JPH0436183A

JPH0436183A - 遺伝マーカーを持ち両親株と遺伝的性質の異なる突然変異株の作出方法

Info

Publication number: JPH0436183A
Application number: JP2142331A
Authority: JP
Inventors: Osamu Tanno; 修丹野; Takeshi Koba; 木葉　丈司; Masako Fujii; 藤井　雅子; Kazuyoshi Morita; 和良森田; Takahiko Baba; 隆彦馬場; Masaaki Yamauchi; 山内　政明
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1990-05-30
Filing date: 1990-05-30
Publication date: 1992-02-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、しいたけの品種改良等に用いられる、遺伝マ
ーカーを持ち両親株と遺伝的性質の異なる突然変異株を
、−度に多数作出する方法に関する。

（従来の技術〕昨今、バイオテクノロジーの発展に伴い、きのこの品種
改良技術として、細胞融合の研究が行われている。

なかでも、食用として価値の高いしいたけは、細胞融合
によって子実体を形成できたという報告がなく、細胞融
合技術を品種改良に応用することは、行われていなかっ
た。

種内１種間の細胞融合を進めるには、融合株の選択を可
能にする為、遺伝マーカーのついた株を作製することが
必要である。

遺伝マーカー株を作出する為には、目的とする菌糸をプ
ロトプラスト化するか或いは１〜数細胞の菌糸片にし、
これらのプロトプラスト或いは菌糸片に対して紫外線照
射または、薬剤処理等を行うという方法がとられている
。

しかし、紫外線照射や薬剤処理では、致死せず再生した
プロトプラスト（生存細胞）が、目的とする代謝系のみ
を完全に阻害され、他の部分は正常である（つまり遺伝
マーカー株として使用できる）確率は、多くて生残細胞
１０３〜１０“個のうちの１個と極めて少なく、目的と
する遺伝因子を持った遺伝マーカー株を多量に得ること
は大変困難であった。

また、復帰突然変異という問題もあり、安定した遺伝マ
ーカーを持つ株を作出する方法が強く望まれていた。

〔発明が解決しようとする諜Ｈ〕

従って本発明の目的は、少ない労力でしかも確実に、安
定した遺伝マーカーを持ち両親株と遺伝的性質の異なる
しいたけの突然変異株を、多数作出する方法を提供する
ことにある。

〔課題を解決する為の手段〕

本発明は、両方又は一方に遺伝マーカーのついたしいた
けの菌糸同士を交配または細胞融合し、得られた２核菌
糸を培養し、発生した子実体より担子胞子を分離・培養
することを特徴とする遺伝マーカーを持ち両親株と遺伝
的性質の異なる突然変異株を作出する方法である。

本発明で言う遺伝マーカーとは、菌糸体での生理的特性
マーカー（栄養要求性、薬剤耐性等）のことである。

本発明に用いられるしいたけ菌糸の例としては、例えば
鐘紡保存菌株ＫＢＬ−０８（微工研薗寄第１１４３６号
）、ＫＢＬ−１４（微工研菌寄第１１４３５号）等が挙
げられる。しいたけ菌糸はこれらに限られるものではな
く、子実体形成が可能であれば良いが、上記ＫＢＬ−Ｏ
８，ＫＢＬ、−１４は、菌床栽培において容易に栽培で
き、子実体が早期に得られる点で好ましい。

また、しいたけ以外にも、あらげきくらげ、えのきたけ
、きくらげ、くりたけ、しろたもぎたけ。

たもぎたけ、つくりたけ、なめこ、まいたけ、むきたけ
等、人工栽培が可能な他のきのこについても本発明を応
用することができる。

本発明の突然変異株作出方法は、例えば次の様にして行
うことができる。

目的とする一核菌糸を、プロトプラスト化するか或いは
適量の無菌水とともにミキサーにかけて１〜数細胞の菌
糸片にする。

これに紫外線を照射又は薬剤処理（Ｎ−メチルＮ′−二
トローＮ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルフォ
ネート等）を行い、遺伝マーカー株を作成する。

この遺伝マーカーを持つ１核菌糸をセルラーゼ・キチナ
ーゼを組み合わせた細胞壁溶解酵素によって、再びプロ
トプラスト化する。（細胞壁熔解酵素はこの他ザイモリ
アーゼ、β−グルクロニダゼ等を組み合わせたもの等も
用いることができる。）得られたプロトプラストを用いて細胞融合或いは交配を
行うが、以下にその方法の例を示す。

電気融合法；平行電極間にプロトプラストを浮遊させ、
交流電圧をかけることによりバールチェーンを形成させ
た後、直流の高圧パルス電圧を印加することによりプロ
トプラストを融合せしめる。

ポリエチレングリコール融合法（ＰＥＧ法）；常温下に
おいてＡｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ。

２２．１２１−１２７．１９８５記載の方法によって融
合を行う。

この他、高Ｃａ’−高ＰＨ法等によっても、細胞融合を
行うことができる。

融合細胞を、ンユークロース等の浸透圧調整剤を含む寒
天培地で培養することによって、菌糸体を再生すること
ができる。

交配には自然交配、ダイ・モン交配等がある。

自然交配；２種類のしいたけ１核菌糸を寒天培地上に約
１ｃｍ離して植菌し、一定温度・暗黒下で１〜２週間培
養する。２種の菌糸の接触した付近から伸長してきた、
クランプコネクションを持った２核菌糸を単離し、再度
培養する。

これらの細胞融合・交配におけるマーカーは、２種の菌
糸の両方につけても良いが、片方のみにつけても良い。

（細胞融合の場合はマユュピュレーノクンによって融合
株を選択できる。）上記の様にして得られた２核菌糸を
、原木１通常用いられるきのこ用培地、もしくは人工横
木等の菌床を用いて栽培し、子実体を形成さセる。

この子実体より胞子を分離し、遺伝マーカーを持つ株を
選択する。

これらの遺伝マーカーを持つ株の接合型（不和合性因子
）等の遺伝的性質を調べれば、両親株と性質の異なる突
然変異株が多数得られていることがわかる。

以下実施例によって、本発明を更に詳細に説明する。

実施例ＩＫＢＬ−０８の２核菌糸より子実体を形成し、単胞子分
離を実施して一核菌糸を得た。この−核菌糸に紫外線照
射を寞施し、常法によりイノシトール要求性の突然変異
株（以後Ｘ　（ｉｎｏ−）とする）を作出した。

（２核菌糸ＫＢＬ−０８は、当社保存シイタケの子実体
より単胞子分離したものである。この子実体は傘型につ
いては山型、大きさは中位、肉質。

厚さともに中位、原木栽培自然発生温度帯については、
１１〜５月の中低温性菌である。菌糸はＰＤＡ培地上に
、白色綿毛状のコロニーを形成する。

最適培養温度は２５°Ｃであり、生長速度は５．５０／
ｄａｙである。〕一方、生シイタケより単胞子分離して得た一核菌糸ＫＢ
Ｌ−１４に紫外線を照射し、ロイシン要求性突然変異株
（以後Ｙ　（１ｅｕ−）とする）を作出した。

（この生シイタケの子実体は、硬質、傘型やや山型２中
肉、大きさ中位である。原木栽培自然発生温度帯は、１
１〜４月の低温性菌である。菌糸はＰＤＡ培地上に白色
綿毛状のコロニーを形成する。

最適培養温度は２５°Ｃであり、生長速度は５．０ｍｍ
／ｄａｙである。）Ｘ　（ｉｎｏ−）とＹ　（ｊ！　ｅｕ−）は交配により
、２核菌糸を形成することができる組みあわせである。

Ｘ　（ｉｎｏ−）とＹ　（ｌ　ｅｕ−）を、それぞれＭ
ＹＧ寒天培地（１，０％マルトエキス、０．４％イース
トエキス　０．４％グルコース、１．５％寒天；ｐＨ４
，５）に植菌し、１〜２週間培養した。

培養した菌糸を細片化し、１００ｍｆｆ１フラスコに１
０ｍｆｆ１入れたＭＹＧ液体培地（１，０％マルトエキ
ス、０．４％イーストエキス、０．４％グルコース、Ｐ
Ｈ４，５）に植菌し、４日間静置培養した。

得られた菌糸体を無菌的に堀遇し、５０ｍＭコハク酸−
ＮａＯＨ緩衝液（０，５８Ｍマンニトール含有、ｐＨ４
，５）で数回洗浄した後、菌糸体１００ｍｇをキャップ
付試験管にとり、これに酵素液（セルラーゼ　オノズカ
　Ｒ３（ヤクルト社製）３０ｍｇ／ｍｊ２．キチナーゼ
（シグマ社製）１ｍｇ／ｍＥを含ｔ０．６　Ｍマンニト
ール５０ｍＭコハク酸Ｎａ０ＨＩｌ衝液、ｐＨ４，５）
を１ｍｌ加え、３０°Ｃで２時間振盪培養し、Ｘ　（ｉ
ｎｏ−）とＹ　（ｌ　ｅｕ−）各々のプロトプラストを
得た。

次に、１２０μｍと６０μｍのナイロンメツツユでろ過
後、８００ｒｐｍで５ｍ１ｎ遠心分離し、菌糸残金を除
去する。プロトプラストを含む上清を再び２８０Ｏｒｐ
ｍで５ｍ１ｎ、遠心分離することにより、精製したプロ
トプラストを得た。

この沈澱を１ｍｆの０．６　Ｍマンニトールに懸濁し、
血球計算板を用いてプロトプラストの数を測定する。

そしてこれら２種の精製したプロトプラストを１＝１の
割合で混合し、再び２８０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離を
した後、０．６Ｍマンニトール溶液（１，０ｍＭＣａＣ
ｆｆ１２含有）中に、約３．０Ｘ１０’個／ｍｌとなる
ように懸濁し、島津電気融合装置の融合チ十ンハーＣ−
０２に添加した０本体の接続後、交流電圧ＶＡｃ””４
０Ｖで約１分間通電してバールチェーンを作り、次に直
流パルス〜’ＤＣ＝４０ｋＶ／ｃｍ、パルス中！１ＰＷ
＝３０　ｕ　ｓ　ｅ　ｃ　　パルス印加回数ｎ＝３の条
件で融合を行った。最終パルスの印加後約２０分間静置
し、二の融合懸濁液を１０’−１０’個／　ｍ　ｌに希
釈し、１００μｌを再往用寒天培地（マンニトール０．
６Ｍ、　ブドウ１１２ｇ、酒石酸アンモニウム０．２ｇ
、Ｍｇ５０・７　ＨｚＯ：　０．０５　ｇ、ＫＨ２ＰＯ
，：０．ｌ　ｇ、　　ＮａｚｃＯｓ：　０．１　ｇ、　
　フマル酸：　０．１　ｇＦ　ｅｚ（Ｓｏｎ）＝：　１
．Ｏｍｇ、Ｚｎｓ○、−７８，０１、Ｏｍｇ、Ｍｎ５Ｏ
ａ・４８ｚＯ：　１．Ｏｍｇ、　チアミン−ＨＣｌ　：
　１Ｏａｇ、　寒天１．２ｇ、／水１００ｍｊ２）に塗
布した。暗条件、２５°Ｃ１相対湿度７０％で１０日間
培養し、増殖したコロニを分取した。

再生用寒天培地は、イノシトールもロイシンも含まない
ことから、再生したコロニーはＸ　（ｉｎｏ−）とＹ（
ｊ！ｅｕ−）の融合株と考えられる。

このようにして得られた融合株１３株を、鋸屑・米糠よ
りなる培地を用い、人工横木で３ケ月間栽培したところ
、６株について子実体が得られた。

この内の４株から、１株につき１個の子実体を選びだし
く■〜■）、常法により胞子を分離した。

分離した胞子をｌＯ〜１０３個／ｍ４に希釈してＭＹＧ
寒天培地に塗布し、２５°Ｃ暗黒下で約６日間培養し、
発芽してきた菌糸２２７株を単離して、それぞれの栄養
要求性を検討した。

第　　１　　表（単位：株）第１表に示した通り、栄養要求性マーカー（ｉｎｏ−、
ｊ２ｅｕ−又は１ｎｏ−・ｆｅｕ−）のついた株が合計
１２７株得られた。

次に、両親味と遺伝的性質の異なる株ができているかど
うか調べる為に、これらの栄養要求性マーカー株の接合
型（不和合性因子）を、クランプコネクシタンの形成の
有無を画べることによって検討した。

子実体■から得られたイノシトール要求株（１５株）及
びロイシン要求株（８株）について調べた結果を第２表
に示す。

尚、融合の親株Ｘ　（ｉｎｏ−）の接合型をＡＩＢＩＹ
（ｌｅｕ−）の接合型を４２Ｂ２とする。

第２表かられかる通り、同し栄養要求性の株の中にも、
４タイプの接合型のものが存在し、遺伝マーカーを持ち
両親味と遺伝的性ｔ（接合型）の異なる突然変異株は、
１３株（Ａ２Ｂ１　；６株、　ＡｌＢ２；７株）得られ
た。

また、接合型が両親味と同し型の１０株（ＡＩＢＩ；４
株、　Ａ２Ｂ２　；　６株）についても、他の遺伝的性
質を調べれば、両親味と性質の違うものが見つかる可能
性がある。

実施例２ＫＢＬ−０８のイノシトール要求性突然変異株Ｘ　（ｉ
ｎｏ−）と栄養要求性のないＫＢＬ−１４正常株（以１
ｚとする）をＭＹＧ″Ｎ天培地に約１ｃｍＭして植菌し
、２５°Ｃ１暗μ下で１〜２週間培養した。

Ｘ　（ｉｎｏ−）とＺの菌糸が接触した付近から伸長し
てきた、クランプコ不りンゴンを持った２核菌糸を単離
し、ＰＤＡ培地（２０％馬鈴薯抽出物、２％グルコース
、２％寒天）で再度約１０日間培養した後、人工横木を
用いて培養した。

形成した子実体から得た胞子由来の一核菌糸１０９株の
栄養要求性を検定した結果を第３表に示す。

更ムこイノシトール要求株７９株のうちの１６株につい
て、接合型を調べた結果を第４表に示す。

尚、交配に用いた親株Ｘ　（ｉｎｏ−）の接合型をＡＩ
ＢＩ鋸屑・米糠より成る培地を用い、人口横木で３ヶ第
４表かられかる通り、遺伝マーカーを持ち両親株株と遺
伝的に性質の異なる突然変異株が、８株（４３ＢＩ　；
　４株、　ＡｌＢ５；　４株）得られた。

また、残りの８株（ＡＩＢＩ　；　２株、＾３Ｂ３ｉ６
株）についても、他の遺伝的性質を調べれば、両親株と
性質の異なる株が見つかる可能性がある。

実施例３ＫＢＬ−０８−核菌糸に紫外線照射を実施し、イノシト
ール要求性変異株（以後Ｘ　（ｉｎｏ−）とする）とロ
イシン要求性変異株〔以後Ｐ（ｊ！ｅｕ−）とする）の
２種の栄養要求性突然変異株を作出した。

Ｘ　（ｉｎｏ−）とＰ（ｆｆｉｅｕ−）は交配により、
２核菌糸を形成することができる組みあわせである。

Ｘ　（ｉｎｏ−）とＰ（ｆｅｕ−）を用いて実施例１と
同様に細胞融合を行い、得られた融合株１ｏ株を月間栽
培したところ、３株について子実体が得られた。

二の中から、１株につき１個の子実体を選びだしく■〜
■）、常法により胞子を分離した。

分離した胞子を１０〜１０３個／　ｍ　ｌに希釈してＭ
ＹＧ″ＩＭ天培地に塗布し、２５℃暗早下で約６日間培
養し、発茅してきた菌糸を、各子実体由来の菌糸より５
０株ずつ（合計１５０）株を単離して、それぞれの栄養
要求性を検討した。

第５表に示した通り、栄養要求性マーカー（ｉｌｏ−、
ｌ　ｅｕ−又は１ｎｏ−・！Ｖ、ｅｕ−）のついた株計
９７株得られた。

子実体■から得られたイノシトール要求株（１６株）及
びロイシン要求株（７株）について接合型を調べた結果
を第６表に示す。

尚、融合の親株Ｘ　（ｉｎｏ−）の接合型をＡＩＢＩ。

第６表かられかる通り、同し栄養要求性の株の中にも、
４タイプの接合型のものが存在し、遺伝マーカーを持ち
両親株と遺伝的性ｆ（接合型）の異なる突然変異株は、
１３株（Ａ４８１　：６株、　ＡＩＢ４ニア株〕得られ
た。

また、接合型が両親株と同し型の１０株（ＡＩＢ！：４
株、　Ａ４Ｂ４　；　６株）についても、他の遺伝的性
質を調べれば、両親株と性質の違うものが見つかる可能
性がある。

実施例１〜３の結果から判る通り、両方又は−方に遺伝
マーカーを持った株同士を細胞融合或いは交配して子実
体を経由させることで、遺伝マーカーを持ち両親株とは
遺伝的性質の異なる突然変異株を容易にしかも、多数作
出することができた。

〔発明の効果〕

本発明の方法では、遺伝マーカーづけは初めの一回だけ
でよい。

また、子実体を経由することによって、遺伝マーカーを
持ち両親株と遺伝的性質の異なる突然変異株を、多種・
多量にしかも確実に得ることかいきる。

しかもこの遺伝マーカーは、担子器における核融合、減
数分裂等を経ても保持されている安定な遺伝マーカーで
あり、復帰突然変異がおこりにくい。

更に、２次菌糸の形で保存できる為、遺伝マーカー株の
死滅の危険性が少ない。

以上のことから、本発明が、しいたけの品種改良研究等
に有用な、安定な遺伝マーカーつきの突然変異株を、確
実に作出する方法であることは明らかである。

平成　２年５月３０日付提出の特許願２、発明の名称３、補正をする者事件との関係　　特許出願人住所　　東京都墨田区墨田五丁目１７番４号〒５３４大阪市部島区友淵町−丁目５番９０号鐘紡株式会社特許部５、補正の対象特許法特許法第３０条第１項に規定する発明であること
を証明する書面の提出及び、明細書の「発明の詳細な説
明」の欄の補正６、補正の内容（１）明細書第１Ｏ頁第２行ｒ４０ＶＪを「３０ｖ」と
補正する。

（２）明細書第１０頁第８行「マンニトール」を「シュ
ークロース」と補正する。

（３）明細書第１０頁第１１行「フマル酸：０．１ｇ、
」の後に「サンパールＣＰ　：　０．４ｇ、Ｊを追記す
る。

（４）明細書第１０頁第１３行ｒＭｎ　Ｓ　Ｏ４’　４
ＨｚＯＪをｒＭｎｃｊｌ！＝　　Ｈ４ＨｚＯＪと補正す
る。

（５）明細書第１９頁第６行から第７行「得ることがい
きる。」を「得ることができる。」と補正する。

７、添付書類の目録特許法特許法第３０条第１項に規定する発明であること
を証明する書面；１通

Claims

【特許請求の範囲】

（１）遺伝マーカーのついたしいたけの菌糸同士、或い
は一方のみに遺伝マーカーのついたしいたけの菌糸同士
を交配または細胞融合し、得られた２核菌糸を培養し、
発生した子実体より担子胞子を分離・培養することを特
徴とする、遺伝マーカーを持ち両親株と遺伝的性質の異
なる突然変異株の作出方法。