JPH04360687A - ウシの雄特異的ｄｎａおよびウシ雌雄の判別方法 - Google Patents
ウシの雄特異的ｄｎａおよびウシ雌雄の判別方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウシの雄特異的ＤＮＡ
および該ＤＮＡをプローブとして用いるウシ雌雄の判別
方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】近年、胎児または胚の性別判定は、重要
な課題となっている。特に、胎児移植などの生殖生物学
分野で重要となりつつある。例えば、乳牛及び食肉業の
分野だけでも、１９８５年にはおよそ５０，０００例の
胎児移植が報告されている。胎児を母体に移植する前に
簡単にその性別の判定ができれば、雌の子孫を増すこと
が可能となり、乳牛業において極めて有利となる。また
、胎児の性別が簡単に判定できれば、乳を多く出すこと
ができるとか子供を多く生むことができるなどの望まし
い特質を持った子孫を選択することが可能となる。 【０００３】性別（雄もしくは雌）が性染色体によって
決定されるということは従来より広く知られている。哺
乳動物において、Ｙ染色体上に存在する遺伝子が雄とし
ての特徴形成の原因となるので、個々の哺乳動物の性別
は、ある特定のＤＮＡ配列をそのゲノムが含んでいるか
否かに依存することになる。従って、ＤＮＡ中のＹ染色
体特異的遺伝子を分析することによって雌雄の判別をす
ることができる。あるいは、遺伝子的に関連した配列、
具体的にはＹ染色体と関連した配列を分析することによ
っても判定することができる。 【０００４】従来より、ＤＮＡによる雌雄判別の方法と
しては種々の報告がある。例えばヒトの男性ＤＮＡと優
先的にハイブリダイズするＤＮＡ配列は多くの研究者に
よって同定されている（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ１９１， １１８９−１１９０ （１９
７６）， Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔａｌ， Ｎａｔｕｒｅ
３０３， ８３１ （１９８３））。しかし、これらの
ＤＮＡ配列がヒト以外の他の種、例えばウシのＤＮＡ配
列とハイブリダイズするか否かについては不明である。 一方特開昭６３−５００２１４号公報には、雄性ＤＮＡ
と優先的にハイブリダイズするウシＤＮＡプローブが記
載されている。このＤＮＡは、胎児および胚の性別を判
定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有
用であるといわれている。 また、ウシの亜科に属し、ことにボス属の反芻動物の胚
もしくは胎児の性別を決定するのに有用な雄特異的ＤＮ
Ａが特開昭６２─２７３０００号公報に、牛、ヒツジ、
ヤギおよび他の反芻動物のＹ染色体特異的ＤＮＡ配列に
のみハイブリダイズすることのできるＤＮＡが特表平１
−５００７２０号公報に開示されている。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ウシの
雌雄判別に関する前記の特開昭６３−５００２１４号公
報に記載のプローブは長すぎるという点が、また、特開
昭６２−２７３０００号公報記載のＤＮＡでは短かすぎ
るのでＰＣＲ等には使えないといった問題点が指摘され
る。また、特表平１−５００７２０号公報では実用性の
例が示されてない。 【０００６】このように当業界では前記のようなウシの
性別判定の重要性に鑑み、簡便にかつ高感度に雌雄判別
ができるような方法の開発が望まれているものの、未だ
充分な方法は見い出されていないのが実情である。しか
して、本発明の目的は、ウシ雌雄判別を簡便かつ高感度
に行うことのできるウシの雄特異的ＤＮＡおよびそれを
プローブとして用いるウシ雌雄の判別方法を提供するこ
とにある。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決するために鋭意検討した。その結果、ウシの雄特異
的ＤＮＡを見い出し、さらに該ＤＮＡを用いることによ
りウシ雌雄の判別を簡易かつ高感度に行うことのできる
ことを見い出し本発明を完成するに到った。 【０００８】即ち、本発明の要旨は、 （１）ウシの雄特異的ＤＮＡおよび （２）前記のＤＮＡをプローブとして用いることを特徴
とするウシ雌雄の判別方法に関する。 【０００９】本発明のウシの雄特異的ＤＮＡは、具体的
には次のものが挙げられる。 ■ ＩＯ−１配列（配列番号：１）の全部またはその
一部を含有するものからなるウシの雄特異的ＤＮＡ、ま
たは該ＤＮＡとハイブリダイズし得るウシの雄特異的Ｄ
ＮＡ。 ＩＯ−１（９２ｂｐ） ５’−ＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡ ＧＧＣＡＣＡＧＧＧ
Ｃ ＴＡＡＧＡＡＣＧＧＣ ＡＣＡＣＡＧＴＣＡＣ Ａ
ＣＡＣＡＡＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣ
ＣＧＧＴＴＧＣＡＣＡ ＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧ ＣＡＣ
ＡＧＧＧＣＴＧ ＡＧ−３’ 【００１０】■ ＩＯ
−２配列（配列番号：２）の全部またはその一部を含有
するものからなるウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮ
Ａとハイブリダイズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−２（１４２ｂｐ） ５’−ＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧ ＧＧＣＴＧＡＧＡＡ
Ａ ＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡ ＣＡＣＧＡＧＣＡＡＡ Ａ
ＡＡＡＡＡＣＣＴＣ ＴＴＧＣＡＣＡＧＴＴ
ＧＣＣＡＧＧＧＧＣＡ ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧ ＡＡＣ
ＧＧＣＡＣＡＣ ＡＣＴＣＡＣＡＴＡＣ ＡＣＡＧＡＣ
ＡＡＴＣ ＣＧＧＴＴＧＣＡＣＡ ＧＴＣＧＣ
ＣＡＧＧＧ ＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧ ＡＧ−３’【００
１１】■ ＩＯ−３配列（配列番号：３）の全部また
はその一部を含有するものからなるウシの雄特異的ＤＮ
Ａ、または該ＤＮＡとハイブリダイズし得るウシの雄特
異的ＤＮＡ。 ＩＯ−３（１７０ｂｐ） ５’−ＴＡＣＡＧＴＣＧＣＣ ＡＧＧＧＣＡＣＡＧ
Ｇ ＧＣＴＧＡＧＡＡＴＴ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ Ｃ
ＣＣＡＡＡＣＡＡＡ ＣＣＴＧＴＴＧＣＡＣ
ＡＧＴＴＧＣＣＡＧＧ ＧＣＡＣＡＧＣＧＣＴ ＧＡＧ
ＴＡＴＧＧＣＡ ＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡ ＣＡＣＡＣＡ
ＣＡＣＡ ＡＡＣＣＧＧＴＴＧＡ ＡＣＣＧＴ
ＴＡＣＣＡ ＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧ ＣＴＧＡＧＡＡＣ
ＡＧ ＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ−
３’【００１２】■ ＩＯ−４配列（配列番号：４）
の全部またはその一部を含有するものからなるウシの雄
特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡとハイブリダイズし得る
ウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−４（２２４ｂｐ） ５’−ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡ
Ｃ ＡＣＡＣＡＣＡＣＴＣ ＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡ Ｃ
ＡＧＴＣＧＣＣＣＧ ＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣ
ＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣ ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＧ ＡＣＡ
ＣＡＴＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＡＡＣＴＧ ＣＴＴＧＣＡ
ＣＡＧＴ ＣＧＴＣＡＧＧＧＣＴ ＣＡＧＧＧ
ＣＴＧＴＧ ＡＡＴＧＧＣＡＣＡＣ ＡＣＡＡＡＣＡＣ
ＴＧ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＧＡＡＣ
ＡＡＡＣＣＡＴＴＧＣ ＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧ ＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧ ＧＧ
ＣＡＣＡＧＧＧＣ ＴＧＡＧ−３’【００１３】本発明
のウシの雄特異的ＤＮＡは、前記のようにＩＯ−１配列
、ＩＯ−２配列ＩＯ−３配列およびＩＯ−４配列のそれ
ぞれ全部からなるものであってもよく、またウシ雌雄の
判別方法にプローブとして使用することができるもので
あればその一部を含有するものであってもよい。さらに
、同様にウシ雌雄の判別方法にプローブとして使用する
ことができるものであれば、該ＤＮＡとハイブリダイズ
し得るものも本発明のウシの雄特異的ＤＮＡに含まれる
。ここで、該ＤＮＡとハイブリダイズし得るものとして
は、例えばＩＯ−１配列のＤＮＡの一部に塩基の置換、
欠失、挿入等の変異のあるものであっても該ＤＮＡとハ
イブリダイズし得るもの等を挙げることができる。 【００１４】本発明のウシの雄特異的ＤＮＡを得るには
、例えば次のような方法が挙げられる。 （１）ゲノムＤＮＡの抽出 ウシの白血球、精巣、卵巣、肝臓などから得られた新鮮
、凍結あるいはホルマリンなどで固定した検体をプロテ
イナーゼ等の酵素処理によりタンパク質を消化した後、
フェノール抽出およびエタノール沈澱処理など常法によ
りＤＮＡを抽出する。 【００１５】（２）ＰＣＲによるゲノムＤＮＡの増幅Ｅ
Ｓ８プローブ（Ｅｌｌｉｓ ら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏ
ｌｏｇｙ ２９：２４２， １９８８ ）の１−２０ｂ
ｐ（ＭＩ３０４）および５４１−５６０ｂｐ（ＭＩ３０
５）に相同する配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮ
Ａ合成機（例えば、ＡＢＩ社製）を用いて合成し、得ら
れたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、常法
によりＰＣＲを行うことによりウシゲノムＤＮＡの増幅
を行う。これらのプライマーの塩基配列は次のとおりで
ある。 プライマーＭＩ３０４（配列番号：５）： ５’−Ｃ
ＡＣＣＡＧＧＧＣＡ ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧ−３’ プ
ライマーＭＩ３０５（配列番号：６）： ５’−ＡＣ
ＡＧＴＣＧＣＣＡ ＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧ−３’ ＰＣ
Ｒに用いるゲノムＤＮＡ量は、通常１μｇ程度を標準と
し、プライマーの量は通常、１００ｐｍｏｌ程度を用い
る。ＰＣＲの条件は、ディナチュレーション工程は通常
９３℃で１．５分、アニーリング工程が通常６０℃で２
分、イクステンション工程が通常８０℃で２．５分の条
件であり、これらの工程を１サイクルとしたＰＣＲを通
常３０サイクル行なう。 【００１６】（３）クローニング （２）で得られた増幅されたＤＮＡ断片は、アガロース
ゲル電気泳動にかける。電気泳動を行ったゲルより、用
いたプライマーから推定される鎖長を有するバンドを切
りだし、目的の鎖長を有するＤＮＡ断片を得る。次いで
得られたＤＮＡ断片を市販のプラスミドに挿入し、さら
に該プラスミドを大腸菌などの適切な宿主に導入する。 形質転換体の有するプラスミドの挿入ＤＮＡの鎖長を調
べ、目的の挿入ＤＮＡを有するクローンを陽性とする。 【００１７】（４）制限酵素による消化（３）で得られ
た陽性クローンのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩとＰｓ
ｔＩにより消化することにより本発明のＩＯ−１配列、
ＩＯ−２配列ＩＯ−３配列およびＩＯ−４配列を得るこ
とができる。 【００１８】本発明のウシ雌雄の判別方法は、これらの
本発明の雄特異的ＤＮＡのうち少なくとも１つをプロー
ブとして用いることを特徴とするものである。具体的に
は、本発明のウシの雄特異的ＤＮＡをプローブとして用
い、検体中のＤＮＡとハイブリダイゼーションが生じる
か否かにより雌雄を判別する。即ち、ハイブリダイゼー
ションを認めればその検体は雄性であり、認めなければ
雌性と判定される。 【００１９】このハイブリダイゼーションの方法は、こ
のような目的を達成することができるものであれば特に
制限されるものではない。例えば、ドットブロットハイ
ブリダイゼーションにより行うことができる。この場合
、本発明の雄特異的ＤＮＡは該ＤＮＡを保持するプラス
ミドＤＮＡをプローブとし、ニックトランスレーション
によって放射標識して用いることができる。具体的には
、まずドットブロットフォーマットを用い、アルカリ変
性および熱変性処理を行った後、検体のＤＮＡをニトロ
セルロースフィルターに吸着させる。該フィルターをハ
イブリダイゼーション液（５×ＳＳＰＥ、５×デンハル
ト溶液、０．５％ｖ／ｖＳＤＳ）に７５℃で１時間浸漬
することによって、プレハイブリダイゼーションを行う
。次いで、該フィルターを前記プローブとともに１晩ハ
イブリダイゼーションに付した後、該フィルターを６×
ＳＳＣ液で１時間洗浄し、Ｘ線フィルムに−８０℃で一
夜露光させることにより行われる。 【００２０】本発明のウシ雌雄の判別方法は、本発明の
雄特異的ＤＮＡのうち少なくとも１つをプローブとして
用いればよいが、複数の雄特異的ＤＮＡを同時にプロー
ブとして用いてドットブロットハイブリダイゼーション
を行ってもよい。 【００２１】 【実施例】以下、実施例により本発明についてさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら
限定されるものではない。 実施例 （１）ＤＮＡ試料 成熟ホルスタイン牛（雌雄１頭づつ）の末梢血５ｍｌを
遠心分離にかけた。白血球画分をプロテイナーゼＫ、Ｒ
Ｎａｓｅ およびフェノールで処理し、ＤＮＡを抽出し
た。 得られたＤＮＡを定量した後、−２０℃で保存した。 【００２２】（２）ＰＣＲによるウシゲノムＤＮＡの増
幅 増幅に用いたＤＮＡの量は、雄ウシ細胞ＤＮＡの場合は
１０−６〜１μｇであり、雌ウシ細胞ＤＮＡの場合は１
μｇであった。ＥＳ８プローブ（Ｅｌｌｉｓ ら、Ｔｈ
ｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２９：２４２，１９８８）
の１−２０ｂｐ（ＭＩ３０４）および５４１−５６０ｂ
ｐ（ＭＩ３０５）に相同する配列を有するプライマーを
ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製）を用いて合成した。得られ
たプライマーはそれぞれ１００ｐｍｏｌをＰＣＲに用い
た。これらのプライマーの塩基配列は次のとおりである
。 プライマーＭＩ３０４（配列番号：５）： ５’−Ｃ
ＡＣＣＡＧＧＧＣＡ ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧ−３’ プ
ライマーＭＩ３０５（配列番号：６）： ５’−ＡＣ
ＡＧＴＣＧＣＣＡ ＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧ−３’ Ｉｎ
ｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． ３−１２， １９９０）の
方法に従って調製したＰＣＲ用緩衝液に、最終容量が１
００μｌになるよう前記のプライマーを加えた。２．５
ユニットの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラ
ーゼ、シータス社製）を各試料に加えた後、プログラム
式熱コントローラー（ＭＪリサーチ社製）を用いてＰＣ
Ｒ操作（６０℃で２分間反応させ、８０℃で２．５分間
反応させ、さらに９３℃で１．５分間反応させる操作）
を３０回繰り返した。ＰＣＲの終了後、反応生成物を４
％アガロースゲル（シーケムＭＥ、ＦＭＣ社製）上で電
気泳動にかけ、臭化エチジウム染色後、紫外線照射下で
現像した。 【００２３】このようにしてＤＮＡ断片を電気泳動で分
画したものを図１に示した。即ち、図１は反応生成物の
１／１０を４％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭
化エチジウム染色後、紫外線照射下で現像した結果であ
る。レーン１〜７はそれぞれ１、１０−１、１０−２、
１０−３、１０−４、１０−５および１０−６μｇのウ
シ雄ＤＮＡから増幅された生成物の泳動結果を示したも
のである。レーン８はウシ雌ＤＮＡ１μｇから増幅され
た生成物についての泳動結果である。図中で矢印を付し
た４つの未知のバンドが雄ＤＮＡ検体で見られた。 【００２４】このバンドを分析したところ、約１００ｂ
ｐ、１３０ｂｐ、１８０ｂｐおよび２３０ｂｐの位置に
存在していた。また他の位置にも残存するプライマーに
由来するバンドが出現した。これらのＤＮＡ断片は、１
０−６μｇのＤＮＡ試料のＰＣＲでも確認された。一方
、１μｇの雌ＤＮＡ試料をＰＣＲで分析したが、このよ
うなＤＮＡ断片は見られなかった。 【００２５】（３）ＰＣＲ生成物のクローニングと配列
決定 ＰＣＲ生成物をプラスミドＤＮＡ ｐＵＣ１１９のＳ
ｍａＩサイトに結合させた後、大腸菌ＭＶ１１８４にク
ローン化した（図２参照、ａはＰｓｔＩサイトを、ｂは
ＳｍａＩサイトを、ｃは挿入ＤＮＡを、そしてｄはＥｃ
ｏＲＩサイトを示す）。クローニング終了後、プラスミ
ドＤＮＡをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩにより制限酵素による
分析に付した後、サンガーらのジデオキシ法によって配
列を決定した。 【００２６】その結果、制限酵素による分析によりＰＣ
Ｒ生成物を４種に分けることができた（図３）。図３は
、４種のＰＣＲ生成物をもつプラスミドをＥｃｏＲＩと
ＰｓｔＩで同時に消化し、その各種の一部を４％アガロ
ースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色した
結果を示すものである。図中の＊はマーカーである。 これらのＤＮＡ断片についてジデオキシ法で決定した塩
基配列を図４に示した。これら４種のＤＮＡ断片のサイ
ズは、それぞれ９２ｂｐ（Ｉ０−１）、１４２ｂｐ（Ｉ
０−２）、１７０ｂｐ（Ｉ０−３）、および２２４ｂｐ
（Ｉ０−４）であった。これらのサイズは、電気泳動度
に基づく推定値とほぼ同じであった。 【００２７】これら４種のＤＮＡ断片の塩基配列はＥＳ
５やＥＳ８の塩基配列と一致していなかった。ＥＳ８と
４種のＤＮＡ断片の塩基配列の一致度を調べたところ、
Ｉ０−１断片では全配列の６５％、Ｉ０−２断片では５
１％、Ｉ０−３断片では５７％、Ｉ０−４断片では８４
％のホモロジーがみられた。また、図４の塩基配列から
も明らかなようにこれら４種のＤＮＡ断片はいずれも反
復ＣＡ配列を有していた。 【００２８】（４）ＤＮＡ断片の雄特異性のドットブロ
ット分析 前記のようにして配列の決定された４種のＤＮＡ断片を
保持するプラスミドＤＮＡをプローブとし、ニックトラ
ンスレーションによって放射標識した後、以下のハイブ
リダイゼーションによる分析を行った。即ち、まずドッ
トブロットフォーマットを用い、アルカリ変性および熱
変性処理を行った後、ウシゲノムＤＮＡをニトロセルロ
ースフィルターに吸着させた。該フィルターをハイブリ
ダイゼーション液（５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液
、０．５％ｖ／ｖＳＤＳ）に７５℃で１時間浸漬するこ
とによって、プレハイブリダイゼーションを行った。 次いで、該フィルターを前記プローブとともに１晩ハイ
ブリダイゼーションに付した。続いて、該フィルターを
６×ＳＳＣ液で１時間洗浄した後、Ｘ線フィルム（コニ
カ社製）に−８０℃で一夜露光させた。 【００２９】図５はこのようにして得られたドットブロ
ットハイブリダイゼーション分析の結果を示す図である
。即ち、ウシ雄およびウシ雌ＤＮＡ１μｇを４種のニト
ロセルロースフィルターにアプライし、３２Ｐで標識し
た４種のＤＮＡ断片をそれぞれハイブリダイズさせた。 図中、１はＩ０−１断片を、２はＩ０−２断片を、３は
Ｉ０−３断片を、４はＩ０−４断片をそれぞれハイブリ
ダイズさせた結果である。図５から明らかなようにこれ
ら４種のＤＮＡ断片を雌雄ウシゲノムＤＮＡのそれぞれ
とハイブリダイズさせたところ、４種の断片はいずれも
雄ゲノムＤＮＡのみに対して陽性反応を示し、これらの
ＤＮＡ断片は雄特異性を有することが明らかとなった。 【００３０】 【発明の効果】本発明において、ＥＳ８から得たプライ
マーを用いたＰＣＲでは、予想されたＥＳ８の増幅は起
こらず、４種の本発明のＤＮＡ断片（９２ｂｐ、１４２
ｂｐ、１７０ｂｐ、２２４ｂｐ）が得られた。これらの
増幅ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＥＳ８の塩基配列と部分
的に一致が見られたものの、ＥＳ５あるいはＥＳ８とも
完全に同一のものではなかった。ＥＳ８はウシＹ染色体
上に存在する約６００コピーにのぼる反復配列の１単位
を成していることが知られているので（Ｂｏｎｄｉｏｌ
ｉら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３１：９５−１
０４， １９８９）、多少異なる部分もあるが類似して
いる塩基配列を有する一群に含まれるものと思われる。 したがって、プライマーＭＩ３０４およびＭＩ３０５で
増幅させた本発明の４種のＤＮＡ断片は前記の類似する
塩基配列に由来するものである可能性が高いと思われる
。 【００３１】また、４種のＤＮＡ断片の塩基配列はいず
れも反復ＣＡ配列を含んでいた。この反復配列はＥＳ８
の塩基配列のかなりの部分を占めていた。この点につい
て、Ｋａｓｈｉら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ７：３１−３
６ １９９０）は、（ＴＧ）１０塩基配列を有するプロ
ーブを制限酵素（ＨａｅＩＩＩまたはＭｂｏＩ）で消化
した後で雌雄ウシゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせる
と、数ｋｂ〜数１０ｋｂの位置に雄特異性バンドが検出
されたと報告している。これらの知見から、反復ＣＡ配
列はウシＹ染色体に特有の塩基配列であることが推察さ
れる。このようにこれらの４種のＤＮＡ断片は雄特異性
であり、これらをプライマー及びプローブとして用いる
ことにより簡易にかつ高感度にウシ雌雄を判別すること
ができる。 【００３２】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：９２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球配列 ＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡ ＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣ ＴＡＡ
ＧＡＡＣＧＧＣ ＡＣＡＣＡＧＴＣＡＣ ＡＣＡＣＡＡ
ＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣ ６０ＣＧＧＴＴ
ＧＣＡＣＡ ＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧ ＣＡＣＡＧＧＧＣ
ＴＧ ＡＧ
９２ 【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：１４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球配列 ＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧ ＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡ ＴＣＡ
ＡＡＴＴＡＣＡ ＣＡＣＧＡＧＣＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡ
ＣＣＴＣ ＴＴＧＣＡＣＡＧＴＴ ６０ＧＣＣＡＧ
ＧＧＧＣＡ ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧ ＡＡＣＧＧＣＡＣ
ＡＣ ＡＣＴＣＡＣＡＴＡＣ ＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣ
ＣＧＧＴＴＧＣＡＣＡ １２０ＧＴＣＧＣＣＡＧＧＧ
ＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧ ＡＧ
１４２ 【００３４】配列番号：３ 配列の長さ：１７０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球配列 ＴＡＣＡＧＴＣＧＣＣ ＡＧＧＧＣＡＣＡＧＧ ＧＣＴ
ＧＡＧＡＡＴＴ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ ＣＣＣＡＡＡ
ＣＡＡＡ ＣＣＴＧＴＴＧＣＡＣ ６０ＡＧＴＴＧ
ＣＣＡＧＧ ＧＣＡＣＡＧＣＧＣＴ ＧＡＧＴＡＴＧＧ
ＣＡ ＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ
ＡＡＣＣＧＧＴＴＧＡ １２０ＡＣＣＧＴＴＡＣＣＡ
ＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧ ＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧ ＣＡ
ＣＡＣＡＣＡＴＡ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ
１７０ 【００３５】配列番号：４ 配列の長さ：２２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球配列 ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡ
ＣＡＣＡＣＴＣ ＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡ ＣＡＧＴＣＧ
ＣＣＣＧ ＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣ ６０ＴＧＡＧＡ
ＡＧＡＡＣ ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＧ ＡＣＡＣＡＴＡＣ
ＡＣ ＡＣＡＣＡＡＡＣＴＧ ＣＴＴＧＣＡＣＡＧＴ
ＣＧＴＣＡＧＧＧＣＴ １２０ＣＡＧＧＧＣＴＧＴＧ
ＡＡＴＧＧＣＡＣＡＣ ＡＣＡＡＡＣＡＣＴＧ ＡＣ
ＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＧＡＡＣ ＡＡＡＣＣ
ＡＴＴＧＣ １８０ＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡ ＧＧＧＣ
ＡＣＡＧＧＧ ＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧ ＧＧＣＡＣＡＧ
ＧＧＣ ＴＧＡＧ
２２４ 【００３６】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡ ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧ
２０ 【００３７】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＣＡＧＴＣＧＣＣＡ ＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧ
２０
および該ＤＮＡをプローブとして用いるウシ雌雄の判別
方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】近年、胎児または胚の性別判定は、重要
な課題となっている。特に、胎児移植などの生殖生物学
分野で重要となりつつある。例えば、乳牛及び食肉業の
分野だけでも、１９８５年にはおよそ５０，０００例の
胎児移植が報告されている。胎児を母体に移植する前に
簡単にその性別の判定ができれば、雌の子孫を増すこと
が可能となり、乳牛業において極めて有利となる。また
、胎児の性別が簡単に判定できれば、乳を多く出すこと
ができるとか子供を多く生むことができるなどの望まし
い特質を持った子孫を選択することが可能となる。 【０００３】性別（雄もしくは雌）が性染色体によって
決定されるということは従来より広く知られている。哺
乳動物において、Ｙ染色体上に存在する遺伝子が雄とし
ての特徴形成の原因となるので、個々の哺乳動物の性別
は、ある特定のＤＮＡ配列をそのゲノムが含んでいるか
否かに依存することになる。従って、ＤＮＡ中のＹ染色
体特異的遺伝子を分析することによって雌雄の判別をす
ることができる。あるいは、遺伝子的に関連した配列、
具体的にはＹ染色体と関連した配列を分析することによ
っても判定することができる。 【０００４】従来より、ＤＮＡによる雌雄判別の方法と
しては種々の報告がある。例えばヒトの男性ＤＮＡと優
先的にハイブリダイズするＤＮＡ配列は多くの研究者に
よって同定されている（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ１９１， １１８９−１１９０ （１９
７６）， Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔａｌ， Ｎａｔｕｒｅ
３０３， ８３１ （１９８３））。しかし、これらの
ＤＮＡ配列がヒト以外の他の種、例えばウシのＤＮＡ配
列とハイブリダイズするか否かについては不明である。 一方特開昭６３−５００２１４号公報には、雄性ＤＮＡ
と優先的にハイブリダイズするウシＤＮＡプローブが記
載されている。このＤＮＡは、胎児および胚の性別を判
定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有
用であるといわれている。 また、ウシの亜科に属し、ことにボス属の反芻動物の胚
もしくは胎児の性別を決定するのに有用な雄特異的ＤＮ
Ａが特開昭６２─２７３０００号公報に、牛、ヒツジ、
ヤギおよび他の反芻動物のＹ染色体特異的ＤＮＡ配列に
のみハイブリダイズすることのできるＤＮＡが特表平１
−５００７２０号公報に開示されている。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ウシの
雌雄判別に関する前記の特開昭６３−５００２１４号公
報に記載のプローブは長すぎるという点が、また、特開
昭６２−２７３０００号公報記載のＤＮＡでは短かすぎ
るのでＰＣＲ等には使えないといった問題点が指摘され
る。また、特表平１−５００７２０号公報では実用性の
例が示されてない。 【０００６】このように当業界では前記のようなウシの
性別判定の重要性に鑑み、簡便にかつ高感度に雌雄判別
ができるような方法の開発が望まれているものの、未だ
充分な方法は見い出されていないのが実情である。しか
して、本発明の目的は、ウシ雌雄判別を簡便かつ高感度
に行うことのできるウシの雄特異的ＤＮＡおよびそれを
プローブとして用いるウシ雌雄の判別方法を提供するこ
とにある。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決するために鋭意検討した。その結果、ウシの雄特異
的ＤＮＡを見い出し、さらに該ＤＮＡを用いることによ
りウシ雌雄の判別を簡易かつ高感度に行うことのできる
ことを見い出し本発明を完成するに到った。 【０００８】即ち、本発明の要旨は、 （１）ウシの雄特異的ＤＮＡおよび （２）前記のＤＮＡをプローブとして用いることを特徴
とするウシ雌雄の判別方法に関する。 【０００９】本発明のウシの雄特異的ＤＮＡは、具体的
には次のものが挙げられる。 ■ ＩＯ−１配列（配列番号：１）の全部またはその
一部を含有するものからなるウシの雄特異的ＤＮＡ、ま
たは該ＤＮＡとハイブリダイズし得るウシの雄特異的Ｄ
ＮＡ。 ＩＯ−１（９２ｂｐ） ５’−ＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡ ＧＧＣＡＣＡＧＧＧ
Ｃ ＴＡＡＧＡＡＣＧＧＣ ＡＣＡＣＡＧＴＣＡＣ Ａ
ＣＡＣＡＡＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣ
ＣＧＧＴＴＧＣＡＣＡ ＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧ ＣＡＣ
ＡＧＧＧＣＴＧ ＡＧ−３’ 【００１０】■ ＩＯ
−２配列（配列番号：２）の全部またはその一部を含有
するものからなるウシの雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮ
Ａとハイブリダイズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−２（１４２ｂｐ） ５’−ＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧ ＧＧＣＴＧＡＧＡＡ
Ａ ＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡ ＣＡＣＧＡＧＣＡＡＡ Ａ
ＡＡＡＡＡＣＣＴＣ ＴＴＧＣＡＣＡＧＴＴ
ＧＣＣＡＧＧＧＧＣＡ ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧ ＡＡＣ
ＧＧＣＡＣＡＣ ＡＣＴＣＡＣＡＴＡＣ ＡＣＡＧＡＣ
ＡＡＴＣ ＣＧＧＴＴＧＣＡＣＡ ＧＴＣＧＣ
ＣＡＧＧＧ ＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧ ＡＧ−３’【００
１１】■ ＩＯ−３配列（配列番号：３）の全部また
はその一部を含有するものからなるウシの雄特異的ＤＮ
Ａ、または該ＤＮＡとハイブリダイズし得るウシの雄特
異的ＤＮＡ。 ＩＯ−３（１７０ｂｐ） ５’−ＴＡＣＡＧＴＣＧＣＣ ＡＧＧＧＣＡＣＡＧ
Ｇ ＧＣＴＧＡＧＡＡＴＴ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ Ｃ
ＣＣＡＡＡＣＡＡＡ ＣＣＴＧＴＴＧＣＡＣ
ＡＧＴＴＧＣＣＡＧＧ ＧＣＡＣＡＧＣＧＣＴ ＧＡＧ
ＴＡＴＧＧＣＡ ＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡ ＣＡＣＡＣＡ
ＣＡＣＡ ＡＡＣＣＧＧＴＴＧＡ ＡＣＣＧＴ
ＴＡＣＣＡ ＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧ ＣＴＧＡＧＡＡＣ
ＡＧ ＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ−
３’【００１２】■ ＩＯ−４配列（配列番号：４）
の全部またはその一部を含有するものからなるウシの雄
特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡとハイブリダイズし得る
ウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−４（２２４ｂｐ） ５’−ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡ
Ｃ ＡＣＡＣＡＣＡＣＴＣ ＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡ Ｃ
ＡＧＴＣＧＣＣＣＧ ＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣ
ＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣ ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＧ ＡＣＡ
ＣＡＴＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＡＡＣＴＧ ＣＴＴＧＣＡ
ＣＡＧＴ ＣＧＴＣＡＧＧＧＣＴ ＣＡＧＧＧ
ＣＴＧＴＧ ＡＡＴＧＧＣＡＣＡＣ ＡＣＡＡＡＣＡＣ
ＴＧ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＧＡＡＣ
ＡＡＡＣＣＡＴＴＧＣ ＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧ ＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧ ＧＧ
ＣＡＣＡＧＧＧＣ ＴＧＡＧ−３’【００１３】本発明
のウシの雄特異的ＤＮＡは、前記のようにＩＯ−１配列
、ＩＯ−２配列ＩＯ−３配列およびＩＯ−４配列のそれ
ぞれ全部からなるものであってもよく、またウシ雌雄の
判別方法にプローブとして使用することができるもので
あればその一部を含有するものであってもよい。さらに
、同様にウシ雌雄の判別方法にプローブとして使用する
ことができるものであれば、該ＤＮＡとハイブリダイズ
し得るものも本発明のウシの雄特異的ＤＮＡに含まれる
。ここで、該ＤＮＡとハイブリダイズし得るものとして
は、例えばＩＯ−１配列のＤＮＡの一部に塩基の置換、
欠失、挿入等の変異のあるものであっても該ＤＮＡとハ
イブリダイズし得るもの等を挙げることができる。 【００１４】本発明のウシの雄特異的ＤＮＡを得るには
、例えば次のような方法が挙げられる。 （１）ゲノムＤＮＡの抽出 ウシの白血球、精巣、卵巣、肝臓などから得られた新鮮
、凍結あるいはホルマリンなどで固定した検体をプロテ
イナーゼ等の酵素処理によりタンパク質を消化した後、
フェノール抽出およびエタノール沈澱処理など常法によ
りＤＮＡを抽出する。 【００１５】（２）ＰＣＲによるゲノムＤＮＡの増幅Ｅ
Ｓ８プローブ（Ｅｌｌｉｓ ら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏ
ｌｏｇｙ ２９：２４２， １９８８ ）の１−２０ｂ
ｐ（ＭＩ３０４）および５４１−５６０ｂｐ（ＭＩ３０
５）に相同する配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮ
Ａ合成機（例えば、ＡＢＩ社製）を用いて合成し、得ら
れたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、常法
によりＰＣＲを行うことによりウシゲノムＤＮＡの増幅
を行う。これらのプライマーの塩基配列は次のとおりで
ある。 プライマーＭＩ３０４（配列番号：５）： ５’−Ｃ
ＡＣＣＡＧＧＧＣＡ ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧ−３’ プ
ライマーＭＩ３０５（配列番号：６）： ５’−ＡＣ
ＡＧＴＣＧＣＣＡ ＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧ−３’ ＰＣ
Ｒに用いるゲノムＤＮＡ量は、通常１μｇ程度を標準と
し、プライマーの量は通常、１００ｐｍｏｌ程度を用い
る。ＰＣＲの条件は、ディナチュレーション工程は通常
９３℃で１．５分、アニーリング工程が通常６０℃で２
分、イクステンション工程が通常８０℃で２．５分の条
件であり、これらの工程を１サイクルとしたＰＣＲを通
常３０サイクル行なう。 【００１６】（３）クローニング （２）で得られた増幅されたＤＮＡ断片は、アガロース
ゲル電気泳動にかける。電気泳動を行ったゲルより、用
いたプライマーから推定される鎖長を有するバンドを切
りだし、目的の鎖長を有するＤＮＡ断片を得る。次いで
得られたＤＮＡ断片を市販のプラスミドに挿入し、さら
に該プラスミドを大腸菌などの適切な宿主に導入する。 形質転換体の有するプラスミドの挿入ＤＮＡの鎖長を調
べ、目的の挿入ＤＮＡを有するクローンを陽性とする。 【００１７】（４）制限酵素による消化（３）で得られ
た陽性クローンのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩとＰｓ
ｔＩにより消化することにより本発明のＩＯ−１配列、
ＩＯ−２配列ＩＯ−３配列およびＩＯ−４配列を得るこ
とができる。 【００１８】本発明のウシ雌雄の判別方法は、これらの
本発明の雄特異的ＤＮＡのうち少なくとも１つをプロー
ブとして用いることを特徴とするものである。具体的に
は、本発明のウシの雄特異的ＤＮＡをプローブとして用
い、検体中のＤＮＡとハイブリダイゼーションが生じる
か否かにより雌雄を判別する。即ち、ハイブリダイゼー
ションを認めればその検体は雄性であり、認めなければ
雌性と判定される。 【００１９】このハイブリダイゼーションの方法は、こ
のような目的を達成することができるものであれば特に
制限されるものではない。例えば、ドットブロットハイ
ブリダイゼーションにより行うことができる。この場合
、本発明の雄特異的ＤＮＡは該ＤＮＡを保持するプラス
ミドＤＮＡをプローブとし、ニックトランスレーション
によって放射標識して用いることができる。具体的には
、まずドットブロットフォーマットを用い、アルカリ変
性および熱変性処理を行った後、検体のＤＮＡをニトロ
セルロースフィルターに吸着させる。該フィルターをハ
イブリダイゼーション液（５×ＳＳＰＥ、５×デンハル
ト溶液、０．５％ｖ／ｖＳＤＳ）に７５℃で１時間浸漬
することによって、プレハイブリダイゼーションを行う
。次いで、該フィルターを前記プローブとともに１晩ハ
イブリダイゼーションに付した後、該フィルターを６×
ＳＳＣ液で１時間洗浄し、Ｘ線フィルムに−８０℃で一
夜露光させることにより行われる。 【００２０】本発明のウシ雌雄の判別方法は、本発明の
雄特異的ＤＮＡのうち少なくとも１つをプローブとして
用いればよいが、複数の雄特異的ＤＮＡを同時にプロー
ブとして用いてドットブロットハイブリダイゼーション
を行ってもよい。 【００２１】 【実施例】以下、実施例により本発明についてさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら
限定されるものではない。 実施例 （１）ＤＮＡ試料 成熟ホルスタイン牛（雌雄１頭づつ）の末梢血５ｍｌを
遠心分離にかけた。白血球画分をプロテイナーゼＫ、Ｒ
Ｎａｓｅ およびフェノールで処理し、ＤＮＡを抽出し
た。 得られたＤＮＡを定量した後、−２０℃で保存した。 【００２２】（２）ＰＣＲによるウシゲノムＤＮＡの増
幅 増幅に用いたＤＮＡの量は、雄ウシ細胞ＤＮＡの場合は
１０−６〜１μｇであり、雌ウシ細胞ＤＮＡの場合は１
μｇであった。ＥＳ８プローブ（Ｅｌｌｉｓ ら、Ｔｈ
ｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２９：２４２，１９８８）
の１−２０ｂｐ（ＭＩ３０４）および５４１−５６０ｂ
ｐ（ＭＩ３０５）に相同する配列を有するプライマーを
ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製）を用いて合成した。得られ
たプライマーはそれぞれ１００ｐｍｏｌをＰＣＲに用い
た。これらのプライマーの塩基配列は次のとおりである
。 プライマーＭＩ３０４（配列番号：５）： ５’−Ｃ
ＡＣＣＡＧＧＧＣＡ ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧ−３’ プ
ライマーＭＩ３０５（配列番号：６）： ５’−ＡＣ
ＡＧＴＣＧＣＣＡ ＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧ−３’ Ｉｎ
ｎｉｓ ａｎｄ Ｇｅｌｆａｎｄ（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． ３−１２， １９９０）の
方法に従って調製したＰＣＲ用緩衝液に、最終容量が１
００μｌになるよう前記のプライマーを加えた。２．５
ユニットの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラ
ーゼ、シータス社製）を各試料に加えた後、プログラム
式熱コントローラー（ＭＪリサーチ社製）を用いてＰＣ
Ｒ操作（６０℃で２分間反応させ、８０℃で２．５分間
反応させ、さらに９３℃で１．５分間反応させる操作）
を３０回繰り返した。ＰＣＲの終了後、反応生成物を４
％アガロースゲル（シーケムＭＥ、ＦＭＣ社製）上で電
気泳動にかけ、臭化エチジウム染色後、紫外線照射下で
現像した。 【００２３】このようにしてＤＮＡ断片を電気泳動で分
画したものを図１に示した。即ち、図１は反応生成物の
１／１０を４％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭
化エチジウム染色後、紫外線照射下で現像した結果であ
る。レーン１〜７はそれぞれ１、１０−１、１０−２、
１０−３、１０−４、１０−５および１０−６μｇのウ
シ雄ＤＮＡから増幅された生成物の泳動結果を示したも
のである。レーン８はウシ雌ＤＮＡ１μｇから増幅され
た生成物についての泳動結果である。図中で矢印を付し
た４つの未知のバンドが雄ＤＮＡ検体で見られた。 【００２４】このバンドを分析したところ、約１００ｂ
ｐ、１３０ｂｐ、１８０ｂｐおよび２３０ｂｐの位置に
存在していた。また他の位置にも残存するプライマーに
由来するバンドが出現した。これらのＤＮＡ断片は、１
０−６μｇのＤＮＡ試料のＰＣＲでも確認された。一方
、１μｇの雌ＤＮＡ試料をＰＣＲで分析したが、このよ
うなＤＮＡ断片は見られなかった。 【００２５】（３）ＰＣＲ生成物のクローニングと配列
決定 ＰＣＲ生成物をプラスミドＤＮＡ ｐＵＣ１１９のＳ
ｍａＩサイトに結合させた後、大腸菌ＭＶ１１８４にク
ローン化した（図２参照、ａはＰｓｔＩサイトを、ｂは
ＳｍａＩサイトを、ｃは挿入ＤＮＡを、そしてｄはＥｃ
ｏＲＩサイトを示す）。クローニング終了後、プラスミ
ドＤＮＡをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩにより制限酵素による
分析に付した後、サンガーらのジデオキシ法によって配
列を決定した。 【００２６】その結果、制限酵素による分析によりＰＣ
Ｒ生成物を４種に分けることができた（図３）。図３は
、４種のＰＣＲ生成物をもつプラスミドをＥｃｏＲＩと
ＰｓｔＩで同時に消化し、その各種の一部を４％アガロ
ースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色した
結果を示すものである。図中の＊はマーカーである。 これらのＤＮＡ断片についてジデオキシ法で決定した塩
基配列を図４に示した。これら４種のＤＮＡ断片のサイ
ズは、それぞれ９２ｂｐ（Ｉ０−１）、１４２ｂｐ（Ｉ
０−２）、１７０ｂｐ（Ｉ０−３）、および２２４ｂｐ
（Ｉ０−４）であった。これらのサイズは、電気泳動度
に基づく推定値とほぼ同じであった。 【００２７】これら４種のＤＮＡ断片の塩基配列はＥＳ
５やＥＳ８の塩基配列と一致していなかった。ＥＳ８と
４種のＤＮＡ断片の塩基配列の一致度を調べたところ、
Ｉ０−１断片では全配列の６５％、Ｉ０−２断片では５
１％、Ｉ０−３断片では５７％、Ｉ０−４断片では８４
％のホモロジーがみられた。また、図４の塩基配列から
も明らかなようにこれら４種のＤＮＡ断片はいずれも反
復ＣＡ配列を有していた。 【００２８】（４）ＤＮＡ断片の雄特異性のドットブロ
ット分析 前記のようにして配列の決定された４種のＤＮＡ断片を
保持するプラスミドＤＮＡをプローブとし、ニックトラ
ンスレーションによって放射標識した後、以下のハイブ
リダイゼーションによる分析を行った。即ち、まずドッ
トブロットフォーマットを用い、アルカリ変性および熱
変性処理を行った後、ウシゲノムＤＮＡをニトロセルロ
ースフィルターに吸着させた。該フィルターをハイブリ
ダイゼーション液（５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液
、０．５％ｖ／ｖＳＤＳ）に７５℃で１時間浸漬するこ
とによって、プレハイブリダイゼーションを行った。 次いで、該フィルターを前記プローブとともに１晩ハイ
ブリダイゼーションに付した。続いて、該フィルターを
６×ＳＳＣ液で１時間洗浄した後、Ｘ線フィルム（コニ
カ社製）に−８０℃で一夜露光させた。 【００２９】図５はこのようにして得られたドットブロ
ットハイブリダイゼーション分析の結果を示す図である
。即ち、ウシ雄およびウシ雌ＤＮＡ１μｇを４種のニト
ロセルロースフィルターにアプライし、３２Ｐで標識し
た４種のＤＮＡ断片をそれぞれハイブリダイズさせた。 図中、１はＩ０−１断片を、２はＩ０−２断片を、３は
Ｉ０−３断片を、４はＩ０−４断片をそれぞれハイブリ
ダイズさせた結果である。図５から明らかなようにこれ
ら４種のＤＮＡ断片を雌雄ウシゲノムＤＮＡのそれぞれ
とハイブリダイズさせたところ、４種の断片はいずれも
雄ゲノムＤＮＡのみに対して陽性反応を示し、これらの
ＤＮＡ断片は雄特異性を有することが明らかとなった。 【００３０】 【発明の効果】本発明において、ＥＳ８から得たプライ
マーを用いたＰＣＲでは、予想されたＥＳ８の増幅は起
こらず、４種の本発明のＤＮＡ断片（９２ｂｐ、１４２
ｂｐ、１７０ｂｐ、２２４ｂｐ）が得られた。これらの
増幅ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＥＳ８の塩基配列と部分
的に一致が見られたものの、ＥＳ５あるいはＥＳ８とも
完全に同一のものではなかった。ＥＳ８はウシＹ染色体
上に存在する約６００コピーにのぼる反復配列の１単位
を成していることが知られているので（Ｂｏｎｄｉｏｌ
ｉら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ３１：９５−１
０４， １９８９）、多少異なる部分もあるが類似して
いる塩基配列を有する一群に含まれるものと思われる。 したがって、プライマーＭＩ３０４およびＭＩ３０５で
増幅させた本発明の４種のＤＮＡ断片は前記の類似する
塩基配列に由来するものである可能性が高いと思われる
。 【００３１】また、４種のＤＮＡ断片の塩基配列はいず
れも反復ＣＡ配列を含んでいた。この反復配列はＥＳ８
の塩基配列のかなりの部分を占めていた。この点につい
て、Ｋａｓｈｉら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ７：３１−３
６ １９９０）は、（ＴＧ）１０塩基配列を有するプロ
ーブを制限酵素（ＨａｅＩＩＩまたはＭｂｏＩ）で消化
した後で雌雄ウシゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせる
と、数ｋｂ〜数１０ｋｂの位置に雄特異性バンドが検出
されたと報告している。これらの知見から、反復ＣＡ配
列はウシＹ染色体に特有の塩基配列であることが推察さ
れる。このようにこれらの４種のＤＮＡ断片は雄特異性
であり、これらをプライマー及びプローブとして用いる
ことにより簡易にかつ高感度にウシ雌雄を判別すること
ができる。 【００３２】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：９２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球配列 ＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡ ＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣ ＴＡＡ
ＧＡＡＣＧＧＣ ＡＣＡＣＡＧＴＣＡＣ ＡＣＡＣＡＡ
ＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣ ６０ＣＧＧＴＴ
ＧＣＡＣＡ ＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧ ＣＡＣＡＧＧＧＣ
ＴＧ ＡＧ
９２ 【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：１４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球配列 ＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧ ＧＧＣＴＧＡＧＡＡＡ ＴＣＡ
ＡＡＴＴＡＣＡ ＣＡＣＧＡＧＣＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡ
ＣＣＴＣ ＴＴＧＣＡＣＡＧＴＴ ６０ＧＣＣＡＧ
ＧＧＧＣＡ ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧ ＡＡＣＧＧＣＡＣ
ＡＣ ＡＣＴＣＡＣＡＴＡＣ ＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣ
ＣＧＧＴＴＧＣＡＣＡ １２０ＧＴＣＧＣＣＡＧＧＧ
ＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧ ＡＧ
１４２ 【００３４】配列番号：３ 配列の長さ：１７０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球配列 ＴＡＣＡＧＴＣＧＣＣ ＡＧＧＧＣＡＣＡＧＧ ＧＣＴ
ＧＡＧＡＡＴＴ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ ＣＣＣＡＡＡ
ＣＡＡＡ ＣＣＴＧＴＴＧＣＡＣ ６０ＡＧＴＴＧ
ＣＣＡＧＧ ＧＣＡＣＡＧＣＧＣＴ ＧＡＧＴＡＴＧＧ
ＣＡ ＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ
ＡＡＣＣＧＧＴＴＧＡ １２０ＡＣＣＧＴＴＡＣＣＡ
ＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧ ＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧ ＣＡ
ＣＡＣＡＣＡＴＡ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ
１７０ 【００３５】配列番号：４ 配列の長さ：２２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：成熟ホルスタイン牛の末梢血の白血球配列 ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡ
ＣＡＣＡＣＴＣ ＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡ ＣＡＧＴＣＧ
ＣＣＣＧ ＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣ ６０ＴＧＡＧＡ
ＡＧＡＡＣ ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＧ ＡＣＡＣＡＴＡＣ
ＡＣ ＡＣＡＣＡＡＡＣＴＧ ＣＴＴＧＣＡＣＡＧＴ
ＣＧＴＣＡＧＧＧＣＴ １２０ＣＡＧＧＧＣＴＧＴＧ
ＡＡＴＧＧＣＡＣＡＣ ＡＣＡＡＡＣＡＣＴＧ ＡＣ
ＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＧＡＡＣ ＡＡＡＣＣ
ＡＴＴＧＣ １８０ＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡ ＧＧＧＣ
ＡＣＡＧＧＧ ＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧ ＧＧＣＡＣＡＧ
ＧＧＣ ＴＧＡＧ
２２４ 【００３６】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡ ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧ
２０ 【００３７】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＣＡＧＴＣＧＣＣＡ ＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧ
２０
【図１】図１は反応生成物の１／１０を４％アガロース
ゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色後、紫外
線照射下で現像した結果を示す図である。レーン１〜７
はそれぞれ１、１０−１、１０−２、１０−３、１０−
４、１０−５および１０−６μｇのウシ雄ＤＮＡから増
幅された生成物の泳動結果を示したものである。レーン
８はウシ雌ＤＮＡ１μｇから増幅された生成物について
の泳動結果である。
ゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色後、紫外
線照射下で現像した結果を示す図である。レーン１〜７
はそれぞれ１、１０−１、１０−２、１０−３、１０−
４、１０−５および１０−６μｇのウシ雄ＤＮＡから増
幅された生成物の泳動結果を示したものである。レーン
８はウシ雌ＤＮＡ１μｇから増幅された生成物について
の泳動結果である。
【図２】図２は大腸菌ＭＶ１１８４にＰＣＲ生成物をプ
ラスミドＤＮＡｐＵＣ１１９のＳｍａＩ部位に結合させ
、クローン化した状態を示す図である。図中、ａは Ｐ
ｓｔＩサイトを、ｂは Ｓｍａ Ｉサイトを、ｃは挿入
ＤＮＡを、そしてｄは ＥｃｏＲＩサイトを示す
ラスミドＤＮＡｐＵＣ１１９のＳｍａＩ部位に結合させ
、クローン化した状態を示す図である。図中、ａは Ｐ
ｓｔＩサイトを、ｂは Ｓｍａ Ｉサイトを、ｃは挿入
ＤＮＡを、そしてｄは ＥｃｏＲＩサイトを示す
【図３
】図３は４種のＰＣＲ生成物をもつプラスミドを Ｅｃ
ｏＲＩと Ｐｓｔ Ｉで同時に消化し、その各種の一部
を４％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジ
ウム染色した結果を示すものである。Ｍはマーカーであ
る。
】図３は４種のＰＣＲ生成物をもつプラスミドを Ｅｃ
ｏＲＩと Ｐｓｔ Ｉで同時に消化し、その各種の一部
を４％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジ
ウム染色した結果を示すものである。Ｍはマーカーであ
る。
【図４】図４は４種のＤＮＡ断片、それぞれ９２ｂｐ（
Ｉ０−１）、１４２ｂｐ（Ｉ０−２）、１７０ｂｐ（Ｉ
０−３）および２２４ｂｐ（Ｉ０−４）の塩基配列を示
した図である。
Ｉ０−１）、１４２ｂｐ（Ｉ０−２）、１７０ｂｐ（Ｉ
０−３）および２２４ｂｐ（Ｉ０−４）の塩基配列を示
した図である。
【図５】図５はドットブロットハイブリダイゼーション
分析の結果である。図中、１はＩ０−１断片を、２はＩ
０−２断片を、３はＩ０−３断片を、４はＩ０−４断片
をそれぞれハイブリダイズした結果である。
分析の結果である。図中、１はＩ０−１断片を、２はＩ
０−２断片を、３はＩ０−３断片を、４はＩ０−４断片
をそれぞれハイブリダイズした結果である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ＩＯ−１配列（配列番号：１）の全部
またはその一部を含有するものからなるウシの雄特異的
ＤＮＡ、または該ＤＮＡとハイブリダイズし得るウシの
雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−１（９２ｂｐ） ５’−ＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡ ＧＧＣＡＣＡＧＧＧ
Ｃ ＴＡＡＧＡＡＣＧＧＣ ＡＣＡＣＡＧＴＣＡＣ Ａ
ＣＡＣＡＡＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＡＡＣ
ＣＧＧＴＴＧＣＡＣＡ ＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧ ＣＡＣ
ＡＧＧＧＣＴＧ ＡＧ−３’ 【請求項２】 Ｉ
Ｏ−２配列（配列番号：２）の全部またはその一部を含
有するものからなるウシの雄特異的ＤＮＡ、または該Ｄ
ＮＡとハイブリダイズし得るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−２（１４２ｂｐ） ５’−ＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧ ＧＧＣＴＧＡＧＡＡ
Ａ ＴＣＡＡＡＴＴＡＣＡ ＣＡＣＧＡＧＣＡＡＡ Ａ
ＡＡＡＡＡＣＣＴＣ ＴＴＧＣＡＣＡＧＴＴ
ＧＣＣＡＧＧＧＧＣＡ ＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧ ＡＡＣ
ＧＧＣＡＣＡＣ ＡＣＴＣＡＣＡＴＡＣ ＡＣＡＧＡＣ
ＡＡＴＣ ＣＧＧＴＴＧＣＡＣＡ ＧＴＣＧＣ
ＣＡＧＧＧ ＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧ ＡＧ−３’ 【
請求項３】 ＩＯ−３配列（配列番号：３）の全部ま
たはその一部を含有するものからなるウシの雄特異的Ｄ
ＮＡ、または該ＤＮＡとハイブリダイズし得るウシの雄
特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−３（１７０ｂｐ） ５’−ＴＡＣＡＧＴＣＧＣＣ ＡＧＧＧＣＡＣＡＧ
Ｇ ＧＣＴＧＡＧＡＡＴＴ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ Ｃ
ＣＣＡＡＡＣＡＡＡ ＣＣＴＧＴＴＧＣＡＣ
ＡＧＴＴＧＣＣＡＧＧ ＧＣＡＣＡＧＣＧＣＴ ＧＡＧ
ＴＡＴＧＧＣＡ ＣＡＣＡＣＴＣＡＣＡ ＣＡＣＡＣＡ
ＣＡＣＡ ＡＡＣＣＧＧＴＴＧＡ ＡＣＣＧＴ
ＴＡＣＣＡ ＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧ ＣＴＧＡＧＡＡＣ
ＡＧ ＣＡＣＡＣＡＣＡＴＡ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣ−
３’ 【請求項４】 ＩＯ−４配列（配列番号：４
）の全部またはその一部を含有するものからなるウシの
雄特異的ＤＮＡ、または該ＤＮＡとハイブリダイズし得
るウシの雄特異的ＤＮＡ。 ＩＯ−４（２２４ｂｐ） ５’−ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡ
Ｃ ＡＣＡＣＡＣＡＣＴＣ ＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡ Ｃ
ＡＧＴＣＧＣＣＣＧ ＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣ
ＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣ ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＧ ＡＣＡ
ＣＡＴＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＡＡＣＴＧ ＣＴＴＧＣＡ
ＣＡＧＴ ＣＧＴＣＡＧＧＧＣＴ ＣＡＧＧＧ
ＣＴＧＴＧ ＡＡＴＧＧＣＡＣＡＣ ＡＣＡＡＡＣＡＣ
ＴＧ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣ ＡＣＡＣＡＣＧＡＡＣ
ＡＡＡＣＣＡＴＴＧＣ ＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧ ＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧ ＧＧ
ＣＡＣＡＧＧＧＣ ＴＧＡＧ−３’【請求項５】 請
求項１〜４いずれか記載のＤＮＡの少なくとも１つをプ
ローブとして用いることを特徴とするウシ雌雄の判別方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16352491A JP3201780B2 (ja) | 1991-06-06 | 1991-06-06 | ウシの雄特異的ｄｎａおよびウシ雌雄の判別方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16352491A JP3201780B2 (ja) | 1991-06-06 | 1991-06-06 | ウシの雄特異的ｄｎａおよびウシ雌雄の判別方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04360687A true JPH04360687A (ja) | 1992-12-14 |
| JP3201780B2 JP3201780B2 (ja) | 2001-08-27 |
Family
ID=15775510
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16352491A Expired - Fee Related JP3201780B2 (ja) | 1991-06-06 | 1991-06-06 | ウシの雄特異的ｄｎａおよびウシ雌雄の判別方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3201780B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100679154B1 (ko) * | 2004-08-09 | 2007-02-05 | 진주산업대학교 산학협력단 | 형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4769319A (en) | 1985-05-31 | 1988-09-06 | Salk Institute Biotechnology Industrial Associates, Inc. | Nucleic acid probes for prenatal sexing |
-
1991
- 1991-06-06 JP JP16352491A patent/JP3201780B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100679154B1 (ko) * | 2004-08-09 | 2007-02-05 | 진주산업대학교 산학협력단 | 형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3201780B2 (ja) | 2001-08-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |