JPS5998096A - ヒト白血球インタ−フエロン製剤からの不純物の除去法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、白血球インターフェロンの精製過程において
、ジスルフィド結合の解離、再結合に起因して生する不
純物質に関し、更に詳しくは、精製インターフェロンか
らの−これら不純物質の新規ｆ、Ｃ除去方法に関する。

ヒト白血球インターフェロン（１−１ｕ　Ｉ　ＦＮ−ａ
　）は、例えはウシ白血球インターフェロン、イヌ類、
魚類または鳥類の白血球インターフェロンと幾分の配列
における相同性を有する、背椎−細胞から生産される白
血球インターフェロン（１１・Ｎ−α）（Ｓ）を代表す
るものである。１−１ｕ　ｌ　Ｆ　Ｎ−αは数種の形態
をとって存在することか知られており、一般にＡからＫ
までの記号を付して表示される。

例えばＨｕＩＦＮ−ａＡおよび１４ｕｌＦＮ−ａＤの如
く表示される。これらのうちいくつかの型のものは、Ｄ
ＮＡ組換え法適用の結果、大腸菌中て、回収し得る程度
の量で発現されており、通常５ｔａｅｂｌｉｎ等の方法
ＣＪ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃ１１ｅｔｎ、、　２５６　：
　９７５０（１９８１）〕に従い、モノクローン抗体カ
ラムを用いて培養液から単離される。このようにして単
離されたインターフェロンには、固有の（ｎａｃｉｖｅ
）蛋白質のジスルフィド結合の解離−再結合により生成
した不純物が混在する。これらの不純物は一非還元条件
下に５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけてザイズを測定すると
単量体蛋白質の数倍の分子量を示す低重合体（オリゴマ
ー）であることがわかる物質、および非還元条件下の５
ＤＳ−ＰＡＧＥにおいてやや緩慢に移動する”スローモ
ノマー゛から成る。

一つの亜型（サブタイプ）のＨｕＩＦＮ−ａＡは、アミ
ノ酸番号１，２９．９８および１３８のアミノ酸にスル
フヒドリル基を有していると考えられている。固有の分
子配置では、アミノ酸番号１−９８、および２９−１３
８でこれらが結合している。２９−１３８結合は活性に
必要であるが、゛この活性は１−９８結合か破壊された
後も維持されると考えられている。本発明は不純物の起
源に関するいかなる特定の理論を解釈することをも意図
するものではないが、一般にＨｕＩＦＮ−ａＡの場合に
は＋２９−１３８結合はそのままで１−９８結合が切れ
ることにより“スローモノマー”が生成し、その分子量
に、ｋＪ）＝応じて活性が低かったりあるいは全く活性
がなかったりする一連のオリゴマーは、新しいジスルフ
ィド結合によりインターフェロン分子か相互に結合して
生じると考えられている。オリゴマーの存在はＨｕ　Ｉ
　Ｆ　Ｎ−ａＡの活性を阻害し、またスローモノマーは
、それ自身活性ではあるが免疫原性を有すると考えられ
ている。

従って天然型のものからこれら不純物を分離することが
強く望まれている。

従来生成物中のオリゴマーは、ゲル透過によって除去さ
れている。しかしながらこの方法は本発明方法はど回収
率が良くない（まかりか、より重大な欠点としてスロー
モノマーを除去することかできなかった。

本発明によれは、オリゴマーおよびスローモノマーの両
者を含まない天然蛋白質を高収率で得ることができる。

本発明はＨｕｌＦＮ−ａ製剤およヒＩ−１ｕ　ｌ　Ｆ　
Ｎと充分な配列相同性を示すことで特色づけられる各種
の白血球インターフェロン製剤から、スローモノマーお
よびオリゴマーを除去する方法に関する。

詳しくはＩ　Ｆ　Ｎ　−ａ　１−２０　ｍｙ／ｍｅを含
有するＩ）１５３〜５以下（約４．８）の緩衝溶液を２
８〜４０　”Ｃでインキュベートして精製する方法を提
供するものである。インキュベート時間は３０分〜２４
時時間である。インキュベートの結果、既に示した望ま
しくない物質が沈殿するので、これを遠心分離またはρ
過の如き通常の方法で除く。

第１図および第２図は、ＨｕＩＦＮ−α溶液に対する本
発明方法の適用前、および適用後の溶液を（Ａ）ＴＳＫ
−ＨＰＬＣおよび（Ｂ）非還元型５ＤＳ−ＰＡＧＥにか
け一濃度計で定量、分析した結果を表わす（Ａ　：　Ｔ
Ｓ　Ｋ　−ＨＰ　Ｌ　Ｃの溶出液の光学密度（０，Ｄ、
）（２１４ｎｍ）−Ｂ　：濃度計ニヨルトレース）。第
１図及び後述の第２図の（Ａ）および（Ｂ）において得
られたデータをそれぞれ表１および表２に示す。

第１図は温度３２°Ｃ−ＨｕｌＦＮ−αの濃度レベル４
．２　ｍｙ／ｍｅで本発明方法を適用した場合を示す。

図中、１はロツシュ製剤（Ｒｏｃｈｅ　Ｐｒｅｐ　）　
−２は上澄液、３はペレット−４はペレット洗浄、７は
分子ｈ１−基べ（を示す。

第２図は３７℃、１−１ｕ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−ａの濃度レ
ベル７．２ｍｇ／ｍｅ　で本発明を適用した場合を示す
。１〜４は第１図と同意義である。

へ 十 第３図は還元および非還元Ｓ　Ｄ　Ｓ　−１）　Ａ　Ｇ
　Ｅの比較を示す。図中Ａ−Ｄなる表示は種々のインキ
ュヘーション条件において非還元Ｓ　Ｄ　５−ＰＡＧ　
Ｅを、出発物質および上澄液と適用した場合を示す。

Ｉ・、は同し試料に還元型５ＤＳ−ＰＡＧＥを適用した
場合を示す。

図中、１，２．７は第１図と同意義であり、５はシエネ
ン５−り（Ｇｃｎｅｎｔｅｃｂ　）製剤、５′はジエネ
ンテク１＋−’−αＡ、５はＲｏｃｈｅ　ｌ　Ｆ　−ａ
　Ａ、　２−１．２−２．２−３はそれぞれ上澄ｉ＆（
Ｄ）−上澄液（Ｃ）、上澄液（Ｂ）を表わす。

第４図はゲル透過クロマトグラフィーにより１１ｕ　Ｉ
　ｌ・Ｎ−α製剤からオリゴマーを分離した場合を示す
。第４図（Ａ）において実線は−セフアクリル（Ｓｅｌ
市ａｃｒｙｌ　）　Ｓ　３００ゲルからの溶出フラクシ
ョンの２８０　ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を、点線
は同じく抗ウィルス活性（ＢＫ”）を示している。

ＣＢ）は蛋白質含有フラクションの染色した５ＤＳ−Ｐ
　ＡＧ　＋−を示している。ｌおよび７は第１図と同層
、ｌ−Ｃあり、８〜１４はそれぞれフラクション番号３
２，３４．３６．３８．４０．４２および４４を表わし
ている。（Ｃ）はゲルフラクション４２のＴ　Ｓ　Ｋ　
−１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃからの流出液の光学密度（ＯＤ２
１４）を示している。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動）は、分子１．１に応じて物質を
分析する電気泳動の一方法である。本発明の如く、Ｓ　
Ｄ　Ｓ　−１）　Ａ　Ｇ　Ｅは、例えばβ−メルカプト
エタノールあるいはジチオスレオトール（ＤＴＴ）の様
な還元剤の存在下より、むしろ非還元条件下で実施され
ることが多い。これら、または他の還元剤は、あらゆる
ジスルフィド結合を対応するスルフヒドリル基に還元し
てしまう。従って本明細也においては、β−メルカプト
エタン−ル等の、いかなる還元剤をも使用しないこの方
法を゛非還元型Ｓ　Ｉ）　Ｓ　−１）　Ａ　Ｇ　ｌ・、
“という。

このように区別することは、還元剤の影響下に５ＤＳ−
ＰＡＧＩ！、を実施すると、除去すべきいくつかの不純
物の存在を看過することになることがら−特に重要であ
る。実施例４により詳しく説明されているように、還元
剤が存在すると標本中のある種の不純物が変化して天然
のＩＦＮ−αと同位置に泳動する。非還元条件下に行っ
た場合のみ、これらの不純物の存在が明らかとなる。

・・”ｌ’　Ｓ　Ｋ　−１−１１）　Ｌ　Ｃ・は、大き
さに従って分離するクロマトグラフィーの一方法であっ
て、高圧下に分子篩を用いることを内容とする。アクロ
ニム（ａｃｒｏｎｙｍ　）は、市販品として入手できる
、■１１”ＬＣ（高速１反体クロマトグラフィー）に使
用されるゲルの商品名である。

ｆｌｕ　ｌ　ｔ’　Ｎ−αはその起源に係らず−ヒト白
血球インターフェロンを表わす。このインターフェロン
は、例えばヒト細胞あるいはＤＮＡ組み換え法の適用に
よりＩ−１ｕ　ｌ　ｌ’　Ｎ−αを発現するようトラン
スフェクトされた大腸菌から単離することかできる。ど
のような場合にも−１−１ｕｌＦＮ−αとは、天然型の
蛋白質およびインターフェロン内のアミノ酸配列を変え
ることのない工程で形成された上記蛋白質の再配列生成
物の両方を含む製剤を意味する。」二て述へたように、
今日、ＨｕｌＦＮ−αは高度に保存された蛋白質群とし
て存在していることが知られており、ＨｕｌＦＮ−αＡ
から１−１ｕｌＦＮ−αＫに至るまで、アルファベット
で表わされている。

本発明において−　”ＩＦＮ−α′とは一般に本発明方
法に係るＨｕＩＦＮ−αとの配列相同性を有する白血球
インターフェロンを意味する。ウシ白血球インターフェ
ロンはそのような相同性を有することが知られているが
、他の種属の白血球から得られたインターフェロンにつ
いては配列の確認が不充分である。しかしながら−今日
では、少くともあらゆる種属の哺乳類のＩＦＮ−αとｆ
−１ｕｌｌ’Ｎ−αとは相同性を有すると考えられてい
る。

“′天然ＩＦＮ−α”とは、細胞内で自然に生成された
物質と三次元的に実質的に同一であると同定された１Ｆ
Ｎ−αの群を意味する。非還元型５ｌ）Ｓ−ＰＡＧＥ分
析によると、天然１１ｕｌＦＮ−αは通常の方法で計算
したとき、１７，２００ＭＷに相当する帯に関連してい
る。天然１１・Ｎ−αは、時に゛′ソファ−トモノマー
”とも呼ばれる。これは、以下に定義する不純物質の１
つである６スローモノマー”との比較におけるＳ　Ｄ　
Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ内の泳動に基くものである。

゛スローモノマー゛とは、非還元型Ｓ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡ
ＧＥ内で異常な動きをするＩＦＮ−αを意味する。

即ち、ｌｌｕ　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−ａはＭＷ計算値１８，３
００　ダルトンの位置、天然のＨｕｌＦＮ−αに関する
帯のやや後方に泳動する。これは、多分ジスルフィド結
合の一方か破壊されたため、空間配置に変化を来した形
態のものであると考えられている。

”オリコマ−°とは部分的に重合したＩＦＮ−αを意味
する。このようなＩＦＮ−αの縮合生成物は、単ｆ、ｊ
、体の別々の分子間のジスルフィド結合に起因すると推
測される。オリゴマーには、二量体、三：１：体、四量
体−および高分子量の縮合体が含まれる。オリコマ−は
、非還元型５ＤＳ−ＰＡＧＥ内で、概略それらの分子量
に応じて泳動する。

°゛不純物“には、通常宿主細胞あるいはその周囲の媒
伯中に、ｌｌ’Ｎ−ａに付随して見い出される他の細胞
成分あるいは上に述へたオリゴマー類およびＩＦＮ−α
のスローモノマ一群が含まれる。本発明において゛′宿
主細胞・とは、適当な生物の白血球またはトランスフェ
クトされた細菌（これらに限定するものでないが）を包
含する全ての白血球インターフェロン生成培養を意味す
る。

本発明方法の出発物質である１ＦＮ−α製剤は、例えは
当該技術者周知の方法、例えば適当な抗体カラムに入れ
、次いて公知技術で濃縮することにより分離、調製され
る。その起源にかかわりなく、天然ＩＦＮ−αと同様に
スローモノマーおよび／またはオリゴマーを含有するあ
らゆる製剤が用いられる。本発明方法の好適な出発物質
は哺乳類のＩＦＮ−ａ−特にＨｕｌＦＮ−ａおよびつ’
７１１’Ｎ−ａである。特に好適なのは、ヒト白血球イ
ンターフェロンとして知られているものの内の１っであ
る１−１ｕ　Ｉ　Ｆ　Ｎ−ａ　Ａである。

本発明方法においては、１ＦＮ−α製剤を滴定によりｐ
ｔｌ　３から約４．８、好ましくは約３．５〜４．２に
調節する。製剤中の１１”Ｎ−αの濃Ｉｆｆ　（分離操
作で得られたもの）は、１　２０　ｍｙ／ｍｅ、好まし
くは５−１０　ｍｙ／ｍｅである。溶液中の蛋白質の特
性から起こり得る変性を防ぐため溶液のイオン強度を適
当なレベルに維持することが望ましい。従って、１１＝
’Ｎ−α溶液は酢酸アンモニウムあるいは塩化ナトリウ
ムのような適当な塩または塩類により適切なイオン強度
に保持する。許容し得るイオン強度の限界は明確に定ま
っていないが、明らかに許容し得る総塩類濃度の範囲は
約０．０１〜０．４Ｍ、好ましくは約０．１〜０．２Ｍ
である。望ましいｐ　ｌ−１値を充足する限り、あらゆ
る許容し得る塩を用いることかできる。この溶液を次い
で２８〜４０℃、４’、ｌｒに約３０〜３４°Ｃて３０
分〜２４時間、好ましくは１０〜１４時間、インキュベ
ートする。スローモノマーおよびオリゴマーを含む沈殿
が生じる。

この沈殿を遠心骨；４１［またはρ過、好ましくは遠心
分：耶して除去する。上澄液（またはρ液）には実ｒｊ
的に純粋な天然１１・’Ｎ−αが含まれている。

以下の実施例は本発明を例示するものであるが本発明を
制約するものではない。

実施例１　１１ｕｌｌ’Ｎ−αＡ製剤からのオリゴマー
オヨヒスローモノマーの除去 オリゴマー３３％およびスローモノマー１２．９％を含
有するＨｕＩＦＮ−’−αＡはＩ−１ｌ−１ｏｆｆ　Ｌ
ａ　ＲｏｃｈｅＩｎｃ　、から入手した（　Ｒｏｃｂｅ
　Ｐ′ｒｅｐ、　）。この製剤は、Ｗｅｔｚｅｌ　、　
ｅｔ　ａｌ　、、　Ｊ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅｓ
、　　１　：３８１（１９８１）に記載されているよう
に一水庖性口内炎ウイルスで攻撃されたｌ　ｌｅ　Ｌａ
およびＭＤＢＫ細胞における細胞変性作用（ＣＰＥ）抗
ウイルス分析法で分析した結果、１×１０８ｕ／■以上
の比活性を示した。

■−鳳ｕｌＦＮ−（ＺＡ調製剤、ｐｉ−１５，Ｑ、０．
１２Ｍ塩化ナトリウムに調節した２５ｍＭ酢酸アンモニ
ウム中の濃度が４．２　ｍｙ／ｍｅ　（ＯＤ　２　（３
Ｑ　ｎｔｎで１１１１１１定）のものである。この溶液
の５　ｍｌを酢酸で滴定しｐＨ４，０とし、時々攪拌し
ながら３２℃で１２時間インキュベートすると１／２時
間後に沈殿か認められた。

この懸濁液を１０．００　Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離
して上澄液を回収し一２回のペレット洗浄液と合わせた
（洗浄は２時間接触させて行なった）。

合わせた上澄液をいくつかの基阜に基き、出発物質と比
較した。結果を第１図に示した。この図で、’Ｉ’５Ｋ
−１１１’ＬＣはＨｕＩＦＮ−ａＡの単量体とオリコマ
−を分離するのに用いた（この方法はファースト七ツマ
−をスローモノマーから分離スるものではない。） １’　Ｓ　Ｋ　−Ｈｌ）　Ｌ　ＣはＡｌ　ｔｅＸ　ｕ　
−５ｐｂｅｒｏｇｅｌ　ＴＳＫ２０００ＳＷカラム（０
，７５Ｘ６０ｃｍ）を用いて行なった。蛋白質２〜１０
ｔｔ９を注入し、１）Ｉ−１５８（７）　０．２　Ｍり
ん酸カリウムを用いて流速０．５　ｍｅ　７分で溶離し
た。蛋白質を２１４　ｎｍにおける光学的濃度に基いて
検出した。カラムを次の分子量基賭物竹により目盛りつ
けした：アルドラーゼ１５８Ｉ（、Ｂ　Ｓ　Ａ　６７　
Ｋ、卵アルブミン４５に一キモトリブシノーケンＡ　２
５　Ｋ。

’ｌ’５Ｋ−Ｉｌｌ）ＬＣの結果を分析し、上澄液含有
物の９８．８％がモノマーであり、二り″Ｊ体は１．２
％にずきす−さらに高分子量のオリゴマーは認められｌ
ｘかった。

Ｊ１還几型Ｓ　ｌ）　Ｓ　−１’　ＡＧ　ＩＥ　ｊまＬ
ａｃｎｎｎｌ　ｉ　、　Ｎａ　ｔｕｒｃ　。

２７７　：６８０（１９７０）に記載の方法に従って行
い、Ｇｏｏ＋ｎａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ　　青染色シタ後し
−ｆ−４／Ｕ４ｔＣＬＫＢ２２０２ウルトラスキャンレ
ーサー淵度計（Ｉ−１，１）、　３３９０Ａ積分計を備
えた）〕で定沿し、９９．８％の天然モノマーおよび０
，２％のスローモノマーを検出したがオリゴマーは検出
されなかった。

Ｎｕ　ｌ　Ｆ　Ｎ−ａＡの収率（％）は−上澄欣中に測
定された総蛋白質量と出発物質中の総蛋白質ｉ１ｊの各
々に修正因子を適用して決定した。これらは−上に述べ
た様にして５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されたファース
ト七ツマ−に帰属し得る総蛋白質の％によって修正した
。総蛋白質は、溶液１　ｍｙ　／　ｍｅに対する消滅係
数（消光率）　（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎｃｏｃｆｆｉｃ
ｉｃｎｔ　）を１．０６と仮定して２８０旧１１におけ
る光学密度６＋１１定法により決定した。これらの蛋白
質分析の結果は、上澄液中の天然１１ｕｌｌ’Ｎ−ａＡ
の回収率が７３％であることを示した。

実施例２ ０ツシユの製剤（Ｒｏｃｈｅ　ｌ’ｔｃｐ　）　　の新
ｆｆＨ’（、ｆ、；試料を用い、インキュベーション／
沈殿に蛋白質１．８ｍｇを含有する試料７．２■／　ｍ
ｅを使用し温度３７℃て行なう以外は実施例１と同様に
操作した（１−１ｕＩＩ・Ｎ−αＡ濃度の変化について
は実施例３を参照）。第２図に示す結果から、上澄液中
に天然のｆｌｕ　１１’Ｎ−ａＡ　　９９．９％および
スローモノマーを不純物として０．１％含有することか
判る。しかしなから、天然１１ｕｌｌ・ヘーαＡの収率
は４３％にすきなかった。

実施例３　種々のインキュベーション条件の比較 インキュベート時間、ｐｌ−１−Ｈｕ　Ｉ　ｌｉ’Ｎ　
−ａ　Ａ　（７）濃度および温度の影響を実施例１の方
法を以下の様に改変して検討した（ここでもＲｏｃｈｅ
　Ｐｒｅｐを用いた：たたしいくつかの実験には、分析
の結果１１ｕ　Ｉ　ｌ’へ一αＡの含有量か８６％であ
るＧｅｎｅｎｔｅｃｈｌｌｕ　１　ｔ’　Ｎ　−ａ　Ａ
製剤（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｂ　Ｐｒｅｐ　）を用いたＸｌ
）ＩＩ変化は、酢酸滴定により所望のｐ　Ｈに調整して
行った。

ｆｌｕ　ｌ　ｌ’　Ｎ　−ａ　Ａのべ２度を変換する為
に、製剤を２倍に希釈し、２５．ｍＭ酢酸アンモニウム
で透析（］）Ｉ−１４で１２時間）した後、凍結乾燥し
、２５ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＩ−１４，０，０，１
Ｍ塩化ナトリウム）に溶解して望ましい濃度にした。ま
た−より低濃度を必要とする場合には一人手した溶７夜
をソノまま２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０，０，
１Ｍ塩化すｌ−ＩＪウム）で希釈した。各変数を変化さ
せ１２時間インキュベートした結果を以下【こ示す。

実施例４　還元型５ＤＳ−１）ＡＧＥとの比較通常の５
ＤＳ−ＰＡＧＥでオリゴマーおよびスローモノマー不純
物を検出できない理由は、おそらく還元剤として使用さ
れるβ−メルカプトエタノール等により、全ての結合が
同一の型（遊離のスルヒドリル基を有するモノマー）に
還元されるためである。

第３図は、Ｒｏｃｂｅ　ＰｒｅｐおよびＧｃｎｅｎｔｅ
ｃｂ　Ｐｒｃｐの両方について、還元および非還元条件
下にＳ　ｌ）　５−ＰＡＧＥを行なった場合の結果を表
わす。

還元型Ｓ　Ｄ　Ｓ　−１３Ａ　Ｇ　Ｉ！、は単量体に相
当する唯一つの帯を示しているか一非運元型Ｓ　Ｄ　Ｓ
　−１）　ＡＧＥは成分の混合物を示している。

実施例５　ゲル透過クロマトグラフィーとの比較 Ｒｏｃｈｅ　−Ｐ　ｒｃｐ　（４，２ｍｙ／ｍｅ　）　
０．２　ｍｅを、５０ｍＭ酢酸アンモニウムで平衡＜　
ｐＨ４）にした５ｃｐｈａｃｒｙｌＳ３００カラム（０
，７Ｘ２７礪）に入れ〜流速（リニアー）　５．２　ｍ
ｅ／ａｍ２時間で溶離した。

溶離形態および結果を第４図に示した。

１）ＡＩ）Ｔ　Ａは蛋白質の測定として２８０　ｎｍに
おける光学的濃度を測定した値に基く溶離形態を示す。

図中、点線部分はインターフェロン活性、おそらく大部
分かモノマーのＨｕＩＦＮ−αＡ（二ｉＩ″Ｌ体は単量
体の活性の約１５％を示す）の軌跡を表わすものである
。

Ｂは蛋白含有画分を非還元条件下に５ＤＳ−ＰＡＧＥに
適用し、出発物質と比較した結果を表わす。これから明
らかなように、オ”リボマーは初期の両分に濃縮されて
いるものの、どの両分も分離か不充分である。さイ、ス
ローモノマーとファーストモノマーとの比率が全両分に
ついて一定である。

Ｃは、単量体の１−１ｕｌＦＮ−αＡを顕著に含有する
第４２１１！Ｉ１分のＴ　Ｓ　Ｋ　−１−Ｉ　Ｌ　Ｐ　
Ｇ軌跡を示すもの、である。ここにも、認め得る量のオ
リゴマーの存在力）Ｊ忍められる。

第４図から明らかな如く、スローモノマーが全く分肉１
１されないはかりか、七ツマ−およびオリゴマーの両分
か小なり合い、明確な分離が妨げられることか判る。

【図面の簡単な説明】 第１図および第２図は本発明方法適用前後におけるｌ−
１ｕｌＦＮ−α溶液の分析結果を示すグラフおよびクロ
マトグラムであり、（Ａ）はＴＳＫ−ＩＩＩ）ＬＣ分析
、（Ｂ）は非還元Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ分析の
結果を示す・第！冒は還元型およ５非運元型５”。 ５−ＰＡＧＥ分析の比較を示す５１）Ｓ　−１）　Ａ　
Ｇ　Ｅのクロマトグラム、第４図はゲル透過クロマトグ
ラフィーによるＨｕｌＦＮ−α製剤からのオリゴマーの
分離を示すグラフおよびクロマトグラムである。 出願人　　ジエネンテク、インコーポレイテッド代理人
　　弁理士　青白　葆　ほか］名１ 図面の浄書：（内 え１１（２） （介） 容に変更なし） （分） Ｍ ■ イ凋 Ｍ トｉ　　　　　　　開１ｉ６　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　イ七瓜２３４１゜ 第２図ａ Ｍ ■ Ｍ ■ ○ 開☆右′　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　イ考リトー第４図勃 第４図Ｕ （分） 手続補正書（睦） １事件の表示 昭和５８年特許願第　２０５６９６　　　　号不純物の
除去法 ３袖正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国カリフオｌヒニア９４０８０、サ
ウス・サン・フランシスコ、ポイント・サン・ブルーフ
・ブールバード４６０番名称　ジエネンテク、インコー
ポレイテッド〆１代理人 ７　補正の内容：　別紙のとおり図面の浄書（内容に変
更ｋを提出致します。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ヒト白血球インターフェロンと高度な配列の相同
   性を有する白血球インターフェロン（ＩＦＮ−α）から
   オリゴマーおよびスローモノマーを除去する方法であっ
   て、 （ａ）　１〜２０　ｍｙ／ｍｅ　（７）　Ｉ　Ｆ　Ｎ　
   −ａを含有ｔ；Ｅ、Ｒ衝液をｐＨ３〜約４．８の間で一
   ３０分〜２４時間、２８〜４０℃においてインキュベー
   トシてオリゴマーおよびスローモノマーを沈殿させ、次
   いで（１））天然ＩＦＮ−αを回収する ことを特徴とする方法。 ２、　　ＰＩ−１を約３．５〜４．１に保持する第１項
   に記載の方法。 ３、　インキュベート時間が約１０〜１４時間である第
   １ｍに記載の方法。 ４、　インキュベート温度が３０〜３４℃である第１項
   に記載の方法。 ５、ＩＦＮ−ａの濃度が５〜１０　ｍｙ／ｍｅである第
   １項に記載の方法。 ６、オリゴマーおよびスローモノマーの沈殿を遠心分離
   によって除去する第１項に記載の方法。 ７、ＩＦＮ−αが哺乳動物のＩＦＮ−αである第１項に
   記載の方法。 ８、　ＩＦＮ−αがヒ）ＩＦＮ−αである第１項に記載
   の方法。 ９、１ＦＮ−αがヒトＩＦＮ−αＡである第１項に記載
   の方法。 ＩＱ、ＩＦＮ−αがウシＩＦＮ−αである第１項に記載
   の方法。 １１、白血球インターフェロン（ＩＩ；Ｎ−α）からオ
   リゴマーおよびスローモノマーを除去する方法であって
   〜 （ａ）　５〜１０　ｍｙ／ｍｅ　（７）　Ｉ　ＦＮ　−
   ａ　金含有ｔ　るＦ　衝Ｍをｐ　ｌ−Ｉ約３．”　５〜
   ４．１で約１０〜１４時間−約３０〜３４℃でインキュ
   ベートしてオリゴマーおよびスローモノマーを沈殿させ
   一次いて （ｂ）天然のＩＩ”Ｎ−αを回収する ことを特徴とする方法。 １２、Ｉｌ’Ｎ−ａが哺乳動物（ｙ）　Ｉ　Ｆ　Ｎ　−
   ａである第１１項に記載の方法。 １３、ＩＩ・Ｎ〜αがヒトＩＦＮ−αである第１１項に
   記載の方法。 １４、　　目＝’Ｎ−αかヒトＩＦＮ−αＡである第１
   １項に記載の方法。 １５、　　Ｉ　Ｆ’Ｎ−αかウシＩＦＮ−αである第１
   １項に記載の方法。 １６、第１項に記載の方法で調製される実質的に不純物
   を含有しない天然ＩＦＮ−α。 １７、　第１１項に記載の方法で調製される実質的に不
   純物を含有しない天然ＩＦＮ−α。