JPH0638730A - 動物細胞培養用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 動物細胞の成長にとって適切な環境を損なう
ことなく、高密度に細胞を固定化し培養出来る動物細胞
培養用担体の開発に関するものである。 【構成】 セルロース製連続発泡体に陽イオン重合体ポ
リエチレンイミンを結合させることを特徴とし、更に連
続発泡体の粒子径，平均孔径，比表面積，真比重，見掛
密度に就いて最適範囲を数値的に限定したものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は動物細胞を培養するため
に用いられる担体に関するものである。動物細胞を大量
培養する場合、出来るだけ表面積の大きな担体に細胞を
固定化させて高密度培養するのが一般的であるが、本発
明は細胞の成長にとって適切な環境を損なうことなく、
高密度に細胞を固定化し培養出来る動物細胞培養用担体
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】細胞培養を実施する場合、殆どの動物細
胞は固体表面に付着させないと増殖させることが出来な
い。そのために、培養スケールの大きさに係わらず何等
かの固体表面を用意する必要が生じる。特に細胞の大量
培養に於いては、その生産性の向上のために凡ゆる方法
を用いて培養容積当りの表面積を大きくする努力が払わ
れている。之等の方法の中で、現在最も一般的なものが
マイクロキャリアー培養法である。この方法はマイクロ
キャリアーという比較的表面積の大きな担体を培養液中
で懸濁させて使用することにより、培養液体積当たりの
培養面積を最も大きく採ることが出来る方法の一つであ
る。

【０００３】マイクロキャリアーは多糖類やポリスチレ
ンなどのポリマーを粒子径100〜300μmのビーズ状に
し、そのビーズ表面に細胞を固定させる動物細胞培養用
担体である。更にマイクロキャリアーは細胞の付着性を
高める為に、コラーゲンで担体表面をコーティングした
り、化学的合成により正の電荷を持たせる等の処理をし
て造られている。前者のコラーゲン型担体が天然物であ
るコラーゲンにより高い生物親和性を示すというメリッ
トを持つのに対し、後者の電荷型担体はコラーゲン型担
体では固定化出来ない浮遊性細胞をも固定化出来る点
や、プロテアーゼ等の酵素を用いて細胞を回収した後も
担体の繰り返し使用が出来るという利点がある。

【０００４】それぞれ目的に応じた使い分けがなされて
いる。この電荷型担体はジエチルアミノエチル基に代表
される３級アミノ基若しくは４級アミノ基をカチオン基
として担体に導入して造られており、主な商品としてフ
ァルマシア（Pharmacia）社製のサイトデックス（Cytod
ex１，Cytodex２）などがある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】大量に細胞を培養する
場合、大きな比表面積を持つマイクロキャリアーを培養
用担体とするのが最も一般的ではあるが、マイクロキャ
リアーの比表面積でも未だ充分とは言えず、動物細胞を
扱う各産業界で更に高密度の培養が可能になる担体の開
発が待望されている。更に、マイクロキャリアーを激し
く流動する培養液中で使用したり、培養液中に多くのマ
イクロキャリアーを充填し過ぎたりすると、担体同士の
衝突の頻度と衝撃が大きくなるので、固定化した細胞が
損傷を受け生存出来ない状態になる。之等の問題はマイ
クロキャリアーの場合、固定化に寄与するのは担体表面
のみで担体内部は固定化に寄与していない事に起因して
いる。

【０００６】一方、細胞付着性を高める目的でマイクロ
キャリアーに導入されているカチオン基は３級或いは４
級アミノ基の単量体または２量体が結合した状態である
ので、低分子の直鎖が担体から伸びた状態となってい
る。よって一度結合部位が何等かの損傷を受けて切断さ
れるとカチオン基が遊離し細胞の成育に悪影響を与える
ことがある。またカチオン基となるアミノ基は化学合成
的手法により導入せざるを得ない為、そのマイクロキャ
リアー中に占める相対量が多くなると細胞毒性が現れ始
めるため、導入出来る電荷量にも限界がある。更に担体
とカチオン基を結合している分子鎖は非常に短いので電
荷は担体素材表面にしか分布しておらず、細胞を担体に
固定化させるのに必要な吸着空間が担体上のみに限定さ
れて了う。また之等のアミノ基は塩基性が強いので、使
用するには何度も緩衝液等で置換して培養液に最適であ
る中性付近のpHに調整しなければならないという操作上
不都合な問題もある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記の問題点を解決する
ために本発明者等は動物細胞培養用担体を構成する素材
とカチオン基の２点に就いて改良を試み、本発明を完成
するに至った。

【０００８】本発明の担体の素材にはセルロースの連続
発泡体を用いる。この発泡体は木材から造った高純度パ
ルプを化学処理したビスコースに少量の補強材と気孔を
形造る結晶物を加えて混合し金型に注入の上、加熱後、
冷却して凝固することや或いはこの混合物を凝固液中へ
滴下することによりビーズ状に成型することなどにより
造られる。セルロースの表面は強い親水性を示すため、
水系で用いる限り支持体表面は水溶液と同様に振る舞う
ことが出来、細胞との親和性が良い。また細胞に対する
毒性は全く無い。

【０００９】数多くの細孔が連続して繋がっている連続
発泡体は培養液等を担体内部に容易に通すため、この細
孔の孔径を0.1〜1.68mmのサイズにする事により培養液
中の栄養源や酸素を速やかに供給出来る。一方、細胞の
出した老廃物等も速やかに除去出来るので担体表面だけ
ではなく担体内全てに於いて細胞が成育可能となる。こ
の特殊な構造により従来の表面にしか付着させることが
出来なかったタイプのマイクロキャリアーに比べ約10倍
の比表面積を持たせることが出来、高密度な細胞の固定
化が実現を可能とした。

【００１０】また、このスポンジ状の連続発泡構造は固
定化された細胞を担体内部に保護した上で衝突の衝撃を
吸収するので、培養液の流動による担体同士の衝突によ
って細胞がダメージを受けることが無い。同様に、スピ
ンナーフラスコ等の培養器で生ずる大きな剪断力からも
細胞を保護するので、担体を分散させるに充分な流速に
なるまで回転数を上げることが出来る。この様な効果に
より通常の担体に比べ高い充填率を採ることが可能にな
る。

【００１１】本発明がカチオン基として導入する物質に
はポリエチレンイミン（１）を用いる。 {-C₂H₄-N(-C₂H₄-NH₂)-C₂H₄-NH-} n （１）

【００１２】ポリエチレンイミンは酸触媒の存在下で重
合させて得られ、その構造は高度に枝分かれした樹枝状
構造を有し、透明で粘稠な水溶性ポリマーである。ポリ
エチレンイミンを本発明のカチオン基に採用するのは、
以下の特徴により細胞の付着性を向上させる事と、合成
物であるカチオン基が与える細胞への悪影響を最小限に
抑える事による。即ち天然物ではない導入カチオン基は
可能な限り少量にするのが好ましいが、ポリエチレンイ
ミンは現存する高分子素材の中で最もカチオン化密度が
高いので最小の導入量で細胞を付着させる能力があり、
細胞付着能が大きく且つ細胞毒性の小さい動物細胞培養
用担体と言える。

【００１３】また官能基となるカチオン分子が直鎖の場
合、損傷を受けて分子鎖が切断されると担体と結合して
いない方の一端が培養液中へ溶出して了うが、枝分かれ
構造を持つポリエチレンイミン分子は複数の末端基それ
ぞれが担体に結合しているので遊離し難い構造となって
いる。また低分子の官能基の場合、担体素材表面にしか
荷電基が存在出来ないのに対し、高分子のポリエチレン
イミンは担体素材表面のみならず担体から或る程度離れ
た空間にも存在出来るので、吸着効率が良くなり、結果
として細胞付着能の向上に繋がる。

【００１４】

【実施例】以下に、本発明に依る動物細胞培養用担体の
１例として実施例の若干を示すが、本発明は之等の実施
例に限定されるものではない。

【００１５】実施例１ マーセル化したセルロース製連続発泡体に、エピクロロ
ヒドリンを介してポリエチレンイミンを共有結合させ動
物細胞培養用担体とした。ポリエチレンイミンには分子
量10,000のものを用い、セルロース製連続発泡体には細
胞培養に適した大きさである一辺の長さが１mmのキュー
ビック状に裁断したものを用いた。（酒伊エンジニヤリ
ング製）

【００１６】実施例２ マーセル化したセルロース連続発泡体に、エピクロロヒ
ドリンを介してポリエチレンイミンを共有結合させ動物
細胞培養用担体とした。ポリエチレンイミンには分子量
1,800のものを用い、セルロースの連続発泡体は実施例
１と同様な大きさに裁断した物を用いた。

【００１７】実施例３ マーセル化したセルロース連続発泡体をモノクロロ酢酸
と反応させてカルボキシメチルセルロースとし、それの
カルボキシル基とポリエチレンイミンのアミノ基とを縮
合させて酸アミド結合させ動物細胞培養用担体とした。
ポリエチレンイミンには分子量10,000のものを用い、セ
ルロースの連続発泡体は実施例１と同様な大きさに裁断
した物を用いた。

【００１８】実施例４ マーセル化したセルロース連続発泡体をモノクロロ酢酸
と反応させてカルボキシメチルセルロースとし、静電的
引力によりポリエチレンイミンを結合させて動物細胞培
養用担体とした。ポリエチレンイミンには分子量70,000
のものを用い、セルロースの連続発泡体は実施例１と同
様な大きさに裁断した物を用いた。

【００１９】実施例５ セルロース連続発泡体を一辺の長さが３mmのキュービッ
ク状に裁断し、実施例１と同様な方法で動物細胞培養用
担体とした。

【００２０】比較例１ 架橋デキストランビーズの表面にN,N,N-トリメチル-2-
ヒドロキシ-アミノプロピル基を導入したファルマシア
製サイトデックス（Cytodex２）を動物細胞培養用担体
とした。

【００２１】比較例２ 架橋デキストランビーズの表面をジエチルアミノエチル
基の２量体を導入したファイファー アンド ランゲン
（Pfeifer&Langen）社製ドーマセル（Dormacel１）を動
物細胞培養用担体とした。

【００２２】具体的実施例 実施例１〜５及び比較例１〜２を動物細胞培養用担体と
して細胞培養を行い、細胞増殖が定常状態に達した時の
各担体に於ける固定化生細胞数と細胞が生産する有用物
質の濃度を測定した。

【００２３】細胞数は担体をトリプシン処理した後、血
球計算盤で測定した。培地には極東製薬社製のE-RDF培
地にインスリン、エタノールアミン、トランスフェリ
ン、セレニウムなどの細胞増殖を促す物質を添加した物
を用いた。固定化は繊維芽細胞及び浮遊性細胞の２つを
それぞれの担体に対して試みた。繊維芽細胞にはヒト・
エリスロポエチン（以下EPOと記載）遺伝子を組み込ん
だマウスL929株を、浮遊性細胞には抗体を生産するマウ
スハイブリドーマ16-3F株を用いた。

【００２４】培養はペトリ皿での静置培養と、直接気泡
通気を伴う横型内筒回転型バイオリアクター（酒伊エン
ジニヤリング製）による連続培養の２法で行った。バイ
オリアクターでの培養の場合、担体の充填率は培養液の
体積に対して15％とした。実施例結果 下記の表の通り、本発明の担体は一般の担体に比べて高
密度の細胞固定化と極めて高い物質生産性を実現してい
る。

【００２５】

【００２６】

【００２７】

【発明の効果】以上説明した様に本発明の動物細胞培養
用担体は動物細胞に最適のカチオン基を保有しているの
で、高密度の固定化が実現出来る。更に、本発明の担体
の特殊な形状が物理的衝撃から細胞を守り、細胞周辺の
培地等を速やかに代謝するので大量培養時の過酷な条件
下でも培養が可能になり、培養細胞を利用する各産業は
目的に応じた種々の培養法にこの担体を利用出来る様に
なる利点を有している。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セルロース製の連続発泡体に陽イオン重
   合体ポリエチレンイミンを結合させた動物細胞培養用担
   体。
2. 【請求項２】 連続発泡体の膨潤時の粒子径が0.5mm〜
   5.0mm，平均孔径が0.1〜1.68，比表面積が1.0〜10.0m²
   ／ｇ，真比重が1.4〜1.6ｇ／cm³，見掛密度が0.03〜0.0
   4ｇ／cm³の３次元網目構造を持つ連続発泡セルロースで
   ある請求項１記載の動物細胞培養用担体。