JPH04325096A - （Ｒ）−２−ハロプロピオン酸および（Ｒ）−２−ハロ−ｎ−酪酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、光学活性の医薬、農薬
、液晶化合物その他の合成中間体として有用な（Ｒ）−
２−ハロプロピオン酸および（Ｒ）−２−ハロ−ｎ−酪
酸を生化学的に工業的に製造する方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】従来（Ｒ）−２−ハロプロピオン酸およ
び（Ｒ）−２−ハロ−ｎ−酪酸（以下両者を合せて（Ｒ
）−２−ハロ有機酸と略す）を生化学的に製造する方法
としては、２−ハロ酸デハロゲナーゼ（系統名、２−ハ
ロ酸ハリドヒドロラーゼ、国際生化学連合酵素委員会の
酵素分類命名規約に従った分類ではクラス〔３、８、１
．２〕）をそれぞれ（Ｒ，Ｓ）−２−ハロプロピオン酸
または（Ｒ，Ｓ）−２−ハロ−ｎ−酪酸に作用させる方
法が知られている〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１
，９９〜１０９（１９７１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２４３，４２８〜４３４（１９６８），Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４６，８３７〜８３８（１９８２
）〕。しかしながら、これらの方法で使用される細菌は
、シュードモナス属に属する細菌であるが、その生育培
地に、２位の炭素にハロゲンを結合して有する脂肪族有
機酸（例えばモノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、２−ハロ
プロピオン酸など）を含有する培地を使用することによ
ってはじめて２−ハロ有機酸デハロゲナーゼが誘導的に
生成されるものであり、この酵素の生成を誘導する物質
、すなわち上記ハロゲンを結合して有する脂肪族有機酸
は使用細菌の生育に阻害的に作用するため、生育培地か
らえられる細菌の量が制限され、そのため生育培地から
える酵素の収量も低い欠点を有する。従って同じ原料の
量からえる酵素量が少ないので大量の培地原料が必要と
なる。このため工業的製法としては不適なもので、ハロ
ゲン結合を有する有機酸をふくむ培地で生育した菌から
酵素を抽出してその性質が報告されているのみで、誘導
物質であるハロゲン結合を有する有機酸をふくまぬ生育
良好な培地に生育した菌を、１％あるいはそれ以上の濃
度の基質に作用させた例は全くない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題と課題を解決するための
手段】前記したように、従来の方法が培地からの菌体の
収量ひいては酵素の収量が低いため高濃度の基質から高
濃度に（Ｒ）−２−ハロ有機酸を生産するのに不適であ
る欠点を克服すべく種々研究を重ねた結果、目的に適し
たシュードモナス属の新菌株を新たに自然界から分離す
ることに成功した。そして菌の生育を阻害するハロゲン
化合物である酵素誘導物質を培地に加えなくても酵素を
生産する（構成性である）新菌株をハロゲン化合物を含
まないで良好な生育を与える培地に生育させることによ
り目的酵素活性の高い菌体を好収量でえて、この菌体ま
たはその処理物を（Ｒ，Ｓ）−２−ハロ有機酸に作用さ
せて、（Ｓ）−２−ハロプロピオン酸または（Ｓ）−２
−ハロ−ｎ−酪酸（以下両化合物を合せて（Ｓ）−２−
ハロ有機酸と略す）を実質的に代謝して（Ｒ）−２−ハ
ロプロピオン酸または（Ｒ）−２−ハロ−ｎ−酪酸（以
下両化合物を合せて（Ｒ）−２−ハロ有機酸と略す）を
残留させることにより工業的に有利な（Ｒ）−２−ハロ
有機酸の製法を発明するに至った。

【０００４】

【作用】本発明に使用する微生物はシュードモナス属に
属し、２−ハロ酸デハロゲナーゼを構成的に生産する菌
株である。このような菌株は従来知られているような２
−ハロ酸デハロゲナーゼを誘導的に生成する菌株から突
然変異と選択により導くことも可能であるが、本発明者
らは自然界からの分離によってえることができた。具体
的な菌株の例としてはＨ１−１およびＨ−２０をあげる
ことができる。両菌株の分類的性質は以下のとおりであ
る。

【０００５】１．肉汁寒天培地に生育した菌の形態両菌
株とも桿菌で、Ｈ１−１は０．８〜０．７×１．９〜３
．５μ、Ｈ２０は０．８〜１．１×１．３〜１．５μの
大きさであり、Ｈ２０はやゝ短く短桿状である。両株と
も多形性はなく、運動性で、極べん毛１本を有する。胞
子をつくらず、グラム陰性で抗酸性はない。 ２．肉汁寒天平板培地で、両菌株とも円形、扁平状、全
縁、平滑のコロニーをつくり、コロニーはバター状で光
沢あり、ベージュ〜クリーム色である。リトマス・ミル
ク培地で変色なく、ゼラチン培地でゼラチンを液化しな
い。 ３．生理的性質 両菌株とも硝酸塩を還元せず、脱窒反応陰性、メチルレ
ッド反応陰性、Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｎｅｒ反応陰
性、インドールを生成せず、硫化水素を生成しない。ク
エン酸を利用し、硝酸塩、アンモニウム塩を利用する。

【０００６】両菌株とも好気性でカタラーゼ陽性であり
、Ｏ−Ｆテストは酸化型である。生育のｐＨはＨ１−１
がｐＨ５〜１０であり、Ｈ−２０はｐＨ５〜８である。 生育温度はＨ１−１が２０〜４０℃で生育し、Ｈ−２０
は２０〜３０℃で生育し、３７℃では生育しない。 Ｈ１−１はウレアーゼ陽極、オキシダーゼ陽性であるが
Ｈ−２０はウレアーゼ陰性、オキシダーゼ陰性である。

【０００７】両菌株ともＤ−グルコース、Ｄ−フラクト
ース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロ
ース、Ｌ−アラビノースを酸化的に利用し、マルトース
、シュクロース、ラクトース、でん粉を利用しない。 トレハロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マニトール、イ
ノシトールは、Ｈ１−１株は利用し、Ｈ−２０は弱く利
用する。Ｈ１−１はグリセリンを利用し、Ｈ−２０のグ
リセリ利用は微弱である。何れの糖でもガスの生成は認
められなかった。Ｈ１−１は可溶性蛍光色素を生成する
がＨ−２０は生成しない。両菌株ともポリヒドロキシ酪
酸を蓄積せず、Ｈ１−１はアルギニンを分解し、Ｈ−２
０は分解しない。芳香環の分解形式はオルソ開裂である
。Ｈ１−１はポリヒドロキシ酪酸を蓄積せず、Ｈ−２０
はこれを蓄積する。

【０００８】以上の性質をバーゼーズ・マニュアル・オ
ブ・システマチック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ
’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２巻（１９８６年
）の記載と照合すると、両菌株はシュードモナス属の細
菌と認められる。シュードモナス属の中のセクション１
に属し、Ｈ１−１は蛍光色素をつくり、アルギニンを分
解するので、シュードモナス・エルギノーサ、シュード
モナス・フルオレッスンス、シュードモナス・クロラフ
ィス、シュードモナス・オーレオファシェンス、シュー
ドモナス・プチダの群に近く、脱窒反応、ゲラチン分解
の点でシュードモナス・エルギノーサと異なり、シュー
ドモナス・プチダにもっとも近いが４０℃で生育する点
でこれとことなる。また４０℃で生育する点で他の４菌
種とも異なる。Ｈ−２０は、ポリヒドロキシ酪酸を蓄積
するが芳香環の開裂はオルソ型である。アルギニンを分
解せず、脱窒反応陰性である点ではシュードモナス・セ
パシア、シュードモナス・グラジオリに近いが可溶性色
素をつくらぬ点で異なる。

【０００９】両菌株は一致する菌種を見いだせず、それ
ぞれシュードモナス属菌株Ｈ１−１およびシュードモナ
ス属菌株Ｈ−２０として微生物工業技術研究所に寄託し
た。寄託番号は次のとおりである。 Ｈ１−１：微工研菌寄第１２１２８号 Ｈ−２０：微工研菌寄第１２１９６号

【００１０】本発明で使用する微生物は、野生株、変異
株の何れも使用でき、微生物の処理物、例えばアセトン
乾燥菌体、凍結乾燥菌体など、さらに菌体から抽出した
酵素を本発明に使用できる。さらに、固定化酵素、固定
化微生物も使用できる。これらの微生物を培養して、必
要な２−ハロ有機酸デハロゲナーゼ活性をふくむ菌体を
えるには、この分野の技術者によく知られている普通の
培養法によればよい。すなわち、グルコースその他微生
物の利用する炭素源、硫酸アンモニウムその他の窒素源
、無機塩、その他菌の必要とする生育因子を含む培地を
用いればよく、従来知られている（Ｓ）−ハロ有機酸を
特異的に代謝するシュードモナス属細菌のように、生育
培地に酵素の誘導物質としてのハロゲン結合を有する有
機化合物を加える必要はなく、そのため、誘導物質によ
る生育の阻害を受けることなく高濃度の菌体従って高収
量の２−ハロ酸デハロゲナーゼを培地からえることがで
きる。培地には固形培地、液体培地の何れも使用できる
。

【００１１】このようにして培養によりえた２−ハロ酸
デハロゲナーゼをふくむ微生物菌体またはその処理物を
（Ｒ，Ｓ）−２−ハロ有機酸に作用させる方法は、基質
である（Ｒ，Ｓ）−２−ハロ有機酸をふくむ溶液に菌体
または処理物を加えて反応が進行する迄培養すればよい
が、微生物の生育した培養液に基質を加えて反応させて
もよく、また微生物の培養液から分離した菌体、洗浄菌
体、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体などの物理、生化
学的に処理した菌体、菌体抽出液精製酵素標品、菌体お
よび酵素の固定化処理標品などの形でも基質と接触反応
させることができる。基質濃度は、バッチ式、連続式の
何れによるかによっても異なるが、バッチ式では一般に
媒質中０．１〜３０％、好ましくは１〜１０％程度で、
連続式ではこれよりやゝ濃度を低くした方がよい。反応
は普通０〜６０℃、好ましくは２５〜５０℃附近、ｐＨ
７〜１０、好ましくはｐＨ８．５〜９．５で行われる。 反応時間は、静置、かく拌、流下などの手段あるいは酵
素標品の形態、力価によって異なってくるので一様でな
いが、バッチ式では通常１〜１５０時間程度である。

【００１２】反応の進行は薄層クロマトグラフィーによ
る（Ｓ）−２−ハロ有機酸の消費、あるいは、（Ｓ）−
２−ハロ有機酸から２−ハロ酸デハロゲナーゼにより遊
離される塩素イオンを分析することによって追跡できる
。基質中の（Ｓ）−２−ハロ有機酸の代謝（脱塩素反応
）により基質中の（Ｓ）−２−ハロ有機酸が実質的にす
べて消費されて、その分量だけ基質として用いた２−ハ
ロ有機酸の濃度が減少した時点で反応を中止し、反応液
を微酸性に調整して、酢酸メチル、エーテル、塩化メチ
レンなどの溶媒で抽出することにより残留する（Ｒ）−
２−ハロ有機酸を回収することができる。

【００１３】

【実施例】以下実施例により本発明をより詳細に説明す
る。実施例１および２から本発明使用菌が２−ハロ酸デ
ハロゲナーゼを構成的につくることがわかる。また参考
例において２−ハロ有機酸が菌が生育に阻害的に働くこ
と、また本発明使用菌は（Ｓ）−２−ハロ有機酸を特異
的に代謝して生育に利用できるが（Ｒ）−２−ハロ有機
酸は代謝しないことが示されている。 実施例１ シュードモナス属菌株Ｈ１−１およびＨ−２０を肉エキ
ス１％、ペプトン１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウ
ム０．３％（ｐＨ７．２）の組成の培地と、この培地に
１％濃度に（Ｒ，Ｓ）−２−クロロプロピオン酸を加え
た培地（ｐＨ７．０）にそれぞれ植菌して、２６℃で１
５時間振とう培養した種培養を、それぞれの種培養と同
じ組成の生育培地５０ｍｌを入れた３００ｍｌ三角フラ
スコに５％の種菌量で植菌して、２６℃、毎分２２０回
転で４８時間振とう培養した。この培養から遠心分離に
よりえた菌体を洗浄、遠心分離を２回くり返して菌体を
洗浄後、１００ｍｇ／ｍｌの湿潤重量濃度に反応液（ｐ
Ｈ７．０または９．０のトリス硫酸緩衝液）に加えた。 反応液中の基質〔（Ｒ，Ｓ）−２−クロロプロピオン酸
）の濃度は１０ｍｇ／ｍｌ（９２．２ｍＭ）とした。 この反応液５ｍｌをふくむ試験管を３０℃で２２時間ゆ
るく振とうしながら培養したときの反応液中の塩素イオ
ン濃度を分析して２−クロロプロピオン酸の代謝率を計
算した。また残留する２−クロロプロピオン酸の濃度を
薄層クロマトグラフィーにより分析した。結果は表１に
示した如くで、代謝率は、生育培地中の２−クロロプロ
ピオン酸の有無に関係なく、再菌株が構成的に２−ハロ
酸デハロゲナーゼを生成する菌株であることがわかる。 また残留する２−クロロプロピオン酸は（Ｒ）−２−ク
ロロプロピオン酸であり、反応の進行はｐＨ７．０より
ｐＨ９．０の方が速いこともわかった。

【表１】

【００１４】実施例２ シュードモナス属細菌Ｈ１−１を、肉エキス１％、ペプ
トン１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．３％（
ｐＨ７．２）の組成の培地に振とう培養した種培養を生
育培地５０ｍｌをふくむ３００ｍｌ三角フラスコに植菌
して２６℃、毎分２２０回転で２４時間振とう培養した
。生育培地としては、乳酸ナトリウム１％、燐酸１カリ
ウム０．３％、燐酸２カリウム０．１％、硫酸アンモニ
ウム０．５％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０１％、
微量元素溶液１ｍｌ／ｌの組成の培地（ｐＨ７．２）と
、同じ組成の培地に（Ｒ，Ｓ）−２−クロロプロピオン
酸０．２％を加えた培地（ｐＨ７．２）を使用した。微
量元素溶液は次の化合物を水にとかして１リットルとし
たものであるＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　１０ｇ、ＦｅＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ　　１０ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ　　
５ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ　　５ｇ、ＣｕＳＯ４
・５Ｈ２Ｏ　　１ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　１ｇ、
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　１ｇ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
　　１ｇ、Ｈ３ＢＯ４　　１ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ　　
２０ｇ。各生育培地で生育した菌を遠心分離により集め
て洗浄後さらに遠心分離により集菌してから以下の処理
をした。第１は菌体を凍結させ凍結乾燥機で一夜乾燥さ
せて凍結乾燥菌体をえた。重量は湿潤重量に対して凍結
乾燥後は２２％の重量に乾燥された。第２は、菌体を少
量の水にけん濁したものを−２０℃のアセトンに加え脱
水し、アセトンを除いて風乾し、乾燥菌体をえた（アセ
トン菌体）。第３は凍結乾燥菌体２００ｍｇを１０ｍｌ
の緩衝液にけん濁して振とう後遠心分離して上澄液をえ
た（上澄液）。 太型試験管（２５×２００ｍｍ）に基質である（Ｒ，Ｓ
）−２−クロロプロピオン酸１％をふくむ２００ｍＭ　
　ＮａＨＣＯ３−Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．５）緩衝液に
表２に示した如く、凍結乾燥菌体、アセトン菌体は１０
０ｍｇ／１０ｍｌの濃度に加えた。上澄液には後から基
質を加えた。これらの反応湿液を２６℃または４０℃で
振とうまたは静置で反応させたときの２４，４８，７２
時間での２−クロロプロピオン酸の代謝率は表２に示す
如くであった。表にみられる如く、２−クロロプロピオ
ン酸をふくむ培地からえた菌体処理物および、２−クロ
ロプロピオン酸をふくまぬ培地からえた菌体の処理物（
凍結乾燥菌体、アセトン菌体、上澄液）の何れでも５０
％前後の２−クロロプロピオン酸代謝率がえられ、２−
ハロ酸デハロゲナーゼが構成的に生産されたことがわか
る。また反応は静置でもよく進行し、４℃でも充分進行
することがわかる。反応は２４時間でほゞ完了し、さら
に長時間反応を続けても代謝率は増加せず、反応後に残
留する２−クロロプロピオン酸が（Ｒ）−２−クロロプ
ロピオン酸であったこととあわせて、（Ｓ）−２−クロ
ロプロピオン酸のみが代謝されることがわかる。

【表２】

【００１５】実施例３ シュードモナス属細菌Ｈ１−１を、肉エキス１％、ペプ
トン１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．３％（
ｐＨ７．２）の組成の培地にて振とう培養した種培養を
、種培養培地と同じ組成の生育培地３０ｍｌをふくむ３
００ｍｌ三角フラスコに植菌して、２６℃、毎分２２０
回転で２４時間振とう培養後、遠心分離によりえた菌体
を生育培地と同じ濃度（湿重量で１２．２ｇ／ｌ）に５
０ｍＭＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．５
）に加えた。この反応混液にはまた基質である（Ｒ，Ｓ
）−２−クロロプロピオン酸を５％濃度に加えた。この
ような組成の反応混液１００ｍｌを３００ｍｌ三角フラ
スコに入れて振とうしながら９６時間反応させたとき、
加えた（Ｒ，Ｓ）−２−クロロプロピオン酸の４６％が
減少し、反応液中に（Ｒ）−２−クロロプロピオン酸が
２７ｇ／ｌの濃度に、またＤ−乳酸が１８ｇ／１の濃度
に残留または生成した。反応液から菌体を遠心分離によ
り除いた液からエーテルを抽出剤として向流抽出装置を
用いて残存２−クロロプロピオン酸を抽出し、エーテル
層を分離濃縮して不溶物を濾別して、２−クロロプロピ
オン酸を回収した。１リットルの反応液から２１．８ｇ
をえた。このものの比旋光度は〔α〕２０ｏＤ＝＋１２
．０°（Ｃ＝３．６、メタノール）であった。

【００１６】実施例４ シュードモナス属細菌Ｈ１−１を実施例２と同様に培養
して、２−クロロプロピオン酸をふくまぬ生育培地から
生菌体および凍結乾燥菌体をえた。生菌体は１１．９ｍ
ｇ／ｍｌ、凍結乾燥菌体は１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、基
質〔（Ｒ，Ｓ）−２−クロロ−ｎ−酪酸〕は１．０％の
濃度で５０ｍＭ　　Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３（ｐＨ
８．５または９．５）の緩衝液中で、２６℃で静置のま
ゝ反応させ、反応２４および４８時間での反応液中の２
−クロロ−ｎ−酪酸の分析から基質の代謝率を示したの
が第３表である。凍結乾燥菌体でｐＨ９．５で４８時間
反応した反応液中に残存する２−クロロ−ｎ−酪酸をエ
ーテル抽出して濃縮してえた標品の旋光度は（〔α〕２
０Ｄ＋８．９°、Ｃ＝１．０、メタノール）から（Ｒ）
−２−クロロ−ｎ−酪酸であることがわかった。

【表３】

【００１７】実施例５ 基質として（±）２−ブロモプロピオン酸または（Ｒ，
Ｓ）−２−ブロモ−ｎ−酪酸を用いた。菌体は生菌体、
緩衝液は５０ｍＭ　　Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３（ｐ
Ｈ９．５）を用いた。その他の条件は実施例４と同様に
実施した。結果は第４表に示す。４８時間後の反応液中
に残存する２−ブロモプロピオン酸および２−ブロモ−
ｎ−酪酸を抽出して濃縮してえた。それぞれの標品の旋
光度から残存して回収された２−ブロモプロピオン酸〔
〔α〕２０Ｄ＋１７．１°（Ｃ＝１、メタノール）〕、
２−ブロモ−ｎ−酪酸〔〔α〕２０Ｄ＋２０．０°（Ｃ
＝１．０、メタノール）〕は何れも（Ｒ）体であること
がわかった。

【表４】

【００１８】参考例 （２−クロロプロピオン酸による菌の生育阻害と立体異
性体の特異的代謝利用）燐酸２カリウム０．３％、燐酸
１カリウム０．１％、硫酸アンモニウム０．５％、硫酸
マグネシウム・７水塩０．０１％、酵母エキス０．０１
％、微量元素溶液（実施例２で用いたもの）１ｍｌ／ｌ
（ｐＨ７．２）の組成の基礎培地に表５に示した濃度に
（Ｓ）−２−クロロプロピオン酸または（Ｒ）−２−ク
ロロプロピオン酸を加えてｐＨを苛性ソーダで中性とし
た培地５ｍｌを試験管に入れたものにシュードモナス属
菌株Ｈ１−１を植菌して２６℃で振とう培養し、２４時
間、４８時間、および５日培養したときの生育を測定し
た結果を表５に示す。

【表５】

【００１９】表５の結果から、使用菌が（Ｓ）−２−ク
ロロプロピオンを特異的に代謝利用し、（Ｒ）−２−ク
ロロプロピオン酸は代謝利用しないことがわかる。また
酵母エキスを微量にしか含まない準合成培地では２−ク
ロロプロピオン酸は０．２％以上の濃度で菌の生育を阻
害することもわかる。

【００２０】

【発明の効果】本発明により、合成法で安価に供給され
ている（Ｒ，Ｓ）−２−ハロプロピオン酸および（Ｒ，
Ｓ）−２−ハロ−ｎ−酪酸から光学活性の医薬、農薬、
液晶化合物その他の中間体として有用な（Ｒ）−２−ハ
ロプロピオン酸および（Ｒ）−２−ハロ−ｎ−酪酸を生
化学的に効率よく製造することができる。特にプロセス
に必要な酵素の生産が構成性である新菌株細菌を使用す
ることにより生産効率が著しく改善された。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　２−ハロ酸デハロゲナーゼを構成的に
   生成するシュードモナス属細菌またはその菌体処理物を
   （Ｒ，Ｓ）−２−ハロプロピオン酸もしくは（Ｒ，Ｓ）
   −２−ハロ−ｎ−酪酸に接触せしめて、（Ｓ）−２−ハ
   ロ−プロピオン酸もしくは（Ｓ）−２−ハロ−ｎ−酪酸
   を反応代謝させ、反応液中に（Ｒ）−２−ハロプロピオ
   ン酸もしくは（Ｒ）−２−ハロ−ｎ−酪酸を残留せしめ
   ることを特徴とする（Ｒ）−２−ハロプロピオン酸およ
   び（Ｒ）−２−ハロ−ｎ−酪酸の製造法。
2. 【請求項２】　　使用する細菌が２位の炭素にハロゲン
   を結合して有する脂肪族有機酸を含まぬ生育培地で生育
   した細菌である請求項１記載の製造法。