JPH04360840A - 血小板減少症治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は血小板減少症治療剤に関
する。

【０００２】

【従来の技術】従来、血小板減少症の治療、及び出血性
疾患の治療には血小板輸血が行われている。血小板輸血
による治療は、材料である血小板を献血によって賄うが
、献血量の不足などの原因により、材料の供給は必ずし
も満足すべき状態ではない。また、頻回の輸血は患者に
とって苦痛であるうえ、主要組織適合性抗原の不一致、
混入した赤血球等の血液型不適合によって、しばしば拒
絶反応、ショック症状を呈することが知られている。さ
らに、輸血材料に由来するウイルスに感染し、肝炎、間
質性肺炎、エイズ等のウイルス性疾患を発症する場合が
あり、輸血を行ううえで問題となっている。

【０００３】いっぽう、最近ポリペプチド、インターロ
イキン６（以下ＩＬ−６と略す、ＩＬ−６はＢＣＤＦ、
ＢＳＦ−２とも称せられるが、本発明ではＩＬ−６と言
う表現で統一することにする。）が、血小板生成作用を
有することが示され、血小板減少症ならびに出血性疾患
の治療において血小板輸血に替わる治療薬として応用で
きることが示された（特開平３−１０１６２４）。また
、ＩＬ−６以外のインターロイキン３（以下ＩＬ−３と
称する）、インターロイキン１（以下、ＩＬ−１と称す
る）、顆粒球コロニー刺激因子（以下、Ｇ−ＣＳＦと称
する）についても同様の効果が報告されている。従って
ＩＬ−６等の造血因子は血小板減少症治療剤として有用
であるが、ＩＬ−６等の因子との併用あるいは単独で血
小板生成に有効な因子が新たに見いだされれば更に優れ
た治療効果が期待できる。

【０００４】

【本発明が解決しようとする課題】血小板輸血に替わる
血小板減少症治療剤として、より効果的で副作用の少な
いものが望まれている。本発明の課題は、単独あるいは
ＩＬ−６等の因子との併用により血小板生成に有効な因
子をヒト細胞の産生する種々の蛋白質の中から見つけ出
し、血小板減少症の治療に役立つ新規な薬剤を提供する
ことにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決するために種々のヒト細胞の生産物について血小板
生成に有効な活性を検索した結果、ヒト悪性単球細胞を
特定の分化誘導物質の共存下で培養することによって生
産されるポリペプチドＢＵＦ−３又はその類縁体である
ＢＵＦ−４、及びＢＵＦ−５のいずれもがマウスの血小
板生成に有効であることを見いだし、本発明を完成する
に至った。すなわち、本発明はポリペプチドＢＵＦ−３
、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５の内１種類以上の物質を有
効成分として含有することを特徴とする薬である。ポリ
ペプチドＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５の理化
学的性質は以下の通りである。

【０００６】（１）　　ポリペプチドＢＵＦ−３（以下
ＢＵＦ−３とする）の理化学的性質 （ａ）構造；単量体Ａ（配列表の配列番号１参照）のホ
モダイマー （ｂ）分子量；単量体として１６±１ｋｄ（１％メルカ
プトエタノール存在下、ＳＤＳ電気泳動法）ホモダイマ
ーとして２５±１ｋｄ（メルカプトエタノール非存在下
、ＳＤＳ電気泳動法） （ｃ）熱安定性；６５℃，６０分の加熱で安定（ｄ）プ
ロナーゼ耐性；プロナーゼ処理で失活（ｅ）アミノ酸配
列；単量体Ａのアミノ酸配列は配列表の配列番号１に示
す （２）　　ポリペプチドＢＵＦ−４（以下ＢＵＦ−４と
する）の理化学的性質 （ａ）　　構造；単量体Ａ及び単量体Ｂ（配列表の配列
番号２参照）のへテロダイマー （ｂ）分子量；単量体として１６±１ｋｄ（１％メルカ
プトエタノール存在下、ＳＤＳ電気泳動法）へテロダイ
マーとして２５±１ｋｄ（メルカプトエタノール非存在
下、ＳＤＳ電気泳動法） （ｃ）熱安定性；６５℃，６０分の加熱で安定（ｄ）プ
ロナーゼ耐性；プロナーゼ処理で失活（ｅ）アミノ酸配
列；単量体Ａのアミノ酸配列は配列表配列番号１に、単
量体Ｂのアミノ酸配列は配列表配列番号２に示す （３）　　ポリペプチドＢＵＦ−５（以下ＢＵＦ−５と
する）の理化学的性質 （ａ）構造；単量体Ｂ（配列表配列番号２参照）のホモ
ダイマー （ｂ）分子量；単量体として１６±１ｋｄ（１％メルカ
プトエタノール存在下、ＳＤＳ電気泳動法）ホモダイマ
ーとして２５±１ｋｄ（メルカプトエタノール非存在下
、ＳＤＳ電気泳動法） （ｃ）熱安定性；６５℃，６０分の加熱で安定（ｄ）プ
ロナーゼ耐性；プロナーゼ処理で失活（ｅ）アミノ酸配
列；単量体Ｂのアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示
す

【０００７】尚、本発明に係るＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４
、ＢＵＦ−５とは、配列表の配列番号１及び２に示され
たアミノ酸配列と全く同一の配列を有しなくとも血小板
減少症治療効果を有すれば、その物質は本発明のＢＵＦ
−３、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５に含有されるものとす
る。すなわち、配列表の配列番号１又は配列番号２に示
すアミノ酸配列中の１個又は複数のアミノ酸を他のアミ
ノ酸に置き換えた構造のポリペプチド、及び当該配列に
おいて１個もしくは複数個のアミノ酸がＮ末端又はＣ末
端に付加されたポリペプチド、更には当該配列のＮ末端
またはＣ末端より１個もしくは複数のアミノ酸が欠損し
、かつ連続しているアミノ酸配列より成るポリペプチド
も含まれるものとする。

【０００８】ＢＵＦ−３はマウスフレンドウイルス誘発
白血病細胞Ｆ５−５に対する分化誘導作用を指標に精製
されたポリペプチドである。また、ＢＵＦ−３はマウス
白血病細胞を正常細胞に分化成熟せしめる活性（特開昭
６２−２４０７００、６２−２３４０９７）以外にも、
貧血防止作用（特開昭６２−２４０７００）及び、卵胞
刺激ホルモン分泌作用（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，７７６
−７７９，（１９８６））を併せ持つ有用な物質である
。

【０００９】尚、ＢＵＦ−３はＥＤＦ（Ｅｒｙｔｈｒｏ
ｉｄ　　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　　Ｆａｃｔ
ｏｒ）ともＦＲＰ（ＦＳＨ　　Ｒｅｒｅａｓｉｎｇ　　
Ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれているが本発明では従来か
ら用いられているＢＵＦ−３という名称を用いることに
する。 一方、ＢＵＦ−４が卵胞刺激ホルモン分泌作用を有する
ことは既に報告されている（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，７
７６−７７９，（１９８６））。尚、ＢＵＦ−４はアク
チビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）とも称されているが、本発明
においてはＢＵＦ−４という名称を用いることにする。 さらに、ＢＵＦ−５は特開昭６３−１１９６７９号公報
に開示されている物質である。上述のようにＢＵＦ−３
、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５には卵胞刺激ホルモン分泌
作用等の作用を有することは既に知られているが、本発
明のごとき血小板生成作用については全く報告されてい
ない。

【００１０】さて、本発明のＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４及
びＢＵＦ−５のいずれの物質も、動物実験でＩＬ−６等
の造血因子との併用あるいは単独投与によって優れた血
小板生成促進作用を有し、またマウス及びヒトの培養細
胞に対して毒性を示さないことにより、血小板減少症の
治療に安全、かつ有効であると考えられる。

【００１１】本発明の血小板減少症治療剤はＢＵＦ−３
、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５のうち１種類以上の物質を
有効成分として含有するものであるから、上記有効成分
を単独で含有するものでもよいし、また、２種類以上の
物質を組み合わせて含有するものでもよい。更に助剤と
して、ＩＬ−６，ＩＬ−３、ＩＬ−１及びＧ−ＣＳＦの
内１種類以上の物質を含有させても良い。特にＩＬ−６
と組み合わせて用いた場合には優れた効果を呈する。 本発明の血小板減少症治療剤はＩＬ−６等の因子の投与
に前後して、或は同時に用いることにより最も効果を発
揮するが、単独の使用でも効果が期待できる。本治療剤
は主として非経口的（静脈内、皮下、筋肉内、経皮、経
粘膜）に投与される。前記有効成分の投与量は、ＢＵＦ
−３，ＢＵＦ−４又はＢＵＦ−５のいずれか１つの物質
のみを単独で用いる場合は、いずれの物質を用いる場合
でも、通常成人１日あたり約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ
であり、これを１回又は数回に分けて投与すれば良い。 また、２種類以上を組み合わせて投与する場合（即ち、
（ａ）ＢＵＦ−３とＢＵＦ−４、（ｂ）ＢＵＦ−３とＢ
ＵＦ−５，（ｃ）ＢＵＦ−４とＢＵＦ−５、（ｄ）ＢＵ
Ｆ−３、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５）も、各物質の薬効
はほぼ等しいことより、通常成人１日あたり約０．０１
ｍｇ〜１００ｍｇを１回または数回に分けて投与すれば
良い。もちろん、投与量は患者の血小板数、病状、患者
の体重及び当業者が認める他の因子によって変化するの
で、上記投与量を厳守する必要はなく、臨機応変に決定
すればよい。また、助剤としてＩＬ−６等の造血因子を
もちいる場合のその投与量も特に制限はないが、通常成
人１日あたり約０．０１ｍｇ−１００ｍｇ投与すれば良
い。

【００１２】本発明に使用するＢＵＦ−３等の有効成分
の製剤化は通常の方法によって行われ、主として注射剤
とされるが、他にカプセル剤、錠剤等の剤形へ製剤化さ
れても良い。注射剤を調製する場合には主薬のＢＵＦ−
３及び／またはＢＵＦ−４及び／またはＢＵＦ−５に必
要により、ＩＬ−６等の助剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安
定化剤、保存剤などを添加し、常法により静脈内、皮下
、筋肉内用注射剤とすればよい。また、経口用製剤を調
製する場合は主薬のＢＵＦ−３及び／又はＢＵＦ−４及
び／またはＢＵＦ−５に賦形剤、さらに必要に応じてＩ
Ｌ−６等の助剤、結合剤、崩壊剤、着色剤等を加え常法
により錠剤、カプセル剤等としても良い。注射剤、錠剤
、カプセル剤等の製剤中のＢＵＦ−３及び／又はＢＵＦ
−４及び／又はＢＵＦ−５の含量は製剤を１００とした
場合、通常０．０１−１００重量部、好ましくは０．１
−１０重量部にすれば良い。

【００１３】次に、本発明に使用するＢＵＦ−３、ＢＵ
Ｆ−４及びＢＵＦ−５の製造法について、以下に説明す
る。まず、ＢＵＦ−３であるが、ＢＵＦ−３を産生する
ヒト悪性単球細胞としては、ヒト白血病細胞またはヒト
骨髄細胞を人為的に悪性化させたもの、より具体的には
次のようなものがある。ヒト慢性骨髄性白血病細胞とし
てはＵ−９３７細胞（ＡＴＣＣ　　ＣＲＬ　　１５９３
　　、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１７：５６５（１９７
６）），Ｋ５６２細胞（Ｂｌｏｏｄ４５：３２１（１９
７５））、急性単球性白血病細胞としてはＴＨＰ−１細
胞（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２６：１７１−１７６（
１９８０））等を挙げることができる。もちろん、ＢＵ
Ｆ−３を生産していれば、上記以外のヒト白血病細胞を
用いても構わない。　　さて特定の分化誘導物質は、悪
性化単球細胞と接触させた時、この細胞をマクロファー
ジ、顆粒球細胞に分化誘導させると共に、ＢＵＦ−３を
生産せしめる作用を有する物質であり、具体的にはアク
チノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、コンカナバリンＡ
及びホルボールエステル（ＴＰＡ）等の特定の分化誘導
物質である。

【００１４】本発明のＢＵＦ−３を生成せしめる方法は
、悪性化単球細胞を少なくとも１種又は２種以上の上記
特定の分化誘導物質共存下で培養することによりなされ
、ＢＵＦ−３は培養液中（細胞外）に産生される。細胞
を培養する培地は、動物細胞を培養する通常の培地が用
いられ、通常１〜５ｘ１０６個／ｍｌの密度で、３５〜
３８℃にて４〜６％の炭酸ガス気流中で緩やかにかくは
んしつつ行われる。特定の分化誘導物質は、通常培養の
最初より培地に添加しても良く又培養の途中から添加し
てもよい。添加量は分化誘導物質の種類によって異なる
がアクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ等の場合には
０．１〜１０μｇ／ｍｌ、ＴＰＡの場合には１〜５００
μｇ／ｍｌである。このようにして１〜５日間培養する
とＢＵＦ−３は培養液中に蓄積される。

【００１５】また、ＢＵＦ−３の生産は組換えＤＮＡ法
による生産法を用いても構わない。組換えＤＮＡ法はＢ
ＵＦ−３をコードする遺伝子すなわち、単量体Ａを含有
するプラスミドにより形質転換された真核動物細胞（具
体的にはＩＦＯ−５０１４６等）を培養液中で培養し、
培養液中に当該ＢＵＦ−３を製造せしめるというもので
ある（特開昭６４−２５８０，　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５１，２３０
−２３５（１９８８））。

【００１６】ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５の生産は組換え
ＤＮＡ法によるＢＵＦ−３の生産に準じて行われる。Ｂ
ＵＦ−４を生成せしめる方法は、ＢＵＦ−４をコードす
る遺伝子、即ち単量体Ａ及び単量体Ｂを含有するプラス
ミドにより形質転換された真核生物を培養液中で培養し
、培養液中にＢＵＦ−４を製造させればよい（特開昭６
３−１１９６７９）。またＢＵＦ−５を生成せしめる方
法はＢＵＦ−５をコードする遺伝子、即ち単量体Ｂを含
有するプラスミドにより形質転換された真核生物を培養
液中で培養し、培養液中にＢＵＦ−５を製造させればよ
い（特開昭６３−１１９６７９）。

【００１７】さて、このように生産されたＢＵＦ−３も
しくはＢＵＦ−４もしくはＢＵＦ−５の精製は通常のポ
リペプチドの精製法に従って行われる。例えば培養液を
限外濾過法で濃縮し、この濃縮液からポリペプチドを塩
析し、透析後陰イオン交換体を使用するイオン交換クロ
マトグラフィーを行うことにより粗ポリペプチド標品が
得られる。この粗標品について疎水クロマトグラフィー
またはクロマトフォーカシング法によりほとんどの夾雑
蛋白が除去される。またこの両者を組み合わせるとさら
に精製倍率を向上することができる。このようにして精
製した標品について逆相高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）またはスーパーローズまたはＭｏｎｏＱ　　
ＨＲ５／５カラムを装備したＦＰＬＣ（ファルマシア製
ＦａｓｔＰｒｏｔｅｉｎ　　Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｐｏｌ
ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　　Ｌｉｑｕｉｄ　　Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）システムによる高性能ゲル濾過
法またはイオン交換クロマトグラフィーを行うことによ
り精製することができる。また、上述のようなポリペプ
チドの一般的精製法とは別に本発明者等が開発した所定
の濃度の有機酸を含む有機溶媒を駆使する精製法（特願
昭６３−１３１２６８）を用いて精製しても構わない。

【００１８】ＢＵＦ−３は、フレンドウイルス誘発白血
病細胞Ｆ５−５（Ｂｉｂｌ．Ｈａｅｍａｔ．，４３，３
７（１９７６））に対する分化誘導作用を有するので、
この作用を利用してＢＵＦ−３の定性及び定量分析がで
き、Ｆ５−５を用いる分析は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，７１，９８，（１９７５）に記載の
方法にしたがって行われる。また活性の表示はＦ５−５
細胞分化が明瞭に確認される検体原液の希釈率の逆数の
値を原液１．０ｍｌ当りの活性とする。この発明方法で
ＢＵＦ−３を生産したとき、培養液は４〜１０００単位
／ｍｌの活性を示す。このようにして目的とするＢＵＦ
−３が生産される。尚、本方法の詳細は特開昭６２−２
３４０９７号公報、特開昭６２−２４０７０号公報に記
載されている。

【００１９】以下、本発明を実施例に従って具体的に説
明する。

【００２０】（実施例１）Ｃ５７／ＢＬ６マウス（雄、
９週令、日本チャールズリバー（株））を用い、１群４
匹を被験動物として用いた。実験群は、対照群、ＢＵＦ
−３単独投与群、ＩＬ−６単独投与群、およびＢＵＦ−
３とＩＬ−６の併用投与群の４群構成とした。ＢＵＦ−
３投与は以下の方法で行った。すなわち、前述の方法で
得られたＢＵＦ−３を、１０ｍＭ酢酸を含む注射用蒸留
水に溶解し、５０μｇ／ｍｌの投与液を調製し、ミニ浸
透圧ポンプ（米国ＡＬＺＡ社製　　ｍｏｄｅｌ２００１
）に充填した。実験開始１日目にＢＵＦ−３単独投与群
及びＢＵＦ−３とＩＬ−６の併用投与群マウスをエーテ
ル麻酔下で開腹したのち、腹くう内に上記ミニ浸透圧ポ
ンプを移入し、直ちに開腹部を縫合した。対照群及びＩ
Ｌ−６単独投与群マウスには１０ｍＭ酢酸のみを含む注
射用蒸留水を充填したミニ浸透圧ポンプを同じ方法で腹
くう内に移入した。ミニ浸透圧ポンプは、充填した投与
液を一定速度で７日間にわたって放出し続ける装置であ
る。本実験に用いたｍｏｄｅｌ２００１は、放出速度１
μｌ毎時なので、ＢＵＦ−３は５０ｎｇ毎時の速度で実
験開始８日目まで連続的に腹くう内に投与される。

【００２１】ＩＬ−６投与は以下の方法で行った。Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，３０−３４，（１９８９）
に記載されている方法で得られたＩＬ−６をＣ５７／Ｂ
Ｌ６マウスより得られたマウス血清０．２％を含む注射
用生理的食塩水に溶解し、５μｇ／ｍｌの投与液を調製
した。実験開始７日目からＩＬ−６単独投与群およびＢ
ＵＦ−３とＩＬ−６併用投与群マウスには上記投与液を
１回０．１ｍｌ（ＩＬ−６　　０．５μｇ）１日２回皮
下注射投与を５日間おこなった。対照群およびＢＵＦ−
３単独投与群にはマウス血清０．２％のみを含む注射用
生理的食塩水を同じ方法で投与した。

【００２２】各実験群のマウスを実験開始１２日目に屠
殺後、ただちに大腿骨を摘出し骨髄中のＣＦＵ−Ｍｅｇ
細胞（血小板を生成する巨核球細胞の前駆細胞）の数を
Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，７，３４５−３５１，（１
９７９）に記載されている方法で測定した。測定結果を
表１に示した。ＢＵＦ−３とＩＬ−６併用投与群のＣＦ
Ｕ−Ｍｅｇ数は骨髄細胞４万個あたり平均１８．３個で
、対照群の平均１０．０個に比べて有意に多いのみなら
ず、ＩＬ−６単独投与群の平均１２．０個に対しても有
意に多かった。

【００２３】

【表１】

【００２４】つぎに、各実験群マウスの骨髄中の巨核細
胞の成熟度を以下の方法で比較した。すなわち、巨核球
細胞の成熟度は細胞の大きさに反映されるため、摘出し
た大腿骨の切片標本から倍率４００倍の顕微鏡写真を作
製し、写真上の各巨核球細胞の直径をノギスにて測定し
た。各実験群について巨核球細胞６９ないし７２個の直
径を平均した結果を表２に示した。ＢＵＦ−３単独投与
群、およびＢＵＦ−３とＩＬ−６併用投与群ではいずれ
も平均７．０ｍｍであり、対照群の６．６ｍｍに対し有
意に大きく、ＢＵＦ−３投与により、巨核球細胞の成熟
が促進された。

【００２８】

【表２】

【００２９】（実施例２）上記実施例１と同様の条件で
ＢＵＦ−５の投与効果を検討した。９週令の雄Ｃ５７／
ＢＬ６マウスを用い、１群４匹を被験動物として用いた
。実験群は、対照群、ＢＵＦ−５単独投与群、ＩＬ−６
単独投与群、及びＢＵＦ−５とＩＬ−６の併用投与群の
４群構成とした。ＢＵＦ−５投与は前述の方法で得られ
たＢＵＦ−５を１０ｍＭ酢酸を含む注射用蒸留水に溶解
し５０μｇ／ｍｌとした投与液を用い、実施例１におけ
るＢＵＦ−３と同様の方法で行った。また、ＩＬ−６投
与は実施例１と同一の条件で行った。

【００３０】骨髄中のＣＦＵ−Ｍｅｇ細胞数はＢＵＦ−
５とＩＬ−６の併用投与群において対照群ならびにＩＬ
−６単独投与群よりも有意に多かった。また、巨核球細
胞の平均直径はＢＵＦ−５単独投与群ならびにＢＵＦ−
５とＩＬ−６の併用投与群に於て対照群及びＩＬ−６単
独投与群よりも有意に大きい値であった。

【００３１】

【本発明の効果】本発明に係るＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４
及びＢＵＦ−５の内、１種類以上の物質を有効成分とす
る血小板減少症治療剤は、骨髄に作用して血小板を生成
する巨核球細胞の成熟を促進するのみならず、ＩＬ−６
等の造血因子と併用することにより、巨核球の前駆細胞
を増加させるため、血小板減少症の治療に有効である。 また、従来の治療法である血小板輸血の問題点である、
拒絶反応やウイルス感染などが原理的に発生しない。従
って本発明の血小板減少症治療剤は従来用いられている
血小板輸血に替わる優れた治療剤として使用できる。Ｂ
ＵＦ−３、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５はヒト由来蛋白な
ので抗原性が低く、アレルギーを起こしにくい為に長期
間の使用が可能である。本発明に係る血小板減少症治療
薬はＩＬ−６との併用により完全な効果を発揮するが、
単独あるいは他の造血因子との併用によっても効果を期
待し得る。

【配列表】

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ポリペプチドＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４
   及びＢＵＦ−５の内１種類以上の物質を有効成分として
   含有する血小板減少症治療剤
2. 【請求項２】　　助剤として更にインターロイキン６、
   インターロイキン３，インターロイキン１及び顆粒球コ
   ロニー刺激因子の内、１種類以上の物質を含有してなる
   請求項１記載の血小板減少症治療剤。