JPH04360677A

JPH04360677A - 細胞浮遊培養法

Info

Publication number: JPH04360677A
Application number: JP3134757A
Authority: JP
Inventors: Takumi Ikeda; 巧池田; Mitsuyuki Katsu; 進勝圓; Ryohei Yamamoto; 良平山本; Toyokazu Nishino; 豊和西野
Original assignee: Kurabo Industries Ltd; Kurashiki Spinning Co Ltd
Current assignee: Kurabo Industries Ltd; Kurashiki Spinning Co Ltd
Priority date: 1991-06-06
Filing date: 1991-06-06
Publication date: 1992-12-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、マイクロキャリアー
を使用する細胞浮遊培養法に関する。

【０００２】

【従来の技術】バイオテクノロジー等の分野においては
、生理活性物質等の有用な物質を産生する動物細胞を大
量に培養する技術が要請されている。動物細胞は浮遊性
細胞と接着性細胞に大別され、前者は培地中に懸濁した
状態で増殖するために、その大量培養は比較的容易にお
こなうことが可能であるが、後者は培養中に器壁等に接
着し、単層で増殖するために、大量培養をおこなうには
培養系の表面積を大きくする必要があり、従来から種々
の提案がされている。

【０００３】例えば、スパイラルフィルム法、マルチプ
レート法、ホロファイバー法およびマイクロキャリアー
法等が知られているが、なかでも、マイクロキャリアー
法、即ち、培養容器中に微粒子（マイクロキャリアー）
を多量に加え、培地と共に緩やかに撹拌して該微粒子を
浮遊させ、被培養細胞を微粒子表面に接着させて培養す
る方法は、培養容積に対する表面積が大きく、接着性細
胞の大量培養法としては好適なものである。

【０００４】この場合、マイクロキャリアーとしては、
粒径が１００μｍ以上の球状粒子が使用されている。こ
の理由は、接着性細胞は単層として増殖するために、該
細胞の径の１０倍以上の曲率を有する球状キャリアーを
用いて該細胞の付着増殖を効率的におこなわせるためで
ある。このため、従来のマイクロキャリアー法において
は、さらに高密度の培養を可能にするためにキャリアー
の表面積を増大させることには自ずから限度があるだけ
でなく、キャリアーと細胞の重量差に起因して、キャリ
アー表面上での細胞の接着増殖が不均一になる等の問題
があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】この発明は、従来のマ
イクロキャリアー法の上記問題点を解決し、培養容器内
での高密度で均一な細胞浮遊培養を可能にするためにな
されたものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ちこの発明は、マイク
ロキャリアーを使用する細胞浮遊培養法において、粒径
８０μｍ以下のマイクロキャリアーを用いることを特徴
とする細胞浮遊培養法に関する。

【０００７】本発明に使用するマイクロキャリアーの材
質は特に限定的ではなく、従来から細胞浮遊培養法にお
いてマイクロキャリアーとして用いられているもの、例
えば、各種の合成ポリマー（アクリル系ポリマー、ポリ
スチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリウレタン等）、無機物（ガラス、シリカ、
アルミナ等）、天然ポリマー（セルロース、アガロース
等）、等を適宜利用すればよいが、特に好適なポリマー
は、（ｉ）親水性が大きい、（ｉｉ）十分な機械的強度
を有する、（ｉｉｉ）適度な柔軟性を有する、（ｉｖ）
塩濃度の変化による体積変化がない、（ｖ）水酸基等の
活性な反応基を有するので、粒子表面の多様な化学修飾
が可能である、等の点で、特開平１−９８６０６号公報
に開示されているポリマー、即ち、次式（Ｉ）：

【数１】（式中、Ｒは水素原子またはメチル基を示し、ｎは０〜
３０の数を示し、ｍは０〜３０の数を示す（但し、ｎ＋
ｍ≧１））で表わされるトリス（２−メタクリロイルオ
キシエチル）リン酸を重合成分の少なくとも一部として
含むモノマー成分の重合によって得られるポリマーであ
る。

【０００８】本発明の特徴は、従来のマイクロキャリア
ー法においては常識とされていた１００μｍ以上の粒径
を、８０μｍ以下にすることによって、従来法に比べて
、より高密度で均一な細胞浮遊培養を可能にすることで
ある。即ち、マイクロキャリアーの粒径が８０μｍより
も大きくなると、接着性細胞の大量培養を効率的におこ
なうのに十分な高密度培養が困難になるだけでなく、キ
ャリアーと被培養細胞の重量差が大きくなり、キャリア
ー表面上での細胞の接着増殖が不均一化するようになる
。特に好適な粒径は約２０〜５０μｍである。

【０００９】粒径８０μｍ以下のマイクロキャリアーは
、そのままの状態で細胞浮遊培養に使用してもよいが、
被培養細胞の種類や培養条件およびマイクロキャリアー
の材質等に応じて、該キャリアー表面を適当な被覆剤、
例えば、コラーゲン、ファイブロネクチン、ゼラチンま
たはケラチン等の蛋白質を用いて被覆してもよく、活性
な反応基を有する前記ポリマー等の場合には、該キャリ
アー表面を適当な化学修飾処理、例えば、エポキシ化、
アミノ化、ホルミル化またはカルボキシル化等の処理に
付してもよい。

【００１０】上記のマイクロキャリアーは通常は、充分
に水洗した後、適当なバッファー液で洗浄し、次いで滅
菌処理に付し、さらに、使用する培地で洗浄した後、細
胞浮遊培養に供される。該マイクロキャリアーは培地、
例えば、ＭＥＭ培地やＤＭＥ培地等の培養液中において
、穏やかな撹拌によって被培養細胞と共に浮遊する。この場合、マイクロキャリアーの粒径が非常に小さいた
めに、細胞の増殖が高密度でおこなわれ、また、該キャ
リアーは軽量であるために、通常の穏やかな撹拌条件下
においては、浮遊細胞よりも優先的に沈降することはな
く、細胞の接着増殖は均一におこなわれる。

【００１１】従来のマイクロキャリアー法においては、
接着性細胞は単層として増殖するという理由から、粒径
１００μｍ以上のキャリアーを使用することが常識とさ
れ、粒径が１００μｍよりも小さなキャリアーを利用す
るという技術的思想は全く考慮されていなかった。顕微
鏡的観察によれば、粒径が１００μｍ以上のキャリアー
を用いる細胞浮遊培養の場合には、ほとんど独立的に浮
遊した状態の個々のキャリアー表面上に細胞が単に局部
的もしくは部分的に接着して増殖するのに対し、本発明
の場合には、ほとんど全表面に細胞が接着した個々のキ
ャリアーが、該接着細胞を介在させて複数個、特に十数
個〜数十個以上集合したクラスターを形成し、該接着細
胞の効率的な増殖を促進することが判明した。

【００１２】

【実施例】以下、本発明を実施例によって説明する。実施例１（マイクロキャリアーの調製）（ｉ）　　還流
冷却器、撹拌器、サーモスタットを取り付けた２リット
ルの四口セパラブルフラスコに、トリス（２−メタクリ
ロイルオキシエチル）リン酸１０ｇｒ、エチレングリコ
ールジメタクリレート９０ｇｒ、２−ヒドロキシエチル
メタクリレート１００ｇｒ、１−ブタノール２８０ｇｒ
、α，α’−アゾイソブチロニトリル４ｇｒを加え、続
いてヒドロキシエチルセルロース６ｇｒ、塩化ナトリウ
ム２５０ｇｒを溶解させた蒸留水７５０ｇｒを加え、３
３５ｒｐｍの回転数で撹拌を行いながら６０℃で１時間
、さらに７５℃で８時間加熱撹拌した。生成した粒子を
十分に水洗し、さらにメタノール洗浄、水洗後、湿式分
級を行って、２０〜３８、３８〜５３、５３〜８０μｍ
の粒子を得た。

【００１３】（ｉｉ）　　５０ｍｌの三角フラスコに、
前記（ｉ）で得た合成高分子粒子５ｗｅｔｇｒ、５Ｎ水
酸化ナトリウム水溶液８ｍｌ、エピクロロヒドリン６ｍ
ｌを加え、恒温振盪器で６０℃、１時間振盪した後、粒
子を十分に水洗し、エポキシ基導入量の定量を行い、２
７７μｍｏｌ／ｄｒｙｇｒのエポキシ基が導入されたエ
ポキシ活性化粒子を得た。

【００１４】（ｉｉｉ）　　５０ｍｌの三角フラスコに
、前記（ｉｉ）で得たエポキシ活性化粒子５ｗｅｔｇｒ
、アンモニア水１０ｍｌを加え、恒温振盪器で４０℃、
９０分間振盪した後、粒子を十分に水洗し、アミノ活性
化粒子を得た。

【００１５】（ｉｖ）　　５０ｍｌの三角フラスコに、
前記（ｉｉｉ）で得たアミノ活性化粒子５ｗｅｔｇｒ、
２５％グルタールアルデヒド水溶液７．５ｍｌ、水素化
ホウ素シアノナトリウム０．３ｇｒを加え、恒温振盪器
で４０℃、２時間振盪した後、粒子を十分に洗浄し、ホ
ルミル活性化粒子を得た。

【００１６】（ｖ）　　５０ｍｌのトールビーカーに、
ｐＨメーターを備え付け、前記（ｉｉｉ）で得たアミノ
活性化粒子５ｗｅｔｇｒ、０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶
液１０ｍｌを加え、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で粒子
の懸濁液のｐＨを６付近に保ちながら、無水こはく酸０
．６ｇｒを少しずつ加え、ゆっくり撹拌させた。すべて
無水こはく酸を加えた後、恒温振盪器で室温、５時間ゆ
っくり振盪した後、粒子を十分に水洗し、カルボキシル
活性化粒子を得た。

【００１７】（ｖｉ）　　（ａ）羊毛１００ｇに３５％
過酸化水素水５００ｍｌを加え、アンモニア水を用いて
ｐＨを８．３に調製した。これを室温で１時間放置し、
羊毛が可溶化されたのを確認後、酢酸でｐＨを下げた。この溶液にアルコールを加え一晩放置した。次いで、上
清を捨て、沈澱として回収された羊毛タンパク質をアル
コールで更に洗浄した。最後にアセトンで洗浄し風乾し
た。この操作により約７０ｇの極淡黄色、無味無臭の粉
末（羊毛の可溶化因子）を得た。（ｂ）前記（ａ）で調製した羊毛の可溶化因子（ケラチ
ン）を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２ｍｌに溶解して５
％水溶液とし、さらにｐＨを１０に調製して、エポキシ
活性化粒子１ｗｅｔｍｌを加え、恒温振盪器で４０℃、
２４時間振盪した後、粒子を十分に水洗した。ケラチン
の固定化量は固定化終了後のケラチン溶液上清の吸光度
を測定し、あらかじめ求めた検量線よりケラチン量を算
出した後、使用したケラチン総量から差し引いて求めた
。その結果、３５ｍｇ／ｗｅｔｍｌのケラチンが化学的
に固定化された粒子を得た。

【００１８】（ｖｉｉ）　　前記（ｖｉ）（ａ）で調製
した羊毛の可溶化因子（ケラチン）をｐＨ６に調製した
０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む純水２ｍｌに溶解して５
％水溶液を調製し、アミノ活性化粒子１ｗｅｔｍｌ、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩７５ｍｇを加え、恒温振盪器で２５℃、
２４時間振盪した後、粒子を十分に水洗した。上記方法
でケラチンの固定化量を求めた結果、５４ｍｇ／ｗｅｔ
ｍｌのケラチンが化学的に固定化された粒子を得た。

【００１９】（ｖｉｉｉ）　　前記（ｖｉ）（ａ）で得
た羊毛の可溶化因子（ケラチン）をｐＨ７に調製した０
．１Ｍリン酸バッファー２ｍｌに溶解して５％水溶液を
調製し、ホルミル活性化粒子１ｗｅｔｍｌ、水素化シア
ノホウ素ナトリウム７５ｍｇを加え、恒温振盪器で２５
℃、２４時間振盪した後、粒子を十分に水洗した。前記
（ｖｉ）（ｂ）の方法でケラチンの固定化量を求めた結
果、４１ｍｇ／ｗｅｔｍｌのケラチンが化学的に固定化
された粒子を得た。

【００２０】（ｉｘ）　　前記（ｖｉ）（ａ）で得た羊
毛の可溶化因子（ケラチン）をｐＨ６に調製した０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む純水２ｍｌに溶解して５％水溶
液を調製し、カルボキシル活性化粒子１ｗｅｔｍｌ、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩７５ｍｇを加え、恒温振盪器で２５℃、
２４時間振盪した後、粒子を十分に水洗した。前記（ｖ
ｉ）（ｂ）の方法でケラチンの固定化量を求めた結果、
４１ｍｇ／ｗｅｔｍｌのケラチンが化学的に固定化され
た粒子を得た。

【００２１】（ｘ）　　５０ｍｌフラスコに、前記（ｉ
）で得た合成高分子粒子５ｗｅｔｇｒ、５Ｎ水酸化ナト
リウム水溶液５ｍｌ、４Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍｌ
、塩酸２−ジエチルアミノエチルクロリド２．５ｇｒを
加え、恒温振盪器で９０℃、４０分振盪した後、粒子を
十分に水洗してジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基が
導入されたＤＥＡＥ陰イオン交換体粒子を得た。次いで
、前記（ｖｉ）（ａ）で得た羊毛の可溶化因子（ケラチ
ン）をｐＨ８に調製した０．０１Ｍトリス−塩酸バッフ
ァー４ｍｌに溶解して１０％水溶液を調製し、ＤＥＡＥ
陰イオン交換体粒子１ｗｅｔｍｌを加え、恒温振盪器で
２５℃、２４時間振盪した後、粒子を十分に水洗した。前記（ｖｉ）（ｂ）の方法でケラチンの吸着量を求めた
結果、１２９ｍｇ／ｗｅｔｍｌのケラチンが物理的に吸
着された粒子を得た。

【００２２】実施例２（細胞浮遊培養）上記実施例１に
おいて調製したマイクロキャリアーのうち、ケラチンを
用いて被覆した微粒子を用いて各種細胞の浮遊培養をお
こなった。（ｉ）マウス繊維芽細胞株３Ｔ３の培養それぞれの細胞
培養溶担体を十分に水洗した後、ＰＢＳバッファーで３
回洗浄し、オートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）を
行った。次いで、ＭＥＭ培地（牛胎児血清１０％を含む
）で５回繰り返し洗浄し、Ｔ−２５培養フラスコに０．
１ｗｅｔｍｌを加えた。さらに、Ｔ−２５培養フラスコ
に３Ｔ３細胞を１．０〜２．０×１０５個加え、最終的
にＴ−２５培養用フラスコの培地容量が２ｍｌになるよ
うに培地を追加し、３７℃に設定したＣＯ２インキュベ
ーター内で細胞培養を行った。この間、３０分〜１時間
ごとにＴ−２５培養用フラスコを軽く振った。

【００２３】（ｉｉ）ヒトニューロブラストーマ細胞株
ＳＫ−Ｎ−ＭＣの培養上記（ｉ）と同様の方法でヒトニューロブラストーマ細
胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣの培養を行った。培地はＤＭＥ（７
％牛胎児血清を含む）を用いた。

【００２４】（ｉｉｉ）ヒトグリオブラストーマ細胞株
Ｕ２５１−ＭＧの培養上記（ｉ）と同様の方法でヒトニューロブラストーマ細
胞株Ｕ２５１−ＭＧの培養を行った。培地はＤＭＥ（７
％牛胎児血清を含む）を用いた。

【００２５】（ｉｖ）ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２の培養
上記（ｉ）と同様の方法でヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２の
培養を行った。培地はＭＥＭ（５％牛胎児血清を含む）

【００２６】（ｖ）ラット正常表皮細胞の培養上記（ｉ
）と同様の方法でラット正常表皮細胞の培養を行った。培地はＫＧＭ（倉敷紡績（株）製）を用いた。

【００２７】（ｖｉ）ラット肝実質細胞の培養上記（ｉ
）と同様の方法で肝実質細胞の培養を行った。培地はＷ
Ｅ（１０％血清を含む）を用いた。

【００２８】上記の細胞浮遊培養（ｉ）〜（ｖｉ）にお
いて、光学顕微鏡で細胞の接着、増殖状態を観察したと
ころ、１時間後にはすべての細胞培養用担体に細胞が接
着し、３時間後には、細胞と粒子が複数個の細胞接着体
を形成し、さらに２４時間後には細胞の増殖が観察され
た。この中でアミノ活性化担体、ホルミル活性化担体、
ＤＥＡＥ陰イオン交換担体にケラチンをコーティングし
た細胞培養用担体を用いた場合、細胞の接着、増殖が特
に良好であった。また、粒子径は、２０〜３８、３８〜
５３μｍに分級した場合に細胞と粒子のクラスター形成
が顕著に観察された。

【００２９】

【発明の効果】発明による細胞浮遊培養法によれば、従
来法に比べてより高密度で均一な細胞浮遊培養が可能と
なる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　マイクロキャリアーを使用する細胞浮
遊培養法において、粒径８０μｍ以下のマイクロキャリ
アーを用いることを特徴とする細胞浮遊培養法。
【請求項２】　　マイクロキャリアーが、トリス（２−
メタクリロイルオキシエチル）リン酸を重合成分の少な
くとも一部として含むモノマー成分の重合によって得ら
れるポリマー微粒子である請求項１記載の細胞浮遊培養
法。
【請求項３】　　マイクロキャリアーが、蛋白質で被覆
したマイクロキャリアーである請求項１または２記載の
細胞浮遊培養法。
【請求項４】　　蛋白質がコラーゲン、ファイブロネク
チン、ゼラチンまたはケラチンである請求項３記載の細
胞浮遊培養法。