JPH0431762A - 心筋梗塞の判定方法 - Google Patents
心筋梗塞の判定方法Info
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- JPH0431762A JPH0431762A JP2139337A JP13933790A JPH0431762A JP H0431762 A JPH0431762 A JP H0431762A JP 2139337 A JP2139337 A JP 2139337A JP 13933790 A JP13933790 A JP 13933790A JP H0431762 A JPH0431762 A JP H0431762A
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- JP
- Japan
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- fabp
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- buffer
- solution
- fatty
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は抗体および定量や診断に有用な試薬に関する。
先行文献および解決課題
脂肪酸結合性蛋白（Ｆａｔｔｙ Ａｃ１ｄ Ｂｉｎ
ｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ １以下、ＦＡＢＰという）は
細胞質に存在する蛋白で、脂肪酸と結合する能力を持ち
、脂肪酸の細胞内代謝に関係している。ＦＡＢＰは動物
の肝臓や心筋組織、小腸などに分布している。
ｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ １以下、ＦＡＢＰという）は
細胞質に存在する蛋白で、脂肪酸と結合する能力を持ち
、脂肪酸の細胞内代謝に関係している。ＦＡＢＰは動物
の肝臓や心筋組織、小腸などに分布している。
最近、ヒトの心筋組織由来のＦＡＢＰ （以下、ｈｈＦ
ＡＢＰという）が分離精製され、その構造解析も行われ
ている。Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、、 ２５２ ９＋８
（１９８９）には、ｈｈ−ＦＡＢＰは＋３２のアミノ酸
から構成され、分子量は＋４７６８であると報告されて
いる。
ＡＢＰという）が分離精製され、その構造解析も行われ
ている。Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、、 ２５２ ９＋８
（１９８９）には、ｈｈ−ＦＡＢＰは＋３２のアミノ酸
から構成され、分子量は＋４７６８であると報告されて
いる。
Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓ、、 ８５ ９８１
（１９８９）にはウサギ心筋組織由来のＦＡＢＰを用
いて作成したモノクロナル抗体がｈ ｈ −ＦＡＢＰと
交差反応を示すことを利用して、ＥＩＡ法によりｈ ｈ
−ＦＡＢＰが定量できると報告されている。しかし、
本法は、標準物質としてｈ ｈ −ＦＡＢＰではなくウ
サギ心筋組織由来のＦＡＢＰを用いたことおよび用いた
抗体のｈ ｈ −ＦＡＢＰに対する交差性がウサギ心筋
組織由来のＦＡＲＰと同等でないことがあいまって、本
法での測定値はｈｈ −ＦＡＢＰ量を正確に反映してい
ない。
（１９８９）にはウサギ心筋組織由来のＦＡＢＰを用
いて作成したモノクロナル抗体がｈ ｈ −ＦＡＢＰと
交差反応を示すことを利用して、ＥＩＡ法によりｈ ｈ
−ＦＡＢＰが定量できると報告されている。しかし、
本法は、標準物質としてｈ ｈ −ＦＡＢＰではなくウ
サギ心筋組織由来のＦＡＢＰを用いたことおよび用いた
抗体のｈ ｈ −ＦＡＢＰに対する交差性がウサギ心筋
組織由来のＦＡＲＰと同等でないことがあいまって、本
法での測定値はｈｈ −ＦＡＢＰ量を正確に反映してい
ない。
そこで本発明者らは種々検討し、より正確な免疫学的定
量法を確立するとともに多数の患者の体液中のｈ ｈ
−ＦＡＢＰ量を定量したところ、ｈｈ−ＦＡＢＰが心筋
梗塞のマーカーとして有用であることを見い出し、本発
明完成した。
量法を確立するとともに多数の患者の体液中のｈ ｈ
−ＦＡＢＰ量を定量したところ、ｈｈ−ＦＡＢＰが心筋
梗塞のマーカーとして有用であることを見い出し、本発
明完成した。
発明の構成
本発明は抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ抗体およびこれを利用し
たｈ ｈ −ＦＡＢＰの免疫学的定量用試薬および心筋
梗塞の診断のための試薬に関するものである。
たｈ ｈ −ＦＡＢＰの免疫学的定量用試薬および心筋
梗塞の診断のための試薬に関するものである。
本発明の抗体は、ｈｈ−ＦＡＢＰを認識し、ヒト肝臓や
イヌ心筋組織由来のＦＡＢＰおよびヒトミオグロビンと
は実質的に交差反応をしないものである。
イヌ心筋組織由来のＦＡＢＰおよびヒトミオグロビンと
は実質的に交差反応をしないものである。
本発明の抗体はポリクロ−ナル抗体であってもよいしモ
ノクロ−ナル抗体であってもよい。より一層厳密な特異
性を持ち均質な品質のものが継続的に安定供給できる点
からすればモノクロ−ナル抗体がより好ましい。
ノクロ−ナル抗体であってもよい。より一層厳密な特異
性を持ち均質な品質のものが継続的に安定供給できる点
からすればモノクロ−ナル抗体がより好ましい。
本発明の抗体は、通常の方法により製造できる。
ポリクロ−ナル抗体はｈ ｈ −ＦＡＢＰでもってマウ
スやウサギ、ヤギ、ウマなどの動物を免疫することによ
り生産せしめることができるし、モノクロ−ナル抗体は
このような免疫された動物の膵臓細胞とミエローマ細胞
とをミルシュタインの方法により細胞融合させ、クロー
ニングをなし、ハイブリドーマを選択し、これをｉｎ
ｖｉｖｏまたは＋ｎ ｖ＋ｔｒ。
スやウサギ、ヤギ、ウマなどの動物を免疫することによ
り生産せしめることができるし、モノクロ−ナル抗体は
このような免疫された動物の膵臓細胞とミエローマ細胞
とをミルシュタインの方法により細胞融合させ、クロー
ニングをなし、ハイブリドーマを選択し、これをｉｎ
ｖｉｖｏまたは＋ｎ ｖ＋ｔｒ。
で培養することにより製造できる。抗原たるｈｈ−ＰＡ
ＢＰはヒト心筋組織から抽出・精製したり、細胞培養や
遺伝子組換え技術により製造できる。
ＢＰはヒト心筋組織から抽出・精製したり、細胞培養や
遺伝子組換え技術により製造できる。
ｈ ｈ −ＦＡＢＰの免疫学的定量には、■本発明の抗
ｈ ｈ −ＦＡＢＰ抗体、■抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ抗体
と標識物との結合物および■不溶性キャリヤーと抗ｈｈ
−ｐ＾ＨＰ抗体の結合ないしは吸着物の内の少なくとも
１種または２種の試薬が用いられる。
ｈ ｈ −ＦＡＢＰ抗体、■抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ抗体
と標識物との結合物および■不溶性キャリヤーと抗ｈｈ
−ｐ＾ＨＰ抗体の結合ないしは吸着物の内の少なくとも
１種または２種の試薬が用いられる。
標識物としては、ペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼの如き酵素、＋５１のよ
うな放射性物質、フルオレッセイフインチオシアネート
のような蛍光性物質さらにはスビ／化合物などが挙げら
れる。不溶性キャリヤーとしては細菌細胞壁片、ガラス
やボリスチレ／のビーズ、チューブ、マイクロプレート
などのＥＩＡやＲＩＡで用いられるものや凝集反応用の
ラテックス粒子などが挙げられる。本発明の抗体と標識
物等との結合は、これらが存するカルボキシル基やアミ
ノ基、ＳＨ基、ＯＨ基などを利用して、結合剤の存在下
または非存在下、常法に従って行われる。
ーゼ、アルカリホスファターゼの如き酵素、＋５１のよ
うな放射性物質、フルオレッセイフインチオシアネート
のような蛍光性物質さらにはスビ／化合物などが挙げら
れる。不溶性キャリヤーとしては細菌細胞壁片、ガラス
やボリスチレ／のビーズ、チューブ、マイクロプレート
などのＥＩＡやＲＩＡで用いられるものや凝集反応用の
ラテックス粒子などが挙げられる。本発明の抗体と標識
物等との結合は、これらが存するカルボキシル基やアミ
ノ基、ＳＨ基、ＯＨ基などを利用して、結合剤の存在下
または非存在下、常法に従って行われる。
ｈ ｈ −ＦＡＢＰの免疫学的定量は、本発明の抗体の
特異的な抗原結合能力を利用する方法であればいずれで
もよく、例えば、ＥＩＡ法やＲＩＡ法、ラテックス凝集
反応法などの方法により実施できる。
特異的な抗原結合能力を利用する方法であればいずれで
もよく、例えば、ＥＩＡ法やＲＩＡ法、ラテックス凝集
反応法などの方法により実施できる。
これらの免疫学的定量法で用いられる試薬としては、例
えば、競合ＥＩＡ法では、 ■ 抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ抗体 ■ ■の抗体に対する不溶化抗体（第２抗体）■ 酵素
標識抗原 ■ 標識酵素に対する基質 ■ 標準ｈ ｈ −ＦＡＢＰ溶液 などが用いられ、サンドイッチＥＩＡ法では、■ 酵素
標識抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ抗体■ 不溶化抗ｈ ｈ −
ＦＡＢＰ抗体 ■ 標識酵素に対する基質 ■ 標準ｈ ｈ −ＦＡＢＰ溶液 などが用いられ、ラテックス凝集反応法、では、■ ラ
テックス粒子と抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ抗体との結合また
は吸着物 ■ 標準ｈ ｈ −ＦＡＢＰ溶液 などが用いられる。
えば、競合ＥＩＡ法では、 ■ 抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ抗体 ■ ■の抗体に対する不溶化抗体（第２抗体）■ 酵素
標識抗原 ■ 標識酵素に対する基質 ■ 標準ｈ ｈ −ＦＡＢＰ溶液 などが用いられ、サンドイッチＥＩＡ法では、■ 酵素
標識抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ抗体■ 不溶化抗ｈ ｈ −
ＦＡＢＰ抗体 ■ 標識酵素に対する基質 ■ 標準ｈ ｈ −ＦＡＢＰ溶液 などが用いられ、ラテックス凝集反応法、では、■ ラ
テックス粒子と抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ抗体との結合また
は吸着物 ■ 標準ｈ ｈ −ＦＡＢＰ溶液 などが用いられる。
血清や尿の如きヒト体液中のｈ ｈ −ＦＡ［ｌＰｌ／
ベルを検知することは心筋梗塞の診断に有用である。
ベルを検知することは心筋梗塞の診断に有用である。
通常、ｈｈ−ＦＡＢＰレベルは心筋梗塞のｌｔ後に、ま
ず、血清レベルがピークに達し、その１〜２時間後に尿
中レベルがピークになるという変動パターンをとる。尿
中レベルは血清レベルよりも高く、血清レベルの５０〜
１００倍にも達することがある。
ず、血清レベルがピークに達し、その１〜２時間後に尿
中レベルがピークになるという変動パターンをとる。尿
中レベルは血清レベルよりも高く、血清レベルの５０〜
１００倍にも達することがある。
血清中のｈ ｈ −ＦＡＢＰのピークが出現する速さ（
時間）は、ヒトミオグロビンの場合と同様に速い。
時間）は、ヒトミオグロビンの場合と同様に速い。
なお、ヒトミオグロビンは心筋梗塞の初期にそのピーク
が出現する点において評価されるマーカーであるが、心
筋４１１ｔａ由来のものと骨格筋組織由来のものとを区
別できず、診断はかならずしも正確でないという欠点が
ある。ヒトの血清や尿中のｈｈ −ＦＡＢＰの検知は、
先に説明した免疫学定量法により行える。治療の緊急度
によって、いずれの方法を選択するのかを決定すればよ
い。例えば、手術中における心筋梗塞の発症をモニター
するときはラテックス凝集反応法のような定量あるいは
定性の結果がすみやかに得られる方法が好適であり、心
筋梗塞が疑われる患者、例えば狭心痛を訴える患者に運
動負荷を施し、ｈｈ−ＦＡＢＰレベルを検知するような
、治療の閑急性よりも診断の正確さが求められるときは
競合ＥＩＡ法などが選択される。
が出現する点において評価されるマーカーであるが、心
筋４１１ｔａ由来のものと骨格筋組織由来のものとを区
別できず、診断はかならずしも正確でないという欠点が
ある。ヒトの血清や尿中のｈｈ −ＦＡＢＰの検知は、
先に説明した免疫学定量法により行える。治療の緊急度
によって、いずれの方法を選択するのかを決定すればよ
い。例えば、手術中における心筋梗塞の発症をモニター
するときはラテックス凝集反応法のような定量あるいは
定性の結果がすみやかに得られる方法が好適であり、心
筋梗塞が疑われる患者、例えば狭心痛を訴える患者に運
動負荷を施し、ｈｈ−ＦＡＢＰレベルを検知するような
、治療の閑急性よりも診断の正確さが求められるときは
競合ＥＩＡ法などが選択される。
具体例
次に参考例および実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。
明する。
なお、以下で略記号でもって表わされる緩衝液は次の組
成からなるものである。
成からなるものである。
緩衝液Ａ；０．１％ＢＳＡ−０，１％ＮａＮ３−０．９
％ＮａＣ］−００，０４Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０緩衝
液Ｂ；１０％グリセロール−１璽ＭＥＤ丁＾−２■Ｍ２
−メルカプトエタノール−０，９％ ＮａＣ１２０■Ｍす／酸緩衝液、ｐＨ７，４緩衝液Ｃ；
１０％グリセロール−１ｍＭＥＤ丁＾−２■Ｍ２−メ
ルカプトエタノールー２０■Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７，４ 緩衝液０１１０％グリセロール−１ｍＭＥＤＴ＾−２ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール−１５−Ｍ トリス−塩酸緩衝液、ｆ）Ｈ８，４ 緩衝液Ｅ ； ０．Ｉ Ｍリン酸緩衝液、ｆ）８７．０
緩衝液Ｆ ； ０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０緩
衝液Ｇ；１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＩ（４，０１１
１ｉ Ｇ Ｈ； ０．９ ％ Ｎ＆Ｃｌ−０，１Ｍ ’
） ７ ａ！Ｉ緩衝液、ｐＨ７，４ 緩衝液１ ； ０．０５Ｍリン酸−ホウ酸緩衝液、ｐＨ
６，０参考例 １ ｈ ｈ −ＦＡＢｐＩ７
１＋調製死後５時間後に行われた病理解剖に際して得ら
れたヒトの心筋組織２５０ｇを用いてｈ ｈ −ＦＡＢ
Ｐを以下の方法で抽出・精製した。
％ＮａＣ］−００，０４Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０緩衝
液Ｂ；１０％グリセロール−１璽ＭＥＤ丁＾−２■Ｍ２
−メルカプトエタノール−０，９％ ＮａＣ１２０■Ｍす／酸緩衝液、ｐＨ７，４緩衝液Ｃ；
１０％グリセロール−１ｍＭＥＤ丁＾−２■Ｍ２−メ
ルカプトエタノールー２０■Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７，４ 緩衝液０１１０％グリセロール−１ｍＭＥＤＴ＾−２ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール−１５−Ｍ トリス−塩酸緩衝液、ｆ）Ｈ８，４ 緩衝液Ｅ ； ０．Ｉ Ｍリン酸緩衝液、ｆ）８７．０
緩衝液Ｆ ； ０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０緩
衝液Ｇ；１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＩ（４，０１１
１ｉ Ｇ Ｈ； ０．９ ％ Ｎ＆Ｃｌ−０，１Ｍ ’
） ７ ａ！Ｉ緩衝液、ｐＨ７，４ 緩衝液１ ； ０．０５Ｍリン酸−ホウ酸緩衝液、ｐＨ
６，０参考例 １ ｈ ｈ −ＦＡＢｐＩ７
１＋調製死後５時間後に行われた病理解剖に際して得ら
れたヒトの心筋組織２５０ｇを用いてｈ ｈ −ＦＡＢ
Ｐを以下の方法で抽出・精製した。
心筋組織をナイフで切断し、２５００ｍ ｌの緩衝液Ｂ
を加え、ポリトロン型ホモゲナイザーで処理し、遠心（
１０万Ｘｇ、９０分）し上清を得る。上清を緩衝液Ｂで
平衡化したセファクリルＳ−１００ＨＲ（ファルマシア
社）カラム（２，５Ｘ９５ｃｍ）を用いて分画する。分
子量１〜２万の分画を緩衝液Ｃに対して十分透析後、緩
衝液Ｃで平衡化したヒドロキシアパタイト（ナカライテ
スク社）カラム（２，５Ｘ３０ｃｍ）に添加し緩衝液Ｃ
で溶出する。最初に溶出される分画（粗製のｈ ｈ −
ＦＡＢＰ）を得る。これは後記実施例１における免疫抗
原として用いた。
を加え、ポリトロン型ホモゲナイザーで処理し、遠心（
１０万Ｘｇ、９０分）し上清を得る。上清を緩衝液Ｂで
平衡化したセファクリルＳ−１００ＨＲ（ファルマシア
社）カラム（２，５Ｘ９５ｃｍ）を用いて分画する。分
子量１〜２万の分画を緩衝液Ｃに対して十分透析後、緩
衝液Ｃで平衡化したヒドロキシアパタイト（ナカライテ
スク社）カラム（２，５Ｘ３０ｃｍ）に添加し緩衝液Ｃ
で溶出する。最初に溶出される分画（粗製のｈ ｈ −
ＦＡＢＰ）を得る。これは後記実施例１における免疫抗
原として用いた。
粗製ｈ ｈ −ＦＡＢＰ溶液を緩衝液りに対して十分透
析後、緩衝液りで平衡化したＤＥＡＥ−セフ７セル（フ
ァルマシア社）カラム（ＩＸ５０ｃｍ）に添加し十分洗
浄後、吸着した蛋白を塩化カリの直線的濃度勾配（０〜
１５０ ｍ Ｍ ）を有する緩衝液Ｃを用いて溶出する
。溶出される蛋白分画を２８０ ｎ ｍの吸光度で追跡
し、各ピークを電気泳動法により分析し、分子量が約１
６０００の単一バンドを示す分画をｈ ｈ −ＦＡＢＰ
溶液とした。
析後、緩衝液りで平衡化したＤＥＡＥ−セフ７セル（フ
ァルマシア社）カラム（ＩＸ５０ｃｍ）に添加し十分洗
浄後、吸着した蛋白を塩化カリの直線的濃度勾配（０〜
１５０ ｍ Ｍ ）を有する緩衝液Ｃを用いて溶出する
。溶出される蛋白分画を２８０ ｎ ｍの吸光度で追跡
し、各ピークを電気泳動法により分析し、分子量が約１
６０００の単一バンドを示す分画をｈ ｈ −ＦＡＢＰ
溶液とした。
実施例 １ ポリクロ−ナル抗体の調製参考例１で
得た粗製ｈ ｈ −ＦＡＢＰ （２，５ｍ ｇ蛋白／ｍ
ｌ）に生理食塩水を蛋白濃度が１ｍｇ／ｒｒ＋ｊ！とな
るように加え、更に等量のフロイント完全アジュバント
を加えてＷｌｏＷ：！エマルジｇノを作成し、これをウ
サギの足ｌ！２カ所、背部皮下８ケ所に０．１ｍｌづつ
注射する。２週間後に背部皮下５カ所に０．１ｍｌづつ
注射する。以後同様にして追加免疫を２週間毎に６回行
う。最終免疫は、粗製ｈｈＦＡＢＰを蛋白濃度が２ｍｇ
／ｍ１となるように生理食塩水で希釈した溶液を等量の
フロイント完全アジュバントを加えＷｌｏ Ｍ１エマル
ジョンを作成し、これをウサギの背部皮下１０ケ所にＯ
，１ｍｌづつ注射することにより行う。その９日後に頚
動脈より全血を採取し、血清を分離する。血清を緩衝液
Ａで希釈したものを抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰポリクロ−ナ
ル抗体溶液とした。
得た粗製ｈ ｈ −ＦＡＢＰ （２，５ｍ ｇ蛋白／ｍ
ｌ）に生理食塩水を蛋白濃度が１ｍｇ／ｒｒ＋ｊ！とな
るように加え、更に等量のフロイント完全アジュバント
を加えてＷｌｏＷ：！エマルジｇノを作成し、これをウ
サギの足ｌ！２カ所、背部皮下８ケ所に０．１ｍｌづつ
注射する。２週間後に背部皮下５カ所に０．１ｍｌづつ
注射する。以後同様にして追加免疫を２週間毎に６回行
う。最終免疫は、粗製ｈｈＦＡＢＰを蛋白濃度が２ｍｇ
／ｍ１となるように生理食塩水で希釈した溶液を等量の
フロイント完全アジュバントを加えＷｌｏ Ｍ１エマル
ジョンを作成し、これをウサギの背部皮下１０ケ所にＯ
，１ｍｌづつ注射することにより行う。その９日後に頚
動脈より全血を採取し、血清を分離する。血清を緩衝液
Ａで希釈したものを抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰポリクロ−ナ
ル抗体溶液とした。
実施例 ２ モノクロ−ナル抗体の調製実施例１に準
じてＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫し、そのｎ臓細飽を採取
する。対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ８−０１ （ＡＴＣＣ力９ ｃｌグ番号Ｃ
ＲＬ−１５９７）の５Ｘ１０’個と抗体生産性膵臓細胞
のｌＸｌ０’個を混合し、これを緩衝液Ｈで遠心（４０
０Ｘｇ１１０分）洗浄後、３７℃に保温した０、５ ｍ
ｌのポリエチレングリコール１５００− ＲＰ Ｍ
Ｉ −１６４０培地（１： １）を徐々に加え、ゆくつ
り撹拌する。
じてＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫し、そのｎ臓細飽を採取
する。対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ８−０１ （ＡＴＣＣ力９ ｃｌグ番号Ｃ
ＲＬ−１５９７）の５Ｘ１０’個と抗体生産性膵臓細胞
のｌＸｌ０’個を混合し、これを緩衝液Ｈで遠心（４０
０Ｘｇ１１０分）洗浄後、３７℃に保温した０、５ ｍ
ｌのポリエチレングリコール１５００− ＲＰ Ｍ
Ｉ −１６４０培地（１： １）を徐々に加え、ゆくつ
り撹拌する。
９０秒後、３７℃に保温した１０ｍ ｌの細胞融合用無
血清培地（５０Ｕ／ｍ ｌペニシリンＧ Ｎ ５０μｇ
／ ｍ ｌ ストレブトマイシ／含訂ＲＰＭＩ −１
６４０培地）を同様にして加え、１０分後、同培地１０
ｍ ｌを加えた後に遠心（４００Ｘ ｇ 、 １０分）
シ、上清を除去する。得られるベレットにＨＡＴ培地を
加えて、常法により培養する。抗体価の高いハイブリド
ーマを選択し、限界希釈法によりクローニングをなし、
クローン化ハイブリドーマを樹立する。なお、抗体価の
検定は後記実施例３で調製したβ−ガラクトシダーゼ標
ｍ ｈ ｈ −ＦＡＢＰを用いて行った。クロ、−ン化
ハイブリドーマを、予めブリスタン処理したＢＡＬＢ／
Ｃマウスに接種し、目的のモノクロ−ナル抗体を含有す
る腹水を得る。
血清培地（５０Ｕ／ｍ ｌペニシリンＧ Ｎ ５０μｇ
／ ｍ ｌ ストレブトマイシ／含訂ＲＰＭＩ −１
６４０培地）を同様にして加え、１０分後、同培地１０
ｍ ｌを加えた後に遠心（４００Ｘ ｇ 、 １０分）
シ、上清を除去する。得られるベレットにＨＡＴ培地を
加えて、常法により培養する。抗体価の高いハイブリド
ーマを選択し、限界希釈法によりクローニングをなし、
クローン化ハイブリドーマを樹立する。なお、抗体価の
検定は後記実施例３で調製したβ−ガラクトシダーゼ標
ｍ ｈ ｈ −ＦＡＢＰを用いて行った。クロ、−ン化
ハイブリドーマを、予めブリスタン処理したＢＡＬＢ／
Ｃマウスに接種し、目的のモノクロ−ナル抗体を含有す
る腹水を得る。
このモノクロ−ナル抗体の性質は次のとおりである。
■ ｈ ｈ −ＦＡＢＰを認識する
■ ヒト肝臓由来のＦＡＢＰと実質的に交差しないＯイ
ヌ心筋組織由来のＦＡＢＰと実質的に交差しない ０ ヒトミオグロビンと実質的に交差しない＠ｈｈ−Ｆ
ＡＢＰおよび酵素標識ｈ ｈ −ＦＡＢＰの双方に対し
て競合的に結合する 実施例 ３ 酵素標ｍｈｈ−ＦＡＢＰノＩＩ製参考例
１で調製した精製ｈ ｈ −ＦＡＢＰ （３，５ｍ ｇ
蛋白／ ｍ １ ） ０．２ ｍ ｌと１ｍＩの緩衝液
Ｅとの混液に２００μｇのｍ−ＭＢＳを含むジオキサン
０．２ｍｌを滴下し、室温で３０分間撹拌する。これに
ｌ０ｍ１の緩衝液Ｆを加え、ＹＭ−５限外濾過膜（アミ
７７社）で濃縮し、さらに同緩衝液Ｆの７ｍｌで２回洗
浄濃縮を行う。濃縮液１．５ ｍ ｌに５００μｇの大
腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（ベーリンガマンハイム
社）を含む緩衝液Ｆ０．２ｍｌと飽和硫安溶液０．２
ｍ ｌの混液を滴下し、室温で８０分撹拌する。緩衝液
Ａで十分洗浄したセファロース６Ｂ（ファマンア社）カ
ラム（１，５Ｘ７０ｃ ｍ ）に上記反応混液を流し、
緩衝液Ａで溶出し、２ｍｌづつ分画する。２５〜３３番
目の分画をプールし、これを緩衝液Ａで５００倍に希釈
したものを酵素標識ｈｈ −ＦＡＢＰ溶液とした。
ヌ心筋組織由来のＦＡＢＰと実質的に交差しない ０ ヒトミオグロビンと実質的に交差しない＠ｈｈ−Ｆ
ＡＢＰおよび酵素標識ｈ ｈ −ＦＡＢＰの双方に対し
て競合的に結合する 実施例 ３ 酵素標ｍｈｈ−ＦＡＢＰノＩＩ製参考例
１で調製した精製ｈ ｈ −ＦＡＢＰ （３，５ｍ ｇ
蛋白／ ｍ １ ） ０．２ ｍ ｌと１ｍＩの緩衝液
Ｅとの混液に２００μｇのｍ−ＭＢＳを含むジオキサン
０．２ｍｌを滴下し、室温で３０分間撹拌する。これに
ｌ０ｍ１の緩衝液Ｆを加え、ＹＭ−５限外濾過膜（アミ
７７社）で濃縮し、さらに同緩衝液Ｆの７ｍｌで２回洗
浄濃縮を行う。濃縮液１．５ ｍ ｌに５００μｇの大
腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（ベーリンガマンハイム
社）を含む緩衝液Ｆ０．２ｍｌと飽和硫安溶液０．２
ｍ ｌの混液を滴下し、室温で８０分撹拌する。緩衝液
Ａで十分洗浄したセファロース６Ｂ（ファマンア社）カ
ラム（１，５Ｘ７０ｃ ｍ ）に上記反応混液を流し、
緩衝液Ａで溶出し、２ｍｌづつ分画する。２５〜３３番
目の分画をプールし、これを緩衝液Ａで５００倍に希釈
したものを酵素標識ｈｈ −ＦＡＢＰ溶液とした。
実施例 ５ 不溶化第２抗体の調製ラクトバチルス
プランタルム＾ＴＣＣ８０１９の細菌細胞壁片４０ｍ
ｇを水４ｍｌに懸濁し、十分に均一にした後に１ｍｇ
の抗つサギＩｇＧヤギ抗体（第２抗体）を加え、撹拌下
、６０μｌの緩衝液Ｇ、５％水溶性カルボジイミド水溶
液１２０μｌおよび２５％グルタルアルデヒドｌＯμｌ
を順次加え、室温で１時間撹拌する。反応混液を遠心（
１５００Ｘｇ、 １０分）シ、沈殿に５ｍＡ＋の緩衝
液Ａを加えて遠心洗浄する。これを３回くり返し、０．
５％の細胞壁片を含有する２０ｍ ｌの緩衝液Ａに懸濁
する。
プランタルム＾ＴＣＣ８０１９の細菌細胞壁片４０ｍ
ｇを水４ｍｌに懸濁し、十分に均一にした後に１ｍｇ
の抗つサギＩｇＧヤギ抗体（第２抗体）を加え、撹拌下
、６０μｌの緩衝液Ｇ、５％水溶性カルボジイミド水溶
液１２０μｌおよび２５％グルタルアルデヒドｌＯμｌ
を順次加え、室温で１時間撹拌する。反応混液を遠心（
１５００Ｘｇ、 １０分）シ、沈殿に５ｍＡ＋の緩衝
液Ａを加えて遠心洗浄する。これを３回くり返し、０．
５％の細胞壁片を含有する２０ｍ ｌの緩衝液Ａに懸濁
する。
実施例 ５ 競合ＥＩＡ法
標準標準ｈ −ＦＡＢＰ溶液または検体５０μｌを試験
管にとり、これに実施例１で得た抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ
ポリクロ−ナル抗体溶液２００μｌを加えて撹拌し、室
温で１５〜２０時間放置する。これに実施例３で得た酵
素標識ｈ ｈ −ＦＡＢＰ溶液２００μｌを加え、３７
℃で３０分間放置する。次に実施例４で得た不溶化第２
抗体の懸濁液２００μｌを加え３７℃で３０分間放置し
た後、０．９％ＮｉＣ１溶液２ｍｌを加え遠心（＋５０
０Ｘｇ１１０分）シ、上清を除去する。この洗浄操作を
さらに１回くり返す。沈殿に０．５ ｍ ｌの緩衝液Ａ
を加えミキサーで撹拌して沈殿を完全に分散させ、３７
℃で３分間予熱し、これに１００μ！の酵素基質溶液［
０，３ｍＭ４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラク
トビラ／シト−１ｍＭＭｇｃ１２０．０４Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）］を加えて３７℃で放置する。６０分
後に酵素反応停止液（０，１Ｍに２ＨＰＯ４ＮａＯＨ緩
衝液、ｆ） Ｈ１１）を加えて撹拌し、蛍光強度（励起
波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）を測定する。
管にとり、これに実施例１で得た抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ
ポリクロ−ナル抗体溶液２００μｌを加えて撹拌し、室
温で１５〜２０時間放置する。これに実施例３で得た酵
素標識ｈ ｈ −ＦＡＢＰ溶液２００μｌを加え、３７
℃で３０分間放置する。次に実施例４で得た不溶化第２
抗体の懸濁液２００μｌを加え３７℃で３０分間放置し
た後、０．９％ＮｉＣ１溶液２ｍｌを加え遠心（＋５０
０Ｘｇ１１０分）シ、上清を除去する。この洗浄操作を
さらに１回くり返す。沈殿に０．５ ｍ ｌの緩衝液Ａ
を加えミキサーで撹拌して沈殿を完全に分散させ、３７
℃で３分間予熱し、これに１００μ！の酵素基質溶液［
０，３ｍＭ４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラク
トビラ／シト−１ｍＭＭｇｃ１２０．０４Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）］を加えて３７℃で放置する。６０分
後に酵素反応停止液（０，１Ｍに２ＨＰＯ４ＮａＯＨ緩
衝液、ｆ） Ｈ１１）を加えて撹拌し、蛍光強度（励起
波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）を測定する。
第１図は本法における定量曲線である。
実施例 ６ 心筋梗塞患者のｈ ｈ −ＦＡＢＰレベル
実施例５に従って、ある心筋梗塞患者の血中および尿中
のｈ ｈ −ＦＡＢＰレベルを定量し、第２図の結果を
得た。なお、同一検体について、日本臨床化学会年会記
録第２６集、８９頁（１９８Ｂ＞に記載の方法に従って
ミオグロビンも定量した。第２図において「Ｓ−」とあ
るのは血清を検体とした場合であり、ｒｕ−Ｊとあるの
は尿を検体とした場合を意味し、Ｍｂはミオグロビンを
意味する。従って例えば、ｒ ｕ −ｈ ｈ −ＦＡＢ
ＰＪは尿中のｈ ｈ −ＦＡＢＰを意味する。
実施例５に従って、ある心筋梗塞患者の血中および尿中
のｈ ｈ −ＦＡＢＰレベルを定量し、第２図の結果を
得た。なお、同一検体について、日本臨床化学会年会記
録第２６集、８９頁（１９８Ｂ＞に記載の方法に従って
ミオグロビンも定量した。第２図において「Ｓ−」とあ
るのは血清を検体とした場合であり、ｒｕ−Ｊとあるの
は尿を検体とした場合を意味し、Ｍｂはミオグロビンを
意味する。従って例えば、ｒ ｕ −ｈ ｈ −ＦＡＢ
ＰＪは尿中のｈ ｈ −ＦＡＢＰを意味する。
第２図に示すように、この患者の場合には心筋梗塞の発
作が発生してから約５時間後に５−ｈｈ−ＦＡＢＰがピ
ークになり、その約３時間後にｕ−ｈｈ −ＦＡＢＰの
ピークが出現し、そして５−ｈｈ−ＦＡＢＰのピークは
ｓ−Ｍｂのピークと一致している。
作が発生してから約５時間後に５−ｈｈ−ＦＡＢＰがピ
ークになり、その約３時間後にｕ−ｈｈ −ＦＡＢＰの
ピークが出現し、そして５−ｈｈ−ＦＡＢＰのピークは
ｓ−Ｍｂのピークと一致している。
ｕ −ｈ ｈ −ＦＡＢＰピーク濃度はＳ −ｈ ｈ
−ＦＡＢＰの約１００倍である。
−ＦＡＢＰの約１００倍である。
緩衝液■に懸濁した１０％カルボン酸変性ラテックＸ
ＨＯ９０１（粒径０．９３μ、日本合成ゴムｅ！Ｊｌ）
３５０μｌに２．５ ｍ ｇの水溶性カルボジイミドを
含む水溶液５０μｌを滴下し、室温で撹拌する。３０分
後、実施例２で得たマウス腹水（抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ
モノクロナル抗体溶液）１００μｌを滴下し室温で３０
分撹拌する。遠心後、沈殿を５ｍｌの緩衝液Ａで３回洗
浄し、超音波処理によりラテックスを分散させ、緩衝液
Ａに懸濁し、１％の抗ｈ１１− ＦＡＢＰモノクロ−ナ
ル抗体感作ラテックス懸濁液を調製する。
ＨＯ９０１（粒径０．９３μ、日本合成ゴムｅ！Ｊｌ）
３５０μｌに２．５ ｍ ｇの水溶性カルボジイミドを
含む水溶液５０μｌを滴下し、室温で撹拌する。３０分
後、実施例２で得たマウス腹水（抗ｈ ｈ −ＦＡＢＰ
モノクロナル抗体溶液）１００μｌを滴下し室温で３０
分撹拌する。遠心後、沈殿を５ｍｌの緩衝液Ａで３回洗
浄し、超音波処理によりラテックスを分散させ、緩衝液
Ａに懸濁し、１％の抗ｈ１１− ＦＡＢＰモノクロ−ナ
ル抗体感作ラテックス懸濁液を調製する。
■ 凝集反応
反応はラテックススライド法により行った。抗ｈ ｈ
−ＦＡＢＰモノクロ−ナル抗体感作ラテックス懸濁液２
０μｌを判定用スライドに滴下し、これに健常者または
種々の心筋梗塞患者の尿２０μｌを加え、よく混合し、
室温における３分後のスライド凝集像により凝集の程度
を判定し、次表の結果を得た。
−ＦＡＢＰモノクロ−ナル抗体感作ラテックス懸濁液２
０μｌを判定用スライドに滴下し、これに健常者または
種々の心筋梗塞患者の尿２０μｌを加え、よく混合し、
室温における３分後のスライド凝集像により凝集の程度
を判定し、次表の結果を得た。
なお、次表には同一検体について、実施例５の競合ＥＩ
Ａ法で定量した結果もあわせて掲載している。
Ａ法で定量した結果もあわせて掲載している。
および血中ミオグロビン（Ｓ
Ｍｂ）の変動バタ
／を示す。
Claims (5)
- （１）ヒト心筋組織由来の脂肪酸結合性蛋白（以下、ｈ
ｈ−ＦＡＢＰという）を認識する抗ｈｈ−ＦＡＢＰ抗体
。 - （２）抗体がポリクロ−ナル抗体である請求項１記載の
抗体。 - （３）抗体がモノクロ−ナル抗体である請求項１記載の
抗体。 - （４）［１］抗ｈｈ−ＦＡＢＰ抗体、［２］抗ｈｈ−Ｆ
ＡＢＰ抗体と標識物質との結合物および［３］不溶性キ
ャリヤーと抗ｈｈ−ＦＡＢＰ抗体との結合または吸着物
の内の少なくとも１種または２種を構成要素とするｈｈ
−ＦＡＢＰの免疫学的定量用試薬。 - （５）［１］抗ｈｈ−ＦＡＢＰ抗体、［２］抗ｈｈ−Ｆ
ＡＢＰ抗体と標識物質との結合物および３不溶性キャリ
ヤーと抗ｈｈ−ＦＡＢＰ抗体との結合または吸着物の内
の少なくとも１種または２種を構成要素とする心筋梗塞
の診断のための試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2139337A JP3012666B2 (ja) | 1990-05-28 | 1990-05-28 | 心筋梗塞の判定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2139337A JP3012666B2 (ja) | 1990-05-28 | 1990-05-28 | 心筋梗塞の判定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0431762A true JPH0431762A (ja) | 1992-02-03 |
| JP3012666B2 JP3012666B2 (ja) | 2000-02-28 |
Family
ID=15242978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2139337A Expired - Lifetime JP3012666B2 (ja) | 1990-05-28 | 1990-05-28 | 心筋梗塞の判定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3012666B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003516541A (ja) * | 1999-12-10 | 2003-05-13 | ユニヴェルシテ ドゥ ジュネーブ | 発作のための診断アッセイ |
| JP2003526788A (ja) * | 2000-03-10 | 2003-09-09 | ユニヴェルシテ ドゥ ジュネーブ | 伝染性海綿状脳症のための診断アッセイ |
| WO2003083486A1 (fr) * | 2002-03-29 | 2003-10-09 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Procédé d'évaluation de la cardiotoxicité d'une substance thérapeutique chimique anticancéreuse du type anthracycline par détection de la protéine de liaison d'acides gras du coeur humain (h-fabp) et réactif associé |
| US7592148B1 (en) | 1997-11-26 | 2009-09-22 | Cmic Co., Ltd. | Method for examining human kidney disease by detecting the fatty acid binding protein |
| CN102608325A (zh) * | 2012-02-24 | 2012-07-25 | 南京诺尔曼生物技术有限公司 | 脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding proteins,H-FABP)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法) |
-
1990
- 1990-05-28 JP JP2139337A patent/JP3012666B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7592148B1 (en) | 1997-11-26 | 2009-09-22 | Cmic Co., Ltd. | Method for examining human kidney disease by detecting the fatty acid binding protein |
| JP2003516541A (ja) * | 1999-12-10 | 2003-05-13 | ユニヴェルシテ ドゥ ジュネーブ | 発作のための診断アッセイ |
| JP4751555B2 (ja) * | 1999-12-10 | 2011-08-17 | エレクトロフォレティックス リミテッド | 脳卒中のための診断アッセイ |
| JP2003526788A (ja) * | 2000-03-10 | 2003-09-09 | ユニヴェルシテ ドゥ ジュネーブ | 伝染性海綿状脳症のための診断アッセイ |
| WO2003083486A1 (fr) * | 2002-03-29 | 2003-10-09 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Procédé d'évaluation de la cardiotoxicité d'une substance thérapeutique chimique anticancéreuse du type anthracycline par détection de la protéine de liaison d'acides gras du coeur humain (h-fabp) et réactif associé |
| CN102608325A (zh) * | 2012-02-24 | 2012-07-25 | 南京诺尔曼生物技术有限公司 | 脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding proteins,H-FABP)测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法) |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3012666B2 (ja) | 2000-02-28 |
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