが
約１００ミクロンを越えないものが一般的で、通常は少
なくとも約０・０５ミクロンで約２０ミクロン未満、好
ましくは約０．３〜１０ミクロンの直径である。該粒状
物は、有機性または無機性の、膨潤性または非膨潤性、
多孔性、または非多孔性の、好ましくは水に近似した密
度を有する一般的には約０．７〜１．５ｇ／ｍＬのもの
であって、透明、半透明または不透明材料からなってい
る。該粒状物は、例えば、赤血球、白血球、リンパ球、
ハイブリドーマ、ストレプトコッカス、スタフィロコッ
カスアウレウス、Ｅ．コリ、ウイルス等の細胞および微
生物等、生物学的材料であってもよい。該粒状物は、有
機または無機のポリマー、リポソーム、ラテックス粒子
、リン脂質ベシクル、キロミクロン（ｃｈｙｌｏｍｉｃ
ｒｏｎｓ）、リポ蛋白質等であってもよい。

【００５７】ポリマー類は、付加または縮合ポリマーの
いずれであってもよい。これらから誘導される粒状物は
、水性媒質中に容易に分散し、またシクロスポリン基に
直接あるいは連結基を介して間接的に結合（接合）する
ように吸着性または官能性付与可能である。

【００５８】該粒状物は、天然産生材料、合成的に修飾
された天然材料、および合成材料から誘導され得る。有
機ポリマーのうち特に興味あるものは、ポリサッカライ
ド、特にはセファロースとして入手可能なアガロース、
セファデックスおよびセファクリルとして入手可能なデ
キストラン、セルロース、デンプン等の交差結合ポリサ
ッカライド；ポリスチレン、ポリビニルアルコール等の
付加ポリマー類；アクリレートおよびメタクリレート等
の誘導体であるホモポリマー類およびコポリマー類、等
には遊離のヒドロキシル官能基を有するエステル類およ
びアミド類等である。

【００５９】該粒状物は、通常多官能性であり、シクロ
スポリン基に対して場合により連結基を介して結合され
るか、あるいは結合（接合）可能である。多くの官能基
が利用可能、または取込み可能である。官能基は、カル
ボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基
、ヒドロキシル基、メルカプト基等を含む。多くの種類
の化合物を粒子に連結する方法は、周知であり、また文
献中に広く例示されている。例えば、Ｃａｕｔｒｅｃａ
ｓａｓのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０，２４５，
３０５７が参考となり、その連結方法をここに参考とし
て取入れる。

【００６０】標識−標識は、信号を生成するか、あるい
は生成を誘発され得る任意の分子である。該標識は、分
析対象もしくは抗体に対し、または他の分子、例えばレ
セプタ、もしくはレセプタに結合可能なリガンド等、特
にはハプテンに対して接合されてよい。この発明におい
て、標識は、以下に記述されるように信号生成手段を含
む信号生成系の一つであり得る。

【００６１】該標識は、同位体的または非同位体的なも
のであって、好ましくは非同位体である。限定ではなく
、例示のために、標識は、酵素、酵素断片、酵素基質、
酵素阻害剤、補酵素、または触媒等の触媒反応系の一部
；螢光剤、染料、化学発光剤、発光剤、または感応剤等
の発色原系の一部；非磁性または磁性であり得る分散性
粒子、固体担体、リポソーム、リガンド、レセプタ、ハ
プテン、放射性同位体等である。

【００６２】酵素、酵素断片、酵素阻害剤、酵素基質、
および酵素反応系の他の成分を標識として使用し得る。 これらの成分のいずれかを標識として使用する場合、該
成分の一つに関連する化学反応は、信号生成系の一部で
ある。酵素類を使用する場合、分子量は、典型的には約
１０，０００〜６００，０００の範囲、更に普通には約
１０，０００〜３００，０００の範囲であり、また関与
する反応は、多くの場合加水分解または酸化還元反応で
あろう。結合触媒は、非酵素的触媒と共に酵素を含むこ
とができる。該酵素は、該非酵素的触媒による触媒反応
を進行させる反応試剤を生成するか、あるいは該非酵素
的触媒は、該酵素の基質（補酵素を含む）を生成し得る
。使用可能な多様な非酵素的触媒は、米国特許第４，１
６０，６４５号（１９７９）に見出され、その適切な部
分をここに参考として取入れる。

【００６３】使用される該酵素または補酵素は、染料等
の光吸収、まは螢光体等の輻射により光を放射する生成
物の産生により、所望の増幅を与える。別法として、触
媒反応は、例えば化学的発光等、直接的光放射を導き得
る。このような生成物を与える多数の酵素および補酵素
が、米国特許第４，２７５，１４９号の１９〜２３欄お
よび米国特許第４，３１８，９８０号の１０〜１４欄に
示されており、その開示をここに参考として取入れる。 多数の酵素の組合せが、米国特許第４，２７５，１４９
号の２３〜２８欄に示されており、その組合せは、本発
明において用途が見出され得る。この開示をここに参考
として取入れる。

【００６４】特に興味あるものは、過酸化水素の生成に
関与する酵素であり、また過酸化水素の染料前駆体を染
料へと酸化するための用途である。特定の組合せは、例
えば、グルコースおよびガラクトースオキシダーゼ等の
サッカライドオキシダーゼ、またはウリカーゼおよびキ
サンチンオキシダーゼ等の複素環オキシダーゼと組合さ
れる、過酸化水素を染料前駆体の酸化のために使用する
酵素、すなわち西洋ワサビパーオキシダーゼ、ラクトパ
ーオキシダーゼまたはマイクロパーオキシダーゼ等のパ
ーオキシダーゼを含む。他の酵素の組合せは、参考とし
て取入れた主題中に見出されるであろう。

【００６５】単一の酵素を標識として使用する場合、用
途が見出されるであろう酵素は、ハイドロラーゼ、トラ
ンスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼま
たはシンセターゼおよびオキシドリダクターゼであり、
好ましくはハイドロラーゼである。別法として、ホタル
のルシフェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ等のルシ
フェラーゼも使用することができる。主としてＩ．Ｕ．
Ｂ分類に基づい酵素の選択は：クラス１のオキシドレダ
クターゼおよびクラス３のハイドロラーゼ；特には、ク
ラス１において興味ある酵素はクラス１．１、更に特定
的には１．１．１、１．１．３および１．１．９９のデ
ヒドロゲナーゼ、およびクラス１．１１のパーオキシダ
ーゼである。ハイドロラーゼについては特にクラス３．
１、更に特定的には３．１．３およびクラス３．２、更
に特定的には３．２．１である。

【００６６】例示的なテヒドロゲナーゼとしては、マレ
エートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、およびラクテートデヒドロゲナーゼを含
む。オキシダーゼとしては、グルコースオキシダーゼが
例示される。パーオキシダーゼとしては、西洋ワサビパ
ーオキシダーゼが例示的である。ハイドロラーゼとして
は、アルカリホスファターゼ、β−グルコシダーゼおよ
びリゾチームが例示的である。ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはそのホスフェート（Ｎ
ＡＤＰ）を補酵素として使用するこれらの酵素は、特に
前者を使用する。一つの好ましい酵素は、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはＮＡＤ−依存
性グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。

【００６７】標識は、直接に、あるいは常法により粒子
または他の分子に結合する螢光性化合物または螢光体に
よって螢光性であってもよい。螢光性標識は、場合によ
り連結基を介して、シクロスポリンまたはシクロスポリ
ンに対する抗体もしくはレセプタに対し、結合されるか
、あるいは結合（接合）可能とすべく官能化されるであ
ろう。

【００６８】興味ある螢光体は、一般に約３５０ｎｍ以
上、通常約４００ｎｍ以上、好ましくは約４５０ｎｍ以
上の波長の光を放射するであろう。螢光体は、望ましく
は高い量子効率を有し、大きいストークスシフトを有し
、かつそれらの接合および使用条件下で化学的に安定で
ある。冷光性標識の用語は、電磁的照射、電気化学的励
起または化学的活性化による活性化において光を輻射す
る物質を含み、また螢光性およびリン光性物質、シンチ
レータ類ならびに化学発光性物質を含むことを意図する
ものである。

【００６９】興味ある螢光体は、ある種の主要な官能基
を有する種々の種類に含まれる。これらの主要な官能基
は、１−および２−アミノナフタレン，ｐ−ｐ−ジアミ
ノスチルベン類、ピレン類、四級フェナントリジン塩類
、９−アミノアクリジン類、ｐ，ｐ′−ジアミノスチル
ベンイミン類、アントラセン類、オキサカルボキシアニ
ン、メロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、
ビス−ベンゾキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベン
ゼン、１，２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−
３−アミノピリジニウム塩類、ベレブリゲニン、テトラ
サイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフ
ェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インドール
、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、４，５−ヘン
ズイミダゾール類、フェノキサジン、サリシレート、ス
トロファンチジン、ポルフィリン類、トリアリルメタン
類、フラビン、および希土類キレートの酸化物および塩
類を含む。例示的螢光体は米国特許第４，３１８，７０
７号の７および８欄に列挙され、その開示をここに参考
として取入れる。

【００７０】エネルギー吸収体または冷却体が、分離し
て、あるいは相互に組合されて使用され得る。該吸収体
または冷却体は、更に少なくとも約５０ｎｍの直径を有
する固体不溶性粒子に結合され得る。該吸収体および冷
却体の間の距離の特異的結合（抗体−抗原結合等）に由
来する場合、吸収体の螢光が、冷却体により冷却される
。冷却体は、螢光体と同じまたは異なってよく、通常異
なっている。

【００７１】検出可能な信号としての別の光源は、化学
発光源であり、従って標識は化学発光性化合物であり得
る。該化学発光源は、化学反応により電子的に励起した
状態となり、次いで検出可能な信号として作用するか、
あるいはエネルギーを螢光性受容体に与える光を放射す
る化合物に関連する。

【００７２】種々の条件において、化学発光性を与える
多くの数の化合物群が見出されている。一つの化合物群
は、２，３−ジヒドロ−１，４−フタルアジンである。 最も一般的な化合物は、上記化合物の５−アミノ類似体
であるルミノールである。該群の他の構成員は、５−ア
ミノ−６，７，８−トリメチル−およびジメチルアミン
−〔Ｃａ〕ベンゾ類似体である。これらの化合物は、ア
ルカリ性過酸水素またはカルシウムの次亜塩素酸塩、お
よび塩基により発光性になり得る。他の群の化合物は、
その親化合物について慣用名としてロフィン（ｌｏｐｈ
ｉｎｅ）をもつ２，４，５−トリフェニルイミダゾール
類である。化学発光性類似体は、パラ−ジメチルアミノ
−およびパラ−メトキシ−置換基を含む。化学発光体は
、ゲリジニウムエステル類、ジオキセタン類、および例
えばｐ−ニトロフェニル等の通常はオキサリル活性エス
テル類であるオキサレート、ならびに塩基性条件下の過
酸化水素等のパーオキシド等により得ることもできる。 別法として、ルシフェリン類は、ルシフェラーゼまたは
ルシゲニンとの組合せにおいて使用されてもよい。

【００７３】接合体−接合体は、２つ以上のサブユニッ
トを場合により連結基を介して互いに結合し、単一の構
造を形成した分子である。結合は、サブユニット間の直
接結合（例えば化学結合）により、または連結基の使用
により形成され得る。例えば、本発明に関連して、シク
ロスポリンのアラニン窒素原子において、場合により連
結基を介して酵素に接合されたシクロスポリンは、シク
ロスポリン−酵素接合体である。場合により連結基を介
してサブユニットＢに接合されたサブユニットＡを含む
ものとして記述される構成物は、サブユニットＡが、場
合により連結基を介してサブユニットＢに結合している
構成物である。

【００７４】接合−接合は、２つのサブユニットを互い
に結合して接合体を形成する任意の方法である。接合工
程は、任意の数の工程を含んでもよい。

【００７５】レセプタ−レセプタは、分子の特定の空間
的および極性的組織を認識し得るいずれかの化合物また
は組成物である。これらの分子の組織化領域は、エピト
ープまたは決定部位と称される。天然に産生する例示的
なレセプタ類は、抗体類、酵素類、ｆａｂ断片、ポリ（
核酸）、補体成分、すなわちチロキシン結合グロブリン
、レクチン類、蛋白質Ａ等を含む。レセプタ類は、抗リ
ガンドとも称される。シクロスポリンを特異的に結合す
る天然のレセプタが存在する。

【００７６】リガンド−リガンドは、そのためのレセブ
タが天然に存在するか、あるいは調製可能であるいずれ
かの有機分子である。例えば、本発明との関連において
シクロスポリンはリガンドであり、本発明はシクロスポ
リンのレセプタ抗体を提供する。本発明の他の関連にお
いて、シクロスポリンは、場合により連結基を介してア
ラニン窒素原子において第２のリガンドに接合され得る
。シクロスポリンがこのような様式で第２のリガンドに
連結した場合（シクロスポリン−リガンド接合体）、該
第２のリガンドを認識可能なレセプタ類は、該シクロス
ポリン−リガンド接合体を認識するであろう。

【００７７】ハプテン−ハプテンは、対応する抗体に特
異的に結合し得るが、それら自体は抗体調製のための免
疫原（抗原）としては作用しない。ハプテンを認識する
抗体は、免疫原性（抗原性）担体に結合されたハプテン
を含んでなる化合物に対して調製され得る。ハプテンは
、リガンドの一部分（ｓｕｂｓｅｔ）である。

【００７８】例えば、本発明との関連においてシクロス
ポリンはハプテンである。シクロスポリンがそのアラニ
ン窒素原子の一つにおいて、場合により連結基を介して
抗原性担体に接合された場合に、シクロスポリンを認識
し得る抗体が調製可能である。本発明の別の関連におい
て、シクロスポリンは、そのアラニン窒素原子の一つに
おいて、場合により連結基を介して第２のハプテンに接
合される。シクロスポリンがこのような形で第２のハプ
テンに接合された場合（シクロスポリン−ハプテン接合
体）、第２のハプテンを認識可能な抗体およびシクロス
ポリンを認識可能な抗体は、該シクロスポリン−ハプテ
ン接合体に結合可能であろう。

【００７９】特異的結合対の一員−特異的結合対の一員
（ｓｐｂメンバ）は、他方の分子の特定の空間的および
極性的組織に特異的に結合し、従って補体として定義さ
れる、表面上または空孔内の領域を有する異なった２つ
の分子の一つである。特異的結合対のメンバは、リガン
ドとレセプタ（抗リガンド）と称される。これらは、通
常は、抗原−抗体等の免疫学的対であるが、ビオチン−
アビジン、ホルモン−ホルモンレセプタ、核酸複製物、
ＩｇＧ−蛋白質Ａ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ等
の他の特異的結合対は、免疫学的対ではない。

【００８０】支持体または表面−支持体または表面は、
多孔性または非多孔性の水不溶性材料である。該支持体
は、親水性または親水性を付与し得るものであって、シ
リカ、硫酸マグネシウム、およびアルミナ等の無機粉体
；例えば、濾紙、クロマトグラフィ用紙等の紙類を含む
繊維等、特にセルロース性またはセルロースから誘導さ
れる材料である天然ポリマー材料；ニトロセルロース、
セルロースアセテート、ポリ（ビニルクロライド）、ポ
リアクリルアミド、交差結合デキストラン、アガロース
、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタク
リレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン
、ポリ（ビニルブチレート）等の合成または修飾された
天然産生ポリマー類；それら自体で使用されるか、ある
いは他の材料と組合せて使用される、Ｂｉｏｇｌａｓｓ
として入手可能なガラス、セラミクス、金属等を含む。 リポソーム、リン脂質胞、および細胞等の天然または合
成組合体も使用可能である。使用可能な他の材料は、上
述の免疫原性担体粒子の定義、および後述の信号生成系
の定義中に記述されている。

【００８１】ｓｂｐメンバの支持体または表面への結合
は、一般に文献中から入手できる周知の技術により行な
うことができ、また上述の免疫原性担体粒子の定義にも
記述されている。表面は、小片、棒、ビーズを含む粒子
等、多くの形状のいずれであってもよい。該表面は、通
常多官能性もしくは多官能性とし得るか、またはｓｂｐ
メンバを、特異的または非特異的な共有または非共有的
相互作用を介して結合し得るものである。連結のための
多くの種類の官能基が免疫原性担体粒子の定義に記述さ
れている。ｓｂｐメンバについて連結基の長さは、連結
される化合物の性質、連結される化合物間の距離、支持
体に連結される化合物間の距離のアッセイに対する効果
等に依存して広く変化し得る。該ｓｂｐメンバは、実質
的には支持体の外部表面に結合されるであろう。

【００８２】信号生成系−信号生成系の機能は、結合お
よび／または非結合標識の量に関連する検出可能な信号
を提供する生成物を生じることである。該信号生成系は
、少なくとも一つが標識である１種以上の成分を有して
いる。該信号生成系は、信号生成のために標識と相互作
用し得る信号生成手段を含め、測定可能な信号を生成す
るために要するすべての試薬類を含む。

【００８３】該信号生成系は、外部的手段、通常は電磁
放射、好ましくは目視試験により検出可能な信号を提供
する。そのほとんどにおいて、該信号生成系は、発色性
基質と酵素とを含み、発色性基質が酵素反応的に紫外ま
たは可視領域において光を吸収する染料、リン光物質、
または螢光物質に変換される。

【００８４】該信号生成手段は標識と相互作用して検出
可能な信号を生成する。このような手段は、例えば電磁
放射、熱、化学的試剤等を含む。化学的試剤が使用され
る場合、該化学的試剤のある種のものは展開溶液の部分
として含まれてもよい。該化学的試剤は、基質、補酵素
、増強剤、第２の酵素、活性化剤、共因子、阻害剤、清
浄化剤、金属イオン、信号発生物質の結合に必要な特異
的結合物質等を含んでよい。補酵素、酵素的生成物と反
応する物質、他の酵素および触媒等、該化学的試剤のあ
るものは、他の分子または支持体に対して固定されても
よい。

【００８５】標識を含む信号生成系は、１種以上の粒子
を含んでもよく、粒子は不溶性であって、少なくとも約
５０ｎｍかつ約５０ミクロン以下、通常は少なくとも約
１００ｎｍかつ約２５ミクロン以下、好ましくは約０．
２〜５ミクロンの直径である。該粒子は、有機または無
機、多孔性または非多孔性、好ましくは水に近似する密
度、一般に約０．７から約１．５ｇ／ｍＬであってよく
、透明、半透明または不透明な材料からなる。一般に、
標識として使用される粒子は、上述の免疫原性担体、お
よび支持体または表面の定義に記述されるものと類似し
た特徴を有するであろう。

【００８６】多くの異なった型の粒子を、光輻射の制御
に使用してもよい。特に興味あるものは、木炭、すす、
グラファイト、コロイド性炭素等の炭素粒子である。炭
素粒子の他に、金属ゾルもまた有用であり、特には金、
銀および白金等の貴金属が有用である。他の金属誘導粒
子は、鉛、銀または銅スルフィド等の金属スルフィド類
、あるいは鉄または銅酸化物等の金属酸化物を含む。

【００８７】螢光化ラテックス粒子は、米国特許第３，
８５３，９８７号中に教示されており、Ｃｏｖａｌｅｎ
ｔ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　Ｃｏｒｐ．からＣｏｖ
ａｓｐｈｅｒｅｓとして商業的に入手可能である。

【００８８】シクロスポリン量の測定−シクロスポリン
測定のための、定量的、半定量的および定性的方法、な
らびに他の方法は、シクロスポリン量の測定方法として
考慮される。例えば、シクロスポリンを含むと考えられ
る試料中のシクロスポリンの存在の有無のみを検出する
方法は、本発明の範囲に含まれると考えられる。本発明
の範囲内と考えられる語法“シクロスポリン量の測定”
の同義語は、限定的ではなく、シクロスポリンの検出、
測定、または決定；シクロスポリンの存在の検出、測定
、または決定；およびシクロスポリンの量の検出、測定
、または決定を含む。

【００８９】実質的に結合もしくは認識可能または不可
能−は、特定のアッセイ条件下におけるアッセイ混合物
中の分子間の、結合または認識する量、またはその欠如
を指している。その最も広い面において、ある分子の他
の分子を結合もしくは認識可能であることと、第３の分
子を結合もしくは認識可能であることとの差異は、該分
子の相対濃度を含む特定の組合せのアッセイ条件下で、
意味のあるアッセイの実施を許容するために充分である
。他の面において、分子の相対濃度を含む特定組合せの
アッセイ条件下において第３の分子に対して示される反
応性の２５％未満、好ましくは１０％未満、更に好まし
くは５％未満であるような反応性を、第１の分子が第２
の分子に対して示す場合、交差反応的な意味である分子
は他の分子を結合または認識できない。

【００９０】シクロスポリンを含むと考えられる試料−
シクロスポリンを含むことが合理的に考えられる任意の
試料は、本発明の方法により分析可能である。このよう
な試料は、ヒト、動物またはヒト生成試料を含む。試料
は、アッセイの妨害とならない任意の都合よい媒質中に
調製され得る。典型的には、該試料は、水性溶液、また
は天然の液体、好ましくは尿、全血、血清、血漿または
唾液、更に好ましくは全血である。

【００９１】試料の前処理−場合により、シクロスポリ
ンを含むと考えられる試料は、前処理を受けてもよい。 前処理は、標的分析対象を１種以上のアッセイ試薬につ
いてより容易に利用できるように設計された工程である
。好ましくは、本発明の方法により分析される試料は、
存在するであろう細胞を溶解し、存在するであろう蛋白
質を沈殿させ、存在するであろうシクロスポリンを可溶
化することによって前処理される。このような前処理は
、有機溶媒、好ましくはアルコール、更に好ましくはメ
タノールによる試料の処理を含む。

【００９２】特定の実施態様本発明の一面は、シクロス
ポリンのアラニン窒素原子において場合により連結基を
介して有機基に接合されたシクロスポリンを含む組成物
に関する。好ましくは、シクロスポリンＡが、その第７
および／または８のアミノ酸残基のアラニン窒素原子に
おいて、場合により、水素以外に約３５個未満、好まし
くは２５個未満、更に好ましくは１５個未満の原子の長
さの鎖を有する、水素以外に約５０個未満、好ましくは
約３５個未満、更に好ましくは約２０個未満の原子を有
する連結基を介して接合される。該有機基は、分子量が
約２，０００を越え、好ましくは約５，０００を越える
基、または、リガンド、ハプテンもしくはビオチン等の
小有機分子である。好ましくは、２，０００以上の分子
量を有する基は、ポリ（アミノ酸）である。更に好まし
くは、該ポリ（アミノ酸）は、キーホールリンペットの
ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
）、もしくはウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）等の免疫
原性担体、またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）等の酵素である。

【００９３】連結基は、存在する場合には、好ましくは
式：−（ＣＨ２）ｎＯ−のヒドロキシアルカン鎖を含ん
でなり、ここでシクロスポリンのアラニン窒素原子は、
該ヒドロキシアルカンの炭素原子に接合し、また有機基
は、該酸素原子に接合し、ｎは１〜６、好ましくは２〜
４の範囲の整数、更に好ましくはｎは２である。更に好
ましくはヒドロキシアルカン連結基は、アルキレン鎖に
よって互いに結合された約１〜３個のカルボキサミド基
によって、該酸素原子に延びている。拡張された場合、
有機基は、カルボキサミド拡張基の一端に結合され、ま
た該ヒドロキシアルカン基の酸素原子は、該カルボキサ
ミド拡張基の他端に結合される。

【００９４】別法として、連結基が存在する場合、該基
は式：

【化１８】

【００９５】のカルボキシベンジル基を含んでなり、こ
こにおいてシクロスポリンのアラニン窒素原子は、ベン
ジルの炭素原子に接合され、また有機基はカルボキシル
基の酸素原子に結合される。該カルボキシル基は、ベン
ジルの炭素に対して、好ましくはオルトまたはパラ、更
に好ましくはパラである。更に好ましくは、該カルボキ
シベンジル基は、アルキレン鎖によって互いに結合され
た約１〜約３個のカルボキサミド基によって、該酸素原
子に延びている。拡張された場合、有機基は、カルボキ
サミド拡張基の一端に結合され、また該カルボキシル基
の酸素原子は、該カルボキサミド拡張基の他端に結合さ
れる。

【００９６】更に好ましくは、連結基は：

【００９７】

【化１９】

【００２０】

【化２０】

【００９９】

【化２１】

【０１００】

【化２２】

【０１０１】シクロスポリン類は、環状ウンデカペプチ
ドであるため、アラニン窒素は、アミノ酸残基の一部で
ある。好ましくは、該アラニン窒素は、第７または８番
目のシクロスポリンアミノ酸残基の部分である。更に好
ましくは、該連結基が場合によりカルボキサミド拡張の
ヒドロキシアルカンを含んでなる場合、該アラニン窒素
はシクロスポリンアミノ酸残基第７番の部分であり、ま
た該連結基が場合によりカルボキサミド拡張のカルボキ
シベンジル基を含んでなる場合、該アラニン窒素は第７
番または８番から選択されたシクロスポリンアミノ酸残
基の部分である。

【０１０２】該有機基が免疫原性担体である場合、好適
には、これは抗原性ポリ（アミノ酸）、リポポリサッカ
ライドおよび粒子であってよい。それが、ポリ（アミノ
酸）であることは好ましい。更に好ましくは、それはキ
ーホールリンペットのヘモシアニン（ＫＬＨ）、または
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。該有機基が免疫
原性担体である場合、連結基がカルボキシベンジル基で
あることは更に好ましい。また更に好ましくは、カルボ
キシベンジル基は、アルキレン鎖により互いに結合され
た約１個〜３個のカルボキサミド基により拡張される。

【０１０３】本発明により考慮される好ましい組成物の
一つは、式（ＸＩＸ）の連結基を介してキーホールリン
ペットヘモシアニンに対して、第７のアミノ酸残基のア
ラニン窒素原子において接合されるシクロスポリンＡお
よび第８のアミノ酸残基のアラニン窒素原子において接
合されるシクロスポリンＡの混合物である。

【０１０４】有機基が標識である場合、標識の型は、行
なわれるアッセイの型に依存する。酵素免疫アッセイの
ためには、該標識は酵素である。好ましくは、均一酵素
免疫アッセイのためには、グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼである。有機基が標識である場合、連結基
がヒドロキシアルカン基であることが更に好ましい。更
に好ましくは、該ヒドロキシアルカン基は、約１〜３個
のカルボキサミド基により拡張されている。

【０１０５】本発明により考慮されるその他の好ましい
組成物は、基（ＩＩ）の連結基を介して第７のアミノ酸
残基のアラニン窒素原子においてグルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼに接合されるシクロスポリンＡであ
る。

【０１０６】別の面において本発明は、シクロスポリン
の環状骨格の一部であるアラニン窒素原子の一つにおい
て、場合により連結基を介して有機基に接合されるシク
ロスポリンの調製方法に関する。該方法は：ａ）場合に
より保護されたシクロスポリンを、２級アミドを脱水素
化するために充分な塩基性の塩基と反応させ、ｂ）ａ）
の化合物をアルキリ化剤と反応させてその環状骨格のア
ミド窒素原子の一つにおいて連結基に接合するシクロス
ポリンを形成し、ｃ）場合により、ｂ）の化合物の連結
基の長さをカルボキサミド基の付加により延長してその
環状骨格のアミド窒素原子の一つにおいてカルボキサミ
ド拡張連結基に接合するシクロスポリンを形成し、ｄ）
ｂ）またはｃ）の化合物からいずれの保護基をも除去し
て、その環状骨格のアラニン窒素原子の一つにおいて、
連結基またはカルボキサミド拡張連結基に接合するシク
ロスポリン（シクロスポリン−連結基接合体）を形成し
、ｅ）ｄ）のシクロスポリン−連結基接合体上の官能基
を場合により活性化して、その環状骨格のアラニン窒素
原子の一つにおいて、活性化連結基に接合するシクロス
ポリン（シクロスポリン−活性化連結基接合体）を形成
し、およびｆ）場合により、ｅ）のシクロスポリン−活
性化連結基接合体を、小有機分子または分子量２，００
０以上の化合物と反応させ、場合により連結基を介して
アラニン窒素原子の一つにおいて、有機基に対して接合
するシクロスポリンを形成し、ここにおいて該有機基は
、小有機分子の残基または分子量２，０００以上の基で
ある、工程を含んでなる。

【０１０７】好ましくは、ａ）の保護基は、強塩基性条
件下で安定であり、かつ他のおだやかな条件で容易に除
去可能なものであるヒドロキシ保護基であろう。このよ
うな基は当技術分野で周知であり、詳細は示さない。し
かしながら、このような基の詳細、ならびにそれらの調
製および後の除去のために必要な条件は、ここに参考と
して取入れるＧｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．の“Ｐｒｏｔｅｃ
ｔｉｖｅ　　Ｇｒｏｕｐｓ　　ｉｎ　　Ｏｒｇａｎｉｃ
　　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓ
ｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９８１）１頁、第１章、および
１０−７２頁、ならびにここに参考として取入れるＭｃ
Ｏｍｉｅ，Ｊ．Ｆ．Ｗ．編“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　　
Ｇｒｏｕｐｓ　　ｉｎ　　Ｏｒｇａｎｉｃ　　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　　”（Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ
，１９７３）９６−１２０頁に見出すことができる。こ
のような基は、メチル、ｔ−ブチル、アリル、ベンジル
、トリアリールメチル、シリル、およびテトラヒドロピ
ラニルエーテル類；アセタール類、ケタール類、アセテ
ート類、ベンゾエート類、ｐ−ニトロベンゾエート類、
ホルメート類；トリフルオロ−、クロロ−、メトキシ−
およびフェノキシ−アセテート類；カルボネート類等を
含む。更に好ましくは、保護基はアルキルシランに基づ
くものである。なおも好ましくは、トリメチルシリルで
あろう。

【０１０８】トリメチルシリル（ＴＭＳ）保護ＣｓＡ（
ＴＭＳ−ＣｓＡ）は、式（ＸＸＶ）に示される。

【化２３】

【０１０９】シリル化反応（取入れた参考文献であるＧ
ｒｅｅｎｅの３９−５０頁に詳細に記述される）は、ア
ミン／ハロアルカン混合物等の混合溶媒中において、典
型的に行なわれる。好ましくは、ジクロロメタンと混合
されるトリアルキルアミンまたはピリジン、更に好まし
くは、ピリジン／ジクロロメタンである。該反応は、窒
素、アルゴン、ヘリウム等の不活性雰囲気下に行なわれ
る。典型的には、該反応は、１分間から２４時間を要し
、好ましくは、３０分間から１８時間である。反応温度
は、−１０℃と１００℃との間、好ましくは０℃と５０
℃との間、更に好ましくは２０℃と２５℃との間である
。

【０１１０】工程ａ）にて使用される塩基は、好ましく
は、ポリ（アミノ酸）の一部である２級アミド基を脱水
素化するために充分な強度の塩基である。このような塩
基は、当該技術分野で周知であり、詳細は記さない。好
ましくは、該塩基は、メチルリチウム、ブチルリチウム
、リチウムハイドライド、カリウムハイドライド、リチ
ウムジイソプロピルアミド、リチウムシクロヘキシルイ
ソプロピルアミド等を含む金属のハイドライド、アルキ
ル化物またはアミド等、アルカリ金属陰イオン（ハイド
ライドまたは有機陰イオンの第１Ａ族塩）である。更に
好ましくは、塩基はナトリウム、リチウムまたはカリウ
ムのハイドライド等、金属ハイドライド塩基である。

【０１１１】脱水素化反応は、−７８℃〜１００℃、好
ましくは−１０℃〜４０℃、更に好ましくは０℃〜２０
℃にて行なわれる。このような反応のための溶媒は、例
えばベンゼン、トルエンまたはヘキサン等の脂肪族炭化
水素、および芳香族炭化水素等、不活性有機溶媒である
。場合により第１Ａ族の錯形成に好適な金属イオンキレ
ート剤、例えばクラウンエーテル、β−ジカルボニル化
合物、またはポリ（アルキレンオキサイド）等が溶媒に
添加される。好ましくは、１８−クラウン−６または１
５−クラウン−５等のクラウンエーテルが、芳香族有機
溶媒において使用され、更に好ましくは、１５−クラウ
ン−５エーテルが、トルエン中で使用される。該反応は
、典型的には不活性雰囲気下で１分間と２４時間との間
、好ましくは１０分間と１２時間との間、更に好ましく
は１０分間と２時間との間で行なわれる。

【０１１２】ｂ）のアルキル化基は、好ましくはα−ハ
ロアルキル安息香酸エステルまたはエポキシドである。 更に好ましくは、調製すべき化合物がカルボキシベンジ
ル連結基を有する場合には、アルキル化基は式（ＸＸＶ
Ｉ）のものであろう。

【０１１３】

【化２４】

【０１１４】式（ＸＸＶＩ）において、Ｒ１およびＲ２
は、互いに独立してＨまたは炭素原子数が約７個未満の
アルキルであり、好ましくはＨまたはメチル、更に好ま
しくはＨである。式（ＸＸＶＩ）において、Ｇ１は、ハ
ロゲン原子、好ましくは臭素、塩素またはヨウ素、更に
好ましくは臭素原子である。

【０１１５】式（ＸＸＶＩ）において、Ｔ２はＯ、Ｓま
たはＮＲ３であり、ここでＲ３は、Ｈまたは炭素数が約
７個未満のアルキルであり、好ましくはＯまたはＳ、更
に好ましくはＯである。式（ＸＸＶＩ）において、ｋ１
の値は、１から約４まで、好ましくは、約２まで、更に
好ましくはｋ１は１である。

【０１１６】式（ＸＸＶＩ）において、Ｇ２は、ＯＲ４
またはＳＲ５であり、ここでＲ４およびＲ５は、Ｔ２お
よびＧ２の本質に依存して選択される、対応する酸素、
窒素またはサルファカルボニル官能基の保護基である。 これらの官能基のための保護基は、ここに参考として取
入れるＧｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．の“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ
　　Ｇｒｏｕｐｓ　　ｉｎ　　Ｏｒｇａｎｉｃ　　Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｗｉｌｅｙ−１ｎｔｅｒｓｃｉｅｎ
ｃｅ，ＮＹ，１９８１）１頁、第１節、１５４−１９２
、２０９−２１０、および２４９−２７８頁；およびＭ
ｃＯｍｉｅ，Ｊ．Ｆ．Ｗ．編“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　
　Ｇｒｏｕｐｓ　　ｉｎ　　Ｏｒｇａｎｉｃ　　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ”（Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，
１９７３）１８３−２１０、２８６−２９５、および４
０４−４１２頁に記述されており、ここに詳細は示さな
い。好ましくは、Ｇ２はＯＲ４であり、Ｒ４は炭素原子
数が約７個未満のアルキルであり、更に好ましくはＲ４
はメチルである。

【０１１７】更になお好ましくは、調製されるべき化合
物がカルボキシベンジル連結基を有する場合には、アル
キル化剤はオルト−またはパラ−α−ハロメチル安息香
酸のアルキル（約７個未満の炭素原子を有する）エステ
ルであろう。好ましくは、該α−ハロメチル安息香酸ア
ルキルエステルとのアルキル化生成物は、シクロスポリ
ンアミノ酸残基の第７および第８のアラニン窒素原子の
一つにおいて、オルト−またはパラーカルボキシベンジ
ルアルキルエステル基に接合するシクロスポリンであろ
う。

【０１１８】更に好ましくは、調製されるべき化合物が
ヒドロキシアルカン連結基を有する場合には、アルキル
化基は、式（ＸＸＶＩＩ）のものであろう。

【０１１９】

【化２５】

【０１２０】式（ＸＸＶＩＩ）において、Ｒ６、Ｒ７、
Ｒ８およびＲ９は、れぞれ独立してＨまたは約７個未満
の炭素原子を有するアルキルであり、好ましくはＨまた
はメチル、更に好ましくはＨである。

【０１２１】更になお好ましくは、調製されるべき化合
物がヒドロキシアルカン連結基を有する場合には、アル
キル化剤は、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイ
ド等、約７個未満の炭素原子を有するアルキレンエポキ
シドであろう。好ましくは、エチレンエポキシドによる
アルキル化生成物は、第７のシクロスポリンアミノ酸残
基のアラニン窒素原子において、末端がヒドロキシル基
である炭素２個の鎖に接合するシクロスポリンである。

【０１２２】アルキル化剤は、典型的には上述した脱水
素化の後に反応混合物に添加される。該アルキル化剤添
加後、反応は１分間と４８時間との間、好ましくは１時
間と３６時間との間、更に好ましくは１２時間と２４時
間との間継続される。好ましくは、場合により行なわれ
るカルボキサミド鎖拡張工程ｃ）は、ポリ（アミノ酸）
合成の標準的方法である。このような工程は、当技術分
野において常法であり、詳述はしない。しかしながら、
このような工程の要約は、ここに参考として取入れるＷ
ｈｉｔｅ，Ａ，らの、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　　ｏｆ
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　”（ＭｃＧｒａｗ−
Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９７８）９２−９５頁に見出される
。

【０１２３】一般的に、反応させるべきでない任意のア
ミノ、ヒドロキシル、カルボニルまたはその他の基は保
護される（上記ＧｒｅｅｎｅおよびＭｃＯｍｉｅの参考
文献のとおり）。保護基は、ベンジルオキシカルボニル
、トリフェニルメチル、３級ブチルオキシカルボニル、
フタロイル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ｐ−ト
ルエンスルホニル、飽和低級アルキル、ベンジルエステ
ル、３級ブチルエステル、アセチル等を含む。反応すべ
く保護されていないカルボキシル基は、カップリング剤
との反応により活性化され、活性化エステル基を形成す
る。このようなカップリング剤は、ジクロロヘキシルカ
ルボジイミド（ＤＣＣ）、イソブチルクロロホルメート
、Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール、ｐ−ニトロフ
ェノール／ＤＣＣ等を含む。次いで活性化エステルは、
アミノ化合物との反応に付され、ｃ）のカルボキサミド
鎖拡張化合物が形成される。

【００２４】更に好ましくは、カルボキサミド鎖延長工
程は、ｂ）の化合物とイソシアネートまたはチオイソシ
アネートとの反応を含む。典型的には、鎖延長されるべ
き化合物が、アルキル金属アルコキシド等の有機金属触
媒と、脂肪族または芳香族炭化水素溶媒中で反応に付さ
れ、イソシアネートまたはチオイソシアネート、飽和ア
ルキル（炭素数７個未満）エステルが添加される。好ま
しくは、触媒はトリアルキルチン錯体、更に好ましくは
トリブチルチンエポキシドである。好ましい溶媒は、芳
香族炭化水素、更に好ましくはトルエンである。カルボ
キサミド鎖延長試薬は、好ましくはβ−アラニンイソシ
アネート、メチルエステル、メチルグリコネートイソシ
アネート等のイソシアネート、メチルエステルである。

【０１２５】別法として、更に好ましいカルボキサミド
鎖延長工程は、ｂ）の化合物の下記条件下における反応
を接合工程のために含む。好ましくは、鎖延長される化
合物を、下記活性化剤と反応させ、該活性化エステルを
、精製または未精製で、カルボキサミド鎖延長単位、好
ましくはアミノ酸またはポリ（アミノ酸）、更に好まし
くはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンもしくはイ
ソロイシンまたはこれらの２〜１２残基からなるポリ（
アミノ酸）等の未置換のアミノ酸、更になお好ましくは
、該鎖延長単位は、グリシルグリシンの２個のアミノ酸
単位からなる。

【０１２６】種々の長さのカルボキサミド延長鎖を得る
ために、数種の適当な鎖延長工程を順次行なってもよい
。

【０１２７】ｄ）の脱保護工程は、上記に詳述した保護
基に基いて選択される。先に引用し、参考とした文献は
、好適な保護基の除去のための条件および試薬を記述し
てある。典型的に脱保護は、ｐＨ約２−１２、好ましく
は３−１１、更に好ましくは４−１０における、５−９
５℃、好ましくは１０−４０℃、更に好ましくは２０−
２５℃の水中での水性加水分解を含む。場合により加水
分解触媒は、酸または塩基を含み、好ましくはＨＣｌ、
Ｈ２ＳＯ４、ＨＦ、ＨＢｒ、ｐ−トルエンスルエンスル
ホン酸、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｋ２
ＣＯ３、またはＫＨＣＯ３、更に好ましくはＨＣｌまた
はＫ２ＣＯ３を含む。場合により有機共溶媒を使用する
ことができ、典型的にはプロトン性溶媒、好ましくはア
ルコール、更に好ましくはメタノールが使用される。

【０１２８】別法として好ましい脱保護反応は、フッ素
イオン供給源との処理を含み、例えば、ＨＦ、または有
機性フッ素塩、好ましくは４級フッ化アンモニウム、更
に好ましくは、テトラアルキルアンモニウムフルオライ
ドを含む。該反応は、上記の温度にて不活性有機溶媒、
好ましくはエーテル、更に好ましくはジエチルエーテル
またはテトラヒドロフラン中にて行なわれる。

【０１２９】上述したカルボキサミド鎖延長方法は、ｅ
）およびｆ）の活性化および接合工程においても有用で
ある。好ましくは、ｅ）およびｆ）の活性化および接合
工程は、この技術における通常の方法で行なわれる。 例えば、Ｍａｇｉｏ，Ｅ．Ｔ．の“Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓｓｙ”（ＣＲＣ　　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃ
ａ　　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８０）、第４章は、この
ような技術の分類を含み、その８１−８６頁をここに参
考として取入れる。

【０１３０】更に好ましくは、シクロスポリン−連結基
接合体は、ＤＭＦ等の有機溶媒中において、アルキル（
炭素原子数９個未満）クロロホルメート、例えばイソブ
チルクロロホルメート；ジアルキルカルボジイミド、例
えばジシクロヘキシルカルボジイミド；１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｅ
ＤＡＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノ
−４−エチル）カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンス
ルフォネート（ＣＭＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（ＮＨＳ）／ＥＤＡＣ、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシ
ンイミド（スルホ−ＮＨＳ）／ＥＤＡＣ等の活性化剤と
の反応により活性化される。該活性化反応は、典型的に
は−１０〜１００℃、好ましくは０〜３０℃、更に好ま
しくは０〜１０℃にて、好ましくは窒素、ヘリウム、ア
ルゴン等の雰囲気下で行なわれる。該活性化反応は、１
分間から１０日間、好ましくは１時間から２日間、更に
好ましくは６−１８時間で行なわれる。該活性化反応後
、活性化化合物は、小有機分子の溶液、または分子量２
０００以上の化合物の溶液に、有機性または水性／有機
性溶媒、例えばＤＭＦまたはＤＭＦ／ボレート緩衝溶液
等の中で添加される。この添加は、ある一定時間にわた
って行なわれてもよく、または、一回に行なわれてもよ
い。添加を一定時間にわたり行なう場合には、典型的に
は１分間から１２時間、好ましくは１０分間から８時間
、更に好ましくは３０分間から３時間を要する。添加後
に、該混合物は、１分間から３日間、好ましくは１０分
間から１日間、更に好ましくは１〜１８時間、攪拌され
る。

【０１３１】該生成物は、場合により、必要に応じて精
製される。ポリ（アミノ酸）−ハプテン接合体の精製お
よび特徴付けは、ここに参考として取入れるＭａｇｉｏ
らの“Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”（ＣＲ
Ｃ　　Ｐｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ，１９８
０）、第４章８６−８８頁に詳細に記述されている。例
えば、該接合体がシクロスポリン−免疫原性担体接合体
、またはシクロスポリン−酵素接合体の場合、精製は、
水性／有機性および水性溶液、例えば水／ＤＭＦまたは
水等に対する透析、あるいはセファデックス等の担体上
のゲル濾過クロマトグラフィにより行なうことができる
。

【０１３２】本発明の別の面は、シクロスポリン環状骨
格のアラニン窒素原子において免疫原性担体に接合され
たシクロスポリンを免疫原とする応答において調製され
る抗体類を含む。更に本発明は、このような抗体類およ
び標識の接合体を含む。

【００３３】好ましくは、該抗体類は、免疫原性担体に
接合されるシクロスポリンＡ、場合により水素以外に約
５０個未満の原子、好ましくは水素以外に約３５個未満
の原子、更に好ましくは水素以外に約２０個未満の原子
を有し、かつ約３５個以下、好ましくは約２５個以下、
更に好ましくは約１５個以下の原子の長さを有する鎖を
もった連結基を介して、第７および／または第８のシク
ロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子において
免疫原性担体に接合されるシクロスポリンＡに対して生
じたものである。

【０１３４】抗体は、他の分子の特定の空間的および極
性組織に特異的に結合し、従って相補的なものとして定
義される免疫グロブリンである。該抗体は、モノクロー
ナルまたはポリクローナルであってよく、この分野で周
知の技術、例えば宿主の免疫および公知技術により免疫
グロブリンが分離される血清の収集（ポリクローナル）
によって、また継続的ハイブリッド細胞系の調製および
分泌蛋白質の収集（モノクローナル）によって、または
天然抗体の特異的結合に要するアミノ酸配列を少なくと
もコードしているヌクレオチド配列またはその変異体の
クローニングおよび発現によって調製され得る。抗体類
は、完全な免疫グロブリンまたはその断片を含み、免疫
グロプリン類は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、
ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよび１ｇＧ３、ＩｇＭ等の種
々のクラスおよびアイソタイプを含む。それらの断片は
、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′等を含
んでよい。

【０１３５】モノクローナル抗体類は、Ｍｉ１ｓｔｅｉ
ｎおよびＫｏｈｌｅｒにより議論され、Ｎａｔｕｒｅ１
９７５、２５６、４９５−７に報告された方法によって
得ることができる。この方法の詳細は周知であってここ
には反復しない。しかしながら、それは基本的には通常
マウスまたは他の適当な動物である宿主に、免疫原を注
射することを含む。次いで該動物の牌臓から細胞を取出
す。別法として、該宿主は、インビトロにおいて免疫原
に感作された非感作牌臓細胞であってもよい。得られる
細胞は、ミエローマ細胞と融合される。融合細胞が結果
として得られ、“ハイブリドーマ”と称され、インビト
ロにおいて培養可能である。ハイブリドーマの母集団は
、選択され、個々のクローンが単離されるように操作さ
れ、それぞれが抗原に対して単一の抗体を分泌する。

【０１３６】本発明の抗体は、シクロスポリンおよび１
位に非修飾９個の炭素原子のアミノ酸を含む密接に関連
した化合物を特異的に認識することができる（ＣｓＡ番
号付け）。

【０１３７】本発明の抗体と標識との接合体は、ポリ（
アミノ酸）のシクロスポリン基への接合について既に述
べた方法により調製可能である。該シクロスポリン−連
結基接合体の活性化は、前述のようにして行なわれる。 活性化化合物の抗体への接合は、前述のようにして行な
われる。

【０１３８】好ましくは、標識接合体試薬のｐＨは、他
の考慮において該標識接合体の活性および安定性を平衡
化するように最適化される。その好ましい実施態様の一
つにおいて、本発明は、シクロスポリン−Ｇ６ＰＤＨ接
合体試薬に関し、ここにおいてｐＨは６−１０、好まし
くは７−９、更に好ましくは７．５−８．５である。好
ましくは、抗体試薬のｐＨは、アッセイ試薬組成物の安
定性および精度を最大とするように最適化される。好ま
しい実施態様の一つにおいて、本発明は、シクロスポリ
ン抗体試薬に関し、ここにおいてｐＨは、４−７、好ま
しくは５−６、更に好ましくは５．２５−５．８５であ
る。

【０１３９】ＢＬＧまたはＰＥＧ等のバルク化剤を含む
表面活性剤；トウィーン−２０、プルラファクスＡ３８
、トライトンＸ−１００、プルロニク２５Ｒ２、ＲＳＡ
、ＢＳＡ、モジュサイト（Ｍｏｄ−ｕ−ｃｙｔｅ）、ゾ
ルプロ（Ｓｏ１−ｕ−ｐｒｏ）等の消胞剤および界面活
性剤；およびこの分野で通常使用されている他の材料は
、抗体および標識接合体試薬の両者に添加することがで
きる。表面活性添加剤は、疎水性または低安定性化合物
の溶液中への維持、アッセイ試薬成分の安定化、または
アッセイ試薬活性の最適化のために添加することができ
る。

【０１４０】表面活性添加剤は、好ましくは、シクロス
ポリンを含むと考えられる試料に該抗体試薬を加えた際
に、シクロスポリンを溶液中に維持するために添加され
る。その好ましい一つの実施態様において、本発明は、
一種以上のバルク化剤、界面活性剤および／または消泡
剤が添加されたシクロスポリン抗体試薬に関する。

【０１４１】表面活性添加剤は、保存および使用時に、
標識接合体を溶液中に維持するために、標識接合体に添
加される。好ましい実施態様の一つにおいて、本発明は
、一種以上のバルク化剤、界面活性剤、および／または
消泡剤を含むシクロスポリン−Ｇ６ＰＤＨ接合体試薬に
関する。

【０１４２】試薬の保存寿命を長くするために、抗微生
物剤をアッセイ試薬に添加してもよい。この分野で一般
的な抗微生物剤が有用である。その最も好ましい実施態
様の一つにおいて、本発明は、抗微生物剤を含むシクロ
スポリンアッセイ試薬に関する。

【０１４３】本発明の他の面は、シクロスポリンを含む
と考えられる試料中のシクロスポリン量の測定方法に関
する。本発明の抗体および標識接合体は、シクロスポリ
ンを含むと考えられる試料中のシクロスポリン量の測定
方法において使用される。該アッセイは、場合により試
料の前処理、それに続く試料とシクロスポリンに対する
抗体との接触、および該抗体とシクロスポリンとの免疫
複合体の直接あるいは間接的定量という工程を含んでな
る。本発明のこの面において与えられる改良は、本抗体
のシクロスポリンに対する抗体としての利用である。該
免疫複合体は、例えば使用する抗体が標識に接合してい
る場合、直接に検出される。該免疫複合体は、アッセイ
媒質中の免疫複合体形成の信号生成系に対する効果を試
験することにより、あるいは、本発明の抗体に特異的に
結合する標識レセプタを使用することにより間接的に検
出される。

【０１４４】場合により前処理されるシクロスポリンを
含むと考えられる試料中のシクロスポリン測定アッセイ
の他の構成において、該試料を、シクロスポリンに対す
る抗体、および該抗体により認識される本発明の標識接
合体に接触させる。この方法は、更に、該標識接合体と
抗体との免疫複合体の量を、直接または間接的に測定す
ることを含む。場合により、水素以外に約５０個未満、
好ましくは３５、更に好ましくは２０個未満の原子を有
し、かつ長さにおいて約３５個以下、好ましくは２５、
史に好ましくは１５個以下の原子を有する鎖をもった連
結基を介し、標識に接合されたシクロスポリンを、標識
接合体として使用してもよい。

【０１４５】本発明のアッセイは、シクロスポリンに対
するすべての免疫アッセイに応用される。該アッセイは
、いずれかのアッセイ成分または生成物の分離を伴わず
（均質的）、あるいは分離を伴って（非均質的）行なわ
れ得る。非均質的アッセイの例は、酵素結合免疫吸着ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の酵素結合免疫アッセイである
。ＥｄＷａｒｄ　　Ｔ．Ｍａｇｇｉｏによる“Ｅｎｚｙ
ｍｅ　　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”ＣＲＣ　　Ｐｒｅｓ
ｓ　　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ
，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８０参照。均質的免疫アッセイ
は、酵素多重化免疫アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ　　ｍｕｌ
ｔｉｐｌｉｅｄ　　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）技術（例
えば、米国特許第３，８１７，８３７号参照）、米国特
許第３，９９３，３４５号に開示されている免疫蛍光法
、米国特許第４，２３３，４０２号に開示されている酵
素チャネリング（ｅｎｚｙｍｅ　　ｃｈａｎｎｅｌｉｎ
ｇ）技術、およびＭａｇｇｉｏの前出文献に議論されて
いる他の酵素免疫アッセイにより例示される。上記特許
の開示を、前述の特定のアッセイ方法の記述についてそ
の全体を参考としてここに取入れる。

【０１４６】分析すべき試料は、存在し得る細胞の溶解
、存在し得る蛋白質の沈殿、および／または存在し得る
シクロスポリンの可溶化等のために前処理されてもよい
。本発明の方法により分析される試料を、有機溶媒、好
ましくはアルコール、更に好ましくはメタノール等の炭
素原子７個未満のアルコールと接触させることにより前
処理することが好ましい。分折対象のアッセイは、通常
は最適なアッセイ感度を与える中程度のｐＨにて、水性
緩衝媒質中で行なわれる。

【０１４７】該水性媒質は、水のみでよく、または０〜
４０体積パーセントの共溶媒を含んでもよい。該媒質に
ついてのｐＨは、通常は約４〜１１の範囲、更に普通に
は約５〜１０の範囲、および、好ましくは約６．５〜９
．５の範囲である。ｐＨは、通常、いずれかの特異的結
合対の結合構成要素の最適結合、および信号生成系の構
成要素等、他のアッセイ試薬について最適なｐＨの間で
の妥協点である。

【０１４８】種々の緩衝溶液を、所望のｐＨ値を達成し
、また測定中のｐＨを維持するために使用してもよい。 例示的な緩衝溶液は、ボレート、ホスフェート、カルボ
ネート、トリス、バルビタール等を含む。この発明にお
いて使用された緩衝溶液は、臨界的ではなく、また個々
のアッセイにおいて一方あるいは他方の緩衝剤が好まし
い。

【０１４９】該アッセイを行なうためには、通常中程度
の温度が使用され、また測定の間、特に速度測定の間は
一定温度が使用される。熟成温度は、通常約５〜４５℃
の範囲、更に普通には約１５°〜４０℃である。測定の
間の温度は、一般には１０゜〜５０℃の範囲、更に普通
には約１５°〜４０℃である。

【０１５０】アッセイされるシクロスポリンの濃度は、
一般には約１０−５〜１０−−１３Ｍ、より普通には１
０−６〜１０−８Ｍで変化する。アッセイが、定量的、
半定量的、または定性的であること（試料中に存在する
シクロスポリンの量に相対的）等の考慮、特定の検出技
術、およびシクロスポリンの濃度は、一般に種々の試薬
の濃度を決定する。

【０１５１】一方においてアッセイ媒質中の種々の試薬
濃度は、興味あるシクロスポリンの濃度範囲により決定
されるが、各試薬の最終濃度は、範囲にわたるアッセイ
の感度を最適化するように経験的に決定される。すなわ
ち、重要であるシクロスポリン濃度の変化は、正確に測
定可能な信号の差異を与える。

【０１５２】添加量の順序は、広範囲に変化するが、ア
ッセイの性質に依存するある種の選択がある。添加の最
も簡単な順序は、すべての材料を同時に添加し、アッセ
イ媒質が信号に対して有する効果を均質アッセイとして
測定する。別法として、試薬は順次合せられ得る。場合
により、熟成工程は、各添加に引続き、一般に３０秒か
ら６時間、より普通には１分間から１時間の範囲で行わ
れてもよい。

【０１５３】均質系アッセイにおいてすべての試薬が同
時に、または順次合せられた後、信号が測定される。該
信号は、試験試料中のシクロスポリン量に関連する。例
えば酵素多重化アッセイ技術において、その開示をここ
に参考として取入れる米国特許第３，８１７，８３７号
（１９７４）に記述されているように、シクロスポリン
の検出のためにはシクロスポリンを含むと考えられる試
料を、水性媒質中に同時あるいは順次に、本発明の抗体
および本発明のシクロスポリン酵素接合体と合わせる。

【０１５４】一般には酵素に対する基質が添加され、こ
れは酵素触媒反応により発色性または蛍光性生成物を生
じる。好ましくは、該シクロスポリン酵素接合体は、第
７のシクロスポリンアミノ酸残基のアラニン窒素原子に
おいて、場合により水素以外に約５０個未満の原子、好
ましくは水素以外に約３５個未満の原子、更に好ましく
は水素以外に約２０個未満の原子を有し、かつ長さにお
いて約３５個以下、好ましくは２５個以下、更に好まし
くは１５個以下の原子からなる鎖を有する連結基を介し
て、酵素に接合されるシクロスポリンＡである。特に好
ましい酵素は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼである。試料中のシクロスポリンと該シクロスポリン
酵素接合体とは、抗体上の部位について競合する。

【０１５５】次いで、媒質中の酵素活性が、通常分光学
的手段により測定され、シクロスポリンの存在量が既知
の標準または参照試料を試験した場合に測定される酵素
活性と比較される。典型的には、標準または参照試料は
、シクロスポリンが含まれると考えられる試料と実質的
に同じ方法で試験される。一般的に、比較は、未知試料
からの結果と、数種の標準試料のアッセイ操作の結果と
についてなされる。該標準試料は、測定すべきシクロス
ポリン分析対象物を、既知であるが異なった濃度で含む
。好ましくは、標準試料中に存在する濃度範囲は、未知
試料中の考えられる分析対象物濃度の範囲におよぶもの
である。

【０１５６】非均質系アッセイは、通常は１以上の分離
工程を含む。該非均質系アッセイは、競合的または非競
合的であり得る。競合的アッセイにおいて、本発明の抗
体は、支持体に結合され、次いで試料およびシクロスポ
リンの環状骨格のアラニン原子において酵素等の検出可
能な標識に接合されたシクロスポリンを含有する媒質に
接触させられる。試料中のシクロスポリンは、支持体に
結合された抗体上の部位について該接合体と競合する。 支持体と媒質とを分離した後、支持体または媒質の標識
活性を、常法により測定し、試料中のシクロスポリン量
と関連付ける。

【０１５７】別の競合的非均質系手段において、本発明
の抗体が支持体に結合される。媒質は、シクロスポリン
を含むと考えられる試料、およびシクロスポリンの環状
骨格のアラニン窒素原子において、ビオチン等の小有機
分子（分子量２，０００未満）に接合されたシクロスポ
リンを含有して調製される。好ましくは、シクロスポリ
ンＡは、第７および／または第８のシクロスポリンＡア
ミノ酸残基のアラニン窒素原子において、場合により水
素以外に約５０個未満の原子、好ましくは水素以外に約
３５個未満の原子、更に好ましくは水素以外に約２０個
未満の原子を有し、長さにおいて約３５個以下、好まし
くは２５個以下、更に好ましくは１５個以下の原子から
なる鎖を有する連結基を介して接合される。

【０１５８】シクロスポリンおよび該接合体は、抗体部
位について競合する。一定時間後、該支持体は媒質から
分離され、洗浄され、レセプタまたは酵素等、標識に結
合された小有機分子の結合相手を含有する第２の媒質に
接触させられる。該小有機分子がビオチンである場合に
、該支持体は、酵素に結合するアビジンと接触させられ
る。該支持体が第２の媒質から分離され、支持体または
第２の媒質のいずれかの酵素活性が、常法により測定さ
れる。該酵素活性は、試料中のシクロスポリン量に関連
する。

【０１５９】非競合的方法の例は、２種の抗休を含むサ
ンドイッチアッセイであり、抗体の一方は、標識され、
他方は支持体に固定されるか、または支持体への固定化
が図られる。

【０１６０】別の面において、試料中のシクロスポリン
の存在または量を測定するために、凝集を利用すること
ができる。シクロスポリンの環状骨格のアラニン窒素原
子において免疫原性担体に接合されたシクロスポリンに
対する応答において生じた抗体は、粒子に接合すること
ができる。好ましくは該抗体は、第７および／または第
８のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子
において、場合により水素以外に約５０個未満の原子、
好ましくは水素以外に約３５個未満の原子、更に好まし
くは水素以外に約２０個未満の原子を有し、長さにおい
て約３５個以下、好ましくは２５個以下、更に好ましく
は１５個以下の原子からなる鎖を有する連結基を介して
免疫原性担体に接合されるシクロスポリンＡに対する応
答において生じるものである。好ましい免疫原性担体は
、ＫＬＨおよびＢＳＡを含み、更に好ましくはＫＬＨで
ある。

【０１６１】凝集という点で利用できる他の接合体は、
シクロスポリンの環状骨格のアラニン窒素原子において
粒子に接合されたシクロスポリンである。好ましくはシ
クロスポリンＡは、第７および／または第８のシクロス
ポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子において、場
合により水素以外に約５０個未満の原子、好ましくは水
素以外に約３５個未満の原子、更に好ましくは水素以外
に約２０個未満の原子を有し、長さにおいて約３５個以
下、好ましくは２５個以下、更に好ましくは１５個以下
の原子からなる鎖を有する連結基を介して免疫原性担体
に接合される。

【０１６２】この凝集という面における一方法として、
シクロスポリンを含むと思われる試料は、上述の抗体粒
子接合体に合されてもよい。適当な熟成の後、シクロス
ポリンの存在による粒子の凝集の程度が直接的に測定さ
れ得る。他方において、該粒子は媒質から分離され得、
かつ上述の方法で粒子に接合されたシクロスポリンと合
することができる。凝集は、試料中のシクロスポリン量
の指標として測定される。上の記述は、本発明の化合物
を使用して行なうことができる多くの凝集プロトコール
のうちの２種類を例示するにとどまる。

【０１６３】本発明の他の局面は、シクロスポリンを含
むと思われる試料中のシクロスポリン量測定のための本
発明のアッセイ方法を都合よく実施するに有用なキット
に関するものである。この発明の応用性を増強するため
に、試薬類は、その割合が該方法およびアッセイの実質
的な最適化を与えるように、同じまたは分離された容器
中において包装された組合せとして提供される。試薬類
は、その交差反応性および安定性に依存して、それぞれ
分離された容器とするか、あるいは種々の試薬を１個以
上の容器に合せることができる。該キットは、試薬の一
つとして、シクロスポリンの環状骨格のアラニン窒素原
子において免疫原性担体に接合されたシクロスポリンに
対する応答において生ずる抗体を含む。好ましくは、該
抗体は、第７および／または第８のシクロスポリンＡア
ミノ酸残基のアラニン窒素原子において、場合により水
素以外に約５０個未満の原子、好ましくは約３５個未満
の原子、更に好ましくは水素以外に約２０個未満の原子
を有し、長さにおいて約３５個以下、好ましくは２５個
以下、更に好ましくは１５個以下の原子からなる鎖を有
する連結基を介して接合されるシクロスポリンＡに対す
る応答において生じたものである。好ましい免疫原性担
体は、ＫＬＨおよびＢＳＡを含み、更に好ましくはＫＬ
Ｈである。この抗体は、標識されてもされなくてもよい
。

【０１６４】このキットは、シクロスポリンの環状骨格
のアラニン窒素原子において標識に接合されるシクロス
ポリンを含んでもよい。好ましくは、シクロスポリンＡ
は、第７および／または第８のシクロスポリンＡアミノ
酸残基のアラニン窒素原子において、場合により水素以
外に約５０個未満の原子、好ましくは水素以外に約３５
個未満の原子、更に好ましくは水素以外に約２０個未満
の原子を有し、長さにおいて約３５個以下、好ましくは
２５個以下、更に好ましくは１５個以下の原子からなる
鎖を介して接合される。該キットは、更に信号生成系の
構成要素、支持体、補助試薬等を含む、アッセイの実施
のための他の包装試薬を包むことができる。

【０１６５】上記定義に記述したように、支持体は、多
孔性または非多孔性の水不溶性材料である。該支持体は
、親水性または親水性を付与し得るものであって、シリ
カ、硫酸マグネシウム、およびアルミナ等の無機粉体；
例えば濾紙、クロマトグラフィ用紙等の紙類を含む繊維
等、特にセルロース性またはセルロースから誘導される
材料である天然ポリマー材料；ニトロセルロース、セル
ロースアセテート、ポリ（ビニルクロライド）、ポリア
クリルアミド、交差結合デキストラン、アガロース、ポ
リアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ
（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレ
ート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポ
リ（ビニルブチレート）等の合成または修飾された天然
産生ポリマー類；それら自体で使用されるか、あるいは
他の材料と組合せて使用される、Ｂｉｏｇ１ａｓｓとし
て入手可能なガラス、セラミクス、金属等を含む。

【０１６６】本発明によるアッセイにおいては、種々の
補助材料がしばしば使用される。緩衝剤は、アッセイ媒
質およびアッセイ成分のための安定化剤と共に、通常ア
ッセイ媒質中に存在する。これらの添加物に加え、アル
ブミン等の付加的な蛋白質、または界面活性剤、特に非
イオン性界面活性剤、結合増強剤、例えばポリエチレン
グリコール等がしばしば含まれるであろう。

【０１６７】別の局面において、本発明は、場合により
連結基を介して標識または免疫原性担体に接合されたア
チオシクロスポリンに関する。該アチオシクロスポリン
は、好ましくはシクロスポリン代謝産物、更に好ましく
はシクロスポリンＡ代謝産物、更になお好ましくはシク
ロスポリンＡ代謝産物Ｍ１から形成される。

【０１６８】好ましくは、連結基は、結合または水素以
外に１〜６０個の原子を有し、かつ長さにおいて３０個
以下の原子からなる鎖を有する基である。更に好ましく
は、連結基は、水素以外に１〜１０個の原子を有し、か
つ長さにおいて５個以下の原子からなる鎖を有する基で
ある。

【０１６９】標識および免疫原性担体は、シクロスポリ
ン接合体について上述した標識および免疫原性担体と同
じ群から選択される。酵素アッセイについては、標識は
酵素である。均質系酵素免疫アッセイについては、好ま
しくは標識はデヒドロゲナーゼ、更に好ましくはグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。免疫原性担
体は、好ましくは抗原性ポリ（アミノ酸）、更に好まし
くは、キーホールリンペットヘモシアニンである。

【０１７０】本発明の好ましい実施態様の一つは、式：

【化２６】

【０１７１】の組成物に関し、式中Ｒは、式：

【化２７
】

【０１７２】であり、Ｚは、蛋白質、ポリサッカライド
、リポ蛋白質、糖蛋白質等、好ましくは分子量２，００
０以上のポリペプチド等の免疫原性担体であり、更に好
ましくはＺは、キーホールリンペットヘモシアニンまた
はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼであり、ま
たｎは、１から、Ｚの分子量を５０００で割った値まで
の数である。

【０１７３】別の局面において、本発明は、シクロスポ
リンのアッセイにおいて交差反応性物質を認識できる抗
体に関するものである。該アッセイは、好ましくは上述
のアッセイの一つである。上述したように、妨害的交差
反応性物質は、シクロスポリン代謝産物、更に好ましく
はシクロスポリンＡ代謝産物、更になお好ましくは、シ
クロスポリンＡ代謝産物Ｍ１である。

【０１７４】本発明のこの局面における抗体類は、シク
ロスポリン量測定のためのアッセイにおいて妨害しない
。従って、該抗体類は、妨害的交差反応性物質に結合す
るが、アッセイ条件下においてシクロスポリンまたはシ
クロスポリン−標識接合体には実質的に結合できない。 好ましくは、該抗体は、ウンデカペブチド環をなおも含
んでいるシクロスポリンＡ代謝産物に結合し、シクロス
ポリンＡには実質的に結合せず、またシクロスポリン−
酵素接合体の酵素活性を実質的に阻害しない。

【０１７５】本発明の好ましい実施態様の一つは、式：

【化２８】

【０１７６】の組成物に対する応答により生ずる抗体に
関するものであり、式中Ｒは、式：

【化２９】

【０１７７】であり、Ｚは、蛋白質、ポリサッカライド
、リポ蛋白質、糖蛋白質等、好ましくは分子量２，００
０以上のポリペプチド等の免疫原性担体であり、更に好
ましくはＺは、キーホールリンペットヘモシアニンであ
り、またｎは、１から、Ｚの分子量を５０００で割った
値までの数である。これらの抗体は、シクロスポリンＡ
代謝産物Ｍ１に結合可能であり、シクロスポリンＡを実
質的に認識せず、かつ第７のシクロスポリンＡアミノ酸
残基のアラニン窒素原子において、場合により連結基を
介してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼに接合
されるシクロスポリンＡの酵素活性を実質的に阻害しな
い。

【０１７８】妨害的交差反応性物質を認識可能な抗体類
は、前述のシクロスポリンを認識する抗体に関する方法
によって調製され得る。

【０１７９】他の面において、本発明は、場合により連
結基を介して免疫原性担体または標識に接合されるアチ
オシクロスポリンの調製方法に関するものである。

【０１８０】これらの接合体の調製方法は、次の工程を
含む：（ａ）　　シクロスポリン代謝産物を、第１のア
ミノ酸残基のオレフィン性側鎖において酸化的に開裂さ
せる；（ｂ）　　場合により、ａ）の生成物を延長し、
アチオシクロスポリン−連結基接合体を形成する；（ｃ
）　　ｂ）の生成物を、接合のために活性化する；およ
び（ｄ）　　ｃ）の活性化生成物を、標識または免疫原
性担体と反応させることにより、接合体を形成させる。

【０１８１】工程ａ）の酸化的開裂反応は、シクロスポ
リン代謝産物の第１のアミノ酸残基の第６および第７の
炭素原子を結合する１個以上の結合を開裂することが好
ましい。該開裂反応は、第６の炭素原子に官能基を生成
する。この官能基は、ヒドロキシ、ケト、アルデヒド、
カルボン酸、アミノ、イミド、スルフィド、ジスルフィ
ド等のいずれかであり、これは、アチオシクロスポリン
−連結基接合体を形成するために側鎖を延長するか、あ
るいは該アチオシクロスポリンを直接に結合を介して免
疫原性担体または標識に接合するために使用され得る。

【０１８２】更に好ましくは、酸化的開裂反応は、アチ
オシクロスポリンカルボキシアルデヒドを生成する。こ
の型の２種類の開裂反応の例は、オゾン分解および過ヨ
ウ素酸分解である。エポキシ化／二重結合の開環により
調製される１，２−ジオール類の過ヨウ素酸分解は、詳
述されている（Ｄｒｙｈｕｒｓｔ，Ｇ．の“ジオールお
よび他の官能基の過ヨウ素酸酸化”（Ｐｒｅｇａｍｏｎ
　　Ｐｒｅｓｓ，ＮｅＷＹｏｒｋ，１９７０））。二重
結合のオゾン分解は、やはり詳述されている（“Ｏｚｏ
ｎｅ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ａｎｄ　　Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ”（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　　Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
１９５９）；Ｍａｙ　　Ｄ，Ｆ．Ｒ．“有機化合物の酸
化”（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｓｏ
ｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９６７
）；Ａｕｇｕｓｔｄｉｎｅ，Ｒ．Ｌ．らの“酸化”（Ｍ
ａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅＷ　　Ｙｏｒｋ，１９７
１））。

【０１８３】更になお好ましくは、酸化的開裂反応は、
溶液相オゾン分解と引続く還元的仕上げである。該反応
のための好ましい溶媒は、ジクロロメタン等のハロアル
カンを含む。反応温度は、−１００℃〜１０℃、好まし
くは−７８℃〜−５０℃である。オゾンは、反応内に気
体流、好ましくは酸素または空気、更に好ましくは酸素
中にて導入される。該反応は、オゾンの特徴的な青色を
溶液が示すまで継続される。次いで、過剰のオゾンを溶
液から好ましくは不活性気体流により除去する。反応混
合物の温度を３０℃以下まで、好ましくは０℃以下まで
、更に好ましくは−１０℃以下まで昇温させる。次いで
還元剤を加え、最終アルデヒド生成物を生成させる。 好ましくは、還元剤は、ジアルキルスルフィド、更に好
ましくはジメチルスルフィドである。

【０１８４】鎖延長反応ｂ）は、シクロスポリン分子の
連結基を延長するための上述したいずれの反応であって
もよい。好ましくは、該反応ｂ）はアルデヒド延長反応
である。更に好ましくは、延長は、アチオシクロスポリ
ンカルボキシアルデヒドをアミノオキサルアルカン酸と
反応させることにより達成される。

【０１８５】好ましくは、該アミノオキサルアルカン酸
は、アミノオキシ酢酸ＨＣｌ塩である。該反応は、アル
カノール溶媒、好ましくは低級アルカノール溶媒、更に
好ましくはメタノール中で行なわれる。この反応は、０
℃と１００℃との間、好ましくは２０℃と５０℃との間
、更に好ましくは室温にて行なわれる。この反応は、不
活性雰囲気下で、１分間と２０時間との間、好ましくは
１０分間と１０時間との間、更に好ましくは１時間と２
時間との間で行なわれる。

【０１８６】ｃ）の活性化反応は、上述したシクロスポ
リン−連結基接合体の活性化と同様にして行なわれ、該
活性化反応は、スルホ−ＮＨＳによる処理を含む。ｄ）
の接合反応は、上述したシクロスポリン−連結基接合体
の接合反応と同様にして行なわれ、好ましくは、該接合
反応は、工程ｃ）の活性化エステル生成物をポリ（アミ
ノ酸）と共に処理することを含む。

【０１８７】その好ましい実施態様の一つにおいて、本
発明は、スキームＩの化合物（４）の調製方法に関する
ものである。スキームＩの工程ａ）は、シクロスポリン
Ａ代謝産物Ｍ１（化合物（１）、スキームＩ）のオゾン
による分解であり、ジメチルスルフィドによる仕上げが
引続く。スキームＩの工程ｂ）は、化合物（２）のアミ
ノオキシ酢酸ＨＣｌ塩を用いた処理による鎖延長であり
、化合物（３）が形成される。スキームＩの工程ｃ）は
、スルホーＮＨＳを用いた化合物（３）の活性化であり
、活性化エステルが形成される。スキームＩの工程ｄ）
は、工程ｃ）の活性化エステル生成物と、キーホールリ
ンペットヘモシアニンまたはグルコース−６−リン酸と
のカップリングであり、好ましい化合物（４）が形成さ
れる。

【０１８８】

【化３０】 ＫＬＨ＝キーホールリンペットヘモシアニン

【０１８９
】

【化３１】

【０１９０】別の局面において、本発明は、シクロスポ
リンを含むと考えられる試料中のシクロスポリン量測定
のためのアッセイにおいて、妨害的交差反応性物質を不
活性化する方法に関する。好ましくは、該アッセイは上
述したシクロスポリンアッセイの一つである。該不活性
化方法は、シクロスポリンを含むと考えられる試料を含
有する媒質を、妨害的交差反応性物質に結合可能な抗体
と合せることを含む。好ましくは、該アッセイ媒質は、
上述したアッセイ媒質である。

【０１９１】使用される抗体は、シクロスポリン量測定
のためのアッセイにおいて妨害しない。好ましくは、該
抗体類はアッセイ条件下で、シクロスポリンに実質的に
結合しない。更になお好ましくは、抗体は妨害的交差反
応性物質に結合し、シクロスポリンに実質的に結合せず
、またアッセイ条件下でシクロスポリン−標識接合体に
実質的に結合しない。

【０１９２】好ましい実施態様の一つにおいて、本発明
は、シクロスポリンＡ代謝産物Ｍ１に結合し、シクロス
ポリンＡに実質的に結合せず、かつ第７のシクロスポリ
ンアミノ酸残基のアラニン窒素原子において、場合によ
り連結基を介してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼに接合されるシクロスポリンＡを実質的に阻害（す
なわち実質的に認識）しない抗体を合せることを含む。

【０１９３】妨害的交差反応性物質を不活性化するため
に必要とされる抗体の量は、シクロスポリンを含むと考
えられる試料中に存在する物質の量、および該物質がア
ッセイを妨害する程度に依存する。より多くの妨害物質
が存在し、かつ交差反応の程度が大きいほど、より多く
の抗体が要求され、アッセイの性能を犠牲にせずに交差
反応を最小とすべく充分な抗体が添加される。

【０１９４】血清中に存在するＭ１の量は、検出される
全ＣｓＡ（代謝産物を含む）の下限９．６％および上限
２３％であることが報告されている。Ｍ１の濃度は、心
臓移植患者の群において３０〜９０ｎｇ／ｍＬ、および
肝臓移植患者の群において２２６〜５４４ｎｇ／ｍＬで
あることが報告されている（ＴｒａｎｓｐｌａｎｔＰｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇ　　１９８８、ＶＸＸ、１７３−１７
５および６１４−６２２参照）。代謝産物Ｍ１の妨害の
程度は、シクロスポリンに結合する抗体の選択性に依存
する。選択性がより低いシクロスポリン抗体を用いるほ
ど、Ｍ１による妨害の程度は大きい。

【０１９５】別の局面において、本発明は、シクロスポ
リンのアッセイにおける妨害的交差反応性物質の不活性
化方法を都合よく行なうために有用なキットに関する。 このようなキットについての好ましい考察は前述されて
おり、また該キットは、本発明のこの局面に従って抗体
を含んでいる。

【実施例】

【０１９６】下記の実施例は、本発明の特定の実施態様
を更に記述するものである。これらは典型的な例示的実
施例であり、また本発明の範囲を記述するが限定するこ
とを意図するものではない。

【０１９７】例　　１保護シクロスポリン乾燥ピリジン
（６ｍＬ）および乾燥ジクロロメタン（６ｍＬ）中のシ
クロスポリンＡ（１８００ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）の攪
拌されている溶液に、クロロトリメチルシランを、室温
にてアルゴン雰囲気下に滴々加えた。添加完了後、該混
合物を一夜攪拌した。次いで、該混合物を真空下に乾燥
まで蒸発させ、固体残渣をジクロロメタンに再溶解させ
、エチルアセテート／ヘキサン（８０：２０）により溶
出するシリカゲルカラム上で精製し、ＴＭＳ保護シクロ
スポリンＡを得た（式（ＸＸＶ）、ＴＭＳ−ＣｓＡ、１
７００ｍｇ、８９％）；白色固体。Ｍ．Ｐ．：１５２−
１５６℃。Ｉ．Ｒ．（ＣＨＣ１３）：３６５０ｗ、３３
００ｓ、２９５０ｓ、２９４５ｓ、２８５０ｓ、１６５
０ｓ、１４１５ｓ、および１４００ｃｍ１。Ｍ．Ｓ．：
ｍ／ｅ１２７５（Ｍ＋）。１Ｈおよび１３Ｃ　　ＮＭＲ
スペクトルは、与えられた構造に一致した。

【０１９８】例　　２ｐ−カルボキシベンジルシクロス
ポリンのキーホールリンペットヘモシアニン接合体Ａ．
保護ｐ−カルボキシベンジルシクロスポリン乾燥トルエ
ン（２０ｍＬ）中の例１の生成物（９００ｍｇ、０．７
１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、１５−クラウン−５エーテ
ル（０．３ｍＬ）を加えた。次いで、ナトリウムハイド
ライド（３５０ｍｇ、鉱油中の５０％懸濁液、乾燥トル
エンにて洗浄）を、氷浴温度にてアルゴン雰囲気下で加
えた。該混合物を攪拌し、３０分間にて室温まで加温さ
れることを許容した。メチルｐ−ブロモメチルベンゾエ
ート（４００ｍｇ、２．５×０．７１ｍｍｏｌ）を添加
し、該混合物を室温にて２４時間攪拌した。

【０１９９】エチルアセテート（１５０ｍＬ）を加え、
続けて水（５０ｍＬ）を徐々に注意深く加え、次いで塩
酸（１Ｎ）を、該混合物が酸性（ｐＨ≒３．０）となる
まで加えた。有機層を分離し、水（２×５０ｍＬ）、食
塩水（１００ｍＬ）により洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）
させた。溶媒を減圧下で除去して青白色泡状物（１．３
ｇ）を得、これをシリカゲル薄層プレート上にてエチル
アセテート／ヘキサン（６５：３５；Ｒ、約０．６）で
溶離して、第７および第８のシクロスポリンＡアミノ酸
残基のアラニン窒素原子において式（ＸＩＩＩ）の連結
基を介してメトキシ基に結合するＴＭＳ保護シクロスポ
リンＡ混合物（約５０：５０）を得た；白色固体（６７
０ｍｇ、６７％）。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ１，４２３（Ｍ＋
）。１Ｈおよび１３Ｃ　　ＮＭＲスペクトルは、与えら
れた構造式に一致した。

【０２００】Ｂ．ｐ−カルボキシベンジルシクロスポリ
ンメタノール（５ｍＬ）中の例２Ａの生成物（２８０ｍ
ｇ、０．１９７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に水を加えた（滴
々、約１．５ｍＬまたは溶液がわずかに白濁するまで）
。炭酸カリウム（無水、２３０ｍｇ）を加え、該混合物
を１２時間攪拌し、追加的に水を、溶液がわずかに白濁
するまで滴々加えた。該混合物を更に１２時間、室温に
て攪拌した。この混合物に、塩酸（１Ｎ）を溶液が酸性
（ｐＨ≒２．０）になるまで注意深く入れた。水（５０
ｍＬ）を加え、該混合物をジクロロメタン（３×５０ｍ
Ｌ）で抽出した。有機抽出分を合せ、食塩水（２×５０
ｍＬ）にて洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。 溶媒を減圧下に除去して粗製の生成物（２７０ｍｇ）を
得、これをジクロロメタン（１０ｍＬ）に再溶解し、シ
リカゲルカラム上で、出発物質を除去するまでエチルア
セテートで溶出させ、次いでエチルアセテート／酢酸（
９９．９９：０１）で溶離して、第７および第８のシク
ロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子において
式（ＸＩＩＩ）の連結基を介してヒドロキシ基に結合す
るシクロスポリンＡ混合物（約５０：５０）を得た（１
６０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、６３％）；白色固体。Ｍ
．Ｐ．：１７１−１７７℃。Ｉ，Ｒ．（ＣＨＣｌ３）：
３７００ｗ、３３００ｗ、３０００ｍ、２９５０ｓ、２
９２０ｍ、２８７５ｍおよび１６４０ｃｍ−１。 Ｕ．Ｖ．：（エタノール）２３０ＮＭ（ε＝２．４×１
０４）。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ１３３４（Ｍ１，２４）。元
素分析Ｃ７０Ｈ１１７Ｎ１１Ｏ１４についての理論値：
Ｃ，６２．９０；Ｈ，８．８２；Ｎ，１１．０６。実験
値：Ｃ，６２．１０；Ｈ，８，８３；Ｎ，１０．０８。 １Ｈおよび１３Ｃ　　ＮＭＲスペクトルは与えられた構
造に一致した。

【０２０１】Ｃ．キーホールリンペットヘモシアニン免
疫原乾燥ＤＭＦ（１．３ｍＬ）中の例２Ｂの生成物（１
００ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、氷浴温
度にてアルゴン雰囲気下で、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）（
２１ｍｇ、１．５×０．０７４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒ
ドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）（２
５ｍｇ、１．５×０．０７４ｍｍｏｌ）を加えた。 該混合物を、一夜またはＴＬＣ分析（エチルアセテート
／酢酸、９９：１）により出発物質が無くなるまで攪拌
した。この溶液を、ボレート緩衝溶液（６ｍＬ、１００
ｍＭ、（ｐＨ≒９．１）およびＤＭＦ（０．５ｍＬ）中
のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（１５
０ｍｇ、６６％蛋白質、９２％純度）の溶液を、氷浴温
度で１．５時間で加えた。添加完了後、該混合物を、４
℃の冷室（以下“冷室”と称す）中で一夜攪拌した。該
乳様混合物を、水／ＤＭＦ（８０：２０）、水／ＤＭＦ
（９０：１０）、最後に水のみに対して透析した。透析
袋内容物を凍結乾燥して、第７および第８のシクロスポ
リンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子において式（Ｘ
ＩＩＩ）の連結基を介してキーホールリンペットヘモシ
アニンに結合するシクロスポリンＡ（１５０ｍｇ）を得
た。

【０２０２】Ｄ．ハプテン数の測定ボレート緩衝溶液（
ｐＨ≒９．１、１００ｍＭ）中の例２Ｃの生成物の溶液
（０．５９ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬ）に、２，４，６−トリ
ニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢ）（０．１％、１ｍ
Ｌ）溶液を加え、該混合物を４０℃にて２時間攪拌した
。該混合物を室温まで冷却後、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）の溶液（１０％、１ｍＬ）および塩酸（１Ｎ
、１ｍ）を加えた。ボレート緩衝溶液（ｐＨ≒９．１、
１００ｍＭ）中のＫＬＨ（精製、１．０９ｍｇ／ｍＬ）
の標準溶液を調製し、ＴＮＢＳ溶液（１ｍＬ、０．１％
）により４０℃にて２時間処理した。この標準溶液を、
ＳＤＳ溶液（１０％、１ｍＬ）および塩酸（１Ｎ、１ｍ
Ｌ）と反応させた。試料および標準溶液の３４０ｎｍに
おける吸光度を測定し、Ｈａｂｅｅｂ，Ａ．Ｆ．Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６６，１４，
３２８（ここに参考として加える）の方法に従ってハプ
テン数を計算し、１，１００を得た。

【０２０３】例　　３ｏ−カルボキシベンジルシクロス
ポリンのキーホールリンペットヘモシアニン接合体Ａ．
保護ｏ−カルボキシベンジルシクロスポリン乾燥トルエ
ン中のナトリウムハイドライド（３５０ｍｇ、鉱油中の
５０％懸濁物、乾燥トルエンにより３×１０ｍＬで洗浄
）の攪拌懸濁物に、例１の生成物（９００ｍｇ、０．７
１ｍｍｏｌ）を室温で加え、続けて１５−クラウン−５
エーテル（０．３５ｍＬ）を加えた。該混合物を室温に
てアルゴン雰囲気下で３０分間攪拌した。メチルｏ−ブ
ロモメチルベンゾエートを４分割して加えた（０、１２
時間、２４時間、３６時間の時点；各時点で５０８ｍｇ
を加え、全体として４×５０８ｍｇ、４×２ｍｍｏｌ）
。 該混合物を、室温にて３６時間攪拌した後、エチルアセ
テート（１５０ｍＬ）を加え、次いで水（２０ｍＬ）を
注意深く加えた。該混合物を、塩酸（１Ｎ）により酸性
化した。

【０２０４】有機層を分離し、水（３×３０ｍＬ）、食
塩水（５０ｍＬ）により洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ
４）。有機溶媒を除去し、油状残渣をエチルアセテート
に再溶解させ、エチルアセテート／ヘキサン（６５：３
５、ＲＦ≒０．６）で溶離するシリカゲル薄層プレート
にて精製し、第７および第８のシクロスポリンＡアミノ
酸残基のアラニン窒素原子において、式（ＸＩＶ）の連
結基を介してメトキシル基に結合するＴＭＳ保護シクロ
スポリンＡ混合物（約５０：５０）を得た（６００ｍｇ
、６０％）。白色固体。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ　　１，４２
３（Ｍ＋）。１Ｈおよび１３Ｃ　　ＮＭＲスペクトルは
、与えられた構造に一致した。

【０２０５】Ｂ．ｏ−カルボキシベンジルシクロスポリ
ンメタノール（１０ｍＬ）中の例３Ａの生成物（５００
ｍｇ、０．３５７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水を添加し
た（≒３．０ｍＬまたはわずかに白濁するまで）。炭酸
カリウム（無水、１０００ｍｇ）を加えた（混合物の白
濁が残っている場合には、透明な溶液が得られるまでメ
タノールを数滴加える）。該混合物を室温で、アルゴン
雰囲気下で２７時間攪拌した。ジクロロメタン（１５０
ｍＬ）および水（５０ｍＬ）を加えた。該有機層を分離
し、水性層をジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で抽出し
た。合せた有機層を、水／食塩水（１：１、２×５０ｍ
Ｌにより洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。溶媒を蒸
発させて乾燥させ、粗生成物（４０ｍｇ）を得、これを
シリカゲルカラム上で、出発物質および非酸性物質が除
去されるまでエチルアセテートで溶出し、次いでエチル
アセテート／酢酸（９９．５：０．５）の混合物により
溶出させて、第７および第８のシクロスポリンＡアミノ
酸残基のアラニン窒素原子において式（ＸＩＶ）の連結
基を介してヒドロキシル基に結合するシクロスポリンＡ
の混合物（約５０：５０）を得た（３５０ｍｇ、０．２
６ｍｍｏｌ、７５％）。白色固体。Ｍ．Ｐ．：１６２−
１７１℃。Ｉ．Ｒ．（ＣＨＣｌ３）：３５００ｗ、３４
５０ｗ、３４００ｍ、３３００ｓ、２９５０ｍ、２８５
０ｍ、および１６２０ｓ、１４２０ｍ、１４００および
１２００ｂｃｍ−１。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ　　１３３４（
Ｍ−１、６０）。元素分析Ｃ７０Ｈ１１７Ｎ１１Ｏ１４
についての理論値：Ｃ，６２．９０；Ｈ，８．８２；Ｎ
，１１．０６。実験値：Ｃ，６２．２３；Ｈ，８．４８
；Ｎ，１１．７９。１Ｈおよび１３Ｃ　　ＮＭＲスペク
トルは、与えられた構造に一致した。

【０２０６】Ｃ．キーホールリンペットヘモシアニン免
疫原例３Ｂの生成物および例２Ｃの方法を使用して、第
７および第８のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニ
ン窒素原子において、式（ＸＩＶ）の連結基を介してキ
ーホールリンペットヘモシアニンに結合するシクロスポ
リンＡの混合物（約５０：５０）を、同様な収率をもっ
て調製した。

【０２０７】Ｄ．ハプテン数の測定例３Ｃの生成物およ
び例２Ｄの方法を使用して、ハプテン数５００を得た。

【０２０８】例　　４ｏ−カルボキシベンジルシクロス
ポリンのウシ血清アルブミン接合体Ａ．ウシ血清アルブ
ミンシクロスポリンウシ血清アルブミンをＫＬＨに代え
て用いた点を除き、例３Ｂの生成物および例２Ｃの方法
を使用して、第７および第８のシクロスポリンＡアミノ
酸残基のアラニン窒素原子において、式（ＸＩＶ）の連
結基を介してウシ血清アルブミンに結合するシクロスポ
リンＡ（Ｃｓ−ＢＳＡ）の混合物（約５０：５０）を、
同様な収率をもって得た。

【０２０９】Ｂ．ハプテン数の測定ＢＳＡをＫＬＨに代
えて使用した点を除き例２Ｄの方法を使用して、例４Ａ
で形成したＣｓ−ＢＳＡ接合体のハプテン数として５５
が見出された。

【０２１０】例　　５保護ヒドロキシメチルシクロスポ
リン乾燥トルエン（３０ｍＬ）中の例１の化合物（１０
００ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）および１５−クラウン−
５エーテル（０．２ｍＬ）の攪拌溶液に、ナトリウムハ
イドライド（４５０ｍｇ、鉱油中の５０％懸濁物、乾燥
トルエンにて洗浄）を、室温にてアルゴン雰囲気下に加
えた。３０分後に該反応混合物を４℃に冷却し、エチレ
ンオキシド（６ｍＬ）をシリンジにより加えた。反応フ
ラスコを密栓し（ストッパーおよびパラフィンにより封
止した）、室温にて２４時間攪拌した。該反応混合物を
水（１００ｍＬ）により注意深く処理し、塩酸（１Ｎ）
により酸性化し、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を添加
した。有機層を分離し、水（１００ｍＬ）にて洗浄し、
乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。溶媒を減圧下で除去して粗
生成物を白色固体として得、これをシリカゲルカラム上
でエチルアセテートを用いて溶離して精製し、第７のシ
クロスポリンアミノ酸残基のアラニン窒素原子において
式（Ｉ）の連結基を介してヒドロキシル基に結合するＴ
ＭＳ保護シクロスポリンＡを得た；白色固体（３５０ｍ
ｇ、３４％）。Ｍ．Ｐ．：１２４−１３２℃。Ｉ．Ｒ．
（ＣＨＣｌ３）：３６５０Ｗ、３４００ｗ、３３００ｍ
、２９５０ｍ、１６２０ｓ、１４６０ｗ、および１４０
０ｗならびに１２００ｂｃｍ−１。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ　
　１３１７（Ｍ＋，１００）、１２１７（Ｍ−ＣＨ２Ｃ
Ｈ２ＯＨ、１０）。１Ｈおよび１３Ｃ　　ＮＭＲスペク
トルは、与えられた構造に一致した。

【０２１１】例　　６モノカルボキシアミド延長ヒドロ
キシエチルシクロスポリンのキーホールリンペットヘモ
シアニン接合体Ａ．保護モノカルボキシアミド延長ヒド
ロキシエチルシクロスポリン乾燥トルエン（２ｍＬ）中
の例５の生成物（３００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およ
びトリ−ｎ一ブチルチンエトキシド（１５４ｍｇ、０．
４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、メチルグリシネートイソシ
アネートを室温にてアルゴン雰囲気下で加えた。該反応
混合物を２時間攪拌した。エチルアセテート（５０ｍＬ
）および水（５０ｍＬ）を加えた。有機層を分離し、食
塩水／水（１：１，２×５０ｍＬ）により洗浄し、乾燥
させた（ＭｇＳＯ４）。溶媒を減圧下で除去し、粗生成
物をエチルアセテートで溶離するシリカゲルカラムで精
製して、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニ
ン窒素原子において式（ＩＩ）の連結基を介してメトキ
シ基に結合するＴＭＳ保護シクロスポリンＡを得た（２
８０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、８５％）。Ｍ．Ｓ．：ｍ／
ｅ　　１４３３（Ｍ＋１，１００）。１Ｈおよび１３Ｃ
　　ＮＭＲスペクトルは、与えられた構造に一致した。

【０２１２】Ｂ．モノカルボキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリンメタノール（１０ｍＬ）中の例６
Ａの生成物（２５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の攪拌溶
液に、水を該混合物がわずかに白濁するまで加えた。炭
酸カリウム（２００ｍｇ、無水）を加え、該混合物を室
温にてアルゴン雰囲気下で一夜攪拌した。該混合物を塩
酸（１Ｎ）により酸性化し、水（２０ｍＬ）を加えた。 該混合物をジクロロメタン（３×７５ｍＬ）により抽出
した。合せた有機抽出物を、食塩水（１０ｍＬ）で洗浄
し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。溶媒を減圧下で除去し
、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素
原子において式（ＩＩ）の連結基を介してヒドロキシル
基に結合されたシクロスポリンＡを得た；白色固体（２
２０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、９６％）。Ｍ．Ｐ．１５
６−１６６℃。この物質は約９５％の純度であったが、
エチルアセテート／メタノール／酢酸（９８：１．９：
１，Ｒ．＝０．１５）により溶離されるシリカゲルカラ
ムによって更に精製され得る。Ｉ．Ｒ　　（ＣＨＣｌ３
）：３６５０ｗ、３４００ｗ、３３００ｗ、２９５０ｍ
、１７００ｗ、１６２０ｓ、１４６０ｍ、１４００ｍお
よび１０９０ｗｃｍ−１。Ｍ．Ｓ．　　ｅ／ｍ　　１３
６９（Ｍ＋＋Ｎａ，６０）、１３４７　　（Ｍ＋Ｈ，５
０）。１Ｈおよび１３Ｃ　　ＮＭＲスペクトルは、与え
られた構造に一致した。

【０２１３】Ｃ．キーホールリンペットへモシアニン接
合体乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中の例６Ｂの生成物（３０ｍ
ｇ、２．２×１０−２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＥＤＡ
Ｃ（５．２ｍｇ、１．２×２．２×１０−２ｍｍｏｌお
よびスルホーＮＨＳ（５．２ｍｇ、１．２×２．２×１
０−２ｍｍｏｌ）を、４℃にてアルゴン雰囲気下で加え
た。次いで該混合物を冷室内で一夜攪拌した。該溶液を
、ボレート緩衝溶液（ｐＨ≒９．１、３．５ｍＬ、１０
０ｍＬ）およびＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＫＬＨ溶液に
２時間で添加した。添加完了後、該混合物を冷室内にて
一夜攪拌した。該混合物を、Ｈ２Ｏ／ＤＭＦ（７５％：
２５％）に対し、次いで水に対して透析し、第７のシク
ロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子において
式（ＩＩ）の連結基を介してキーホールリンペットヘモ
シアニンに結合するシクロスポリンＡを得た（７４ｍｇ
）。

【０２１４】Ｄ．ハプテン数測定例６Ｃの生成物および
例２Ｄの方法を使用してハプテン数５００が測定された
。

【０２１５】例　　７トリカルボキシアミド延長ヒドロ
キシエチルシクロスポリンのキーホールリンペットヘモ
シアニン接合体Ａ．ジカルボキシアミド−アミノ延長ヒ
ドロキシエチルシクロスポリン乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）中
の例６Ｂの生成物（８０ｍｇ、６×１０−２ｍｍｏｌ）
の攪拌溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ
）（９．０ｍｇ、１．３×６×１０−２ｍｍｏｌ）およ
びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１６．
１ｍｇ、１．３×６×１０−２ｍｍｏｌ）を、４℃にて
アルゴン雰囲気下で加えた。該混合物を冷室内で一夜攪
拌し、ＴＨＦ（５ｍＬ）中のエチレンジアミン（６００
ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）溶液にゆっくり加えた。該混合物
を室温にて４時間攪拌し、水（２０ｍＬ）を加えた。該
混合物をジクロロメタン（３×５０ｍＬ）により抽出し
、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒を減圧下で除去し
て、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒
素原子において、式（ＸＩ）の連結基を介してアミノ基
に結合するシクロスポリンを得（８０ｍｇ、５．６×１
０−２ｍｍｏｌ、９４％）、これを更に精製することな
く使用した。

【０２１６】Ｂ．トリカルボキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリン乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）中の例７Ａ
の生成物（８０ｍｇ、５・６×１０−２ｍｍｏｌ）の攪
拌溶液に、無水ジグリコール酸（９７％、２４ｍｇ、３
×５．６×１０−２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン
（２６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を室温にてアルゴン雰
囲気下で加えた。該反応物を一夜攪拌した。水（１０ｍ
Ｌ）およびジクロロメタン（５０ｍＬ）を加え、該混合
物を塩酸（１Ｎ）により酸性化した。有機相を分離し、
水性相をジクロロメタン（２×２５ｍＬ）により抽出し
た。合せた有機層を食塩水（５０ｍＬ）により洗浄し、
乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。溶媒を減圧下にて除去し、
第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原
子において式（ＸＩＩ）の連結基を介してヒドロキシル
基に結合するシクロスポリンＡを得た（７０ｍｇ、８３
％）；ガラス様固体。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ１５０５（Ｍ＋
Ｈ，３０％）。１Ｈ　　ＮＭＲスペクトルは、与えられ
た構造に一致した。

【０２１７】Ｃ．キーホールリンペットヘモシアニン接
合体ＤＭＦ（１ｍＬ）中の例７Ｂの生成物（６０ｍｇ、
４×１０−２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＮＨＳ（５．５
ｍｇ、１．２×４×１０−２ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（
９．８ｍｇ、１．２×４×１０−２ｍｍｏｌ）を４℃に
てアルゴン雰囲気下で加えた。該混合物を一夜攪拌した
。該溶液を、リン酸緩衝溶液（６ｍＬ、ｐＨ≒８．３、
１００ｍＭ）中のＫＬＨ（１２０ｍｇ、６６％蛋白質、
９２％の純度）の溶液およびＤＭＦ（０．８ｍＬ）に４
℃にて３時間で加えた。添加完了後、該溶液を冷室内で
一夜攪拌した。該混合物をＨ２Ｏ／ＤＭＦ（９０：１０
）および水に対して透析した。次いで接合体を凍結乾燥
して、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン
窒素原子において、式（ＸＩＩ）の連結基を介してキー
ホールリンペットヘモシアニンに結合するシクロスポリ
ンＡを得た（１２０ｍｇ）。

【０２１８】Ｄ．ハプテン数測定例７Ｃの生成物および
例２Ｄの方法を使用して、ハプテン数７００が測定され
た。

【０２１９】例　　８モノカルボキシアミド延長ヒドロ
キシエチルシクロスポリン同族体Ａ．保護カルボキシア
ミド延長ヒドロキシエチルシクロスポリン同族体乾燥ト
ルエン（１ｍＬ）中の例５の生成物（６０ｍｇ、４．５
×１０−２ｍｍｏｌ）およびトリ−ｎ−ブチルチンエト
キシド（３０ｍｇ、８．９×１０−２ｍｍｏｌ）の攪拌
溶液に、β−アラニンイソシアネートメチルエステルを
加えた。該混合物を２時間攪拌した。エチルアセテート
（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）を加え、有機層を分
離し、食塩水／水（１：１、２×５０ｍＬ）により洗浄
し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。減圧下で有機相を除去
し、泡状固体を、エチルアセテートで溶離するシリカゲ
ルカラムで精製し、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残
基のアラニン窒素原子において、式（ＩＸ）の連結基を
介してメトキシ基に結合するＴＭＳ保護シクロスポリン
Ａを得た（５９ｍｇ、４．１×１０−２ｍｍｏｌ、９１
％）。

【０２２０】Ｂ．モノカルカキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリン同族体メタノール（１ｍＬ）中の
例８Ａの生成物の攪拌溶液に、水および炭酸カリウム（
３０ｍｇ、無水）を加え、該混合物を２０時間攪拌した
。該混合物を塩酸（１Ｎ）により酸性化し、水（２０ｍ
Ｌ）を加え、該混合物をジクロロメタン（２×２０ｍＬ
）により抽出し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。この物質
をシリカゲルカラム上にてエチルアセテート／メタノー
ル／酢酸（９８：２：０．１）により溶離させて精製し
、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素
原子において、式（ＩＸ）の連結基を介してヒドロキシ
ル基に結合されるシクロスポリンＡを得た（２５ｍｇ、
９０％）。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ　　１３１８（Ｍ＋Ｈ，１
００）。

【０２２１】例　　９モノカルボキシアミド延長ヒドロ
キシエチルシクロスポリンチオ類似体Ａ．保護モノカル
ボキシアミド延長ヒドロキシエチルシクロスポリンチオ
類似体乾燥トルエン（１ｍＬ）中の例５の生成物（６０
ｍｇ、４．５×１０−２ｍｍｏｌ）およびトリ−ｎ−ブ
チルチンエトキシド（７０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の攪
拌溶液に、酢酸イソチオシアネートメチルエステル（９
０ｍｇ）を加えた。該混合物を２時間攪拌した。エチル
アセテート（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）を加えた
。 有機層を分離し、食塩水／水（１：１、２×５０ｍＬ）
により洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。減圧下で有
機層を分離し、泡状固体を、シリカゲルカラム上にてエ
チルアセテートにより溶離させて精製し、第７のシクロ
スポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原子において、
式（Ｘ）の連結基を介してメトキシ基に結合されるＴＭ
Ｓ保護シクロスポリンＡを得た（５５ｍｇ、３．８×１
０−２ｍｍｏｌ）。

【０２２２】Ｂ．モノカルボキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリンチオ類似体メタノール（１０ｍＬ
）中の例９Ａの生成物（５５ｍｇ、３．４×１０−２ｍ
ｍｏｌ）の攪拌溶液に、水および炭酸カリウム（３０ｍ
ｇ、無水）を加え、該混合物を２０時間攪拌した。該混
合物を塩酸（１Ｎ）により酸性化し、水（２０ｍＬ）を
加え、該混合物をジクロロメタン（２×２０ｍＬ）によ
って抽出し、乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。この材料を、
シリカゲルカラム上にてエチルアセテート／メタノール
／酢酸（９８：２：０．１）により溶離させて精製し、
第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原
子において、式（Ｘ）の連結基を介してヒドロキシル基
に結合するシクロスポリンＡを得た（５０ｍｇ、３．４
×１０−２ｍｍｏｌ、８９％）。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ　　
１４９６（７０％），１３６３（８０％）。

【０２２３】例１０モノカルボキシアミド延長ヒドロキ
シエチルシクロスポリンアルキル類似体Ａ．保護モノカ
ルボキシアミド延長ヒドロキシエチルシクロスポリンア
ルキル類似体例５の生成物および例８Ａの方法を使用し
て（β−アラニンイソシアネートメチルエステルに代え
てα−アラニンイソシアネートメチルエステルを使用し
た点を除く）、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基の
アラニン窒素原子において式（ＶＩ）の連結基を介して
メトキシ基に結合するＴＭＳ保護シクロスポリンＡを、
同様な収率をもって調製した。

【０２２４】Ｂ．モノカルボキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリンアルキル類似体例１０Ａの生成物
および例８Ｂの方法を使用して、第７のシクロスポリン
Ａアミノ酸残基のアラニン窒素原子において式（ＶＩ）
の連結基を介してヒドロキシル基に結合するシクロスポ
リンＡを、９０％の収率をもって調製した。Ｍ．Ｓ．：
ｍ／ｅ　　１３９９（Ｍ＋Ｋ、１００％）、１３８３（
Ｍ＋Ｎａ、７０％）、１３６２（Ｍ＋Ｈ、３０％）。

【０２２５】例１１モノカルボキシアミド延長ヒドロキ
シエチルシクロスポリン芳香族類似体Ａ．保護モノカル
ボキシアミド延長ヒドロキシエチルシクロスポリン芳香
族類似体例５の生成物および例８Ａの方法を使用して（
α−アラニンイソシアネートメチルエステルに代えてα
−フェニルα−アラニンイソシアネートメチルエステル
を使用した点を除く）、第７のシクロスポリンＡアミノ
酸残基のアラニン窒素原子において、式（Ｖ）の連結基
を介してメトキシ基に結合するＴＭＳ保護シクロスポリ
ンＡを同様な収率をもって得た。

【０２２６】Ｂ．モノカルボキシアミド延長ヒドロキシ
エチルシクロスポリン芳香族類似体例１０Ａの生成物お
よび例８Ｂの方法を使用して、第７のシクロスポリンＡ
アミノ酸残基のアラニン窒素原子において、式（Ｖ）の
連結基を介してヒドロキシル基に結合するＴＭＳ保護シ
クロスポリンＡを同様な収率をもって得た。Ｍ．Ｓ．：
ｍ／ｅ　　１４２２（Ｍ−Ｈ，３０％）。

【０２２７】例１２カルボキシメチル延長ヒドロキシエ
チルシクロスポリンＡ．保護カルボキシメチル延長ヒド
ロキシエチルシクロスポリン乾燥ＴＨＦ（１．５ｍＬ）
中の例５の生成物（１３０ｍｇ、９．８×１０−２ｍｍ
ｏｌ）の攪拌溶液に、ナトリウムハイドライド（２０ｍ
ｇ、鉱油中の５０％懸濁物、乾燥ＴＨＦにて洗浄）およ
び１５−クラウン−５エーテル（≒２０ｍｇ）を、室温
にてアルゴン雰囲気下で加えた。該混合物を１時間攪拌
し、乾燥ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のα−ブロモ酢酸メチ
ルエステル（８０ｍｇ）を加えた。

【０２２８】該反応物を更に２時間攪拌し、追加分のα
−ブロモ酢酸メチルエステル（８０ｍｇ）を添加し、該
反応物を２時間攪拌した。エチルアセテート（５０ｍＬ
）および（２０ｍＬ）を加え、該混合物を塩酸（１Ｎ）
により酸性化した（ｐＨ≒３．０）。有機相を分離し、
水（２×５０ｍＬ）により洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳ
Ｏ４）。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲル薄層
プレート上でエチルアセテートにより溶離して精製し、
第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原
子において、式（ＶＩＩ）の連結基を介してメトキシ基
に結合するＴＭＳ保護シクロスポリンＡを得た（８０ｍ
ｇ、６０％）；白色固体。Ｍ．Ｓ．：ｍ／ｅ　　１３５
８（Ｍ−Ｈ，１００）。１Ｈ　　ＮＭＲスペクトルは、
与えられた構造に一致した。

【０２２９】Ｂ．カルボキシメチル延長ヒドロキシエチ
ルシクロスポリンメタノール（４ｍＬ）中の例１２Ａの
生成物（７９ｍｇ、５．８×１０−２ｍｍｏｌ）の攪拌
溶液に、水を該混合物が白濁するまで（約１．５ｍＬ）
加えた。炭酸カリウム（無水、４０ｍｇ）を加え、該混
合物を２０時間攪拌した。該混合物を塩酸（１Ｎ）によ
り酸性化し、水（２０ｍＬ）を加え、該混合物をジクロ
ロメタン（２×２０ｍＬ）により抽出し、乾燥させた（
ＭｇＳＯ４）。該粗生成物を、シリカゲルカラム上でエ
チルアセテート／メタノール／酢酸（９８：２：０．１
）により溶離して精製し、第７のシクロスポリンＡアミ
ノ酸残基のアラニン窒素原子において、式（ＶＩＩ）の
連結基を介してヒドロキシル基に結合するシクロスポリ
ンＡを得た（６５ｍｇ、８０％）；白色固体。Ｍ．Ｓ．
：ｍ／ｅ　　１３２６（Ｍ＋Ｎａ）、１３０４（Ｍ＋Ｈ
）。１Ｈ　　ＮＭＲスペクトルは、与えられた構造式に
一致した。

【０２３０】例１３ジカルボキシアミド延長ｐ−カルボ
キシベンジルシクロスポリンキーホールリンペットヘモ
シアニン接合体Ａ．ジカルボキシアミド延長ｐ−カルボ
キシベンジルシクロスポリンＤＭＦ（０．６９ｍＬ）中
の例２Ｂの生成物（６０ｍｇ）の攪拌溶液に、Ｎ−ヒド
ロキシスルフォスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ、１２
．８ｍｇ）および（１−エチル−３（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、１３．９ｍｇ
）を４℃にてアルゴン雰囲気下で加えた。該反応混合物
を４℃にて一夜攪拌した。スルホ−ＮＨＳエステルの完
全な形成は、１８時間後にＴＬＣ（シリカゲル、溶離剤
０．１５：２：８の酢酸／メタノール／ジクロロメタン
）により観察した。得られたスルホ−ＮＨＳエステルを
、ボレート緩衝液（１ｍＬ、ｐＨ９、０．０５Ｍ）およ
びＤＭＦ（２ｍＬ）の混合物中のグリシルグリシン（１
２．１ｍｇ）の溶液に、ｐＨを８．５〜９に調節しなが
ら４℃にて３０分間でゆっくり加えた。淡黄色溶液を４
℃にて更に３０分間攪拌し、室温で２時間攪拌した。得
られた生成物に、１Ｎ　　ＨＣｌを加え（混合物がｐＨ
４となるまで）、沈殿を収集し、真空下で乾燥させて白
色生成物を得た（４９ｍｇ）。濾液をエチルアセテート
で抽出し、該有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、
溶媒を蒸発させて生成物の第２の量を得た。合せた生成
物を調製用層クロマトグラフィ（シリカゲル、溶離液３
：４０：１６０の酢酸／メタノール／ジクロロメタン）
により精製し、第７および第８のシクロスポリンアミノ
酸残基のアラニン窒素原子において、式（ＸＩＸ）の連
結基を介してヒドロキシル基に結合するシクロスポリン
Ａの混合物（約５０：５０）を得た（２９ｍｇ）。Ｍ．
Ｓ．：ｍ／ｅ　　１４５０（Ｍ＋Ｈ）、１４８８（Ｍ＋
Ｋ）。

【０２３１】Ｂ．キーホールリンペットヘモシアニン接
合体ＤＭＦ（３００μＬ）中の例１３Ａの生成物（２０
ｍｇ）に、ＤＭＦ（３００μＬ）中のＥＤＡＣ（３．１
ｍｇ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（３
．５８ｍｇ）を加えた。該反応混合物を４℃にて一夜攪
拌した。スルホ−ＮＨＳエステルの不完全形成は、ＴＬ
Ｃ（シリカゲル、溶離液３：４０：１６０の酢酸／メタ
ノール／ジクロロメタン）により観察された。追加的に
ＥＤＡＣ（３．１ｍｇ）およびＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（３．５８ｍｇ）を添加した。該反応混合物を、
室温にて４時間攪拌した。完全反応をＴＬＣ（シリカゲ
ル、溶離液３：４０：１６０の酢酸／メタノール／ジク
ロロメタン）により観察した。

【０２３２】ボレート緩衝溶液（３．０ｍＬ、ｐＨ９、
０．０５Ｍ）およびＤＭＦ（０．７ｍＬ）の混合物中の
ＫＬＨ（４０ｍｇ）の溶液に、上記で調製されたスルホ
−ＮＨＳエステル反応混合物を、ｐＨ８．５の一定ｐＨ
調節を行ないつつ室温にて４時間で添加した。追加量の
ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）を４時間で加えた。得られた反
応混合物を４℃にて一夜攪拌した。該白濁混合物を、１
０％ＤＭＦ／水（ＮＨ４ＯＨによりｐＨ８、３×４Ｌ）
および水（ＮＨ４ＯＨによりｐＨ８、５×４Ｌ）に対し
て透析した。得られた生成物を凍結乾燥し、第７および
第８のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原
子において、式（ＸＩＸ）の連結基を介してキーホール
リンペットヘモシアニンに結合するシクロスポリンＡを
得た（３２ｍｇ）

【０２３３】Ｃ．ハプテン数測定例１３Ｂの生成物およ
び例２Ｄの方法を使用して、ハプテン数９４８が測定さ
れた。

【０２３４】例１４シクロスポリン，グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ接合体Ａ．シクロスポリンハプ
テンの活性化炎中で乾燥させたフラスコに、３５ｍｇの
シクロスポリンハプテン、特に例６Ｂの生成物、６．２
ｍｇのスルホ−ＮＨＳ、５．５ｍｇのＥＤＡＣ、および
０．３５ｍＬのＤＭＦを容れた。該混合物を４℃にて一
夜攪拌した。

【０２３５】Ｂ．グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼへの接合例１４Ａの生成物を、ｐＨ８．８の炭酸ナ
トリウム緩衝液／ＤＭＦ（０．２ｍＬ／ｍＬの緩衝液）
中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐ
ＤＨ、炭酸ナトリウム緩衝液中で０．０５５ｍ）、グル
コース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ、４．５ｍｇ／ｍｇＧ６Ｐ
ＤＨ）、およびＮＡＤＨ（９ｍｇ／ｍｇＧ６ＰＤＨ）の
溶液に対して、氷浴温度にて小分けして加えた。反応を
、監視し、抗−ＣｓＡ抗体不在時の酵素活性に相対的な
、抗−ＣｓＡ抗体存在時の酵素活性の２９−３５％阻害
において停止させた。

【０２３６】Ｃ．接合体の単離この例１４Ｂの接合体で
ある、第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン
窒素原子において式（ＩＩ）の連結基を介してグルコー
ス−６−デヒドロゲナーゼに結合するシクロスポリンＡ
を、Ｇ１００セファデックス上のクロマトグラフィ的分
離により、０．０５％のナトリウムアジドおよび０．０
０５％のチメロサールを含む０．０５５Ｍ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて単離した。約３５％未
満の不活性化において、５−１０のハプテン数を得た。 例２Ｂ、３Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂ、１１Ｂまた
は１２Ｂも、例１４と同様な方法で対応するＧ６ＰＤＨ
接合体に変換された。

【０２３７】例１５モノクローナル抗体の調製、シクロ
スポリンＡ．一般的方法使用した標準的ハイブリドーマ
技術は、詳述されている（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．；Ｍｉｌ
ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ１９７５，２５６，４９
５−７；Ｈｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｇ．Ｒ．“Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ　　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　　ａｎｄ　　Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ”，ＣＲＣ　　Ｐｒｅｓｓ，１９８２，
Ｂｏｃａ　　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ３３４３１）。

【０２３８】Ｂ．免疫ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、完全フロ
イントアジュバンド（ＣＦＡ）中のイムノゲン（特には
例１３ＢのＫＬＨ接合体）の５０〜２００μｇを用いて
、腹腔内的（ＩＰ）または皮下的（ＳＣ）注射により免
役した。イムノゲン（不完全フロイントアジュバンド（
ＩＦＡ）、ＩＰまたはＳＣ）を用いてブーストを月毎に
行なった。最終のＩＰ、ＳＣ、または静脈内（ＩＶ）注
射を生理食塩水中の１００−５００μｇにて融合に先立
って実施した。

【０２３９】Ｃ．免疫の監視マウスの監視のために、血
清抗体に向いたＥＬＩＳＡ試験を２〜３回の免疫後に使
用した。血清抗体力価は、アッセイに先立って倍々希釈
した。

【０２４０】マイクロタイターＥＩＡプレート（Ｃｏｓ
ｔｅｒ　　＃３５９０）を、イムノゲンと同じハプテン
により標識したＧ６ＰＤＨ酵素−接合体の５０μＬ／ウ
ェルにより被覆し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、０．０
１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、お
よび０．０２％ナトリウムアジド、ｐＨ７．２）に１：
１００に希釈し、３７℃にて１時間熟成させ、次いでＰ
ＢＳ中の１％正常ヒツジ血清（ＮＳＳ）を、非特異的結
合を防ぐために３００ｕＬ／ウェル添加した。３０分間
放置した後、プレートの内容物を傾けて排出した。一連
の希釈を行なった血清を５０ｕＬ／ウェル加え、３７℃
にて３０分間熟成した。該プレートを、ＥＬＩＳＡ洗浄
緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０〔Ｆｉｓｈｅｒ　
　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　　Ｃｏ．＃ＣＳ−２７９−３
〕、ＰＢＳ中、ｐＨ７．２）を用いて３回洗浄した。Ｐ
ＢＳ中に１：１０００に希釈されたアルカリホスファタ
ーゼ（ＩｇＧ＋ＩｇＭ＋軽鎖特異的、Ｔａｇｏ＃６５４
３、８８７Ｍｉｔｔｅｎ　　Ｒｏａｄ、Ｂｕｒｌｉｎｇ
ａｍｅ，ＣＡ９４０１１，ＵＳＡ）にて標識されたヤギ
の抗−マウス血清を５０ｕＬ／ウェルでプレートに加え
、更に３０分間３７℃で熟成した。該プレートを前述と
同様に洗浄し、次いで１００ｕＬ／ウェルの基質（１５
ｍｇのｐ−ニトロフェニルホスフェート・２ナトリウム
〔ＰＮＰＰ、Ｓｉｇｍａ＃Ｓ１０４−１０５〕２５ｍＬ
の１０％ジエタノールアミン〔Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄ
ａｋ＃１５９８〕あたり、ｐＨ９．８、０．５ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２〔Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ＃５９５８〕を
含む）を添加した。プレートを震盪機上に室温で３０分
間、または可視的な発色があるまで置いた。該プレート
を、次いでＴｉｔｅｒｔｅｋ　　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎに
より４０５ｎｍで測定した。ＯＤ値を、血清試料の希釈
度に対してプロットした。血清抗体力価は、滴定曲線の
最大ＯＤから７０％低減する希釈度と定義した。

【０２４１】Ｄ．細胞融合免疫マウスから脾臓細胞を取
出し、ＰＧＥを用いてＰ３　　Ｘ６３−ＡＧ８．６５３
ミエローマ細胞と融合させた。該細胞をＨＡＴ添加媒質
中に懸濁し、９６−ウェルのマイクロタイタープレート
に分配した。４日後に、細胞に半量のＨＡＴ添加媒質を
置換することにより養分を与えた。

【０２４２】Ｅ．ハイブリトーマの選択細胞融合から約
１週間後、ハイブリトーマを特異的抗体について選択し
た。抗体産生に対する選択のために、逆ＥＬＩＳＡアッ
セイを使用した。マイクロタイターＥＩＡプレートを、
ＰＢＳ中に１：１００に希釈したＩｇＧ＋ＩｇＡ＋Ｉｇ
Ｍ，Ｈ＋Ｌ鎖に対するウサギの抗−マウス特異的抗体（
Ｚｙｍｅｄ＃６１−６４００ＳＹ）、ｐＨ７．２により
５０ｕＬ／ウェルを用いて被覆し、使用まで４℃にて１
週間を限度として保存した。該プレートに、非特異的結
合を防ぐために１％ＮＳＳ／ＰＢＳを３００ｕＬ／ウェ
ル用いて充填し、３０分間静置した後、傾けて排出した
。次いで用いた媒質５０ｕＬ／ウェルを加え、３７℃に
て３０〜６０分間熟成させた。イムノゲンと同じハプテ
ンにより標識したＧ６ＰＤＨ酵素を、ＰＢＳ中に１：１
００〜１：７００に希釈し、５０ｕＬ／ウェルを加え、
次いで３７℃にて３０〜６０分間熟成した。プレートを
前述と同様に洗浄し、最終的に１００ｕＬ／ウェルの基
質（０．０５３Ｍ　　ｔｒｉｚｍａ塩基〔Ｓｉｇｍａ＃
Ｔ１５０３〕、０．０２Ｍ　　ＮＡＤ、０．０３３Ｍ　
　Ｇ−６−Ｐ、０．０２５％ＮａＮ〔ナトリウムアジド
、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ＃７−ＶＯ１５〕、ＨＣｌにてｐ
Ｈ６．２に調節、０．６３ｍＭ　　ｐ−ヨウ化ニトロテ
トラゾリウムバイオレット〔ＩＮＴ、Ｓｉｇｍａ＃Ｉ８
３７７〕、１％ＮＳＳおよび６単位／ｍＬのジアホラー
ゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）〔Ｓｉｇｍａ＃２３８１〕
）を添加した。該プレートを室温にて約１時間、震盪機
上に置き、４９２ｎｍにてＴｉｔｅｒｔｅｃ　　Ｍｕｌ
ｔｉｓｃａｎにより測定した。背景より少なくとも２倍
高い読取値を与えるウェルをＥＬＩＳＡ＋とした。

【０２４３】Ｆ．腹水中における抗体産生腹水中におい
てモノクローナル抗体産生の規模を拡大するために、細
胞の移植の２〜７日前に０．３〜０．５ｍＬ／マウスの
ＩＦＡのＩＰ注射によりマウスをプライムして腫瘍細胞
の生育を誘発した。細胞をＴ−７５フラスコ中で対数相
にて約１８×１０６細胞に生育させ、遠心分離し、次い
で２ｍＬのＳ−ＤＭＥＭ中に再懸濁させた。各マウスに
、約４−５×１０６細胞の０．５ｍＬ　　ＩＰ注射を行
なった。腹水腫瘍は、通常１または２週間で発達する。 次いで高濃度の抗体を含む腹水を１８−ゲージの針を用
いて流出させた。該液体を室温で凝結させ、次いで、１
５００ｒｐｍにて３０分間遠心分離を行なった。抗体を
含む液体を注出し、−２０℃に冷凍して保存した。この
例１５の方法により、例２Ｃ、３Ｃ、６Ｃ、７Ｃおよび
４Ａの生成物に対しても抗体を生成させた。

【０２４４】例１６抗体および酵素接合体の選択Ａ．一
般的因子シクロスポリンに対するＥＭＩＴ（登録商標）
アッセイに使用する最適なモノクローナル抗体および酵
素接合体の選択は、多くの相互関連因子に依存する。主
には、抗体は酵素接合体を認識し、効果的でなければな
らない。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ
６ＰＤＨ）は、好適な酵素であるため、抗体は、グルコ
ース−６−リン酸接合体の活性を阻害する能力に基づい
て選択されるであろう。更には、抗体は、興味あるシク
ロスポリンを認識する能力に基いて選択される。例えば
、シクロスポリンＡを検出し、その代謝産物は検出しな
いアッセイが望まれる場合、抗体はこの特異性をもつも
のが選択されるであろう。別法として、シクロスポリン
Ａとその主要な代謝産物を検出し得るアッセイが望まれ
る場合には、この特異性を有する抗体が選択されるであ
ろう。

【０２４５】他の選択因子は、安定性、調製の容易さ、
ならびに抗体および酵素接合体の溶解性を含む。行なわ
れるアッセイの詳細も、抗体および酵素接合体の選択に
影響を与える。例えば、試料は全血、血清、尿等であり
得る。アッセイ希釈剤、安定化用添加剤、緩衝剤成分、
消泡剤、および前処理も、抗体および酵素接合体の選択
に影響を与える。上述の因子は、一般的であり、かつ相
互関連性のものである。最適抗体および酵素接合体の選
択は、上述の因子のいくつかの注意深い平衡に加えて、
興味ある特定のアッセイにおいて重要な他の因子に関連
する。

【０２４６】Ｂ．酵素接合体スクリーニング例１４にお
いて調製されたシクロスポリンＡ、グルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ接合体を、例１５の２種類の抗体
（クローン５Ｅ１０および２Ｇ４）を用いて処理した場
合の阻害百分率について選択を行なった。主要な選択因
子は、接合阻害能および安定性を最大にすることを含む
。

【０２４７】

【表１】 ａ．接合反応混合物中の酵素に対するハプテンの最終モ
ル比ｂ．不活性化百分率ｃ．酵素阻害百分率

【０２４８
】Ｃ．抗体スクリーニング例１５の抗体を例１４のグル
コース−６−リン酸接合体に対する阻害割合について選
択した。主要な選択因子は、酵素接合体の阻害およびＣ
ｓＡ添加による阻害低下を最大にすることを含む。

【０２４９】

【表２】

【０２５０】

【表３】

【０２５１】

【表４】

【０２５２】Ｄ．抗体交差反応スクリーニング例１５の
抗体を、Ｇ６ＤＰＨ接合体、連結基ＩＩを使用してシク
ロスポリン代謝産物に対する交差反応性の選択を行なっ
た。主要な選択因子は、交差反応性の最小化を含む。

【０２５３】

【表５】

【０２５４】

【表６】

【０２５５】Ｄ．結論上記スクリーニングに基づくと、
第７のシクロスポリンＡアミノ酸残基のアラニン窒素原
子において、式ＩＩの連結基を介してグルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼに接合するシクロスポリンが、
例示的な酵素接合体として選択される。抗体クローン番
号２Ｇ４が、例示的な抗体として選択される。

【０２５６】例１７ＥＭＩＴ（登録商標）アッセイ性能
ＥＭＩＴアッセイプロトコールの詳細は、米国特許第３
，５１７，８３７号（１９７４）に記述されている。 例１３ＢのＫＬＨ接合体を使用する例１５の方法により
調製された抗体を使用し、これを、この例においては抗
−ＣｓＡモノクローナル抗体と称する。Ｇ６ＤＰＨ接合
体は例６Ｂの化合物を使用して例１４の方法により調製
され、この例においてはＣｓＡ−Ｇ６ＤＰＨ接合体と称
する。該アッセイは、ＣＯＢＡＳ　　ＭｉＲＡ分析装置
で行なわれた。

【０２５７】１００マイクロリットルの全血試料および
６種の基準を、別々に２００μＬのメタノールと回転攪
拌した。メタノールは、細胞を溶解させ、シクロスポリ
ンを可溶化し、また血液蛋白質を沈殿させた。１分間の
熟成後、混合物を遠心分離にかけた。上澄を前処理希釈
剤で１〜３に希釈した。分析機において、得られた前処
理試料３６μＬを、基質および補体を含むモノクローナ
ル抗−ＣｓＡ−抗体試薬の１５５μＬと共に７５秒間熟
成した。次いで、７５μＬのＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨ接合体
試薬を加えた。１７５秒間熟成後、酵素活性、（薬剤濃
度の機能）をＮＡＤＨ生成を追って、３４０ｎｍにて分
光測定的に１００秒間監視した。

【０２５８】該モノクローナル抗−ＣｓＡ抗体試薬は、
モノクローナル抗−ＣｓＡ抗体、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド、グルコース−６−リン酸、塩化ナト
リウム、バルク剤、界面活性剤および保存剤を含んでい
た。該ＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨ接合体試薬は、酵素接合体、
トリス緩衝剤、バルク剤、安定剤および保存剤を含んで
いた。希釈剤は、トリス緩衝剤、界面活性剤および保存
剤を含んでいた。

【０２５９】各試薬は、標準的ＥＭＩＴ技術に適合する
ように調剤される。該試薬は凍結乾燥されておらず、従
って液体である。バルク剤、界面活性剤および保存剤は
、使い易さおよび試薬の保存のために選択された。Ｃｓ
Ａ−Ｇ６ＤＰＨ接合体試薬のために好ましい安定剤は、
酵素活性部位以外の部位においてグルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼに結合する抗体である。このような
抗体は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをイ
ムノゲンに用いて例１５に記述した標準的なハイブリド
ーマ技術により調製される。抗−Ｇ６ＰＤＨ抗体は、Ｃ
ｓＡ−Ｇ６ＰＤＨ接合試薬の安定化剤として使用された
。

【０２６０】２０の試料および６種の基準を、このプロ
トコールのもとに２時間以内で前処理し、アッセイした
。アッセイの標準曲線の範囲は、５００ｎｇ／ｍＬまで
拡がっている。曲線の範囲内の分析的回復は、９５−１
０４％変化した。３種の水準の対照を用いた操作精度は
、５．０〜７．１％ＣＶの範囲であった。同じ対照間の
操作精度は４．９〜７．４％ＣＶであった。シクロスポ
リン代謝産物Ｍ１を用いて交差反応性が観察されたが、
他の主な代謝産物Ｍ８、Ｍ１７およびＭ２１については
観察されなかった。５７種類の可能的に同時投与されて
いる薬剤、血球数の変化、ビリルビンまたはトリグリセ
リドの高い水準は、アッセイにおいて妨害しなかった。

【０２６１】

【表７】ＣＯＢＡＳ　　ＭＩＲＡ分析機上のアッセイパ
ラメータアッセイ温度３７℃波長　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３４０ｎｍ前
処理試料の体積　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　３６μＬ希釈体積（水）　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５９μＬ抗体試薬体積　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１５５μＬ熟成時間（試
料＋抗体試薬）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　７５ｓｅｃ酵素試薬
体積７５μＬ遅延時間（試料＋抗体および酵素試薬）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５ｓ
ｅｃ読取時間　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１００ｓｅｃ

【０２６２】３種の水準のシ
クロスポリンＡを、１０種の新鮮なシクロスポリンＡ−
負の全血試料に入れた。該試料を２つ一組でアッセイし
た。

【０２６３】

【表８】

【０２６４】５種の水準のシクロスポリンＡを２種類の
分離した新鮮なシクロスポリン−負の全血試料に入れた
。アッセイを２つ一組で行なった。

【０２６５】

【表９】

【０２６６】操作内の精度決定を、それぞれ３種の水準
にある２０の別個の試料抽出物について行なった。操作
間の精度決定を、２台の分析機において合計２０回の操
作における各々３種の水準について行なった。個々の試
料抽出物は、各操作においてアッセイされ、また、定量
化は同一の標準曲線から行なった。

【０２６７】

【表１０】

【０２６８】Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ａｓｓｏｃｉａｔｉ
ｏｎ　　ｏｆ　　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔ
／Ｃｏｌｌｅｇｅ　　ｏｆ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｐ
ａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ（ＡＡＣＣ／ＣＡＰ）のＷｈｏ
ｌｅ　　Ｂｌｏｏｄ　　ＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ　　
Ｓｕｒｖｅｙの試料、およびｔｈｅ　　Ｕｎｉｔｅｄ　
　Ｋｉｎｇｄｏｍ　　Ｑｕａｌｉｔｙ　　Ａｓｓｅｓｓ
ｍｅｎｔ　　Ｓｃｈｅｍ（ＵＫＱＡＳ）からの試料をＥ
ＭＩＴシクロスポリンＡアッセイにより測定した。結果
は、ＨＰＬＣおよびＣＹＣＬＯ−Ｔｒａｃ　　ＳＰ　　
ＲＩＡ（ＩＮＣＳＴＡＲ）のものと良好に一致した。

【０２６９】

【表１１】

【０２７０】４種の主要なシクロスポリンＡ代謝産物に
よる交差反応性を、２００ｎｇ／ｍＬのシクロスポリン
Ａの存在下で評価した。これらの代謝産物中、Ｍ１（Ａ
Ｍ９）のみが有意な交差反応性を示した。

【０２７１】

【表１２】

【０２７２】下記の５７種の化合物は、アッセイにおい
て交差反応を起こさなかった。それらは、以下の濃度に
おいて２００ｎｇ／ｍＬのシクロスポリンＡの存在下で
試験された。実質的な交差反応性は、シクロスポリンＡ
濃度において、２５％を越える上昇として定義した。

【０２７３】

【表１３】

【０２７４】３０ｍｇ／ｄＬのビリルビンまたは１００
０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリドの存在下において、ＥＭ
ＩＴ（登録商標）シクロスポリンＡアッセイでは何らの
有意な妨害を生じないことが見出された。

【０２７５】

【表１４】

【０２７６】１８％〜６６％の範囲のヘマトクリット値
を有する試料は、シクロスポリンＡの濃度７５、２５０
および４００ｎｇ／ｍＬにおける回収率について、何ら
臨床的に有意な変位を示さなかった。

【０２７７】

【表１５】

【０２７８】例１８オキシ酢酸イミノ延長アチオシクロ
スポリン無水メタノール（１ｍｌ）中のシクロスポリン
Ａ代謝産物Ｍ−１（化合物（１）、スキームＩ、６ｍｇ
、４．９×１０−３ｍｍｏｌ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ，
Ｕ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍ．１９８８，３
４（１），３４−３９の方法により、Ｒｏｅｒｉｇ，Ｄ
．Ｌ．らのＳ．Ｃｈｅｍａｔｏｇ．１９７５，１１０，
３４９の方法に従ってＢｉｏ−Ｂｅａｄｓを使用して、
イヌ尿から得た）の攪拌溶液に、−７８℃にてオゾンを
含む酸素気流（Ｗｅｌｂａｃｈオゾン発生装置、０．５
ｍＬ／分、制御圧６ｐｓｉ、オゾン発生器圧４ｐｓｉ、
オゾン発生器を８０ボルトで運転）を１０分間（溶液が
青色に変わるまで）通し、オゾン含有酸素気流を停止し
た。該溶液にアルゴンを１０−１５分間通気した（溶液
温度が−２０℃となるまで）。ジメチルスルフィド（０
．２ｍｌ）を加えた。該混合物を、室温まで温め、メタ
ノールのほとんどが蒸発するまでアチオシクロスポリン
カルボキシアルデヒド生成物（化合物（２）、スキーム
Ｉ）は単離、精製、分析されなかった。オゾン分解生成
物を含む反応混合物を、無水メタノール（１ｍｌ）中に
再溶解し、アミノオキシ酢酸（ＨＣｌ塩、１２ｍｇ、０
．１ｍｍｏｌ）を加えた。該混合物を、室温にて２時間
攪拌した。ジクロロメタン（３０ｍｌ）、食塩水／水混
合物（１：１、２０ｍｌ）および２滴のＨＣｌ（１Ｎ）
を加えた。ジクロロメタン層を分離し、乾燥させ（Ｍｇ
ＳＯ４）、蒸発させてオキシ酢酸イミノ延長アチオシク
ロスポリン（化合物（３）、スキームＩ、６ｍｇ、４．
７×１０−３ｍｍｏｌ、９６％）。Ｍ．Ｓ．，ｍ／ｅ１
２７９．９（Ｍ＋Ｈ）＋。該生成物を、精製なしで使用
したが、更に、調製用薄層クロマトグラフィ（シリカゲ
ル、エチルアセテート／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ，９０：１
０：０．１）によって精製することもできる。

【０２７９】例１９オキシ酢酸イミノ延長アチオシクロ
スポリンキーホールリンペットヘモシアニン接合体乾燥
ＤＭＦ（０．２ｍｌ）中の例１８の生成物（化合物（３
）、スキームＩ、５ｍｇ、３．９×１０−３ｍｍｏｌ）
およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−
ＮＨＳ、１１ｍｇ、１．２×３．９×１０−３ｍｍｏｌ
）の攪拌溶液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、１．１ｍｇ、
１．６×３．９×１０−３ｍｍｏｌ）を添加した。 該混合物を室温にてアルゴン雰囲気下に５時間攪拌した
。該反応の監視に薄層クロマトグラフィ（シリカゲル、
エチルアセテート／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ，８５：１５：
０．４）を使用した。この技術により、すべての出発物
質が消費された。該活性化エステル生成物は、単離、精
製、分析を行なわなかった。リン酸緩衝液（ｐＨ≒８．
１、１００ｍＭ、２ｍｌ）およびＤＭＦ（０．２ｍｌ）
中のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、６４
％純度、１７ｍｇ、２×１０−５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液
に、４℃において活性化エステル生成物を、１時間で添
加した。該混合物を４℃にて一夜攪拌した。該混合物を
、Ｈ２Ｏ／ＤＭＦ（８０：２０、５００ｍｌ）および水
に対して透析した。透析生成物を凍結乾燥して、オキシ
酢酸イミノ延長アチオシクロスポリンのキーホールリン
ペットヘモシアニン接合体（式（４）、スキームＩ、１
５ｍｇ）を得た。この接合体は、Ｍ１−ＫＬＨ接合体と
も称される。

【０２８０】例２０オキシ酢酸イミノ延長アチオシクロ
スポリンのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ接
合体例１４の方法および例１８のアチオシクロスポリン
ハプテンを使用して、オキシ酢酸イミノ延長連結基を介
してグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼに接合す
るアチオシクロスポリン（化合物（４）、スキームＩ、
ＫＬＨに代えて接合はＧ６ＰＤＨに対して）を調製した
。この接合体は、Ｍ１−Ｇ６ＰＤＨ接合体とも称される
。

【０２８１】例２１抗Ｍ１モノクローナル抗体の調製Ａ
．一般的方法例１５の方法、および例１９のオキシ酢酸
イミノ延長アチオシクロスポリンのキーホールリンペッ
トヘモシアニン接合体生成物を使用して、モノクローナ
ル抗体を調製した。例２０のオキシ酢酸イミノ延長アチ
オシクロスポリンのグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ接合体生成物をＥＬＩＳＡスクリーニングに使用
した。

【０２８２】Ｂ．抗−Ｍ１抗体の選択Ｂａｌｂ／ｃマウ
スを免役した。３回の免疫（１００μｇ／注射／マウス
、月毎）後、マウスから尾部静脈にて採血し、血清抗体
力価を測定した。Ｆｏｒｗａｒｄ　　ＥＬＩＳＡプロト
コールにより、血清の一連の希釈物をＣｓＡ−Ｇ６ＰＤ
ＨおよびＭ１−Ｇ６ＰＤＨの両者に対して選択した。初
期の力価は、ＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨに比べてＭ１−Ｇ６Ｐ
ＤＨに対して約３倍高いものであった。力価は、Ｍ１−
Ｇ６ＰＤＨに対して選択した場合、１：３０，０００で
あったが、一方ＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨに対しては、わずか
１：１０，０００であった。

【０２８３】４回の融合を行なった。融合の際、脾臓は
、免疫応答の上昇を示してわずかに拡大した。脾臓の大
きさは、置換により測定して０．２５〜０．５ｍＬの範
囲であった。初期の選択は、逆ＥＬＩＳＡにより、ウサ
ギα−マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭ鎖（Ｚｙｍｅｄ、
４５８、Ｃａｒｌｔｏｎ　　Ｃｏｕｒｔ、Ｓ．Ｓａｎ　
　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ　　９４０８０、ＵＳＡ、
＃６１−６４００ＳＹ）で被覆した複写プレート上で行
なわれた。初期選択の応答は、融合あたり３〜３６ＥＬ
ＩＳＡ−正ウェルの範囲の変化があった。第２の選択は
、ＥＭＩＴにより行なった。抗体類を、ＣｓＡ−Ｇ６Ｐ
ＤＨを阻害する能力について試験した。抗体は、抗−Ｃ
ｓＡ−抗体の存在下で、ＣｓＡの存在において阻害の逆
転を示すが、Ｍ１の存在において阻害の逆転を示さず、
かつＭ１−Ｇ６ＰＤＨを阻害するが、ＣｓＡには実質的
に結合せず、またＣｓＡ−Ｇ６ＰＤＨを阻害しないもの
として選択された。一つの抗体（クローン２Ｂ１０）が
、抗−Ｍ１モノクローナル抗体として選択された。

【０２８４】Ｃ．抗−Ｍ１抗体の調製および精製抗−Ｍ
１モノクローナル抗体（クローン２Ｂ１０）を産生可能
な細胞をスピナーフラスコ中で、３７℃および７％ＣＯ
２において生育させた。培養物を、新鮮培地の供給およ
び培養の追加またはより大型の容器に分割することによ
り維持した。Ｔｒｙｐａｎ　　Ｂｌｕｅを用いた細胞の
計数および生存性測定は、細胞生育を監視するために常
法どおり行なった。使用媒質の５Ｘ〜１０Ｘ濃縮物のＰ
ａｒａｇｏｎゲル電気泳動を、抗体産生を監視するため
に常法どおり行なった。１０日後、培養物をＢｅｃｋｍ
ａｎ　　ＲＣ２Ｂ遠心分離機により５０００ｒｐｍで１
５分間、４℃にて遠心分離し、抗体から細胞を除去した
。

【０２８５】１５Ｌの培養液中の抗体を５倍に濃縮し、
１０ｍＭ　　ＭＥＳ緩衝溶液にて透析した。該抗体を、
Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　　ＡＢｘ（Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒＩ
ｎｃ．＃７２６９−００）上のカラムクロマトグラフィ
により精製した。高さ５０ｃｍ、直径２．６ｃｍのカラ
ムに、約１００グラムのＡＢｘを１０ｍＭ　　ＭＥＳ緩
衝液で平衡化して充填した。抗体を５ｍＬ／分にて負荷
し、次いで、１０ｍＭ　　ＭＥＳｐＨ５．６から２００
ｍＭ　　ＮａＣｌ／１００ｍＭトリスｐＨ７．４までの
１Ｌの勾配により溶出した。試料は、カラムから１０ｍ
Ｌの分画で収集され、蛋白質濃度について２８０ｎｍに
おいて吸光度の監視が行なわれた。抗体を含む分画を集
めた。

【０２８６】例２２抗−Ｍ１抗体を用いたＥＭＩＴアッ
セイの性能例１７のアッセイを、例Ａに特定した成分に
加えて例２１の抗−Ｍ１抗体を含むモノクローナル抗−
ＣｓＡ抗体試薬を使用して行なった。４種の主要なシク
ロスポリンＡ代謝産物の交差反応性を、２００ｎｇ／ｍ
ＬのシクロスポリンＡの存在下で評価した。代謝産物Ｍ
１、Ｍ８、Ｍ１７またはＭ２１について、臨床的に有意
な交差反応性（臨床的に有意な交差反応性は、ＣｓＡ定
量値を≧２０％で増大させる交差反応性である）は観察
されなかった。アッセイ性能の他の局面は、実質的に影
響を受けなかった。

【０２８７】

【表１６】

【０２８８】前述の本発明は、例示のためにある程度詳
細に記述されているが、ある種の変更や修飾が、添付す
る請求の範囲の内で行なわれ得るであろうことは自明で
あろう。特には、本発明の化合物の連結基の構造の重要
でない変更が行なわれ得る。本発明の化合物または抗体
の性質を顕著に変えるものではないこのような修飾は、
自明のものと考えられる。

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　シクロスポリンを含むと考えられる試
   料中のシクロスポリン量の測定方法であって、水性媒質
   中において１）シクロスポリンを含むと考えられる前記
   試料、２）そのアラニン窒素原子の一つにおいて標識に
   接合されるシクロスポリン（シクロスポリン標識接合体
   ）、および３）前記シクロスポリン標識接合体に結合可
   能な抗体類、を合する工程を含んでなる方法。
2. 【請求項２】ａ）　　水性媒質中において１）シクロス
   ポリンを含むと考えられる前記試料、２）そのアラニン
   窒素原子の一つにおいてグルコース−６−リン酸デヒド
   ロゲナーゼに接合されるシクロスポリン（シクロスポリ
   ンＧ６ＰＤＨ接合体）、３）前記シクロスポリンＧ６Ｐ
   ＤＨ接合体に結合可能な抗体類、および４）グルコース
   −６−リン酸デヒドロゲナーゼの基質、を合する工程；
   およびｂ）　　該グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
   ーゼ活性の測定工程、を含んでなる請求項１に記載のシ
   クロスポリンを含むと考えられる試料中のシクロスポリ
   ン量の測定方法。
3. 【請求項３】　　シクロスポリンの環状骨格のアラニン
   窒素原子において少なくとも５個の原子を有する有機基
   に接合するシクロスポリンを含んでなる化合物。
4. 【請求項４】　　前記シクロスポリンが、結合、または
   長さで約１５原子以下の鎖を有する水素原子以外に約２
   ０原子未満の原子からなる連結基によって、前記有機基
   に結合される請求項３に記載の化合物。
5. 【請求項５】　　前記有機基が、標識、免疫原性担体、
   または小有機分子の残基を含んでなる請求項３または４
   に記載の化合物。
6. 【請求項６】　　該有機基が免疫原性担体である請求項
   ３、４または５に記載の化合物に対する応答において調
   製される抗体類。
7. 【請求項７】　　シクロスポリンを認識可能な抗体類で
   ある請求項６に記載の抗体類。
8. 【請求項８】　　前記シクロスポリンが、シクロスポリ
   ンＡ代謝産物Ｍ１である請求項６に記載の抗体類。
9. 【請求項９】　　請求項６に記載の抗体類と標識との接
   合体である化合物。
10. 【請求項１０】　　式、 【化１】 式中、基β１およびβ２の一方が水素であり、他方が少
    なくとも５個の原子を有する有機基、を有する請求項に
    記載の化合物。
11. 【請求項１１】　　前記有機基が、グルコース−６−リ
    ン酸デヒドロゲナーゼに結合される約３〜１５個の原子
    を水素以外に有する鎖を含んでなる請求項１０に記載の
    化合物。
12. 【請求項１２】　　該有機基が免疫原性担体である請求
    項１０に記載の化合物に対する応答において調製される
    抗体類。
13. 【請求項１３】　　（ｉ）β２が、水素であり、かつβ
    １が： 【化２】 【化３】 式中、β３はポリ（アミノ酸）であり、からなる群から
    選択されるものであるか、または、（ｉｉ）　　β１お
    よびβ２の一方が水素であり、他方が： 【化４】 【化５】 式中、β３はポリ（アミノ酸）である、からなる群から
    選択されるものである、請求項１０に記載の化合物。
14. 【請求項１４】　　請求項１０に記載の化合物の調製方
    法であって、（ｉ）前記有機基が水酸基を末端とする２
    個の炭素を有する鎖を含み：ａ）シクロスポリンを、二
    級アミドの脱水素に充分な塩基性を有する塩基と反応さ
    せ、ｂ）脱水素化されたａ）の化合物をエポキシドと反
    応させ、およびｃ）前記シクロスポリンから保護基を除
    去する工程を含むか；（ｉｉ）前記有機基がカルボキシ
    ベンジル基を含み：ａ）シクロスポリンを、二級アミド
    の脱水素に充分な塩基性を有する塩基と反応させ、ｂ）
    脱水素化されたａ）の化合物を低級α−ハロメチル安息
    香酸低級アルキルエステルと反応させ、およびｃ）前記
    シクロスポリンから保護基を除去する工程を含むか；あ
    るいは、（ｉｉｉ）前記有機基が酵素標識であり、ａ）
    前記有機基がカルボキシル基に結合する約２〜１４個の
    原子を水素以外に有する鎖を含む場合の請求項１０に記
    載の化合物の活性エステルを調製し、およびｂ）前記活
    性エステルを酵素に添加する工程を含むことを特徴とす
    る方法。
15. 【請求項１５】　　シクロスポリンを含有すると考えら
    れる試料中のシクロスポリン量測定アッセイにおいて、
    前記試料を含むアッセイ媒質を、妨害的交差反応性物質
    に結合可能な抗体と合することを含んでなり、前記抗体
    がシクロスポリン量測定アッセイを妨害しないものであ
    る妨害的交差反応性物質の不活性化方法。
16. 【請求項１６】　　前記妨害的交差反応性物質が、前記
    シクロスポリンの代謝産物である請求項１５に記載の方
    法。
17. 【請求項１７】　　前記抗体が、シクロスポリン代謝産
    物Ｍ−１に結合し、シクロスポリンＡに実質的に結合不
    可能な抗体である請求項１５または１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】　　シクロスポリンを含有すると考えら
    れる試料中のシクロスポリン量測定アッセイにおいて、
    ａ）水性媒質中に：１）シクロスポリンを含有すると考
    えられる前記試料、２）標識に接合されるシクロスポリ
    ン（シクロスポリン接合体）、３）シクロスポリンおよ
    び前記シクロスポリン接合体に結合可能な第１の抗体、
    および４）シクロスポリンの代謝産物に結合可能な第２
    の抗体を合し；ならびにｂ）前記標識の活性を測定する
    、工程を含んでなることを特徴とする請求項１５に記載
    の方法。
19. 【請求項１９】　　前記第２の抗体が、シクロスポリン
    代謝産物Ｍ１に結合可能であり、シクロスポリンＡまた
    は前記シクロスポリン接合体に結合不可能である請求項
    １８に記載の方法。
20. 【請求項２０】　　前記第２の抗体が、式：【化６】 式中：Ｚは免疫原性担体であり；ｍは、１からＺの分子
    量を５０００で割った値までの数であり；およびＡは、
    式： 【化７】 式中、Ｙは、結合または長さにおいて約３０個の原子以
    下である鎖を有し、水素以外に１〜６０個の原子からな
    る連結基である、を有するシクロスポリン誘導体である
    を有する化合物に対する応答により生じる抗体である請
    求項１８または１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】　　グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
    ナーゼ−ハプテン接合体（Ｇ６ＰＤＨ接合体）である免
    疫複合体およびシクロスポリンに対する抗体を含んでな
    る組成物。
22. 【請求項２２】　　シクロスポリン代謝産物に結合し、
    かつシクロスポリンまたは前記Ｇ６ＰＤＨ接合体に実質
    的に結合しない第２の抗体を含む請求項２１に記載の組
    成物。
23. 【請求項２３】　　式： 【化８】 式中、Ｚはヒドロキシル、標識、または分子量が５００
    ０を越える基であり；ｍは１からＺの分子量を５０００
    で割った値までの数であり；ならびにＡは、式；【化９
    】 式中、Ｙは、結合または長さにおいて約３０個の原子以
    下である鎖を有し、水素以外に１〜６０個の原子からな
    る連結基であり；Ｒ１Ｒ２およびＲ３は、水素またはヒ
    ドロキシルであり、但しＲ１Ｒ２およびＲ３のうち少な
    くとも一つがヒドロキシルであり；Ｒ４は、水素または
    低級アルキルであり；およびＲ５はヒドロキシルかつＲ
    ６は水素であるを有するシクロスポリン誘導体であるを
    有する化合物。
24. 【請求項２４】　　Ｒ５がヒドロキシルかつＲ６が水素
    である請求項２３に記載の化合物。
25. 【請求項２５】　　Ｒ１がヒドロキシルであり、Ｒ２お
    よびＲ３が水素であり、ならびにＲ４がメチルである請
    求項２３または２４に記載の化合物。
26. 【請求項２６】　　Ｙが、式： 【化１０】 を有する請求項２３、２４または２５に記載の化合物。
27. 【請求項２７】　　Ｚが標識である請求項２３に記載の
    化合物に対して結合可能であり、かつシクロスポリンに
    対して実質的に結合不可能であり、Ｚが免疫原性担体で
    ある請求項２３に記載の化合物に対する応答において調
    製される抗体類。
28. 【請求項２８】　　請求項２３に記載の化合物の製造に
    際し、ａ）シクロスポリン代謝産物を第１のアミノ酸残
    基のオレフィン性側鎖において酸化的に分解し、ｂ）ａ
    ）の生成物をアミノオキシアルカン酸と反応させ、ｃ）
    ｂ）の生成物を接合のために活性化し、ｄ）ｃ）の活性
    化生成物を、標識または免疫原性担体と反応させること
    により、請求項２３に記載の化合物を形成する工程、を
    含んでなることを特徴とする方法。