JPS61280565A - フロ−サイトメトリ−用網状血球測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はフローサイトメトリーを応用した血液の光学的
測定技術に使用するに適した赤血球特に成熟赤血球と網
状赤血球などの血球計数測定用試薬に関する。

従来の技術 血液試料中の未成熟の赤血球は網状赤血球（レチクロサ
イトＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｏ、ＲＢＴとも略記）と称
せられ、通常全赤血球中Ｏ１７〜２．２係　　がこれＫ
あたり、網状赤血球数の測定によって急性内出血、溶血
性貧血、産生不良性貧血その他の各種診断乞裏付けるた
め近時の臨床検査に重要視されてきた。

上記網状赤血球の計数には当初ニューメチレンブルー、
ブリリアントクレゾールブルー等の塩基性染料により染
色された塗床血液が用いられ、全赤血球を顕微鏡で観察
しながら発色した網状赤血球の割合を計数することが行
われた。

止揚の各種染料による染色には血液試料の前処理、染色
後の目視算定に時間と労力を要し、検査数の大きい場合
に不適当であった。

そこで開発されたフローサイトメトリーたよる血液検査
は高速化、ｆＩ！７度の向上を達成しつつあるがなお未
だ網状赤血球計数にとって様々な問題が残されている。

従来技術のうち、米国特許第４，３３６，０２９号、同
第４．６２５，７０６号、同第４．２８４，４１２号は
網状赤血球の染色にアクリジンオレンジを用いることを
提案している。このアクリジンオレンジは網状赤血球中
のＲＮＡ成分に吸着されて赤色螢光を発し、緑色螢光が
主体の成熟赤血球と区別して計数可能にする。しかし、
アクリジンオレンジの場合、（Ａ）染色溶液それ自体の
バックグランド螢光が強（、血球由来の螢光強度測定に
背景雑音となり誤差を生じ易い、（Ｂ）螢光が赤色領域
の６３０　ｎｍ以上であるため、高感度の螢光測光装置
が必要、（Ｃ）非特異染色のｇｔ会が強（、成熟赤血球
の中に赤色壁ｉ：ヲ発生させるため、検体量誤差の小さ
い染色液組成の調製が峻しい、ＣＤ）血小板を強く染色
するため、測定中に血小板と赤血球が同時通過すると成
熟赤血球の散乱光強度と血小板の赤色螢光強度とが同時
測定され、これが網状赤血球相当の信号レベルを構成す
るので誤差の原因となる、（Ｅ）アクリジンオレンジ溶
液は環境依存性が大きく螢光強度が変化し易い、などの
問題がめった。

また、特開昭５９−１４２４（５５号公報においては染
料としてチオフラビンＴの使用を開示している。これは
、血液試料の凡ＮＡ染色を行った後希釈や洗浄によって
背景螢光及び成熟赤血球の非特異螢光を減少させたうえ
で網状赤血球のｆ（、Ｎ　Ａ螢光をフローサイトメータ
で検出測定するものであるが、（Ｆ）上記希釈を通じて
非特異螢光の低減に伴ない同時に几ＮＡ結合の染料によ
る特異螢光も低減するため、螢光感度の高い測光装置が
要求される。また、（Ｑ希釈後は螢光強度の経時的低下
が激しくなるので再現性の高いデータが得られない又（
Ｇ′）染色に比較的時間がかかるという問題があった。

さらに、ビロニンＹを染料として用いることも　。

行われたが、これは固定した赤血球を几ＮＡ染色してか
ら洗浄して非特異螢光及び背景螢光を完全に除いた後、
凡ＮＡ結合の染料による特異螢光を測定するものである
。これは■ｊ）血球の事前固定処理、染色、洗浄の各工
程に要する時間が大きく他の方式の数十倍の所要時間が
かかるため多検体処理には適当でない、（Ｉ）ビロニン
Ｙそのものの螢光量子収率がきわめて低（、このため大
出力レーザ光源による励起によってはじめて測定可能に
なる、（Ｊ）ピロニンＹは低重合度の凡ＮＡ、ＤＮＡと
しか結合しないので特異螢光を得るべきＲ，ＮＡ染色の
効率が低い、などの問題があった。

発明が解決しようとする問題点 従来使用されているフローサイトメトリーによる染色網
状赤血球計数に避は難い前述のごとき、アクリジンオレ
ンジの場合の囚〜（Ｅ）、チオフラビンＴの場合の（Ｆ
）〜（Ｑ、ビロニンＹの場合）（６）〜（Ｊ）のすべて
の問題点を及ぶ限り除去し得る染料物質を選択使用して
、染色試料中の網状赤血球の螢光強度を増強させ、その
反面試料溶液についてはその背景螢光を低下させて螢光
測定におけるＳ／Ｎ比を高め、網状赤血球の測定ｆ＃度
を格段に向上せしめることが本発明の解決しようとする
課題である。

問題点を解決するための手段 本発明は、上記の問題点の多くを解決し、全血液試料中
の赤血球について成熟赤血球群と未成熟赤血球であって
几ＮＡの多い網状赤血球群とをＲＥＴ比率の多少、赤血
球濃度の大小等に影響されることなく鮮烈かつ強固な螢
光染色を網状赤血球群に施こしこれの高精度の識別を可
能にするものであり、そのために本発明は網状赤血球？
螢光染色するためオーラミンを用いることを特色とする
フローサイトメトリー用血球測定試薬を実現したもので
ある。血球形状を安定化させるために塩化ナトリウム等
のアルカリ金属塩を添加して染色液試薬を等張くし、ま
た血液細胞の染色効率を高めるために緩衝剤を添加する
ことか最適である。

螢光染料としてのオーラミン０は または　　　　　ＮＨ−ＨＣノ が用いられ、さらにオーラミンＧ ＮＨ−ＨＣｌ Ｉｆ やジエチル７′ニリン等より製造するｂｉｓ−（４−Ｎ
、Ｎ−ジエチルアミノフェニル）イミノメタン陪司訳０
３ も用いられ得る。これらのオーラミンは染色血球に対し
て鮮明な色相を与えるとともにそれ自体の着色力も犬で
ある。

なお、オーラミンを螢光染料とした場合、界面活性剤例
えばトリトン−Ｘを少量添加すると、染色された成熟赤
血球及び網状赤血球の均一化が効率よく達成され各血球
からの散乱光強度及び螢光強度の増強を助けるとともに
、この増強作用はグルタルアルデヒドを加えるとより高
められ結局溶液の背景螢光を相対的に抑制し得るので、
網状赤血球分布Ｙｆとめ膜粘性を下げてその弁別計数を
之らに一層容易ならしめ測定精度の向上に役立つ。

オーラミンは試薬１ｄ当り２０〜２５００μｇの含量が
、又塩化ナトリウムなどのアルカリ金属塩は同じ＜５〜
２０１ｖでよく、Ｐｋｍ６〜ｆＯＩ／ｃ適宜調整するこ
とが好適である。

上述した組成分を含有する等張緩衝染料溶液はＥＤＴＡ
などで抗凝固化した全血液試料と混合するだめの血球測
定特に網状赤血球測定用試薬となる。

作用 以上の構成による血球測定用試薬を抗凝固性全血液試料
に混合すると、オーラミン染料が網状赤海原を含む海原
をすべて鮮烈に染色し特に細胞中のＲＮＡと結合し析出
させ１時間以上安定した黄色螢光を帯びさせる。染色さ
れた血球は水銀又はキセノンアークランプ、レーザ（Ｈ
ｅ−Ｃｄレーザ又はＡｒレーザ）の４９０〜５００　ｎ
ｍ程度までの励起光源を用い約５２０〜７００１ｍ程度
以上の黄色螢光を７ａ−サイトメータで検出する。

本発明による試薬を使用した場合の成熟赤血球群の弁別
域は未成熟の網状赤血球さらに血小板の各弁別域と明確
に区別しやすくなる。

実施例 （１）オーラミン０：１．！ｉ’ζ塩化ナトリウム：９
９ｒに０．０１Ｍ／ｌリン酸緩衝液と水を加えて１１と
しＰＨ７，２０の黄色の試薬を調製した。この試薬５ａ
＋ｌにＥＤＴＡ抗凝固新鮮血１０μｌ’ｉ加え、室温で
１０分間・ｆンキュベートした後螢光フローサイトメー
タ釦送入した。光源は約４８０ｎｍ　　ｆでの励起光を
発生する水銀アークラングを用い、５２Ｄｎｍ以上の螢
光を受光検出した。前方散乱光−後方螢光で検出した網
状赤血球の弁別域を四角形で囲んだ０．１〜２６％ＢＥ
Ｔの３０検体についての測定結果が第１図（ａ）、（ｂ
）及び第２図に示されている。この場合の測定データ（
１）と目視計数データ（３）との相関は極めて高く、相
関係数ｒ＝０．９９５、回帰直線はＹ＝１．１４ｘ−０
，０５が得られた。

（２）細胞容積を反映しにくく赤血球群と血小板との区
別が比較的困難とされる側方散乱光を後方螢光とともに
測光し成熟赤血球、網状赤血球、血小板をそれぞれ個別
に計数することにした。

染色液組成は、オーラミンＯ：　４００ｍ９ｒ、塩化ナ
トリウム：９．９ｒ、グルタルアルデヒド：３０ｍｆ！
ｒに０．０２　Ｍ／ｌ　ＩＪン酸緩衝液と水を加えて１
１としｐＨ８，００の黄色を帯びた試薬を調製した。こ
の染色液５ｄにＥＤＴＡ抗凝固血液又はこれから密度勾
配法により網状赤血球を濃縮した試料１０μｌを加え、
室温で１０分間イン４・ユベートした後上記（１）と同
様に螢光フローサイトメータにより５８０ｎｍ以上の螢
光と側方散乱光とを受光検出計数した。目視データとの
相関は、網状赤血球比率の低値域から高値域まで極めて
よく、赤血球の散乱光も比較的均一化されていた。結果
は第３図（ａ）、（ｂ）に示した。

（３１次にオーラミンの濃度を１桁以上薄めたほか、組
成数値を変えて（２）と同じ検体で側方散乱光／後方螢
光で網状赤血球を計数した。

染色液組成は、オーラミン０：３０〜ｒ、塩化すトリウ
ム：１１ｒ、グルタルアルデヒ）”：１００１ｎ９【　
に０．０２Ｍ／ｌホウ酸緩衝液と水を加えて１１としＰ
Ｈ９，００の黄色試薬を調製した。この試薬５ｄにＥＤ
ＴＡ抗凝固血から密度勾配法により網状赤血球を濃縮し
た試料１０μノを加え、室温で１０分間インキュベート
した後フローサイトメータに送入し血球測定した。受光
した螢光波長は５４０ｎｍ以上であった。結果は、第４
図（ａ）、（ｂ）に明らかなように、赤血球の散乱の拡
がシが見られたが測定値は殆んど変らなかった。

（４）オーラミン０：４００１ｖ、塩化ナトリウム：　
８１ｉｒ　Ｋ　０．０１Ｍ／Ａ！のリン酸緩衝液と水を
加え１１のＰＨ５，［］　の試薬を調製した。この試薬
２ＭにＢＤＴＡ抗凝固抗凝固新入面１０μｌを加え室温
で６０秒間インキュベートした後螢光フローサイトメー
タに送入した。光源はアルゴンイオンの青色レーザー光
を用い、波長４８８ｎｍ　出力１０ｍｗの低出力で前記
試料を励起し前方散乱光と５２０１ｍ以上の側方螢光を
光電変換器で受光するかたちで螢光フローサイトメータ
で測定した。

従来にない低出力励起にもか〜わらず、試料数６０検体
で従来法の目視法との相関係数ｒ＝０．９７回帰直線Ｙ
＝１．１４５Ｘ−０，０７（％）が得られ、網状赤血球
数の低値から高位までよく目視と一致するデータが得ら
れた。

第５図（ａ）（ｂ）（ｃ）は、横軸に螢光強度分布図に
散乱強度率をとり各粒子信号をプロットしたもので横の
数値は図の四角で囲んだ部分の網状赤血球数の測定値と
視算値を示している。

第６図は前記の相関を示すグラフで、横軸にオーラミン
０による測定値と縦軸に視算値を表したものである。

効果 以上に述べた本発明試薬を用いフローサイトメータに血
液試料と混合してから流すと、赤血球群と血小板との弁
別はもちろんのこと、赤血球群の中で成熟した通常の赤
血球と未成熟の網状赤血球との峻別が鮮明な染色状態で
明確に行えることになる。実際に目視測定データとの優
れた相関が確認された。また、血液試料との混合後の溶
液の背景螢光が極端に低下させ得るのでアクリジンオレ
ンジ等の場合のよう忙螢光の一部をフィルタで選択して
とるのでなく血球の螢光を特異的にすべて捕捉すること
ができ、低出力の励起光源を用いても可測である。この
場合、染料としてのオーラミンは成熟赤血球膜に非特異
吸着しても微弱な螢光を発するに留まり、これに対して
網状赤血球では高い強度の螢光を発するので判別が簡単
である。

又染色が迅速であり従来のアクリジンオレンジ法の１／
１０以下の時間で網状赤血球の多い検体まで充分染色が
完了する。フローサイトメトリーでは血球を浮態した試
料溶液を計数孔を通過させるが、この際血小板と成熟赤
血球とが同時に孔を通過すると網状赤血球として計数さ
れる誤差が伴なう。しかし本発明試薬を用いると、網状
赤血球の螢光強度が極めて高くなるため成熟赤血球数と
網状赤血球数を混同することなくそれぞれ正確に計数し
得る。これに関連して、オーラミン濃度をある程度高め
ると非特異吸着した染料同士の反撥により血球同士の凝
集−同時通過が避けられる。さらに、オーラミンはＰＨ
上昇で簡単に分解するのでフローサイトメータ流路系に
付着しても洗浄が極めて容易である。筐た、オーラミン
を用いた場合、染料自体の特性から赤血球の前方散乱光
強度分布のまとまりがよくこれ１でのような散開状態が
少な（なったため、前方散乱光による血小板と赤血球と
の分離が良好になりこれらの計数の精度向上も期待でき
る。オーラミンはまた非特異染色の条件を増大させても
網状赤血球の螢光強度だけが増加する特異染色の増強に
つながる一方成熟赤血球の螢光強度は増加しない。この
結果、染色の度合を高めてフローサイトメータの螢光悪
友なより一層上昇させたり、低い比率域の網状赤血球試
料に対する計数精度を維持した適応性が高まるなど多く
の利点を実現し得るものである。

【図面の簡単な説明】

第ｉａ、ｌｂ図は本発明試薬を使用してフローサイトメ
ータにより測定した散乱光強度−螢光強度分布図、第２
図は第ｉａ、ｉｂ図に基づく網状赤血球計数の測定デー
タと目視データの相関を示すグラフ、第３ａ、３ｂ図及
び第４ａ、４ｂ図は異なる実施例についての第ｉａ、　
１ｂ図と同様の分布図を示すものである。さらに、第５
ａ、５ｂ。 ５０図は他の実施例による第１図又は第６図、第４図と
同様の分布図、第６図は第５図に対する、第２図と同様
の相関グラフを示すものである。 特許出願人　東亜医用電子株式会社 朱／ＩＦ（１ ，２四１２３　四σ（ａン ４３　ＵｉＪ（ｂ） を光侍凍 見４図（σ〉 二日町２４　回（ｂン ［ｆｔＲｒ；ｙ　ｗ　６，５０７゜ 疵ｉ伊１宇　６゜２２ち Ｙ尤罐々 も５図（ｄ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）網状赤血球の螢光染料としてオーラミンＯを含有す
   ることを特徴とするフローサイトメトリー用血球測定試
   薬。 ２）特許請求の範囲１記載の試薬において、オーラミン
   Ｏ：２０〜２５００μｇ／ｍｌ、アルカリ金属塩５〜２
   ０ｍｇ／ｍｌ、適量の緩衝剤を添加しｐＨ６〜９．５に
   調整してなることを特徴とするフローサイトメトリー用
   血球測定試薬。