JPH04330286A - 組換えｄｎａ及びキメラ抗体の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗体のＬ鎖又はＨ鎖に
関してコードし、その定常部（ｋｏｎｓｔａｎｔｅ　　
Ｒｅｇｉｏｎ）はヒト起源であり、その可変部（ｖａｒ
ｉａｂｌｅ　　Ｒｅｇｉｏｎ）は非ヒト起源である組換
えＤＮＡ、このような組換えＤＮＡを含有する表現ベク
ター、この組換えＤＮＡもしくは表現ベクターの製法及
び最後に、キメラ抗体の製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】治療における抗体の使用は、非常に重要
になっている。例えば、インターロイキン（ＩＬ−２）
−レセプターに対する抗体は、免疫抑制剤として治療上
重要性が大きい。このような抗体の生体内作用は、一連
の実験動物モデルで証明できている。その例は、マウス
における心臓−及び皮ふ−移植に関して、キルクマン（
Ｋｉｒｋｍａｎ）等によるトランスプランテーション・
プロシーディングス（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
　　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）１９（１９８７）６１８
〜６９０　　及び　　Ｔ．ディアマントスタイン（Ｄｉ
ａｍａｎｔｓｔｅｉｎ）等によるトランスプランテーシ
ョン・レビュース（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　
　Ｒｅｖｉｅｗｓ）１（１９８７）、１７７〜１９６に
、ラッテにおける心臓移植に関しては、Ｊ．Ｗ．クピエ
ク−ウェグリンスキィ（Ｋｕｐｉｅｃ−Ｗｅｇｌｉｎｓ
ｋｉ）等による　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．　ＵＳＡ８３（１９８６）、２６２４に、ラッ
テにおけるランゲルハンス氏島の移植に関しては、ハー
ン（Ｈａｈｎ）等によるディアベトロギア（Ｄｉａｂｅ
ｔｏｌｏｇｉａ）３０（１９８７）、４０に、かつ霊長
類の腎臓移植に関しては、Ｔ．ディアマントスタイン等
によるトランスプランテーション・レビュース　　１（
１９８７）、１７７〜１９６に記載されている。ヒトに
おいても、腎臓移植の際のＩＬ−２−レセプターに対す
るラッテ−抗体の有効な予防的使用が記載されている（
Ｊ．Ｐ．Ｓｏｕｌｉｌｌｏｕ　等の　Ｊ．ｏｆ　　Ａｕ
ｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ　　１（１９８８）、６５５〜６
６１；Ｄ．Ｃａｎｔａｒｏｖｉｔｃｈ　等の　Ａｍ．Ｊ
．ｏｆ　　Ｋｉｄｎｅｙ　　Ｄｉｓｅａｓｅ　　１１（
１９８８）、１０１〜１０６参照）。

【０００３】しかしながら、相応して、マウス−及びラ
ッテ−抗体は、ヒト中では適用した後に、強い免疫原で
あり、これは治療活性を中和する欠点を有する。従って
、実質的にヒトにおいて減少されたか又はまったく消失
された免疫原性が期待されるハイブリドマウス／ヒト−
抗体又は人間用抗体の提供の重要性が大きくなっている
（Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　等の　Ｐｒｏｃ．　Ｎａ
ｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　８１（１９８４
）、６８５１〜６８５５；Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ等のＮａ
ｔｕｒｅ　　３２１（１９８６）５２２〜５２５参照）
。

【０００４】このようなハイブリド抗体は、従来は、大
抵、相応するｃＤＮＡの遺伝子工学的融合及び適当な宿
主細胞中での表現により製造されている。しかしながら
、この場合には、このハイブリッド抗体をコードするｃ
ＤＮＡが劣悪に表現される問題がある。その製造の他の
１可能性では、このような抗体の構成のために、通例、
まず、ファージ−ライブラリィ（Ｐｈａｇｅ−Ｂｉｂｌ
ｉｏｔｈｅｋ）からＬ鎖及びＨ鎖に関する遺伝子を単離
し、特性付ける。引続き、ＶＪ−部もしくはＶＤＪ−部
のゲノムＤＮＡとヒトのＬ鎖及びＨ鎖の定常部の相応す
るＤＮＡとの遺伝子工学的融合を行なう（これに関して
Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　
Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　　ＵＳＡ　　８１（１９８４）
６８５１〜６８５５；Ｓ．Ｈ．Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ等の
Ｎａｔｕｒｅ　　３１２（１９８４）、６４１〜６４６
；Ｌ．Ｋ．Ｓｕｎ等のＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａ
ｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　８４（１９８７）、２１４〜
２１８；Ｙ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等のＣａｎｃｅｒ　　
Ｒｅｓ．４７（１９８７）、９９９〜１００５；Ｂ．Ａ
．Ｂｒｏｗｎ等のＣａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ．４７（１９
８７）、３５７７〜３５８３参照）。

【０００５】一般に、コピー数１を有する遺伝子を見つ
けるためにプラーク１０６個を検査しなければならない
ので、この処置のこの第２の方式は、極めて経費がかか
る。更に、ゲノム単離物の特性付け（制限地図作製、体
中及び生殖系列細胞中の遺伝子構造の区別、誤まって及
び正しく再編成された遺伝子の識別）は非常に時間がか
かる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、キメラ抗体の製造を容易にすることであった。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この課題は、本発明によ
り、抗体のＬ鎖及びＨ鎖に関してコードし、その定常部
がヒト起源であり、その可変部が非ヒト起源である組換
えＤＮＡにより解決され、これは、転写の方向に、（ａ
）　　Ｊ部及び場合によりＤ部をも包含する、非ヒト可
変部に関してコードするｃＤＮＡ配列（ｂ）　　その５
′−末端に１個のスプライス−ドナー位置を有し、５′
−末端の非ヒトイントロン−部分配列及び３′−末端の
ヒトイントロン−部分配列より構成されているイントロ
ン配列及び （ｃ）　　ヒト定常部に関してコードするゲノムＤＮＡ
配列を有する。

【０００８】この組換えＤＮＡを用いると、意外に高い
収率で、所望の特異性のキメラ抗体に関するＬ鎖もしく
はＨ鎖を得ることができる。しかしながら、この場合に
は、更に、所望の特異性の可変部に関する取得容易なｃ
ＤＮＡ配列（抗体遺伝子に関するｃＤＮＡは、相応する
ｍＲＮＡがハイブリドーマ細胞中に多量の総ｍＲＮＡと
共に存在するので、製造容易である）が、ここでヒト定
常部に関してコードし、従って広い使用性を有する既に
サブクローニングされたゲノムＤＮＡ−セグメントと、
イントロン−配列を介して結合しうることはまったく特
別な利点である。本発明により、低い経費でそれぞれ相
応する特異性に関するＤＮＡ−配列を有する組換えＤＮ
Ａ−分子を製造する可能性も開発される。

【０００９】本発明による組換えＤＮＡのｃＤＮＡ−配
列（ａ）は、Ｌ鎖に関してＶ−及びＪ−部を包含し、Ｈ
鎖に関して付加的に、ＶとＪの間のＤ−部を包含する。 本発明による組換えＤＮＡは、その要素ａ）、ｂ）及び
ｃ）と共に、抗体遺伝子中のそこに、当然のイントロン
が存在している全ての位置に、信号配列内の全てのＬ鎖
及びＨ鎖中のイントロンが存在する場所以外の相応する
ＤＮＡ−配列を含有する。適当な宿主細胞中での本発明
による組換えＤＮＡの表現は、従来公知のｃＤＮＡ−表
現の使用下でのキメラ抗体の製法に比べて、所望抗体の
非常に高い表現度をもたらす。

【００１０】本発明の有利な実施形では、配列ａ）はｂ
）の非ヒトイントロン−部分配列と同様に、マウス（ｍ
ｕｒｉｎ）起源であり、ｂ）の非ヒトイントロン−部分
配列は、ヌクレオチド１５〜２０の長さであるのが有利
である。

【００１１】特に有利な１実施形では、ｂ）の非ヒトイ
ントロン−部分配列は、配列ａ）上に当然の即ちゲノム
ＤＮＡ内の後続のイントロン配列の１部分である。しか
しながら、本発明の範囲では、他の非ヒトイントロン配
列特に同種のかつできるだけ１抗体原から誘導されたも
のも使用できる。

【００１２】本発明のもう１つの有利な実施形では、ｂ
）中のスプライス−ドナー位置が配列ＧＴを有する。

【００１３】本発明によれば、有利に、例えばシャープ
（Ｓｈａｒｐ）のＰ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２３５（
１９８７）７６６〜７７１に記載のような公知配列の１
つに相当しうるイントロン配列のヒト部分内に分枝部位
が配置されている。この分枝部位は、このイントロンの
マウス分中にも配置されうる。

【００１４】組換えＤＮＡの可能な表現度を制御するた
めに、組換えＤＮＡの５′−末端の所に、その制御下に
抗体鎖に関してコードする配列が表現可能であるなお１
個のプロモーター配列を添加するのが有利である。この
場合に、例えば、もちろん、ゲノム中におけると同様に
、組換えＤＮＡの相応する配列を介しての制御を行なう
プロモーターを使用することができる。しかしながら、
場合により調節可能な強い表現を可能とするプロモータ
ーを使用するのが有利である。このようなプロモーター
は当業者にとっては公知である。特に有利な１実施形で
は、この組換えＤＮＡはサイトメガロウイルスのプロモ
ーターを有する。

【００１５】更に、本発明の有利なもう１つの実施形は
、その配列ａ）がインターロイキン−２−レセプターと
特異的に結合しうる抗体のＬ鎖又はＨ鎖の可変部に関し
てコードする組換えＤＮＡである。更に、本発明による
組換えＤＮＡのＨ鎖に関してコードするヒト配列ｃ）が
ＩｇＧ型のヒト抗体のＨ鎖の定常部に関してコードする
ことが有利である。

【００１６】このような組換えＤＮＡは、プラスミドｐ
ｋｃｈｉｍ．及びｐγｃｈｉｍ．を含有しており、ここ
でこのプラスミドｐｋｃｈｉｍ．は、軽い、即ち、κ−
鎖に関してコードするＤＮＡ配列を有し、プラスミドｐ
γｃｈｉｍ．はγ型のＨ鎖に関してコードする組換えＤ
ＮＡを有し、これらは、共通して、インターロイキン−
２−レセプターのα−鎖に対向する特異性を有し、Ｉｇ
Ｇ型である抗体に関してコードする。

【００１７】本発明のもう１つの目的は、本発明の組換
えＤＮＡの１つ並びにこの組換えＤＮＡの表現のために
必要であるすべての要素を含有する表現ベクターである
。このために必要であるか又は有利に使用される要素は
、プロモーター、調節配列等である。表現ベクターは、
当業者にとっては周知であり、例えばＥ．Ｌ．ウィナッ
カー（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ）のゲン・ウント・クローン
（ＧｅｎｅｕｎｄＫｌｏｎｅ）１９８５（Ｖｅｒｌａｇ
　　Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）中に詳述されて
いる。本発明による表現ベクターを用いて、本発明によ
る組換えＤＮＡを適当な宿主細胞中に入れ、そこで表現
させることが可能になる。本発明による組換えＤＮＡを
含有する特別に有利な表現ベクター及び同様に本発明の
目的物は、既に記載のプラスミドｐｋｃｈｉｍ．及びｐ
γｃｈｉｍ．である。

【００１８】本発明のもう１つの目的は、本発明による
組換えＤＮＡの製法であり、ここでは、所望の特異性の
抗体を分泌するハイブリドーム細胞系からポリＡ＋ＲＮ
Ａを単離し、そのためにｃＤＮＡ−ライブラリィを適当
なベクター中に製造し、抗体の定常部分に関してコード
するＤＮＡに対して補足性のオリゴヌクレオチドとのハ
イブリド形成を介して、抗体鎖に関するｃＤＮＡを含有
するクローンを検査し、これからＶ−、Ｊ−及び場合に
よってはＤ−配列を単離し、それぞれのＤ−ドメインに
引続く、目標とする突然変異生成により転写の方向に、
１個のスプライス−ドナー位置、非ヒト起源抗体−イン
トロン配列の１部分及び制限切断位置を導入し、相応す
る制限酵素を用いる消化により、定常部に関してコード
する配列を分離し、得られるＤＮＡをゲノムＤＮＡ−配
列（これはヒト抗体のＬ鎖又はＨ鎖の定常部に関してコ
ードし、その５′−末端に相応するヒトイントロン配列
の１部分を有する）と連結させる（ｌｉｇｉｅｒｔ）こ
とよりなる。

【００１９】ポリＡ＋ＲＮＡの単離、これに加えたｃＤ
ＮＡ−合成並びにｃＤＮＡ−ライブラリィの取り付けは
、自体公知の方法で実施され、例えば、マニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）等のモレキュラー・クローニング（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ、１９８２、Ｃｏｌｄ　
　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ）に記載されている。 抗体鎖に関してコードするｃＤＮＡ−クローンの計数も
、公知方法で実施される。即ち、同じハイブリドーム細
胞種から生じる抗体の定常部に関してコードするＤＮＡ
を補足するオリゴヌクレオチドとハイブリド形成するク
ローンを検査する。

【００２０】スプライス−ドナー位置及び制限切断−位
置を導入するための目標とする突然変異生成も自体公知
であり、これは、モリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）等によ
るＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　２（１９８４）、
６３６〜６３９に記載の方法により実施されうる。

【００２１】本発明の有利な１実施形では、マウス−又
はラッテ−ハイブリドーム細胞を使用する。所望の特異
性の抗体を分泌するハイブリドーム細胞の取得は、ケー
ラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ）により最初に記載され（Ｎａｔｕｒ　　２５６
（１９７５）、４９５）、引続き更に開発された方法に
より実施される。この操作は、当業者にとって周知のこ
とである。特に、本発明の方法では、ヒトインターロイ
キン−２−レセプターのα−鎖に対する抗体を分泌する
マウス−ハイブリドーム細胞を使用するのが有利である
。

【００２２】非ヒトイントロン−部分配列の導入の際に
、１５〜２０塩基対の長さの配列を使用するのが有利で
ある。特に、ここでは、真正の遺伝子内で接続している
イントロン配列を部分的に使用することが有利である。 更に、スプライス−ドナー位置としてヌクレオチド列Ｇ
Ｔを導入することが有利である。

【００２３】最後に、本発明によれば、そのイントロン
部分配列が１個の分枝−部位を有するヒトゲノムＤＮＡ
を使用することが更に有利である。

【００２４】良好に表現されうる組換えＤＮＡを得るた
めに、最後に得られたＤＮＡ−配列の前にプロモータ配
列を取り付けるか又は本発明の方法で必要な操作を、同
時に、適当な位置にプロモータを有する１ベクター中で
実施する。この場合、特に、サイトメガロウイルスゲノ
ムのプロモーターを使用するのが有利である。

【００２５】更に、本発明のもう１つの有利な実施形で
は、Ｈ鎖に関してコードする組換えＤＮＡの製造のため
に、ＩｇＧ型の抗体のＨ鎖の定常部に関してコードする
ヒトゲノムＤＮＡ−配列を使用する。

【００２６】本発明のもう１つの目的は、本発明による
表現ベクターの製法であり、ここでは、１フラグメント
の表現のために好適なベクター中に本発明による組換え
ＤＮＡを挿入する。前記のように、このようなベクター
は当業者にとっては公知であり、次のようなすべての必
要な要素を含有する：例えば組換えＤＮＡの挿入のため
のポリリンカー、組換えＤＮＡを含有するコロニイを見
出すことを可能にする抗生物質耐性遺伝子、複製起原、
調節要素、プロモーター（組換えＤＮＡが既にそのもの
を有さない場合）並びに場合により他の要素例えばサプ
レッサー遺伝子。　　更に、本発明のもう１つの目的は
、その可変部が非ヒト起源であり、その定常部がヒト起
源であるキメラ抗体の製法であり、この際、ここでは、
各々、Ｌ鎖に関してコードする本発明の組換えＤＮＡを
有する１個の表現ベクター及び抗体のＨ鎖に関してコー
ドする本発明による組換えＤＮＡを含有する１個の表現
ベクターを適当な宿主細胞中に導入し、安定な形質転換
細胞を単離し、自体公知の方法で細胞の培養上澄みから
抗体を取得する。ここで、宿主細胞として、非−プロデ
ュサーハイブリドーマ細胞特に細胞系Ｓｐ２／０を使用
するのが有利である。このベクターの導入のために、本
発明の方法では、場合により線状化されたＤＮＡ−分子
を用いて電気ポレーション（Ｅｌｅｋｔｒｏｐｏｒａｔ
ｉｏｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ．１５（１９
８７）、１３１１〜１３２６、Ｂｉｏ　　Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ　　６（１９８８）、７４２〜７５１）を実施
するのが有利である。しかしながら、他の、当業者に公
知の宿主細胞のトランスフェクションのための方法も使
用することもできる。

【００２７】本発明の方法は、定常部がヒト起源である
ので、ヒトにおける治療上のその使用の際に、免疫原で
はないか又は非常に弱い免疫原である種々の特異性の抗
体を、簡単な方法で入手することを可能にする。例えば
、所望の特異性の抗体を分泌するマウス−ハイブリドー
ム細胞を製造し、これからｃＤＮＡを単離する現今の比
較的簡単な可能性により、本発明方法によるこのｃＤＮ
Ａは、容易に、それぞれ、Ｌ鎖もしくはＨ鎖の定常部に
関するヒトゲノム抗体を含有する既に準備されたベクタ
ー中に導入することができる。例えば、所望のｃＤＮＡ
−フラグメントを相応する準備されたベクター中に簡単
な挿入により、双方のベクターの組換えＤＮＡの表現の
ための各々所望の特異性のキメラ抗体を宿主細胞中で得
ることが可能である。この製造は、従来公知の方法によ
るよりも非常に簡単に実施されるばかりでなく、著るし
く高められた収率でも行なわれる。

【００２８】従って、本発明のもう１つの目的物は、Ｌ
鎖及びＨ鎖に関するその配列が次の配列表ＳＥＱ　　Ｉ
Ｄ　　Ｎｏ．：１〜６に示されているキメラ抗体ＭＡＫ
１７９、ＭＡＫ２１５及びＭＡＫ４４７であり、可変部
の配列が示されており、定常部の配列は公知であり（例
えばＳｅｑｕｅｎｃｅｓ　　ｏｆ　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
　　ｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　ｉｎｔｅｒｅ
ｓｔ；Ｅ．Ｋａｂａｔ，Ｔ．Ｗｕ．Ｍ．Ｒｅｉｄ−Ｍｉ
ｌｌｅｒ，Ｈ．Ｐｅｒｒｙ及びＫ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ
，ＵＳ　　Ｄｅｐｅｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ｈｅａｌ
ｔｈ　　ａｎｄ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，
１９８７、ｐ２８２〜３２５に記載されている）、その
製造を実施例に記載する。３種の全ての抗体は、ヒトＩ
Ｌ２−レセプターのα−鎖に関して特異的である。

【００２９】

【実施例】本発明を、配列表及び図面と関連させて次の
実施例で更に説明する。

【００３０】ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．：１は、ＭＡＫ
１７９のＬ鎖の可変部ＤＮＡ−及びアミノ酸配列を示し
ている。

【００３１】ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．：２は、ＭＡＫ
４４７のＬ鎖の可変部のＤＮＡ−及びアミノ酸配列であ
る。

【００３２】ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．：３は、ＭＡＫ
２１５のＬ鎖の可変部のＤＮＡ−及びアミノ酸配列であ
る。

【００３３】ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．：４〜６は、Ｈ
鎖のそれぞれの可変部の所属する配列である。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【表２】

【００３６】

【表３】

【００３７】

【表４】

【００３８】

【表５】

【００３９】

【表６】

【００４０】図１は、マウスの免疫グロブリンＬ鎖の可
変部に関してコードするｃＤＮＡ−フラグメントの単離
及び目標とする突然変異生成の実施を示す図である。

【００４１】図２は、表現ベクター中へのマウス可変部
の挿入を示す図である。

【００４２】図３は、Ｌ鎖に関するマウス及びヒト抗体
コード化配列の融合を示す図である。

【００４３】図４及び図５並びに図６は、免疫グロブリ
ンＨ鎖のＤＮＡを得るための同様な処置を示す図である
。

【００４４】例１ ＭＡＫ１７９、４４７及び２１５のＬ鎖及びＨ鎖のクロ
ーニング及び配列分析 モノクローナル抗体１７９、４４７もしくは２１５を分
泌するハイブリドーム−系から、ＲＮＡを調製し（Ｃｌ
ｅａｒｙ等のＣｅｌｌ　　４４（１９８６）、９７〜１
０６）、これから、オリゴ−ｄＴ−セルロースカラム（
Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を通してポリＡ＋ＲＮＡを単離し
た（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　
　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍ
ａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｂｏｒ
　　Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂ
ｏｒ，ＮＹ，１９８２）。ファルマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）のｃＤＮＡクローニングスーキットを用いて、
製造者の処方（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．ａｎｄ　　Ｈｏｆｆ
ｍａｎ，Ｇ．Ｊ．：Ｇｅｎｅ（１９８３）２５、２６３
に類似）に従って各々のハイブリドーム−細胞系に関す
るｃＤＮＡライブラリィを設定した。これは、各ハイブ
リドーム−系に関して約１００００の組換え体を包含し
た。

【００４５】κ−鎖のクローンのスクリーニングのため
に、次のプライマーを使用した： ５′ＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＴ３′γ−鎖のクロー
ン（γ１及びγ２ｂ）のスクリーニングのために次のプ
ライマーを使用した： ５′ＣＡＧＡＴＡＧＧＴＧＡＣＣＧＧ３′このプライマ
ーを用いて、マウス免疫グロブリン−遺伝子の総Ｈ鎖を
捕捉する（Ｓａｂｌｉｔｚｋｙ，Ｆ．及びＲａｊｅｗｓ
ｋｉ，Ｋ．：ＥＭＢＯ　　Ｊ．３（１９８４）、３００
５〜３０１２参照）。

【００４６】このｃＤＮＡライブラリィをベクターＰＴ
７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中に設置した。こ
れにより、挿入をＥｃｏＲＩフラグメントとして再利用
することができた。制限−エンドヌクレアーゼを用いる
分析の結果、ＭＡＫ１７９、４４７及び２１５のＬ鎖及
びＨ鎖に関して、全長のクローンを得ることができた。 この重要な部位を、Ｍ１３ベクター中でサブクローニン
グし、配列決定した（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．等のＰｒｏｃ
．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ７４（
１９７７）、５４６３〜５４６７参照）。

【００４７】可変部の配列は配列表ＳＥＱ　　ＩＤ　　
ＮＯ：１〜ＮＯ：６に示されている。ここで、ＭＡＫ１
７９及び４４７は、Ｌ鎖及びＨ鎖に関して同じＶ−セグ
メントを利用することが明らかである。

【００４８】双方のκ−鎖はＪ１−部を利用し、ＶＪ突
出部に同じヌクレオチドを有し、これは、双方のκ−遺
伝子のＶＪ−部の共通の起源を示唆している。双方のγ
１鎖は、同じＤ−部、同じＪ−部（Ｊн３）及び双方の
γ１遺伝子のＶＤＪ部の共通の起源を推測させる同じＶ
ＤＪ組換えを有する。

【００４９】κ−鎖のアミノ酸配列を比較すると、ＭＡ
Ｋ１７９及びＭＡＫ４４７のκｃＤＮＡのＶ−部内で３
個のアミノ酸−交換が起る。これは、次の交換である：
（ＴｈｒからＳｅｒへ、アミノ酸２０）、（Ｌｙｓから
Ａｒｇへ、アミノ酸４５）、（ＡｓｎからＬｙｓへ、ア
ミノ酸５３）。

【００５０】ＭＡＫ１７９及び４４７のＶＪ−部のアミ
ノ酸の９８％は同じである。

【００５１】ＭＡＫ１７９及び４４７のγ１ｃＤＮＡの
Ｖ−部内で６個のアミノ酸−交換が存在する。これは次
の交換である：（ＶａｌからＡｌａへ、アミノ酸２３；
ＧｌｙからＳｅｒへ、アミノ酸５６；ＩｌｅからＶａｌ
へ、アミノ酸５８；ＴｈｒからＡｒｇへ、アミノ酸６３
；ＬｙｓからＡｒｇへ、アミノ酸６５；ＧｌｎからＧｌ
ｕへ、アミノ酸８２）。

【００５２】これらのデータは、ＭＡＫ１７９及びＭＡ
Ｋ４４７のアミノ酸配列内のちがいは体細胞突然変異に
帰因していることを示している。

【００５３】ＭＡＫ１７９及び４４７のκ及びγ１ｃＤ
ＮＡに関する配列表内に、開始コドン（Ｍｅｔ）＝信号
配列の開始が示されている。同様に、ＪもしくはＤ、Ｊ
部並びにそれぞれの定常部の初めが示されている。

【００５４】（ＩＬ−２−結合に関する）非抑制性の抗
体ＭＡＫ２１５のκ及びγ２ｂ−鎖に関する可変部の配
列は、ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：３及びＮＯ：６に示さ
れている。

【００５５】κ−鎖を得るためにＪ４部が利用される。 ＭＡＫ１７９及び４４７のＬ鎖とは著るしく異なるＶ−
セグメントが利用される。

【００５６】１７９のＶ−セグメントと比較すると、ア
ミノ酸の５１％が同じである。

【００５７】γ２ｂ−鎖の配列をＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎ
Ｏ：６に示す。クローンＭＡＫ１７９及びＭＡＫ４４７
のＨ鎖とは明らかに異なるＶ−セグメントが利用される
。Ｄ−部（７個のアミノ酸を包含する）並びにＪ−部（
Ｊн３）及び不変部の初めが示されている。クローンＭ
ＡＫ１７９のＨ鎖のＶ−セグメントと比較すると、アミ
ノ酸の５７％は同じである。

【００５８】例２ ＭＡＫ１７９のＬ−鎖のキメラ化及びキメラ化されたＬ
−鎖に関する表現ベクターの構成　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ａ）
　　ＭＡＫ１７９のκ−鎖のＶＪ１−部へのスプライス
−ドナー、イントロン−及びＮｏｔＩ−配列の導入（図
１） マウスＭＡＫ１７９のＬ−鎖に関するｃＤＮＡを、ｐＵ
Ｃ１８中のＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩフラグメント（Ｙａｎ
ｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．等によるＧｅｎｅ３３（１
９８５）、１０３〜１０９）としてサブクローニングす
ると、プラスミドｐＵＣＫが生じた。突然変異生成によ
り、ＥｃｏＲＩ−及びＮｏｔＩ−末端を介してクローニ
ング可能な（ポータブルな）ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−フ
ラグメントが得られ、これは、マウスκ−鎖のゲノム組
織に相応するＶＪ１−部を有する。これに引続き、マウ
スκ−鎖のゲノムＪ１−セグメントのスプライス−ドナ
ー配列ＧＴで初まって、２０ヌクレオチドの所にイント
ロン配列（Ｍａｘ．Ｅ．Ｅ．等によるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．　　２５６（１９８１）５１１６〜５２２０）
及び制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩに関する認識配列
（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）が続く。突然変異生成（後記参照
）は、モリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）等による方法（Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　２（１９８４）、６３
６〜６３９）により実施する。

【００５９】この突然変異生成のために使用したオリゴ
ヌクレオチドの配列は次のとおりである：

【００６０】

【化１】

【００６１】ヘテロ二重鎖−形成のために、ｐＵＣＫか
ら２個のフラグメントを単離した。フラグメントＡ：ｐ
ＵＣＫを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、
双方のフラグメントをゲル電気泳動（アガロースゲル）
により分離し、このゲルから大きいＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントを単離した。このフラグメントはマウ
スκ配列を含有しない。

【００６２】フラグメントＢ：ｐＵＣＫをＮａｅＩで処
理し（ｐＵＣ−部分の原切断位置）、アルカリホスファ
ターゼでの処理により５′−ホスフェート基を除去し、
引続きこのフラグメントを０．７％アガロースゲル上で
２回精製した。

【００６３】ヘテロ二重鎖形成のために、フラグメント
Ａ、フラグメントＢ（それぞれ５００ｆモル）及びオリ
ゴヌクレオチド（８０ｆモル）を混合し、ＮａＣｌ　　
５０ｍモル／ｌ、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１０ｍ
モル／ｌ、ＭｇＳＯ４　　１０ｍモル／ｌ中、１００℃
で３分間インキュベートし、その後、氷上に移した。引
続き、このＤＮＡを復元させた（６０℃で２０分）。修
復−合成のために、反応バッチにデオキシヌクレオシド
トリホスフェート（０．２５ｍモル／ｌ）、ＡＴＰ（１
ｍモル／ｌ）、ＮａＣｌ（１００ｍモル／ｌ）、トリス
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（６．５ｍモル／ｌ）、ＭｇＣｌ
２（８ｍモル／ｌ）、β−メルカプトエタノール（１ｍ
モル／ｌ）を入れ、Ｅ．コリーからのＤＮＡ−ポリメラ
ーゼのクレノフ−フラグメント（０．１２５Ｕ／バッチ
μｌ）及びＴ４リガーゼ（０．１Ｕ／バッチμｌ）と共
に１６℃で４時間インキュベートした。引続き、この反
応バッチでＥ．コリーＨＢ１０１を形質転換し、アンピ
シリン含有（５０μｌ／ｍｌ）寒天−プレート上のコロ
ニーを選択した。コロニーハイブリド形成法（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ等のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ．
Ａ　　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．Ｃｏｌ　　
Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
（１９８２）を用いて、そのプラスミドＤＮＡ中に前記
オリゴヌクレオチドが埋封された同じコロニーを同定す
ることができた。 この同定は、まず制限エンドヌクレアーゼの分析により
行なった。最後に、配列の所望の変更を配列決定により
確認した（Ｓａｎｇｅｒ　　Ｆ．等によるＰｒｏｃ．　
Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　　７４（
１９７７）、５４６３〜５４６７）。

【００６４】ｂ）　　ＭＡＫ１７９のキメラ化されたκ
−鎖に関する表現ベクターの構成（図２及び図３）出発
プラスミドとしてｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
，Ｓａｎ　　Ｄｉｅｇｏ；Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．及びＳｅ
ｅｄ，Ｂ．（１９８７）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａ
ｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　　８４、８５７３〜８５
７７）を使用した。これは、ヒトのサイトメガロウイル
スのプロモーター、ファージＴ７及びＳＰ６のプロモー
ター、ポリリンカー、ＳＶ４０のスプライス−及びポリ
アデニル化−配列、選択のためのｓｕｐＦｔＲＮＡ並び
にＭ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０及びポリオーマの複製
のオリジン（ｏｒｉｇｉｎｓ　　ｏｆ　　ｒｅｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎ）を含有する。クローニングの理由から書き
込まれたＮｄｅＩ位置を、適当なリンカーの連結導入に
よりＰｖｕＩ位置に変換した（＝ｐｃＤＮＡ１−Ｐｖｕ
Ｉ）。 後者プラスミドをポリリンカー中で、ＥｃｏＲＩ及びＮ
ｏｔＩを用いて切断し、（ａ）により得られたＤＮＡ（
約４００ｂｐ）のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメント（
ＭＡＫ１７９カッパのＶＪ１−部及びイントロン配列を
含有）をベクター中に連結導入した。この連結バッチを
Ｅ．コリー菌株ＭＣ１０６１／Ｐ３（Ａｒｕｆｆｏ，Ａ
．及びＳｅｅｄ，Ｂ．：Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　　８４（１９８７）、８５７
３〜８５７７；Ｓｅｅｄ，Ｂ．：Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ
ｓ．　Ｒｅｓ．　　１１（１９８３）、２４２７〜２４
４５）中にトランスフェクションさせ、寒天−プレート
上のアンピシリン耐性プラスミドを単離した。この生じ
たプラスミドをｐｃＤＮＡＫと称する。次いでｐｃＤＮ
ＡＫをＰｖｕＩ及びＮｏｔＩで切断し、短かいフラグメ
ントを、低融解性アガロースゲル上で単離した。

【００６５】プラスミドｐ１０１９５（欧州特許（ＥＰ
−Ａ）第０３７８１７５号により製造）を、同様に、Ｎ
ｏｔＩ及びＰｖｕＩで切断し、大きいフラグメント（図
３）を低融解性アガロースゲル上で単離した。ｐ１０１
９５は、κ−鎖に関するマウスのイントロン配列並びに
ヒト定常κ−部のコード化及び非コード化範囲を有する
。

【００６６】ｐｃＤＮＡＫ及びｐ１０１９５の双方のフ
ラグメントをＴ４リガーゼで処理し、ＭＣ１０６１／Ｐ
３中にトランスフェクションさせ、アンピシリン耐性コ
ロニーを単離した。生じたプラスミドをｐｋｃｈｉｍ．
と称した。ハイブリド−遺伝子（ＶＪ１−マウス−Ｃκ
−ヒト）はヒトＣＭＶ−プロモーター（サイトメガロウ
イルス）のコントロール下に表現される。ホスホトラン
スフェラーゼ・ネオ（ｐ１０１９５からｐｋｃｈｉｍ．
に導入された）に関する表現カセットは、哺乳動物細胞
中のトランスフェクション後のＧ４１８耐性コロニーの
選択に役立つ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．ａｎｄ　　Ｂｅ
ｒｇ，Ｐ．：Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１（
１９８２）、３２７〜３４１）。

【００６７】例３ ＭＡＫ１７９のＨ鎖のキメラ化及びキメラ化されたＨ鎖
に関する表現ベクターの構成　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ａ）　　ＭＡＫ１７９のγ１鎖のＶＤＪ３−部へのスプ
ライス−ドナー、イントロン及びＮｏｔＩ配列の導入（
図４） γ１−鎖に関するｃＤＮＡ（５′未翻訳部及び不変部内
のＢａｍＨＩ−位置までのコード化部）をｐＵＣ１８内
のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（Ｙａｎｉｓｃ
ｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．等のＧｅｎｅ　　３３（１９８
５）、１０３〜１０９）としてサブクローニングした＝
プラスミドｐＵＣγ１。

【００６８】突然変異生成により、マウスγ１−鎖のゲ
ノム性組織に相応するＶＤＪ３−部、これに引き続く、
マウスγ１−鎖のゲノム性Ｊ３セグメントのスプライス
−ドナー配列ＧＴで初まっている２０ヌクレオチドイン
トロン−配列（Ｓａｋａｎｏ，等のＮａｔｕｒｅ　　２
８６（１９８０）、６７６〜６８２）及びこれに引続く
制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩに関する認識配列（Ｇ
ＣＧＧＣＣＧＣ）を含有するポータブルなＥｃｏＲＩ−
ＮｏｔＩフラグメントが得られる。この突然変異生成は
、モリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）等による方法（Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　２（１９８４）、６３６〜
６３９）により実施した。この突然変異生成のために使
用されたオリゴヌクレオチドの配列：

【００６９】

【化２】

【００７０】ヘテロ二重鎖形成のために、ｐＵＣγ１か
ら２個のフラグメントを単離した。

【００７１】フラグメントＣ：ｐＵＣγ１を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、双方のフラグメント
をゲル電気泳動（１％アガロースゲル）により分離し、
大きいＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをこのゲル
から単離した。このフラグメントはマウスγ１−配列を
含有する。

【００７２】フラグメントＤ：ｐＵＣγ１をＮａｅＩで
切断し（ｐＵＣ−部分内の原切断位置）、５′−ホスフ
ェート基をアルカリホスファターゼでの処理により除去
し、引続き、このフラグメントを０．７％アガロースゲ
ル上で２回精製した。フラグメントＣ及びＤ（各々５０
０ｆモル）及びオリゴヌクレオチド（８０ｆモル）の混
合の後に、突然変異生成を例２の記載と同様に実施した
。コロニーハイブリド形成法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等のＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏ
ｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ１９８２
）を用いて、そのプラスミド−ＤＮＡ中に前記オリゴヌ
クレオチドが組み込まれたそのコロニーを同定すること
ができた。この同定は、まず制限−エンドヌクレアーゼ
を用いて行なった。最後に、この配列の所望の変化を配
列決定により確認した（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．等のＰｒｏ
ｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　７
４（１９７７）、５４６３〜５４６７）。図４は、所望
のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントの製造を図示して
いる。

【００７３】ｂ）　　ＭＡＫ１７９のキメラ化されたγ
１−鎖に関する表現ベクターの構成（図５及び図６）ベ
クターｐｃＤＮＡ中の原ＮｄｅＩ−位置（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ；Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．ａｎ
ｄ　　Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａ
ｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　　８４、８５
７３〜８５７７）を、相応するリンカーの使用によりＰ
ｖｕＩ−位置に変換した。生じたプラスミドをｐｃＤＮ
Ａ１−ＰｖｕＩと称する。ｐｃＤＮＡ１−ＰｖｕＩをＥ
ｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを用いて切断し、図４に記載のｐ
ＵＣγ１−Ｍｕｔ（γ１のＶＤＪ３及びイントロン−配
列）のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントを連結導入し
た。 生じたプラスミドをｐｃＤＮＡγ１と称する。

【００７４】プラスミドｐ１１２０１（欧州特許（ＥＰ
−Ａ）第０３７８１７号により製造）を、ＮｏｔＩ及び
ＢａｍＨＩを用いて切断し、突出末端をクレノフで充填
し、ＮｏｔＩ−リンカーを連結させ、ＮｏｔＩで後切断
し、図６に示されているフラグメントを低融解性アガロ
ースゲル上で単離する。このフラグメントはマウスのＨ
鎖のイントロン配列、ヒトのＨ鎖のイントロン配列並び
にヒトγ１遺伝子の定常部のゲノム性均等物を含有する
。このフラグメントをベクターｐｃＤＮＡγ１の原Ｎｏ
ｔＩ−位置内に連結導入した。正しい配向は制限エンド
ヌクレアーゼを用いて確認された。生じたＭＡＫ１７９
のキメラ化γ１−鎖に関する表現ベクターをｐγｃｈｉ
ｍと称する。この原理に依って、他のアイソトープのキ
メラ化鎖（例えば、μ、γ２、γ３、γ４、α１、α２
、σ、ε）も構成されうる。

【００７５】例４ ＭＡＫ１７９のキメラ化された鎖に関する表現プラスミ
ドでの電気ポレーションによる非−プロデュサーハイブ
リドーム−系の永久細胞系の創製　　　　　　　　　　
プラスミドｐｋｃｈｉｍ．及びｐγ１ｃｈｉｍ．を同量
混合し、電気ポレーション（Ｅｌｅｋｔｒｏｐｏｌａｔ
ｉｏｎ；Ｂｉｏ　　Ｒａｄの遺伝子パルサー）により、
免疫グロブリン非−プロデュサー−ハイブリドーム系Ｓ
ｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ　　ＣＲＬ８９２３）（
Ｏｃｈｉ，Ａ．等のＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　　８０（１９８３）、６３５１〜
６３５５）中にトランスフェクションさせた。同様に、
全ての他の非−免疫グロブリン−プロデュサーハイブリ
ドーム細胞系例えばｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴ
ＣＣ　　ＣＲＬ８３７５）も好適である。双方のプラス
ミドを、トランスフェクションの前に、制限エンドヌク
レアーゼＰｖｕＩを用いて線状化させた。電気ポレーシ
ョンの実施は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅ
ｓ．１５（１９８７）、１３１１〜１３２６もしくはＢ
ｉｏ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　　６（１９８８）、７
４２〜７５１に記載されている。遠心分離の後に、細胞
を冷ＨｅＢＳ−緩衝液（ＨＥＰＥＳ　　２０ｍモル／ｌ
、ｐＨ７．０５、ＮａＣｌ　　１３７ｍモル／ｌ、ＫＣ
ｌ　　５ｍモル／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４　　０．７ｍモル
／ｌ、デキストロース　　６ｍモル／ｌ）を用いて洗浄
し、ＨｅＢＳ−緩衝液で再懸濁させ、細胞１０６個／ｍ
ｌの濃度に調節し、氷上に置いた。プラスミド添加の後
に、パルスをかけた（条件：容量５００μＦ、電圧範囲
２４０〜２８０Ｖ、又は１６０μＦ及び２００〜２４０
Ｖで）。細胞を、このパルスの後約１０分間氷上に保持
し、引続き、培地Ｉ（ＲＰＭＩ　　１６４０、牛胎児血
清　　１０％、グルタミン　　２ｍモル／ｌ、ピルビン
酸ナトリウム　　１ｍモル／ｌ、非必須アミノ酸　　０
．１ｍモル／ｌ）中、３７℃でインキュベートした。こ
のトランスフェクション後３０時間に、この培地を交換
し、培地Ｉ＋Ｇ４１８　　８００μｇ／ｍｌと共にイン
キュベートし、その後、９６ウエルのマイクロ滴定プレ
ートの１ウエル当り細胞約１０３個を接種した。合計１
０個のマイクロ滴定プレート（各々９６ウエルを有する
）を設置した。接種後７〜１０日に、ウエル内にＧ４１
８耐性コロニーが同定できた。それらの培養上澄みを次
の例に記載のように、再構成キメラ化ＭＡＫ１７９に関
して試験した。最良のプロデュサーが培地Ｉ中の培養物
質中に増大された。 例５ 　　ヒトＩＬ−２−レセプターに対する再構成抗体の測
定　　まず、マイクロ滴定プレートにヒトＦｃγに対す
るポリクローナル抗体を塗布した。このために、マイク
ロ滴定プレートのウエルに、炭酸塩／重炭酸塩０．２モ
ル／ｌ（ｐＨ９．５）中のヒトＦｃγ（ＩｇＧ）に対す
るポリクローナル抗体２００μｌ（２．５μｇに相当）
を入れて、４℃で１晩又は室温で１時間インキュベート
する。ウエル内容物を吸い出した後に、ＨＥＰＥＳ　　
５ｍモル／ｌ、ＮａＣｌ　　０．１５モル／ｌ、１％ク
ロテインＣ（ｐＨ７．０）３００μｌと共に室温で３０
分〜１時間インキュベートした。引続き、参照試料又は
トランスフェクトされた細胞の培養上澄み２００μｌを
加え、室温で振動（５００ｒｐｍ）下に１時間又は室温
で振動せずに９０分間インキュベートした。参照曲線を
モデル−キメラを用いて得た（ヒトＩｇＧ　　ＭＡＫ及
びＭＡＫ１７９のＦａｂ−フラグメントの化学的架橋に
より製造）。ウエル内容物を吸い出した後にＩＰ＝イン
キュベーション緩衝液（ＨＥＰＥＳ　　５０ｍモル／ｌ
、ｐＨ７．０、ＮａＣｌ　　０．１５モル／ｌ、酒石酸
ジナトリウム　　０．２モル／ｌ、クロテインＣ　　１
％、ＰＥＧ　　４０００（Ｓｅｒｖａ）０．７５％、プ
ルロニックＦ６８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）０．５％、フェノール０．０１％）各３００
μｌで２回洗浄した。引続きＩＬ−２−レセプターＰＯ
Ｄ−抗体−接合錯体（Ｋｏｎｊｕｇａｔｋｏｍｐｌｅｘ
）−溶液（後記）２００μｌを加え、室温で振動（５０
０ｒｐｍ）下に１時間又は室温で振動せずに９０分間イ
ンキュベートした。この予め形成された錯体は、可溶性
インターロイキン−２−レセプター及びＩＬ−２−レセ
プターＭＡＫ２１５のＰＯＤマークされたＦａｂ−フラ
グメントより成る。

【００７６】錯体溶液の製造：ＭＡＫ２１５のＰＯＤ−
マークされたＦａｂ−フラグメント（１５０Ｕ／ｍｌ）
２０μｌ＋インキュベーション緩衝液ＩＰ（前記）１９
．５ｍｌ＋可溶性ＩＬ−２−レセプタースタンダード（
６４００Ｕ／ｍｌ、ユニットはＴ−Ｃｅｌｌ　　Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓの標準により定義されている）３ｍｌ。可溶
性ＩＬ−２−レセプターを、シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ）
等のＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３（１９８６）５０９
〜５２０に記載のマウス−繊維芽細胞細胞系の培養上澄
みから取得した。

【００７７】インキュベーションの実施後に、前記の洗
浄緩衝液で３回洗浄し、引続き、ＰＯＤ活性を、ＡＢＳ
溶液［２，２′−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾ
リンスルホネート］＋Ｈ２Ｏ２を用い、室温で４５〜６
０分のインキュベーションの後に、ＥＬＩＳＡ−リーダ
ー中で、４０５ｎｍでの吸光度を読み取ることにより測
定した。この方法を用いて、高い表現度（１０μｇ／ｍ
ｌまで）を有するクローンが測定された。

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスの免疫グロブリンＬ鎖の可変部に関して
コードするｃＤＮＡ−フラグメントの単離及び目標とす
る突然変異生成の実施を示す図。

【図２】表現ベクター中へのマウス可変部の挿入を示す
図。

【図３】Ｌ鎖に関するマウス及びヒト抗体コード化配列
の融合を示す図。

【図４】免疫グロブリンＨ鎖のＤＮＡを得るための、所
望ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントの製造を示す図。

【図５】免疫グロブリンＨ鎖ＤＮＡを得るための、ＭＡ
Ｋ１７９のキメラ化されたγ１−鎖に関する表現ベクタ
ーの構成を示す図。

【図６】Ｈ鎖に関するマウス及びヒト抗体コード化配列
の融合を示す図。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　抗体のＬ鎖又はＨ鎖に関してコードし
   、その定常部はヒト起源であり、その可変部は非ヒト起
   源である組換えＤＮＡにおいて、これは、転写の方向に
   、（ａ）　　非ヒト可変部に関してコードするｃＤＮＡ
   −配列（Ｊ部及び場合によりＤ部を包含する）（ｂ）　
   　その５′−末端に１個のスプライス−ドナー位置を有
   し、５′−末端の非ヒトイントロン−部分配列及び３′
   −末端のヒトイントロン−部分配列から構成されている
   イントロン配列　　及び （ｃ）　　ヒト定常部に関してコードするゲノムＤＮＡ
   −配列を有することを特徴とする、組換えＤＮＡ。
2. 【請求項２】　　請求項１記載の組換えＤＮＡを含有す
   る表現ベクター。
3. 【請求項３】　　請求項１記載の組換えＤＮＡを製造す
   るため、所望の特異性の抗体を分泌するハイブリドーム
   細胞系からポリＡ＋−ｍＲＮＡを単離し、このためのｃ
   ＤＮＡ−ライブラリイを適当なベクター内に製造し、こ
   の抗体の定常部に関してコードするＤＮＡを補足するオ
   リゴヌクレオチドとのハイブリド形成を介して、抗体鎖
   に関するｃＤＮＡを含有するクローンを検査し、これか
   らＶ−、Ｊ−及び場合によってはＤ−配列を単離し、こ
   の際、目標とする突然変異生成により、転写方向のそれ
   ぞれのＪ−ドメインに引続き、１個のスプライス−ドナ
   ー位置、非ヒト起源の抗体−イントロン配列の１部分及
   び１個の制限切断位置を導入し、相応する制限酵素を用
   いる消化により、この定常部に関してコードする配列を
   分離し、得られるＤＮＡを、ヒト抗体のＬ鎖又はＨ鎖の
   定常部に関してコードし、その５′−末端に相応するヒ
   トイントロン配列の１部分を有するゲノム性ＤＮＡ配列
   と連結させることを特徴とする、組換えＤＮＡの製法。
4. 【請求項４】　　異種遺伝子の表現のために好適なベク
   ター中に、請求項１による又は請求項３により製造され
   た組換えＤＮＡを挿入することを特徴とする、表現ベク
   ターの製法。
5. 【請求項５】　　その可変部が非ヒト起源であり、その
   定常部がヒト起源であるキメラ抗体を製造するために、
   請求項１に記載の又は請求項３により製造され、Ｌ−鎖
   に関してコードする組換えＤＮＡを含有する表現ベクタ
   ー及び請求項１に記載のもしくは請求項３により製造さ
   れ、Ｈ鎖に関してコードする組換えＤＮＡを含有する表
   現ベクターを適当な宿主細胞中に導入し、安定な形質転
   換細胞を単離し、自体公知の方法で、細胞の培養上澄み
   から抗体を取得することを特徴とする、キメラ抗体の製
   法。
6. 【請求項６】　　キメラ抗体ＭＡＫ１７９。
7. 【請求項７】　　キメラ抗体ＭＡＫ２１５。
8. 【請求項８】　　キメラ抗体ＭＡＫ４４７。