JPH0434560B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、白血球インターフエロンの精製過程
において、ジスルフイド結合の解離、再結合に起
因して生ずる不純物質に関し、更に詳しくは、精
製インターフエロンからの、これら不純物質の新
規な除去方法に関する。 ヒト白血球インターフエロン（HuIFN−α）
は、例えばウシ白血球インターフエロン、イヌ
類、魚類または鳥類の白血球インターフエロンと
幾分の配列における相同性を有する、背椎細胞か
ら生産される白血球インターフエロン（IFN−
α）(S)を代表するものである。HuIFN−αは数
種の形態をとつて存在することが知られており、
一般にＡからＫまでの記号を付して表示される。
例えばHuIFN−αAおよびHuIFN−αDの如く表
示される。これらのうちいくつかの型のものは、
DNA組換え法適用の結果、大腸菌中で、回収し
得る程度の量で発現されており、通常Staehlin等
の方法〔J.Biol.Chem.，256：9750（1981）〕に従
い、モノクローン抗体カラムを用いて培養液から
単離される。このようにして単離されたインター
フエロンには、固有の（native）蛋白質のジスル
フイド結合の解離−再結合により生成した不純物
が混在する。これらの不純物は、非還元条件下に
SDS−PAGE分析にかけてサイズを測定すると単
量体蛋白質の数倍の分子量を示す低重合体（オリ
ゴマー）であることがわかる物質、および非還元
条件下のSDS−PAGEにおいてやや緩慢に移動す
る“スローモノマー”から成る。 一つの亜型（サブタイプ）のHuIFN−αAは、
アミノ酸番号１，29，98および138のアミノ酸に
スルフヒドリル基を有していると考えられてい
る。固有の分子配置では、アミノ酸番号１−98、
および29−138でこれらが結合している。29−138
結合は活性に必要であるが、この活性は１−98結
合が破壊された後も維持されると考えられてい
る。本発明は不純物の起源に関するいかなる特定
の理論を解釈することをも意図するものではない
が、一般にHuIFN−αAの場合には、29−138結
合はそのままで１−98結合が切れることにより
“スローモノマー”が生成し、その分子量に応じ
て活性が低かつたりあるいは全く活性がなかつた
りする一連のオリゴマーは、新しいジスルフイド
結合によりインターフエロン分子が相互に結合し
て生じると考えられている。オリゴマーの存在は
HuIFN−αAの活性を阻害し、またスローモノマ
ーは、それ自身活性ではあるが免疫原性を有する
と考えられている。従つて天然型のものからこれ
ら不純物を分離することが強く望まれている。 従来生成物中のオリゴマーは、ゲル透過によつ
て除去されている。しかしながらこの方法は本発
明方法ほど回収率が良くないばかりか、より重大
な欠点としてスローモノマーを除去することがで
きなかつた。 本発明によれば、オリゴマーおよびスローモノ
マーの両者を含まない天然蛋白質を高収率で得る
ことができる。 本発明はHuIFN−α製剤およびHuIFNと充分
な配列相同性を示すことで特色づけられる各種の
白血球インターフエロン製剤から、スローモノマ
ーおよびオリゴマーを除去する方法に関する。詳
しくはIFN−α １−20mg／mlを含有するPH３〜
５以下（約4.8）の緩衝溶液を28〜40℃でインキ
ユベートして精製する方法を提供するものであ
る。インキユベート時間は30分〜24時間である。
インキユベートの結果、既に示した望ましくない
物質が沈澱するので、これを遠心分離または過
の如き通常の方法で除く。 第１図および第２図は、HuIFN−α溶液に対
する本発明方法の適用前、および適用後の溶液を
(A) TSK−HPLCおよび(B)非還元型SDS−
PAGEにかけ、濃度計で定量、分析した結果を表
わす（Ａ：TSK−HPLCの溶出液の光学密度
（O.D.）（214nｍ）、Ｂ：濃度計によるトレース）。
第１図及び後述の第２図のＡおよびＢにおいて得
られたデータをそれぞれ表１および表２に示す。 第１図は温度32℃、HuIFN−αの濃度レベル
4.2mg／mlで本発明方法を適用した場合を示す。 図中、１はロツシユ製剤（Roche Prep）、２
は上澄液、３はペレツト、４はペレツト洗浄、７
は分子量基準を示す。

【表】 第２図は37℃、HuIFN−αの濃度レベル7.2
mg／mlで本発明を適用した場合を示す。１〜４は
第１図と同意義である。

【表】 第３図は還元および非還元SDS−PAGEの比較
を示す。図中Ａ−Ｄなる表示は種々のインキユベ
ーシヨン条件において非還元SDS−PAGEを、出
発物質および上澄液と適用した場合を示す。Ｅは
同じ試料に還元型SDS−PAGEを適用した場合を
示す。 図中、１，２，７は第１図と同意義であり、５
および５′はジエネンテク製剤（Genentech
Prep）、６はロツシユ製剤、２−１，２−２，２
−３はそれぞれ上澄液(D)、上澄液(C)、上澄液(B)を
表わす。 第４図はゲル透過クロマトグラフイーにより
HuIFN−α製剤からオリゴマーを分離した場合
を示す。第４図Ａにおいて実線は、セフアクリル
（Sephacryl^R）S300ゲルからの溶出フラクシヨン
の280nｍにおける光学密度（OD）を、点線は同
じく抗ウイルス活性（BK）を示している。Ｂは
蛋白質含有フラクシヨンの染色したSDS−PAGE
を示している。１および７は第１図と同意義であ
り、８〜１４はそれぞれフラクシヨン番号３２，
３４，３６，３８，４０，４２および４４を表わ
している。Ｃはゲルフラクシヨン４２のTSK−
HPLCからの流出液の光学密度（OD₂₁₄）を示し
ている。 SDS−PAGE（ドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動）は、分子量に応じて
物質を分析する電気泳動の一方法である。本発明
の如く、SDS−PAGEは、例えばβ−メルカプト
エタノールあるいはジチオスレオトール（DTT）
の様な還元剤の存在下より、むしろ非還元条件下
で実施されることが多い。これら、または他の還
元剤は、あらゆるジスルフイド結合を対応するス
ルフヒドリル基に還元してしまう。従つて本明細
書においては、β−メルカプトエタノール等の、
いかなる還元剤をも使用しないこの方法を“非還
元型SDS−PAGE”という。 このように区別することは、還元剤の影響下に
SDS−PAGEを実施すると、除去すべきいくつか
の不純物の存在を看過することになることから、
特に重要である。実施例４により詳しく説明され
ているように、還元剤が存在すると標本中のある
種の不純物が変化して天然のIFN−αと同位置に
泳動する。非還元条件下に行つた場合のみ、これ
らの不純物の存在が明らかとなる。 “TSK−HPLC”は、大きさに従つて分離す
るクロマトグラフイーの一方法であつて、高圧下
に分子篩を用いることを内容とする。アクロニム
（acronym）は、市販品として入手できる、
HPLC（高速液体クロマトグラフイー）に使用さ
れるゲルの商品名である。 HuIFN−αはその起源に係らず、ヒト白血球
インターフエロンを表わす。このインターフエロ
ンは、例えばヒト細胞あるいはDNA組み換え法
の適用によりHuIFN−αを発現するようトラン
スフエクトされた大腸菌から単離することができ
る。どのような場合にも、HuIFN−αとは、天
然型の蛋白質およびインターフエロン内のアミノ
酸配列を変えることのない工程で形成された上記
蛋白質の再配列生成物の両方を含む製剤を意味す
る。上で述べたように、今日、HuIFN−αは高
度に保存された蛋白質群として存在していること
が知られており、HuIFN−αAからHuIFN−αK
に至るまで、アルフアベツトで表わされている。 本発明において、“IFN−α”とは一般に本発
明方法に係るHuIFN−αとの配列相同性を有す
る白血球インターフエロンを意味する。ウシ白血
球インターフエロンはそのような相同性を有する
ことが知られているが、他の種属の白血球から得
られたインターフエロンについては配列の確認が
不充分である。しかしながら、今日では、少くと
もあらゆる種属の哺乳類のIFN−αとHuIFN−
αとは相同性を有すると考えられている。 “天然IFN−α”とは、細胞内で自然に生成さ
れた物質と三次元的に実質的に同一であると同定
されたIFN−αの群を意味する。非還元型SDS−
PAGE分析によると、天然HuIFN−αは通常の
方法で計算したとき、17200MWに相当する帯に
関連している。天然IFN−αは、時に“フアース
トモノマー”とも呼ばれる。これは、以下に定義
する不純物質の１つである“スローモノマー”と
の比較におけるSDS−PAGE内の泳動に基くもの
である。 “スローモノマー”とは、非還元型SDS−
PAGE内で異常な動きをするIFN−αを意味す
る。即ち、HuIFN−αはMW計算値18300ダルト
ンの位置、天然のHuIFN−αに関する帯のやや
後方に泳動する。これは、多分ジスルフイド結合
の一方が破壊されたため、空間配置に変化を来し
た形態のものであると考えられている。 “オリゴマー”とは部分的に重合したIFN−α
を意味する。このようなIFN−αの縮合生成物
は、単量体の別々の分子間のジスルフイド結合に
起因すると推測される。オリゴマーには、二量
体、三量体、四量体、および高分子量の縮合体が
含まれる。オリゴマーは、非還元型SDS−PAGE
内で、概略それらの分子量に応じて泳動する。 “不純物”には、通常宿主細胞あるいはその周
囲の媒質中に、IFN−αに付随して見い出される
他の細胞成分あるいは上に述べたオリゴマー類お
よびIFN−αのスローモノマー群が含まれる。本
発明において“宿主細胞”とは、適当な生物の白
血球またはトランスフエクトされた細菌（これら
に限定するものでないが）を包含する全ての白血
球インターフエロン生成培養を意味する。 本発明方法の出発物質であるIFN−α製剤は、
例えば当該技術者周知の方法、例えば適当な抗体
カラムに入れ、次いで公知技術で濃縮することに
より分離、調製される。その起源にかかわりな
く、天然IFN−αと同様にスローモノマーおよ
び／またはオリゴマーを含有するあらゆる製剤が
用いられる。本発明方法の好適な出発物質は哺乳
類のIFN−α、特にHuIFN−αおよびウシIFN
−αである。特に好適なのは、ヒト白血球インタ
ーフエロンとして知られているものの内の１つで
あるHuIFN−αAである。 本発明方法においては、IFN−α製剤を滴定に
よりPH３から約4.8、好ましくは約3.5〜4.2に調節
する。製剤中のIFN−αの濃度（分離操作で得ら
れたもの）は、１−20mg／ml、好ましくは５−10
mg／mlである。溶液中の蛋白質の特性から起こり
得る変性を防ぐため溶液のイオン強度を適当なレ
ベルに維持することが望ましい。従つて、IFN−
α溶液は酢酸アンモニウムあるいは塩化ナトリウ
ムのような適当な塩または塩類により適切なイオ
ン強度に保持する。許容し得るイオン強度の限界
は明確に定まつていないが、明らかに許容し得る
総塩類濃度の範囲は約0.01〜0.4M、好ましくは
約0.1〜0.2Mである。望ましいPH値を充足する限
り、あらゆる許容し得る塩を用いることができ
る。この溶液を次いで28〜40℃、特に約30〜34℃
で30分〜24時間、好ましくは10〜14時間、インキ
ユベートする。スローモノマーおよびオリゴマー
を含む沈殿が生じる。この沈殿を遠心分離または
過、好ましくは遠心分離して除去する。上澄液
（または液）には実質的に純粋な天然IFN−α
が含まれている。 以下の実施例は本発明を例示するものであるが
本発明を制約するものではない。 実施例 １ HuIFN−αA製剤からのオリゴマーおよびスロ
ーモノマーの除去 オリゴマー33％およびスローモノマー12.9％を
含有するHuIFN−αAはHoffman La Roche
Inc.から入手した（ロツシユ製剤）。この製剤は、
Wetzel，et al．，J.Interfero′n Res，１：381
（1981）に記載されているように、水疱性口内炎
ウイルスで攻撃されたHeLaおよびMDBK細胞に
おける細胞変性作用（CPE）抗ウイルス分析法
で分析した結果、１×10⁸u／mg以上の比活性を示
した。 このHuIFN−αA製剤は、PH5.0、0.12M塩化ナ
トリウムに調節した25mM酢酸アンモニウム中の
濃度が4.2mg／ml（OD280nｍで測定）のものであ
る。この溶液の５mlを酢酸で滴定しPH4.0とし、
時々撹拌しながら32℃で12時間インキユベートす
ると1/2時間後に沈殿が認められた。 この懸濁液を10000rpmで15分間遠心分離して
上澄液を回収し、２回のペレツト洗浄液と合わせ
た（洗浄は２時間接触させて行なつた）。 合わせた上澄液をいくつかの基準に基き、出発
物質と比較した。結果を第１図に示した。この図
で、TSK−HPLCはHuIFN−αAの単量体とオリ
ゴマーを分離するのに用いた（この方法はフアー
ストモノマーをスローモノマーから分離するもの
ではない。） TSK−HPLCはAltex ｕ−Spherogel TSK^R
2000SWカラム（0.75×60cm）を用いて行なつた。
蛋白質２−10μｇを注入し、PH6.8の0.2Mりん酸
カリウムを用いて流速0.5ml／分で溶離した。蛋
白質を214nｍにおける光学的濃度に基いて検出
した。カラムを次の分子量基準物質により目盛り
づけした：アルドラーゼ158K、BSA67K、卵ア
ルブミン45K、キモトリプシノーゲンA25K。 TSK−HPLCの結果を分析し、上澄液含有物
の98.8％がモノマーであり、二量体は1.2％にす
ぎず、さらに高分子量のオリゴマーは認められな
かつた。 非還元型SDS−PAGEはLaemmli，Nature，
277：680（1970）に記載の方法に従つて行い、ク
ーマシーブルー染色した後レーザー濃度計
〔LKB^R2202ウルトラスキヤンレーザー濃度計
（H.P.3390A積分計を備えた）〕で定量し、99.8％
の天然モノマーおよび0.2％のスローモノマーを
検出したがオリゴマーは検出されなかつた。 HuIFN−αAの収率（％）は、上澄液中に測定
された総蛋白質量と出発物質中の総蛋白質量の
各々に修正因子を適用して決定した。これらは、
上に述べた様にしてSDS−PAGEにより測定され
たフアーストモノマーに帰属し得る総蛋白質の％
によつて修正した。総蛋白質は、溶液１mg／mlに
対する消滅係数（消光率）（extinction
coefficient）を1.06と仮定して280nｍにおける光
学密度測定法により決定した。これらの蛋白質分
析の結果は、上澄液中の天然HuIFN−αAの回収
率が73％であることを示した。 実施例 ２ ロツシユ製剤の新鮮な試料を用い、インキユベ
ーシヨン／沈殿に蛋白質1.8mgを含有する試料7.2
mg／mlを使用し温度37℃で行なう以外は実施例１
と同様に操作した（HuIFN−αA濃度の変化につ
いては実施例３を参照）。第２図に示す結果から、
上澄液中に天然のHuIFN−αA99.9％およびスロ
ーモノマーを不純物として0.1％含有することが
判る。しかしながら、天然HuIFN−αAの収率は
43％にすぎなかつた。 実施例 ３ 種々のインキユベーシヨン条件の比較 インキユベート時間、PH、HuIFN−αAの濃度
および温度の影響を実施例１の方法を以下の様に
改変して検討した（ここでもロツシユ製剤を用い
た：ただしいくつかの実験には、分析の結果
HuIFN−αAの含有量が86％であるGenentech
HuIFN−αA製剤（ジエネンテク製剤）を用い
た）。 PH変化は、酢酸滴定により所望のPHに調整して
行つた。 HuIFN−αAの濃度を変換する為に、製剤を２
倍に希釈し、25mM酢酸アンモニウムで透析（PH
４で12時間）した後、凍結乾燥し、25mM酢酸ナ
トリウム（PH4.0、0.1M塩化ナトリウム）に溶解
して望ましい濃度にした。また、より低濃度を必
要とする場合には、入手した溶液をそのまま
25mM酢酸ナトリウム（PH4.0、0.1M塩化ナトリ
ウム）で希釈した。各変数を変化させ12時間イン
キユベートした結果を以下に示す。

【表】 ＋ 以下の式による計算値：
TSK−HPLC上の単量体ピークのOD214(上澄液)
×100

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト白血球インターフエロンと高度な配列の
   相同性を有する白血球インターフエロン（IFN−
   α）からオリゴマーおよびスローモノマーを除去
   する方法であつて、 (a) １〜20mg／mlのIFN−αを含有する緩衝液を
   PH３〜５の間で、30分〜24時間、28〜40℃にお
   いてインキユベートしてオリゴマーおよびスロ
   ーモノマーを沈澱させ、次いで (b) 天然IFN−αを回収する ことを特徴とする方法。 ２ PHを 3.5〜4.1に保持する第１項に記載の方
   法。 ３ インキユベート時間が 10〜14時間である第
   １項に記載の方法。 ４ インキユベート温度が30〜34℃である第１項
   に記載の方法。 ５ IFN−αの濃度が５〜10mg／mlである第１項
   に記載の方法。 ６ オリゴマーおよびスローモノマーの沈澱を遠
   心分離によつて除去する第１項に記載の方法。 ７ IFN−αが哺乳動物のIFN−αである第１項
   に記載の方法。 ８ IFN−αがヒトIFN−αである第１項に記載
   の方法。 ９ IFN−αがヒトIFN−αAである第１項に記
   載の方法。 １０ IFN−αがウシIFN−αである第１項に記
   載の方法。 １１ (a) ５〜10mg／mlのIFN−αを含有する緩
   衝液をPH 3.5〜4.1で 10〜14時間、 30〜34
   ℃でインキユベートしてオリゴマーおよびスロ
   ーモノマーを沈澱させ、次いで (b) 天然のIFN−αを回収する ことからなる第１項に記載の方法。 １２ IFN−αが哺乳動物のIFN−αである第１
   １項に記載の方法。 １３ IFN−αがヒトIFN−αである第１１項に
   記載の方法。 １４ IFN−αがヒトIFN−αである第１１項に
   記載の方法。 １５ IFN−αがウシIFN−αである第１１項に
   記載の方法。