JPS63273496A - モノクロ−ナル抗体、ハイブリド−マおよびヒト成長ホルモン測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は末端肥大症や下垂体性小人症等の成長障害疾患
の診断および下垂体機能検査に有用なヒト成長ホルモン
（以下ｈＧＨと略す）の酵素免疫測定等に利用されるモ
ノクローナル抗体、これを生成するハイブリドーマおよ
び当該モノクローナル抗体を利用するヒト成長ホルモン
の測定法に関する。

〔従来技術〕

従来ｈＧ）Ｉはアミノ酸残基１９１個より成る分子Ｗｉ
２２．０００のペプチドホルモン（以下２２ＫｈＧＨと
略す）　１種類のみと考えられてきたが、最近ヒトの下
垂体前葉あるいは血中や尿中にアミノ酸１７６個より成
る分子１１２０．０００のｈＧＨ（２０ＫｈＧＨと略す
）が存在していることが明らかとなった。その生理活性
に関しては、成長促進作用は２２Ｋｈｃｏと同等である
が、２２ＫｈＧＨが有しているインシュリン様活性、脂
質分解作用および糖尿病原性がないことが判明した。従
って多彩な成長ホルモン作用は専ら２２ＫｈＧＨによる
ものと考えられるのでｈＧＨの分泌異常が引き起こす各
種疾患の診断には、２２ＫｈＧＨの生体内濃度測定が望
ましいことになる。

一方、ｈＧＨの測定に関しては現在ラジオイムノアッセ
イが用いられているが、測定感度が０．５〜１．Ｏｎｇ
／−と比較的低いために血中基礎レベルを測定できない
ので、インシュリン、アルギニン等による負荷試験後の
ｈＧＨ測定により診断が行われている。

しかしながら、生理的分泌動態との不−敗例もかなり多
（、自然な分泌動態でのｈＧＨ測定が望まれていた。

そこで血中、尿中ＧＨの基礎レベルの測定が可能な高感
度酵素免疫測定法の開発が行われ、既に報告されている
〔橘田、石川ら、クリ二カ・キミカ・アクタ（ＣＩｌｎ
ｌｃａ、　Ｃｈｌｍｌｃａ、＾ｃｔａ）−ｌ工、　（１
９Ｂ？）２２９−２３５頁】。

〔発明が解決しようとする問題点〕

このような現状に鑑みれば、ｈ　Ｇ　Ｈの自然分泌動態
測定による診断にはより高感度であり、２２ＫｈＧＨの
みの定量または２０ＫｈＧＨとの分別定量の可能な物質
ないしは測定法の開発力、（待望されるところであり、
従って、本発明の目的はかかる物質、これを生成するハ
イブリドーマおよび当該物質を使用するヒト成長ホルモ
ンの測定方法を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

この目的は、本発明によるモノクローナル抗体、ハイブ
リドーマおよびモノクローナル抗体を利用するヒト成長
ホルモンの測定方法により解決される０ｗＩち、本発明
は下記Φ〜■の通りである。

■２２ＫｈＧＨに特異的に反応し２０ＫｈＧＨと実質的
反応しないモノクローナル抗体 ■当該モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ。

■前記モノクローナル抗体を利用することによるヒト成
長ホルモンの測定方法。

本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマＣＬ、
Ｂ１．を培養することによって、また当該ハイブリドー
マを接種したマウス腹水等から製造することができる。

ハイブリドーマＣＬ、Ｂ１．は、所謂細胞融合によって
得たハイブリドーマをクローン化し、２２ＫｈＧＨに対
して特異性を有するクローンを選択することによって製
造される。

具体的には次の如き手段が例示される。

抗体産生細胞は、免疫された動物からの牌細胞、リンパ
節細胞、Ｂ−リンパ球である。免疫原としては、たとえ
ば下垂体抽出ｈＧＨ（たとえば、商品名タレスコルモン
）等が例示され、免疫される動物としては、マウス、ラ
ット等が例示される。

免疫原は、たとえばアジュバントと組み合わせて常法で
投与する。アジュバントとしてはフロイントの完全また
は不完全アジュバントが有利である。免疫化は２〜６週
間間隔で少なくとも２回以上の投与により行われる。

このように免疫化した動物から、たとえば牌細胞を得、
骨髄腫細胞系と融合させる。この融合はケーラー（ＫＢ
ｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｆｌｌｌｓｔｅｉｎ）
の公知の方法〔ネイチュア（Ｎａ　ｔｕｒｅ）韮、４９
５〜４９７頁１９７５年〕により行う、骨髄腫細胞系と
しては、たとえばマウス、ラット等が使用される。

この際生じた融合細胞を限定希釈法等により、クローン
化する。さらにその中で下垂体抽出ｈＧＨ（クレスコル
モン）および２０ＫｈＧＨ（Ｕ、Ｊ。

Ｌｅｗｉｓより分与）を用いた酵素イムノアッセイ法（
ＥＬＩＳＡ法）によりスクリーニングを行って２２Ｋｈ
ＧＨとのみ特異的に反応し、２０ＫｈＧＨとは実質的に
反応しないモノクローナル抗体産生株、即ちハイブリド
ーマＣＬ、Ｂ１．を得ることができる。

当該ハイブリドーマはほぼ球形の浮遊細胞であり３７℃
、ＣＯ□５％、湿度１００％、ｐＨ７，２〜７．４で培
養すると約９〜２４時間の間に細胞数が倍増する。また
染色体数は１０９〜１２１である。

ハイブリドーマＣＬ、Ｂ１．は凍結法（−８０℃以下）
で保管することができる。凍結の条件は、たとえば１０
’　／ｌｄ／バイアルを、ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０７０
％、ウシ胎児血清２０％、ジメチルスルホキシド１０％
の溶液中で１℃／分の速度で降下させるというものであ
る。

当該ハイブリドーマＣＬ、Ｂ１．は工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託申請を行ったところ受託出来る微生
物の範囲外であるとして受託拒否された旨、当該研究所
よりすでに連絡を受けており、寄託受託拒否通知書は該
研究所よりすでに発送ずみである。

本発明のモノクローナル抗体は上記ハイブリドーマの培
養上澄から、あるいはマウス腹水、血清などから回収で
きる。

当該ハイブリドーマを培養するための培地は、炭素源、
窒素源、必要に応じてビタミン類、無機塩類を含有し、
このような培地の一例としては、子牛胎児血清（たとえ
ば１０％程度）を添加したＲＰＭＩ−１６４０が例示さ
れる。

培養温度は３６〜３７．５℃（好適には３７℃）、培養
期間は１〜４（好適には２〜３日）、ｐＨは６．５〜７
．５（好適には７．２〜７．４）、５％Ｃｏｔ　　９５
％ａｉｒ　％湿度１００％の条件で通常１〜２　Ｘ　１
０’／＠ｌの細胞濃度で植え継ぐ、マウス腹水、血清な
どからの回収は、たとえば次の様にして行われる。６ｉ
！！１令のＢＡＬＢ／Ｃマウス（日本チャールズリバー
）に０．５−のプリスタン（２，６＋　１０＋　１４−
ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ、　Ａ
ｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内投与し、その２週間〜１ケ月後
ＣＬ、Ｂ１．５Ｘ１０’を腹腔内投与する。１０〜１４
日後にマウスから腹水を採取する。

このモノクローナル抗体は、精製せずに使用することも
できるが、好ましくは使用前に精製する。

たとえば硫安塩析、ＤＥＡＥセルロースクロマト等の操
作によって精製し、ＩｇＧ画分を得る。

本発明のモノクローナル抗体は２２ＫｈＧＨに対して高
い親和性（９，６ｘＬＯ”ｚ１モル親和定数）を有して
いる。さらに２０ＫｈＧＨに対する交叉反応性は１５％
以下と低く、血中、尿中の２０ＫｈＧＨの存在割合が１
０％以下である〔バウマン（Ｂａｕｍａｎｎ）ら、ジャ
ーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アン
ド・メタポライド（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉ
ｃａｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｔ
ａ−ｂｏｌｉｔｅ）　５６．３０５〜３１１頁、９４６
〜９５２頁、１９８３年〕ことから２２ＫｈＧＨの測定
系に対して実質的影響はない。

当該モノクローナル抗体は１ｇクラス（サブクラス）は
ＩｇＧ、であり、４本のポリペプチド（２本のＨ鎖、分
子１４７〜５０にと２本のし鎖、分子量２５〜２９ｋ）
からなる糖蛋白であり、ｐ＋は６．１〜７．０である。

本発明のモノクローナル抗体を利用するヒト成長ホルモ
ンの測定方法としては、当該モノクローナル抗体が利用
可能で、ヒト成長ホルモンの測定が可能な方法であれば
特に制限はない。たとえば酵素免疫測定法、ラジオイム
ノアッセイ、螢光免疫測定法等が例示され、特に好まし
くは酵素免疫測定法が例示される。

たとえば酵素免疫測定法においては、当該モノクローナ
ル抗体を不溶性支持体に結合させて抗体結合不溶性支持
体を得、この不溶性支持体を用いた所謂サンドインチ法
酵素免疫測定法が特に好ましいものである。

以下サンドインチ法酵素免疫測定法に基づいて本発明の
測定方法を説明する。

不溶性支持体としては、ポリスチレン球、ポリスチレン
チューブ、シリコン片、マイクロプレートなどが挙げら
れるが、特にポリスチレン球が好ましい。

モノクローナル抗体ＴｇＧ画分をこれらの不溶性支持体
に結合させる方法は公知の化学的結合方法でもよいが物
理的吸着法で十分である。即ち、上記１ｇＧ画分とリン
酸緩衝液等に溶解し前記不溶性支持体を加えて、０℃〜
室温にて１時間〜４８時間、好ましくは４℃〜ｌＯ℃に
て１０時間〜２４時間放置した後、牛血清アルブミン、
アジ化ナトリウム等の安定化剤を添加したリン酸緩衝液
等により洗浄し、２〜８℃にて保存する。

本発明ではまずモノクローナル抗体１ｇＧ画分結合不溶
性支持体にｈＧＨを含む被検液を反応させて、２２Ｋｈ
ＧＨを結合させる。反応は２０℃〜４０℃、好ましくは
２５℃〜３７℃にて１時間〜−夜、好ましくは３時間〜
８時間行う、ここでｈＧＨを含む被検液とは血清、血漿
、尿などヒト成長ホルモンを含有するものであればよい
。

次に、２２ＫｈＧＨを結合させた抗２２ＫｈＧＨモノク
ローナル抗体１ｇＧ画分結合不溶性支持体に抗ｈＧＨ抗
体を酵素で標識した標識物（以下標識物と略す）を反応
させ、不溶性支持体上に抗２２ＫｈＧＨモノクローナル
抗体１ｇＧ画分−２２ＫｈＧＨ−標識物なるサンドイン
チ状複合体を形成させる。

ここで標識物に用いる抗ｈＧＨ抗体はｈＧＨに対して特
異的に反応する抗体であって、２２ＫｈＧＨのみまたは
２０ＫｈＧＨとも反応する抗体であればよく、モノクロ
ーナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもよい
、特に、好ましくはアフィニティ精製した抗ｈＧＨウサ
ギポリクロニナル抗体であり、しかも非特異的吸着を減
少させるためにＦ　（ａｂ’）ｘ＋　　Ｆａｂ’　フラ
グメント等が望ましい。

さらに酵素としてはペルオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシ
ダーゼ等が挙げられるが、非特異的吸着の少ないペルオ
キシダーゼが好適である。

そしてこの酵素を抗ｈＧＨ抗体または抗ｈＧＨ抗体のＦ
　（ａｂ’）ｚ、　　Ｆａｂ’　フラグメントに標識す
る方法は公知方法で実施することができる。たとえば酵
素の１！鎖を過ヨウ素酸で酸化し、生成したアルデヒド
基に抗ｈＧＨ抗体などのアミノ基を結合させる方法、た
とえば酵素にマレイミド基あるいは、ピリジルスルフィ
ド基等を導入し、抗ｈＧＨＦ　ａｂ’　フラグメントに
存在するチオール基と結合させる方法などが挙げられる
。

本発明では、得られたサンドイッチ状複合体中の標識に
用いた酵素の活性を測定する。この酵素の活性量は、最
初に反応させた２２ＫｈＧＨの量に依存して対応するの
で、被検液中の２２ＫｈＧＨを測定することができる。

酵素の活性測定はその酵素の基質となる物質を添加する
ことにより行われるが、ペルオキシダーゼにおいては過
酸化水素とｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸等の螢
光物質を生ずる基質が高感度測定法として望ましい。

本発明における酵素免疫測定法においては２２ＫｈＧＨ
を特異的に測定可能であるが、検量線作製に用いる標準
ｈＧＨとしては下垂体ｈＧＨより精製した２２ＫｈＧＩ
（であるのが望ましい、しかしながら下垂体ｈＧＨ中の
２０ＫｈＧＨは１０％以下とされていること〔ルイス（
Ｌｌ、　Ｊ、　Ｌｅｗｉｓ）ら、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー〇、　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｃｈｅ＋ｗｉｓｔｒｙ）　２５３　（１９７
８）　２６７９−２６８７頁〕、また２２ＫｈＧＨ特異
モノクロ一ナル抗体の反応する割合が一定である下垂体
ｈＧＨで、しかもＷＨＯ測定１ｓｔ　１．Ｒ，Ｐ、を用
いて補正することにより一定品質のｈＧＨを用いること
ができれば標準品として２０ＫｈＧ）Ｉを若干含むｈＧ
Ｈを使用することができる。従って表示値は下垂体抽出
ｈＧＨ換算値となる。

〔発明の効果〕

本発明のハイブリドーマは２２ＫｈＧＨと特異的に反応
し、２０　Ｋ　ｈ　Ｇ　ｆ（と実質的に反応しないモノ
クローナル抗体を生成し、当該モノクローナル抗体を利
用したヒト成長ホルモンの測定方法においては、たとえ
ばヒト尿中濃度１ｐｇ／ｌｌｌ７以上、ヒト血中濃度５
ｐｇ／＠Ｚ以上のレベルの２２ＫｈＧ■（を酵素免疫測
定法により高感度に定量することができる。

さらに従来の２２ＫｈＧ１（と２０ＫｈＧＨの両方にの
み反応するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル
抗体を結合させた不溶性支持体を用いるサンドインチ法
酵素免疫測定法を組み合わせることにより２２ＫｈＧＨ
と２０ＫｈＧＨの高感度分別定量することができる。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を説明するが本発明はこれら
の実施例により議定されるものではない。

実施例１ 抗２２ＫｈＧＨモノクローナル抗体の作製ｆｉ＋　　免
疫 フロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔＨＦＣＡ；　Ｄｉｆｃ
ｏ　Ｌａｂ、、　Ｄｅｔｒｏｉｔ。

Ｍｉｃｈｉｇａｎ）　　と混和した２　２　Ｋ　ｈ　Ｇ
　Ｈ（Ｃｒｅｓｃｏｒ曽ｏｎ；Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ
　ＡＢ、＋　Ｓｔｏｃｋｈｏ１ｍ＋　Ｓｗｅｄｅｎ）　
　１００／ＩｇをＢＡＬＢ／Ｃ雌・５週齢マウス（日本
タレア、東京）へ腹腔内投与した。その後、３週間隔に
て３回、フロイントの不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎ
ｄ’　５ｉｎｃｏｓ＋ｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ；
　Ｆ　ｒ　Ａ）　　と混和した２２ＫｈＧＨ１００ｑを
腹腔内投与した。その３週間後、生理的緩衝液に溶解さ
れた２２ＫｈＧＨ１００ｑを静脈内投与することによっ
て追加免疫した。

（２）免疫肺臓細胞の調製 最終追加免疫４日後に、肺臓を摘出、イーグルのＭＥＭ
培地（阪大敵研、大阪）に懸濁し、肺臓細胞を得た。

（３）細胞融合 マウス骨髄腫細胞ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・Ｕｌ（Ｐ２Ｏ３
；　ＡＴＣＣＣＲＬ、　１５９７：　Ｃｕｒｔ、　Ｔｏ
ｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏ＋、　８１．１−７．１９７８）を１０％
ウシ胎児血清（Ｆｅ２　ＨＧｉｂｃｏ＋　Ｃｈａｇｒｉ
ｎ　Ｆａｌｌｓ、　０ｈｉｏ）加ＲＰＭＩ−１６４０培
地（阪大微研）中で培養し、対数増殖期で細胞を集め細
胞融合に用いた。融合方法はケーラー（Ｋｉｊｈｌｅｒ
）ら（ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ）　　２５６゜４９５
〜４９７．１９７５　）の方法に準じた。即ち、肺臓細
胞と骨髄腫細胞とを１０：ｌの比率で血清不含のイーグ
ルＭＥＭ培地に懸濁し、７分間１．００Ｏｒｐｍ（トミ
ー精工ＣＤ　−１０ＯＲ）にて遠心分離した。沈渣に３
７℃に保温された４５％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコ
ール（Ｐ［！Ｇ）　６０００　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏｏｔ　ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ＋　ＭＣ）の溶’ｔｆＸ　１　ｓｒを１分間
かけて添加し、さらに室温（２３±３℃）にて８分間イ
ンキュベートした０次いで、血清不合イーグルＭＥＭ培
地１６ｄを２ｍ／分の割合で加え、懸濁した。さらに血
清不含イーグルＭＥＭ培地１０ｔｆを徐々に加えＰＥＧ
を希釈した。

７分間１　＊　ＯＯＯｒｐｍで遠心分離し、その後、マ
ウス骨［１１１細胞として６Ｘ１０’／ｓ７の細胞濃度
が得られるように、１０％ＦＣ３−ＲＰＭＩ　−，１６
４０培地に再懸濁し、９６六マイクロプレート（住人ベ
ークライトＭＳ−３０９６Ｆ）に０．２ｍ／穴あて分注
した。この融合細胞を５％Ｃｏよにおいて３７℃で培養
した。Ｉｉ胞融合の１日後に、半分量の培地を新たなＨ
ＡＴ培地（１０−’Ｍピポキサンチン（Ｓｉｇｍａ　Ｃ
ｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｇｏ、）、４Ｘ１０−’Ｍアミノプ
テリン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　、
１．６　Ｘｌ０−’Ｍチミジン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏ、）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地〕と
交換した。以後、２日毎にＨＡＴ培地による半量交換を
３回行った。

１０日後には、約１００％のマイクロプレート穴で、細
胞の増殖が観察された。

（４）　　抗体アッセイ 細胞融合１１日後、ハイブリドーマ細胞の培養上清中の
２２ＫｈＧＨに対する抗体の存在を酵素免疫定量法、所
謂ＥＬＩＳＡ法にてスクリーニングした。即ち、リンり
緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　５）ｐＨ７，２に溶解された
２２ＫｈＧＨ溶液、１００μｌをポリ塩化ビニル９６六
マイクロプレート（ＦａｌｃｏｎＭｉｃｒｏｔｅｓｔ　
ｍ　ｆｌｅｘｉｂｌｅ　ａｓｓａｙ　ｐｌａｔｅ；　　
Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；　　以下ｐｖｃア
ッセイブレートと略す）に分注、３７℃２７℃２時間イ
ンキュページ溶液を除去し、次いでＰｖＣアッセイブレ
ートを乾燥させた。非特異的結合を防ぐために同様の操
作により牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）を吸着させ、
抗原プレートとして用いた。１％ＢＳＡ、０．０５％（
ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　２０＠（ポリオキシエチレン・
ソルビタン・モノラウレート−牛丼化学）を含むリン酸
緩衝生理食塩水ｐＨ７，２（以下ＰＢＳＴと略す）にて
適宜希釈した培養上清を１ウエルあたり１００μ！加え
て、２時間３７℃にて培養した。その後、ＰＢＳＴにて
３回洗浄し、次いでカルシウム・マグネシウム不含のＰ
ＢＳにて１０３倍希釈されたａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓ
ｐｈａ　ｔａｓｅ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　ｉｍｍｕ
ｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ　（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を１ウエルあたり１
００μｌ加え、２時間３７℃にて培養した。　ＰＢＳＴ
にて５回洗浄後、パラニトロフェニル　ピロフォスフエ
イト　（ｐａｒａｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｙｒｏｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＮＰＰ））を基質として、１５分
間３７℃にてインキュベートすることにより発色させ、
マルチスキャン（Ｔｉｔｅｒｔｅｃｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋ
ａｎ　ＭＣＣ＋　Ｆｌｏｗ　ｌ、ａｂ、）にて４０５ｎ
ｍでの吸光度を測定した。

アッセイの結果、１７０ウエルで陽性を示した（細胞増
殖ウェルに対して約３５％であった）。

２２ＫｈＧＨへの結合を示したウェルの培養上清は、い
ずれもＢＳＡに結合しなかった。このことは、特異性の
高いことを示している。

（５）ハイブリドーマのクローニング ２２ＫｈＧＨに対し高い結合能を示す抗体を産生してい
るハイブリドーマを、それぞれ、ＢＡＬ８／Ｃマウスの
胸腺細胞をフィーダ一層（ＩＸＩＯ″細胞／ウェル）と
して用いた９６六マイクロプレートに０．５細胞／ウエ
ルとなるように播種した。３〜４日毎に半量を新鮮培地
に交換しながら、５％ＣＯを存在下３７℃にて培養を続
け、細胞を充分に増殖させた。

１　各々のウェルの抗体価を（４）のごとくアッセイし
、増殖性が良好で、かつ高い抗体価を示すウェルを選別
した。

（６）ハイブリドーマの培養 クローニング後、培養にて増殖させたハイブリドーマ５
Ｘ１０’細胞を２週間前に、ブリスタン投与したＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウスの腹腔内へ接種した。

１０〜１４日後、マウスの腹腔より腹水を採取した。

（７）　　腹水の抗体価 腹水の抗体価をラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）によ
り調べた。即ち、ＰＢＳにて適宜希釈した腹水を９６穴
マイクロプレートのウェルに５０μ！／ウエルとなるよ
う分注、さらにＰＢＳにて希釈した”’ｌ−２２ＫｈＧ
Ｈ（５０μＣｉ／Ｐｇ）を５０μｌ／ウエルとなるよう
分注し、３７℃２時間および４℃−夜装置した。翌日抗
マウスイムノグロブリン抗体（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｌｅｓ＋　Ｉｎｃ、）を５０ｕ７！／ウエルと
なるよう分注し、３７℃１時間放置した。

さらに遠心後ウェルのカウントをＴ−カウンター（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、＋　
Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、　（ＣＡ））により計測した。

アッセイの結果、クローンＣＬ、Ｂｌは抗原最大結合量
の５０％を示す希釈度が２．８ＸｌＯｓという高い抗体
価を示した。

（８）抗体の免疫グロブリンクラスの同定ハイブリドー
マ培養上清７５μｌを、オフタロニーの二重免疫拡散法
に基づくモノクローナル抗体タイピングキット（生化学
工業）に対して、室温（２３±３℃）にて２４時間イン
キュベートし、抗原抗体沈降物を観察し、サブクラスを
同定した。抗血清としては、マウス免疫グロブリンγ１
、Ｔ２いｒｔｂ、γ５、αおよびμに対するヒツジポリ
クローナル抗体（Ｍｔｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、　Ｉｎｃ、）を用いた。

モノクローナル抗体ＣＬ、Ｂ１のクラスおよびサフリラ
スはＩｇＧ、であった。

（９）　　抗体の親和性の決定 抗体の親和性をｔＡにより決定した。即ち、（７）の方
法において一定量の”’？−２２ＫｈＧＨ（５０μＣｉ
　／　ｐｇ、１０，０００−２０，０００　ｃｐｓ）と
同時に各種の濃度の非放射性標！１ｉ２２ＫｈＧＨを加
え、抗体へ結合する２２ＫｈＧＨｆｔを求め、Ｓｅａ　
ｔｃｈａｒｄの方法（Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、＾ｃａｄ、
　Ｓｃｉ、、　５１．６６０−６７２゜１９４９）に従
って、親和性を算出した。

モノクローナル抗体ＣＬ、Ｂ１の２２ＫｈＧＨへの結合
定数は９．６Ｘ１０Ｍ！１モルと算出された。

叫　結合特異性の決定 モノクローナル抗体ＣＬ、Ｂ１の結合特異性をＥＬ４Ｓ
＾法により決定した。即ち、（４）の方法において２２
ＫｈＧＨの代わりに、２０ＫｈＧＨ（３２〜４６番目の
アミノ酸が欠如したｈＧＨ；Ｄｒ、　Ｕ、　Ｊ。

Ｌｅｗｉｓ、　５ｃｒｉｐｐｓ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｈ
ｏ５ｐｉｔａｌ＋　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ。

ＣＡより分与）、ヒトプロラクチンｈＰＲＬ（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、、　Ｌａ　
Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）、メチオニル２２ＫｈＧＨ（γ−
ｈＧＨ，組み換えＤＮＡ標品；Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ
　ＡＢ、、　　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　　Ｓｗｅｄｅｎ
　）、３２（１３５−１４０番目のアミノ酸が欠如した
ｈＧＨ。

Ｄｒ、　Ｕ、　Ｊ、　Ｌｅｗｉｓ＋　５ｃｒｉｐｐｓ　
　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ。

Ｌａ　Ｊｏｌｌａ＋　ＣＡより分与）およびヒト絨毛性
ソマトマモトロビン（ｈｃｓＨＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｆ
ｉｎｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌｓＡＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ、
　Ｓｗｅｄｅｎ）をそれぞれ添加したマイクロプレート
を作製し、アッセイを行った。

アッセイの結果、モノクローナル抗体ＣＬ、　Ｂｌはγ
−ｈＧＨ，３２に対して２２ＫｈＧＨと同程度結合した
が、２０Ｋｈ（１，Ｈに対しては１５％以下の低い結合
しか示さなかった。またｈＰＲＬおよびｈＣ３に対して
はほとんど交叉性が認められなかった（１％以下）。

αＤ　モノクローナル抗体の精製 前記（６）で得られた各腹水を硫安分画（４０％飽和）
後、食塩２０ｍＭを含む２０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１
７．８）で平衡化したＤＥＡＥセルロース（ＤＨ−５２
、Ｗｈａｔｔｍａｎ社）に付し食塩４００ｓ＋Ｍを含む
４゜１１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，８）によりグラジェ
ント溶出を行い、ＩｇＧ、百分を分取した後、０．１％
アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に対して４℃−夜透析して、４℃にて保存する。

実施例２ 抗血清、抗ｈＧＨウサギポリクローナル抗体の作製 ｆｉｌ　　免疫 下垂体抽出ｈＧＨ（タレスコルモン）をフロイント完全
アジュバントと共にウサギに初回免疫する。１１００ｐ
のｈＧＨの０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１−
をフロイント完全アジュバント１−と混合し、そのエマ
ルジョンをウサギ背部数十ケ所に皮下投与し、さらに２
週間毎に同様の投与法により追加免疫を行った。各追加
免疫後、血清を採取し、”’Ｉ−ｈＧＨとの結合活性を
調べた。抗血清１　／２５６００の希釈率で３０％の結
合率を示した。

（２）抗血清の精製 上記（１１で得られたウサギ抗血清を硫酸ナトリウム分
画（１８％飽和）後、１７．５ｄリン酸緩衝液（ｐＨ６
，３）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（Ｄ　Ｅ−５
２、Ｗｈａｔｔ＋ｗａｎ社）カラムの非吸着画分を分取
し、抗ｈＧＨポリクローナル抗体１ｇＧ画分を得た。

実施例３ サンドイツチ法に基づ＜２２ＫｈＧＨ酵素免疫測定法 （１）抗２２ＫｈＧＨマウスモノクローナル抗体ＴｇＧ
画分結合不溶性支持体の調製法 実施例１で得られた抗２２ＫｈＧＨマウスモノクローナ
ル抗体ＩｇＧ画分の０．１％アジ化ナトリウム含有０．
１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）溶液の濃度を０．１
５曙／ｌｌ１７に調整する。

この抗体溶液にポリスチレンボール（Ｐｒｅｃｉｓｉｏ
ｎＰｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１１社）を４℃、２４時間浸漬
し、抗体をボールに吸着させる０次に抗体浸漬液を回収
し、ポリスチレンボールを緩衝液ＡＣ０，１％ＢＳＡ。

０．１％食塩および０．１％アジ化ナトリウム含有１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐｌ＋　７．０　）　）で５回洗浄
し、使用する。

（２）　　ウサギ抗ｈＧＨＦａｂ’　のペルオキシダー
ゼ標前記実施例２（２）で得られたウサギ抗ｈＧＨＩｇ
Ｇ画分を０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）に透析し
、その抗ｈＧＨＩ　ｇＧ画分に対して２％（ｗ／ｖ）ペ
プシンを加え、３７℃、２０時間消化した。

ＩＮ水酸化ナトリウムにより反応を止め、０．１ＭＭリ
ン酸緩衝液ｐＨ８，０）で平衡化したウルトロゲル＾ｃ
Ａ４４　（ＬＫＢ社）カラムでゲル濾過し、Ｆ　（ａｂ
’）、百分を分取する０次に、Ｆ　（ａｂ’）ｇ画分を
０．２Ｍ食塩含有０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．
０）に４℃−夜透析した後アフィニティ精製を行う、即
ち、下垂体抽出ｈＧＨ結合セファロース４Ｂカラムを前
記緩衝液で平衡化した後、Ｆ（ａｂ’）を画分をカラム
に付し、吸着させる。さらに同一緩衝液によりカラムを
洗浄した後、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，
５）により特異抗体Ｆ（ａｂ’）を画分を０、５　Ｍ　
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）の入った容器に溶出
させる。

次に、この特異抗体Ｆ（ａｂ’）ｇ画分を０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６，０）に透析し、０．５−５■／４５
０μｌ溶液を調整する。これに５ｍＭＥＤＴＡを含む０
、１　Ｍ　＋Ｊ　ン＃Ｒｆｆｌ衝液（ｐＨ６，０）　ニ
’ｌｌｌ解した０、　１　Ｍメルカプトエチルアミン５
０μ！を加え、３７℃９０分間インキエベートする。

次に５ｍＭＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）で平衡化したセファデックスＧ−２５（ファルマ
シア社）カラムでゲル濾過し、Ｆａｂ’画分を分取する
。

上記の操作とは別に、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ
（以下ＰＯＤと略す）にピリジルスルフィド基を結合さ
せる。即ち、６■のＰ　ＯＤ　Ｏ，Ｉ　Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）に溶解し、それに対して５０倍モルのＮ
−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オネートのエタノール溶液を加え、３０℃３０分間イン
キエベートする。これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）で平衡化したセファデックスＧ−２５でゲル濾過
し、ピリジルジチオ基結合ＰＯＤｉｉ１分を分取する。

次に、前記Ｆ　ａｂ’画分に対してピリジルジチオ基結
合ＰＯＤを等モル加え、４℃２０時間静置する。この混
合液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化し
たウルトロゲルＡｃＡ４４　（Ｌ　Ｋ　Ｂ社）カラムで
ゲル濾過し、ウサギ抗ｈ　Ｇ　ＨＦａｂ’　−ＰＯＤ画
分を分取する。

保護安定剤としてＢＳＡおよびチメロサールをそれぞれ
０．１％およびｏ、ｏｏｓ％になるように添加し、使用
時まで４℃にて保存する。

（３）　　測定法 検量線用試験管（内径１０鶴、長さ７５寵）を１０本×
２組用意し、各々に、下垂体抽出ｈＧＨ標準品（０，０
，１，０，３，１，３，１０，３０，１００，３００，
１１０００ｐ／１５０．ｕｌ）を１５０ｐｌ加える。

検体用試験管にはヒト血清２０μｌを加え、さらに検量
線用緩衝液（０，１％ＢＳＡ、０．４Ｍ食塩および０．
１％アジ化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７
，０）１３０μｌを加え、よく混合する。

尿検体の場合は、尿１００ｕｌと前記緩衝液５０μｌを
混合する６次に上記＋１１項で調製した抗体結合ボール
をビンセットで軽くはさみ、付着液を濾紙で吸い取り、
各試験管に１個宛入れる。各試験管を３７℃６時間振盪
加温後（第１反応）、各試験管内の反応液を吸引除去し
、生理食塩水２ｄを加え、２回洗浄し、洗浄液を吸引除
去し、また予め別の試験管に前記実施例２（ｌ）及び（
２）で調製した酵素標識抗体を０．１％ＢＳＡおよびＯ
，１Ｍ食塩含有１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、１０ｎ
ｇ／　１５０μｌに調整した溶液を各１５０μ！加えて
おき、そこへ前記洗浄済みポリスチレンボールを移し変
える。これら各試験管を２０℃６時間振盪加温（第２反
応）した後、各試験管内の未反応の酵素標識抗体液を吸
引除去し、上記と同様の洗浄操作を行う。

次に予め別の試験管に０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐ１１
７．０）に溶解したＰＯＤ基質０．６％ｐ−ヒドロキシ
プロピオン酸（ＨＰ　Ｐ　Ａ）溶液１００μ２を加えお
き、そこへ前記洗浄済みポリスチレンボールを移し変え
る。

またこの反応ステップから試薬ブランク用としてＰＯＤ
基ｆＨＰＰＡのみの試験管２本を準備し、その後の操作
を行う、上記基質添加各試験管に、０．０１５％過酸化
水素水５０μｌを加え、３０℃で９０分振盪加温（酵素
反応）後、０．０５　Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ１０，３）　２．５−にて反応を停止せしめ
、硫酸キニーネ（ｌＰｇ／ｄ、０．　Ｉ　Ｎ硫酸）を対
照に、螢光光度計を用い、相対螢光強度から試薬ブラン
ク値を差引き、両対数座標用紙の横軸に標準ｈａ）（（
ｐｇ）　、縦軸に相対螢光強度をとり、各々の測定値を
プロットし検量線を描く、検体の２０μｌの相対強度に
相当するｈＧｔＩ量（ｐｇ）を検量線から読み取り、そ
の値を５０倍したものを検体１−あたりｈＧＨ量とする
。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素免疫測定法の検量線を示す図面である。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）分子量２２，０００のヒト成長ホルモン（以下２
   ２ＫｈＧＨと略す）に特異的に反応し分子量２０，００
   ０のヒト成長ホルモン（以下２０ＫｈＧＨと略す）と実
   質的に反応しないモノクローナル抗体。
2. （２）２２ＫｈＧＨとの親和性定数が１０＾８ｌ／モル
   以上であり、２０ＫｈＧＨと実質上反応しないマウスモ
   ノクローナル抗体である特許請求の範囲第（１）項記載
   のモノクローナル抗体。
3. （３）ハイブリドーマＣＬ．Ｂ１．によって生成される
   特許請求の範囲第（１）項記載のモノクローナル抗体。
4. （４）特許請求の範囲第（１）項記載のモノクローナル
   抗体を生成するハイブリドーマ。
5. （５）ハイブリドーマＣＬ．Ｂ１．である特許請求の範
   囲第（４）項記載のハイブリドーマ。
6. （６）特許請求の範囲第（１）項記載のモノクローナル
   抗体を利用することを特徴とするヒト成長ホルモンの測
   定方法。
7. （７）ヒト成長ホルモンの測定方法が酵素免疫測定法で
   ある特許請求の範囲第（６）記載の方法。
8. （８）２２ＫｈＧＨに特異的に反応し２０ＫｈＧＨと実
   質的に反応しないモノクローナル抗体を不溶性支持体に
   結合させた抗体結合不溶性支持体とヒト成長ホルモン（
   以下ｈＧＨと略す）を含む被検液を反応させて、２２Ｋ
   ｈＧＨのみを特異的に該抗体結合不溶性支持体に結合さ
   せた後に、ｈＧＨと特異的に反応する抗体を酵素標識し
   た標識物と反応せしめて該抗体結合不溶性支持体上に抗
   体−２２ＫｈＧＨ−標識複合体を形成させた後、該抗体
   結合不溶性支持体上に結合した標識物の酵素活性量を測
   定することにより２２ＫｈＧＨを特異的に測定すること
   を特徴とする特許請求の範囲第（７）項記載のヒト成長
   ホルモンの測定方法。
9. （９）ｈＧＨと特異的に反応する抗体を酵素標識した標
   識物として抗ｈＧＨポリクローナル抗体の酵素標識抗体
   を用いることを特徴とする特許請求の範囲第（８）項記
   載の方法。
10. （１０）抗ｈＧＨポリクローナル抗体としてアフィニテ
    ィ精製したウサギ抗ｈＧＨ抗体のＦａｂ′フラグメント
    を用いることを特徴とする特許請求の範囲第（９）項記
    載の方法。
11. （１１）酵素標識した標識物としてペルオキシダーゼ標
    識物を用いることを特徴とする特許請求の範囲第（７）
    項〜第（１０）項のいずれかに記載の方法。
12. （１２）酵素活性量を測定するに際し、酵素基質として
    酵素反応により螢光物質に変換する化合物を用いること
    を特徴とする特許請求の範囲第（７）項〜第（１０）項
    のいずれかに記載の方法。