JPH04364199A - ヒト型グリセンチンの合成遺伝子 - Google Patents
ヒト型グリセンチンの合成遺伝子Info
- Publication number
- JPH04364199A JPH04364199A JP16969291A JP16969291A JPH04364199A JP H04364199 A JPH04364199 A JP H04364199A JP 16969291 A JP16969291 A JP 16969291A JP 16969291 A JP16969291 A JP 16969291A JP H04364199 A JPH04364199 A JP H04364199A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glicentin
- dna
- plasmid
- gene
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 101800002945 Glicentin Proteins 0.000 title abstract description 36
- URJOZSLMTIRWFW-QGZVFWFLSA-N (4r)-4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5,6-dimethoxy-4,9-dihydro-1h-benzo[f][2]benzofuran-3-one Chemical compound C1=C2OCOC2=CC([C@H]2C3=C(COC3=O)CC3=CC=C(C(=C32)OC)OC)=C1 URJOZSLMTIRWFW-QGZVFWFLSA-N 0.000 title abstract description 23
- 102400000320 Glicentin Human genes 0.000 title abstract description 23
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 101500028778 Homo sapiens Glicentin Proteins 0.000 claims description 49
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 32
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 9
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 abstract description 4
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002305 strong-anion-exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 3
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108010058003 Proglucagon Proteins 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 3
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000035554 Proglucagon Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000027119 gastric acid secretion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- XTUSEBKMEQERQV-UHFFFAOYSA-N propan-2-ol;hydrate Chemical compound O.CC(C)O XTUSEBKMEQERQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト型グリセンチンの
アミノ酸配列をコードする新規なＤＮＡ配列を有する合
成遺伝子に関する。
アミノ酸配列をコードする新規なＤＮＡ配列を有する合
成遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】動物の膵臓中のランゲルハンス島Ａ細胞
から分泌され、肝臓などの細胞膜のアデニル酸シクラー
ゼ系を活性化することが知られている２９個のアミノ酸
残基から構成されるポリペプチドホルモンであるグルカ
ゴンの研究から、Ｓｕｎｄｂｙ， Ｆ．らはブタ小腸抽
出物よりグルカゴン抗体に対する抗原性を有する大分子
量のポリペプチドを単離し、これをグリセンチンと命名
した〔Ｓｕｎｄｂｙ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｈｏｒ
ｍ． Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．８， ３６
６〜３７１ （１９７６）〕。続いてＴｈｉｍ， Ｌ．
および Ｍｏｏｄｙ， Ａ．Ｊ．はその構造決定を行な
ってこのグリセンチンが６９個のアミノ酸残基から構成
され、その３３〜６１番のアミノ酸配列はグルカゴンと
同一の配列であることを解明した〔Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ
ｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｖｏｌ．２：１３９ （１９
８１）〕。このようにしてブタのグリセンチンの精製と
構造の解明はなされたが、ブタのグリセンチンがブタの
小腸に存在することから当然にヒトにも存在することが
予想されるヒト型グリセンチンについては抽出のための
原材料すなわちヒトの腸管の材料の入手の困難性からこ
れまでに精製物として単離されたことはなく、従ってそ
のアミノ酸配列の決定もなされていない。そしてこの単
離が困難であった事情などから、ヒト型グリセンチンの
生理活性はいまだ解明されていない。
から分泌され、肝臓などの細胞膜のアデニル酸シクラー
ゼ系を活性化することが知られている２９個のアミノ酸
残基から構成されるポリペプチドホルモンであるグルカ
ゴンの研究から、Ｓｕｎｄｂｙ， Ｆ．らはブタ小腸抽
出物よりグルカゴン抗体に対する抗原性を有する大分子
量のポリペプチドを単離し、これをグリセンチンと命名
した〔Ｓｕｎｄｂｙ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｈｏｒ
ｍ． Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．８， ３６
６〜３７１ （１９７６）〕。続いてＴｈｉｍ， Ｌ．
および Ｍｏｏｄｙ， Ａ．Ｊ．はその構造決定を行な
ってこのグリセンチンが６９個のアミノ酸残基から構成
され、その３３〜６１番のアミノ酸配列はグルカゴンと
同一の配列であることを解明した〔Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ
ｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｖｏｌ．２：１３９ （１９
８１）〕。このようにしてブタのグリセンチンの精製と
構造の解明はなされたが、ブタのグリセンチンがブタの
小腸に存在することから当然にヒトにも存在することが
予想されるヒト型グリセンチンについては抽出のための
原材料すなわちヒトの腸管の材料の入手の困難性からこ
れまでに精製物として単離されたことはなく、従ってそ
のアミノ酸配列の決定もなされていない。そしてこの単
離が困難であった事情などから、ヒト型グリセンチンの
生理活性はいまだ解明されていない。
【０００３】ところで、Ｂｅｌｌ， Ｇ．Ｉ．らはハム
スターのプレプログルカゴンのｃＤＮＡをヒト遺伝子の
ＥｃｏＲ Ｉ分解物とハイブリダイズする手法でヒトプ
レプログルカゴン遺伝子の配列を推定し、同遺伝子のエ
クソン部分の構造からヒト型グリセンチンのアミノ酸配
列を解明した〔Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０４， ３６
８〜３７０ （１９８３）〕。このようにしてヒト型グ
リセンチンのアミノ酸配列は対応するヒトプレプログル
カゴンのＤＮＡ配列から推定されたけれども、これまで
にこのヒト型グリセンチンをコードするＤＮＡから組換
えＤＮＡベクターを作り、これによって形質転換された
宿主細胞からヒト型グリセンチンを製造する試みはいま
だなされていない。
スターのプレプログルカゴンのｃＤＮＡをヒト遺伝子の
ＥｃｏＲ Ｉ分解物とハイブリダイズする手法でヒトプ
レプログルカゴン遺伝子の配列を推定し、同遺伝子のエ
クソン部分の構造からヒト型グリセンチンのアミノ酸配
列を解明した〔Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０４， ３６
８〜３７０ （１９８３）〕。このようにしてヒト型グ
リセンチンのアミノ酸配列は対応するヒトプレプログル
カゴンのＤＮＡ配列から推定されたけれども、これまで
にこのヒト型グリセンチンをコードするＤＮＡから組換
えＤＮＡベクターを作り、これによって形質転換された
宿主細胞からヒト型グリセンチンを製造する試みはいま
だなされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上述したようにヒト型
グリセンチンは生体試料から取り出すことが困難なため
、これまでに精製品としては得られていない。従って、
ヒト型グリセンチンについての生理活性、薬理効果はい
まだ不明ではあるが、生体中で産生されるペプチド物質
であること、またブタ型グリセンチンがラットの胃酸分
泌を抑制することが知られていること〔Ｐ． Ｋｉｒｋ
ｅｇａａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．２９７，
１５６〜１５７ （１９８２）〕から、ヒト型グリセン
チンについて何らかの医薬用途が期待される。
グリセンチンは生体試料から取り出すことが困難なため
、これまでに精製品としては得られていない。従って、
ヒト型グリセンチンについての生理活性、薬理効果はい
まだ不明ではあるが、生体中で産生されるペプチド物質
であること、またブタ型グリセンチンがラットの胃酸分
泌を抑制することが知られていること〔Ｐ． Ｋｉｒｋ
ｅｇａａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．２９７，
１５６〜１５７ （１９８２）〕から、ヒト型グリセン
チンについて何らかの医薬用途が期待される。
【０００５】そこでヒト型グリセンチンのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡを合成し、これをベクターにつなぎ
、これにより形質転換された宿主細胞を培養することに
よってヒト型グリセンチンを大量に製造しうることが考
えられ、かかる着想のもとに本発明者らはいわゆる遺伝
子工学技法を用いてヒト型グリセンチンの製法を確立し
ようと試みたのである。
をコードするＤＮＡを合成し、これをベクターにつなぎ
、これにより形質転換された宿主細胞を培養することに
よってヒト型グリセンチンを大量に製造しうることが考
えられ、かかる着想のもとに本発明者らはいわゆる遺伝
子工学技法を用いてヒト型グリセンチンの製法を確立し
ようと試みたのである。
【０００６】従って本発明が解決しようとする課題は、
宿主細胞によって最も効率的にヒト型グリセンチンが発
現される合成遺伝子の解明にある。
宿主細胞によって最も効率的にヒト型グリセンチンが発
現される合成遺伝子の解明にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、次のア
ミノ酸配列
ミノ酸配列
【化３】
を有するヒト型グリセンチンをコードするＤＮＡ配列の
合成遺伝子、この合成遺伝子をプラスミドベクターに挿
入したプラスミド組換え体、このプラスミド組換え体に
よって形質転換された宿主細胞、およびこの宿主細胞を
培養して所望のヒト型グリセンチンを発現させることに
よるヒト型グリセンチンの製造方法が提供される。
合成遺伝子、この合成遺伝子をプラスミドベクターに挿
入したプラスミド組換え体、このプラスミド組換え体に
よって形質転換された宿主細胞、およびこの宿主細胞を
培養して所望のヒト型グリセンチンを発現させることに
よるヒト型グリセンチンの製造方法が提供される。
【０００８】ヒト型グリセンチンの上記したアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列は、そのアミノ酸配列に基づ
いて種々のものを設定することができ、上記した先行文
献に示されたＤＮＡ配列もヒト細胞内におけるこのもの
の生合成のためのＤＮＡ配列であるが、形質転換された
宿主細胞によってこのヒト型グリセンチンを発現させよ
うとする場合にはＤＮＡ配列の設定に当っては次の諸点
の考慮が望まれる。すなわち、 （１） 宿主細胞（例えば大腸菌）での使用頻度が高
く、宿主細胞になじまれたコドンを選択する。 （２） 設定されるＤＮＡ配列内およびその両端の部
位に特定の制限酵素認識部位を持たせ、他のＤＮＡ配列
またはプラスミドベクターへの挿入、連結を容易なもの
とすると共に、組換え体中における設定されたＤＮＡ配
列が正しく維持されているか否かの検定を容易なものと
する。 （３） ＤＮＡ断片の連結によって目的とするＤＮＡ
を合成する場合に、誤った連結が生ずることがないよう
なＤＮＡ断片の選択を行なう。 （４） 設定されたＤＮＡ配列中に例えばストップコ
ドンなどのペプチド合成上不都合なＤＮＡ配列が生ずる
ことがないように設計する。
列をコードするＤＮＡ配列は、そのアミノ酸配列に基づ
いて種々のものを設定することができ、上記した先行文
献に示されたＤＮＡ配列もヒト細胞内におけるこのもの
の生合成のためのＤＮＡ配列であるが、形質転換された
宿主細胞によってこのヒト型グリセンチンを発現させよ
うとする場合にはＤＮＡ配列の設定に当っては次の諸点
の考慮が望まれる。すなわち、 （１） 宿主細胞（例えば大腸菌）での使用頻度が高
く、宿主細胞になじまれたコドンを選択する。 （２） 設定されるＤＮＡ配列内およびその両端の部
位に特定の制限酵素認識部位を持たせ、他のＤＮＡ配列
またはプラスミドベクターへの挿入、連結を容易なもの
とすると共に、組換え体中における設定されたＤＮＡ配
列が正しく維持されているか否かの検定を容易なものと
する。 （３） ＤＮＡ断片の連結によって目的とするＤＮＡ
を合成する場合に、誤った連結が生ずることがないよう
なＤＮＡ断片の選択を行なう。 （４） 設定されたＤＮＡ配列中に例えばストップコ
ドンなどのペプチド合成上不都合なＤＮＡ配列が生ずる
ことがないように設計する。
【０００９】かかる配慮のもとに、本発明者らはヒト型
グリセンチンを大腸菌に産生させる場合の好ましい遺伝
子として次のＤＮＡ配列を有する合成遺伝子を見出した
。
グリセンチンを大腸菌に産生させる場合の好ましい遺伝
子として次のＤＮＡ配列を有する合成遺伝子を見出した
。
【００１０】
【化４】
【００１１】上記した合成遺伝子はヒト型グリセンチン
をコードする互に相補的な二重鎖のＤＮＡ配列として示
されているが、これを構成する一重鎖のＤＮＡ配列の夫
々もまた本発明の合成遺伝子を構成するものである。
をコードする互に相補的な二重鎖のＤＮＡ配列として示
されているが、これを構成する一重鎖のＤＮＡ配列の夫
々もまた本発明の合成遺伝子を構成するものである。
【００１２】このＤＮＡ配列は宿主細胞として大腸菌を
使用する場合の大腸菌における使用頻度の高いコドンを
選択ししかしてこのＤＮＡ配列内にＢａｍＨ Ｉ、Ｐｓ
ｔ ＩおよびＳａｃ Ｉなどによる制限酵素認識部位が
存在するようにし、そのことによって組換え体中におい
てこのＤＮＡ配列が正しく維持されているか否かの検定
を容易化したものである。
使用する場合の大腸菌における使用頻度の高いコドンを
選択ししかしてこのＤＮＡ配列内にＢａｍＨ Ｉ、Ｐｓ
ｔ ＩおよびＳａｃ Ｉなどによる制限酵素認識部位が
存在するようにし、そのことによって組換え体中におい
てこのＤＮＡ配列が正しく維持されているか否かの検定
を容易化したものである。
【００１３】このＤＮＡ配列を有する合成遺伝子はこの
ものをベクターへの接続を考慮してベクターへの接続部
分を含むＤＮＡ配列を下記する表１に示すように５個の
断片すなわち断片Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５、Ｇ７およびＧ９に
分け、これらのオリゴヌクレオチド断片とは相補的な断
片Ｇ２、Ｇ４、Ｇ６、Ｇ８およびＧ１０とともに、すな
わち合計１０個のオリゴヌクレオチドを合成的な手段に
よって製造したのである。
ものをベクターへの接続を考慮してベクターへの接続部
分を含むＤＮＡ配列を下記する表１に示すように５個の
断片すなわち断片Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５、Ｇ７およびＧ９に
分け、これらのオリゴヌクレオチド断片とは相補的な断
片Ｇ２、Ｇ４、Ｇ６、Ｇ８およびＧ１０とともに、すな
わち合計１０個のオリゴヌクレオチドを合成的な手段に
よって製造したのである。
【００１４】
【表１】
【００１５】このオリゴヌクレオチドの断片の夫々は通
常この技術分野において知られたＤＮＡ合成手段を用い
て合成することができ、このためにＤＮＡ合成機が用い
られ、例えばこの合成機としてはファルマシア社製のジ
ーンアセンブラーがある。
常この技術分野において知られたＤＮＡ合成手段を用い
て合成することができ、このためにＤＮＡ合成機が用い
られ、例えばこの合成機としてはファルマシア社製のジ
ーンアセンブラーがある。
【００１６】得られたオリゴヌクレオチド断片のうち断
片Ｇ２〜Ｇ９は５′末端をリン酸化し、リン酸化してい
ない断片Ｇ１およびＧ１０と共にアニーリングを行ない
引き続いてリガーゼを作用させて次の配列で示される二
重鎖のＤＮＡが得られた。
片Ｇ２〜Ｇ９は５′末端をリン酸化し、リン酸化してい
ない断片Ｇ１およびＧ１０と共にアニーリングを行ない
引き続いてリガーゼを作用させて次の配列で示される二
重鎖のＤＮＡが得られた。
【００１７】
【化５】
【００１８】この二重鎖のＤＮＡはその構造中にさきに
述べた本発明のヒト型グリセンチンを大腸菌に産生させ
るための遺伝子部分と、その両末端に次のベクターＤＮ
Ａへ連結する際の付着端としてのＮｃｏ ＩおよびＨｉ
ｎｄ ＩＩＩ サイトに結合可能な末端をそなえている
。
述べた本発明のヒト型グリセンチンを大腸菌に産生させ
るための遺伝子部分と、その両末端に次のベクターＤＮ
Ａへ連結する際の付着端としてのＮｃｏ ＩおよびＨｉ
ｎｄ ＩＩＩ サイトに結合可能な末端をそなえている
。
【００１９】このようにして得られたヒト型グリセンチ
ンの遺伝子を含むＤＮＡ配列は次いで適当なプラスミド
ベクターに連結される。この場合上記したようにこのＤ
ＮＡ配列はその両末端にＮｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩ サイトに結合可能な付着端を有することから、プ
ラスミドベクターはＮｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ
によって消化されうるものが用いられる。しかしてこ
のプラスミドベクターは爾後の遺伝子情報の発現のため
に必要なプロモーター部位をそなえておりかつ抗生物質
耐性遺伝子部位のような形質転換された宿主細胞のマー
カーとなる遺伝子をそなえたものであることが好ましい
。
ンの遺伝子を含むＤＮＡ配列は次いで適当なプラスミド
ベクターに連結される。この場合上記したようにこのＤ
ＮＡ配列はその両末端にＮｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩ サイトに結合可能な付着端を有することから、プ
ラスミドベクターはＮｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ
によって消化されうるものが用いられる。しかしてこ
のプラスミドベクターは爾後の遺伝子情報の発現のため
に必要なプロモーター部位をそなえておりかつ抗生物質
耐性遺伝子部位のような形質転換された宿主細胞のマー
カーとなる遺伝子をそなえたものであることが好ましい
。
【００２０】そして本発明者らはこの目的のためにプラ
スミドｐＫＫ２３３−２を用いることが好適であること
を見出している。
スミドｐＫＫ２３３−２を用いることが好適であること
を見出している。
【００２１】こうしてヒト型グリセンチンの遺伝子を連
結したプラスミド組換え体は宿主細胞を形質転換するた
めに用いられる。この形質転換された宿主細胞によって
所望のヒト型グリセンチンを産生させることも可能であ
る。
結したプラスミド組換え体は宿主細胞を形質転換するた
めに用いられる。この形質転換された宿主細胞によって
所望のヒト型グリセンチンを産生させることも可能であ
る。
【００２２】本発明者らによる本発明の実施の具体例に
おいては、プラスミドｐＫＫ２３３−２をＮｃｏ Ｉお
よびＨｉｎｄ ＩＩＩ で切断し、本発明による上記し
たヒト型グリセンチン遺伝子をコードしたＤＮＡ配列を
有する合成遺伝子をこの切断されたプラスミド中に挿入
しかくしてｐＧＬ３と命名したプラスミドを得、これを
用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌の培養によって
ｐＧＬ３をクローニングした。
おいては、プラスミドｐＫＫ２３３−２をＮｃｏ Ｉお
よびＨｉｎｄ ＩＩＩ で切断し、本発明による上記し
たヒト型グリセンチン遺伝子をコードしたＤＮＡ配列を
有する合成遺伝子をこの切断されたプラスミド中に挿入
しかくしてｐＧＬ３と命名したプラスミドを得、これを
用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌の培養によって
ｐＧＬ３をクローニングした。
【００２３】このようにして得られたプラスミドｐＧＬ
３をＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化すると
、ヒト型グリセンチン遺伝子のＤＮＡ配列の上流にｔｒ
ｃプロモーターを有する断片が得られ、これとＥｃｏＲ
ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ で消化したプラスミドｐ
ＵＣ１８とをライゲーションするとｐＧＬ５と命名した
プラスミドが得られた。プラスミドｐＵＣ１８はマルチ
コピー性を有するプラスミドであり、そしてｐＧＬ５は
グリセンチン遺伝子にｌａｃプロモーターとｔｒｃプロ
モーターとがタンデムにつながった形のもので、またプ
ラスミドコピー数の多いプラスミド組換え体が得られた
ことになる。
３をＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化すると
、ヒト型グリセンチン遺伝子のＤＮＡ配列の上流にｔｒ
ｃプロモーターを有する断片が得られ、これとＥｃｏＲ
ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ で消化したプラスミドｐ
ＵＣ１８とをライゲーションするとｐＧＬ５と命名した
プラスミドが得られた。プラスミドｐＵＣ１８はマルチ
コピー性を有するプラスミドであり、そしてｐＧＬ５は
グリセンチン遺伝子にｌａｃプロモーターとｔｒｃプロ
モーターとがタンデムにつながった形のもので、またプ
ラスミドコピー数の多いプラスミド組換え体が得られた
ことになる。
【００２４】このｐＧＬ５プラスミドを用いて大腸菌を
形質転換することにより、きわめて効率良くヒト型グリ
センチンを生産することができる。
形質転換することにより、きわめて効率良くヒト型グリ
センチンを生産することができる。
【００２５】このように生産されたグリセンチンについ
てこれが所望の構造を有するものであることを確認する
ために、抗原抗体反応による検定、化学分析によるアミ
ノ酸組成の分析、アミノ酸配列の決定を行ったが、これ
らの試験の結果はいずれも生産されたものが所望のヒト
型グリセンチンであることを示すものであった。
てこれが所望の構造を有するものであることを確認する
ために、抗原抗体反応による検定、化学分析によるアミ
ノ酸組成の分析、アミノ酸配列の決定を行ったが、これ
らの試験の結果はいずれも生産されたものが所望のヒト
型グリセンチンであることを示すものであった。
【００２６】以上本発明について、宿主細胞に大腸菌を
用いる例によって説明をしたが、大腸菌以外に、枯草菌
、イーストなどの微生物、およびヒトを含む哺乳動物の
細胞を用いることができることは勿論である。
用いる例によって説明をしたが、大腸菌以外に、枯草菌
、イーストなどの微生物、およびヒトを含む哺乳動物の
細胞を用いることができることは勿論である。
【００２７】
【実施例】つぎに本発明を更に詳しく説明するために、
実施例によって本発明のヒト型グリセンチンをコードす
る新規なＤＮＡ配列を有するグリセンチン遺伝子と、こ
の新規なＤＮＡ配列のグリセンチン遺伝子を含有する組
換えＤＮＡと、この組換えＤＮＡにより形質転換された
宿主と、この宿主からヒト型グリセンチンを発現させ、
そしてこの発現させた生成物が所望のヒト型グリセンチ
ンであることを検定する方法について詳細に説明するこ
ととする。
実施例によって本発明のヒト型グリセンチンをコードす
る新規なＤＮＡ配列を有するグリセンチン遺伝子と、こ
の新規なＤＮＡ配列のグリセンチン遺伝子を含有する組
換えＤＮＡと、この組換えＤＮＡにより形質転換された
宿主と、この宿主からヒト型グリセンチンを発現させ、
そしてこの発現させた生成物が所望のヒト型グリセンチ
ンであることを検定する方法について詳細に説明するこ
ととする。
【００２８】ヒト型グリセンチン遺伝子の断片の調製上
記したＢｅｌｌ， Ｇ．Ｉ． ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕ
ｒｅ， Ｖｏｌ． ３０４， ３６８〜３７０（１９８
３）によって解明されたヒト型グリセンチンのアミノ酸
配列から、このヒト型グリセンチンを大腸菌によって産
生させる場合に最も効率的に大腸菌がこれを産生するた
めのＤＮＡ配列を研究した。すなわち、ヒト型グリセン
チンをコードするＤＮＡを含有する組換ＤＮＡによって
大腸菌を形質転換した場合に、この宿主の大腸菌におけ
る使用頻度の高いコドンを有するＤＮＡを含有する組換
ＤＮＡによる大腸菌の形質転換を計った。この目的で、
ヒト型グリセンチンをコードし、しかも大腸菌による使
用頻度の高いコドンを有するＤＮＡを構築するために、
ヒト型グリセンチン遺伝子とベクターへの接続部分を含
むＤＮＡを上記表１に示すように５個の断片に分け、こ
の５個の断片に相補的な断片とともに１０個のオリゴヌ
クレオチドを合成手段によって調製した。
記したＢｅｌｌ， Ｇ．Ｉ． ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕ
ｒｅ， Ｖｏｌ． ３０４， ３６８〜３７０（１９８
３）によって解明されたヒト型グリセンチンのアミノ酸
配列から、このヒト型グリセンチンを大腸菌によって産
生させる場合に最も効率的に大腸菌がこれを産生するた
めのＤＮＡ配列を研究した。すなわち、ヒト型グリセン
チンをコードするＤＮＡを含有する組換ＤＮＡによって
大腸菌を形質転換した場合に、この宿主の大腸菌におけ
る使用頻度の高いコドンを有するＤＮＡを含有する組換
ＤＮＡによる大腸菌の形質転換を計った。この目的で、
ヒト型グリセンチンをコードし、しかも大腸菌による使
用頻度の高いコドンを有するＤＮＡを構築するために、
ヒト型グリセンチン遺伝子とベクターへの接続部分を含
むＤＮＡを上記表１に示すように５個の断片に分け、こ
の５個の断片に相補的な断片とともに１０個のオリゴヌ
クレオチドを合成手段によって調製した。
【００２９】上記のオリゴヌクレオチド断片Ｇ１〜Ｇ１
０の夫々は、β−シアノエチルフォスフォアミダイト法
により合成し、引き続き強陰イオン交換クロマトグラフ
ィーカラムを用いて精製を行なって得た。
０の夫々は、β−シアノエチルフォスフォアミダイト法
により合成し、引き続き強陰イオン交換クロマトグラフ
ィーカラムを用いて精製を行なって得た。
【００３０】ヒト型グリセンチン遺伝子の調製上記のよ
うに合成され、精製されたオリゴヌクレオチド断片のう
ち、断片Ｇ２〜Ｇ９は５′末端をＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造（株）製）によりリン酸化した。すな
わち、ｐＨ７．５の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０
ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および
５ｍＭ ＡＴＰを含む溶液５０μｌに、５μｇの上記オ
リゴヌクレオチド断片の夫々を加え、これに４ユニット
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃で１時
間反応させたのち、９５℃に５分間保持し酵素を失活さ
せた。このようにして断片Ｇ２〜Ｇ９の８個の断片はそ
の５′末端がリン酸化された。
うに合成され、精製されたオリゴヌクレオチド断片のう
ち、断片Ｇ２〜Ｇ９は５′末端をＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造（株）製）によりリン酸化した。すな
わち、ｐＨ７．５の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０
ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および
５ｍＭ ＡＴＰを含む溶液５０μｌに、５μｇの上記オ
リゴヌクレオチド断片の夫々を加え、これに４ユニット
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃で１時
間反応させたのち、９５℃に５分間保持し酵素を失活さ
せた。このようにして断片Ｇ２〜Ｇ９の８個の断片はそ
の５′末端がリン酸化された。
【００３１】リン酸化していない断片Ｇ１およびＧ１０
並びにリン酸化された断片Ｇ２〜Ｇ９の各々２μｇを混
合し常法に従いエタノール沈殿を行なった（Ｐｅｒｂａ
ｌ， Ｂ．， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， １９８
８， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐ．７８， ＪＯＨ
Ｎ ＷＩＬＥＹ＆ ＳＯＮＳ）。こうして得られた沈殿
物を４０μｌの蒸留水に溶解し、ｐＨ７．６の０．６６
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．１Ｍ ＭｇＣｌ２を含
む溶液５μｌを加え、９０℃に加熱したのち約３時間を
かけて３０℃まで冷却した。この溶液に０．２Ｍジチオ
スレイトール２．５μｌ、０．１Ｍ ＡＴＰ ０．５μ
ｌ、２０ｍＭスペルミジン０．５μｌおよび蒸留水２μ
ｌを加え、これにＴ４リガーゼ（宝酒造（株）製）３５
０ユニットを加え、１４℃で１６時間反応させることに
よりライゲーションを行ないオリゴヌクレオチド断片を
結合させた。反応物を５％ポリアクリルアミド電気泳動
により展開し、２３０ｂｐに相当する位置のバンドを切
り出した。 切り出したゲルに０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む液１ｍｌを加え３７℃で終夜抽出した。 抽出物を１２０００回転／分で５分間遠心分離して上清
と沈殿物とに分け、上清をフェノール抽出に付し、次い
で常法に従いエタノール沈殿を行なった。このようにし
て沈殿して分離されたＤＮＡを再びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼによってリン酸化した。
並びにリン酸化された断片Ｇ２〜Ｇ９の各々２μｇを混
合し常法に従いエタノール沈殿を行なった（Ｐｅｒｂａ
ｌ， Ｂ．， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， １９８
８， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐ．７８， ＪＯＨ
Ｎ ＷＩＬＥＹ＆ ＳＯＮＳ）。こうして得られた沈殿
物を４０μｌの蒸留水に溶解し、ｐＨ７．６の０．６６
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．１Ｍ ＭｇＣｌ２を含
む溶液５μｌを加え、９０℃に加熱したのち約３時間を
かけて３０℃まで冷却した。この溶液に０．２Ｍジチオ
スレイトール２．５μｌ、０．１Ｍ ＡＴＰ ０．５μ
ｌ、２０ｍＭスペルミジン０．５μｌおよび蒸留水２μ
ｌを加え、これにＴ４リガーゼ（宝酒造（株）製）３５
０ユニットを加え、１４℃で１６時間反応させることに
よりライゲーションを行ないオリゴヌクレオチド断片を
結合させた。反応物を５％ポリアクリルアミド電気泳動
により展開し、２３０ｂｐに相当する位置のバンドを切
り出した。 切り出したゲルに０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む液１ｍｌを加え３７℃で終夜抽出した。 抽出物を１２０００回転／分で５分間遠心分離して上清
と沈殿物とに分け、上清をフェノール抽出に付し、次い
で常法に従いエタノール沈殿を行なった。このようにし
て沈殿して分離されたＤＮＡを再びＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼによってリン酸化した。
【００３２】このようにして上記したオリゴヌクレオチ
ド断片が結合されて上記した化５の式に示される両末端
に４塩基の付着末端を有する２２８塩基対のヌクレオチ
ドから成り、その中にヒトグリセンチンをコードするＤ
ＮＡを含有するものと、そしてこのＤＮＡとは相補的な
ＤＮＡであって次のベクターＤＮＡへ連結する際の付着
端を両末端にそなえた二重鎖のＤＮＡが得られた。
ド断片が結合されて上記した化５の式に示される両末端
に４塩基の付着末端を有する２２８塩基対のヌクレオチ
ドから成り、その中にヒトグリセンチンをコードするＤ
ＮＡを含有するものと、そしてこのＤＮＡとは相補的な
ＤＮＡであって次のベクターＤＮＡへ連結する際の付着
端を両末端にそなえた二重鎖のＤＮＡが得られた。
【００３３】プラスミドｐＫＫ２３３−２の制限酵素に
よる切断 本実施例においてベクターとして使用するプラスミドｐ
ＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）を制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ（宝酒造（株）製）とＨｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒造（
株）製）で切断した。Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ の切断部位で切断されたプラスミドのＤＮＡは次い
でフェノール処理ののちエタノール沈殿させた。沈殿し
たＤＮＡ ８μｇを仔ウシ腸由来のアルカリホスファタ
ーゼ（ＣＩＰ）（ベーリンガー社製）１ユニットで３７
℃、３０分間処理して５′末端の脱リン酸化を行なった
。脱リン酸化処理したＤＮＡをフェノール抽出した後、
エタノール沈殿せしめた。
よる切断 本実施例においてベクターとして使用するプラスミドｐ
ＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）を制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ（宝酒造（株）製）とＨｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒造（
株）製）で切断した。Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ の切断部位で切断されたプラスミドのＤＮＡは次い
でフェノール処理ののちエタノール沈殿させた。沈殿し
たＤＮＡ ８μｇを仔ウシ腸由来のアルカリホスファタ
ーゼ（ＣＩＰ）（ベーリンガー社製）１ユニットで３７
℃、３０分間処理して５′末端の脱リン酸化を行なった
。脱リン酸化処理したＤＮＡをフェノール抽出した後、
エタノール沈殿せしめた。
【００３４】グリセンチン遺伝子とベクターＤＮＡの連
結 リン酸化した上記二重鎖のヒト型グリセンチン遺伝子２
０ｎｇと、脱リン酸化した上記のプラスミドｐＫＫ２３
３−２のＮｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ による切
断生成物であるＤＮＡ ４００ｎｇを混合し、Ｔ４リガ
ーゼによりライゲーションした。このライゲーションし
たＤＮＡを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１を形質転換し（Ｐｒｅｂａｌ， Ｂ．， Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， １９８８， ２ｎｄ ｅ
ｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ．４１４〜４１６， ＪＯＨＮ
ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ）、得られた各形質転換菌株
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌ
で３７℃で１６時間培養し、培養菌体よりＨａｔｔｏｒ
ｉ， Ｍ． ａｎｄ Ｓａｋａｋｉ， Ｙ． の方法に
よりプラスミドを抽出精製した（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ． Ｖｏｌ．１５２， ２３２〜２３８ （１９
８６））。
結 リン酸化した上記二重鎖のヒト型グリセンチン遺伝子２
０ｎｇと、脱リン酸化した上記のプラスミドｐＫＫ２３
３−２のＮｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ による切
断生成物であるＤＮＡ ４００ｎｇを混合し、Ｔ４リガ
ーゼによりライゲーションした。このライゲーションし
たＤＮＡを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１を形質転換し（Ｐｒｅｂａｌ， Ｂ．， Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， １９８８， ２ｎｄ ｅ
ｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ．４１４〜４１６， ＪＯＨＮ
ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ）、得られた各形質転換菌株
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌ
で３７℃で１６時間培養し、培養菌体よりＨａｔｔｏｒ
ｉ， Ｍ． ａｎｄ Ｓａｋａｋｉ， Ｙ． の方法に
よりプラスミドを抽出精製した（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ． Ｖｏｌ．１５２， ２３２〜２３８ （１９
８６））。
【００３５】得られたプラスミドをＢａｍＨ Ｉ、Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩ、Ｓａｃ Ｉの各制限酵素とそれぞれ反応
させ、グリセンチン遺伝子中の各制限酵素切断部位が存
在するプラスミドを選択した。これらのプラスミドの塩
基配列をｄｉｄｅｏｘｙ法により確認した。Ｄｉｄｅｏ
ｘｙ法塩基配列決定は宝酒造（株）製の７−Ｄｅａｚａ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用い同社のマニュア
ルに従い行なった。塩基配列決定によりグリセンチン遺
伝子部分が設計通りに配列していたプラスミドを有する
菌株を保存し、このプラスミドをｐＧＬ３と命名した。 この菌株（微工研菌寄第１１０３０号）の培養によりプ
ラスミドｐＧＬ３を容易に複製することができる。
ｎｄ ＩＩＩ、Ｓａｃ Ｉの各制限酵素とそれぞれ反応
させ、グリセンチン遺伝子中の各制限酵素切断部位が存
在するプラスミドを選択した。これらのプラスミドの塩
基配列をｄｉｄｅｏｘｙ法により確認した。Ｄｉｄｅｏ
ｘｙ法塩基配列決定は宝酒造（株）製の７−Ｄｅａｚａ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用い同社のマニュア
ルに従い行なった。塩基配列決定によりグリセンチン遺
伝子部分が設計通りに配列していたプラスミドを有する
菌株を保存し、このプラスミドをｐＧＬ３と命名した。 この菌株（微工研菌寄第１１０３０号）の培養によりプ
ラスミドｐＧＬ３を容易に複製することができる。
【００３６】また、このプラスミドｐＧＬ３を用いてＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０５を形質転換
した菌株（微工研菌寄第１１０２９号）も同様に作製し
た。
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０５を形質転換
した菌株（微工研菌寄第１１０２９号）も同様に作製し
た。
【００３７】以上のオリゴヌクレオチド断片Ｇ１〜Ｇ１
０のアニーリングおよびライゲーションによる上流側に
Ｎｃｏ Ｉサイトに結合可能な付着端を、下流側にＨｉ
ｎｄＩＩＩサイトに結合可能な付着端を有し、配列中に
ＢａｍＨ ＩおよびＳａｃ Ｉによる切断部位をそなえ
たヒト型グリセンチンをコードする合成ＤＮＡの二重鎖
の生成と、プラスミドｐＫＫ２３３−２の制限酵素Ｎｃ
ｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩによる同プラスミドの切
断と、上記ヒト型グリセンチンをコードする合成ＤＮＡ
の二重鎖と切断されたプラスミドｐＫＫ２３３−２との
ライゲーションによるプラスミドｐＧＬ３の生成は図１
に模式的に示される。
０のアニーリングおよびライゲーションによる上流側に
Ｎｃｏ Ｉサイトに結合可能な付着端を、下流側にＨｉ
ｎｄＩＩＩサイトに結合可能な付着端を有し、配列中に
ＢａｍＨ ＩおよびＳａｃ Ｉによる切断部位をそなえ
たヒト型グリセンチンをコードする合成ＤＮＡの二重鎖
の生成と、プラスミドｐＫＫ２３３−２の制限酵素Ｎｃ
ｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩによる同プラスミドの切
断と、上記ヒト型グリセンチンをコードする合成ＤＮＡ
の二重鎖と切断されたプラスミドｐＫＫ２３３−２との
ライゲーションによるプラスミドｐＧＬ３の生成は図１
に模式的に示される。
【００３８】ベクターの変換
ｐＧＬ３のベクターをマルチコピー型プラスミドｐＵＣ
１８に変換することによりｌａｃプロモーターとｔｒｃ
プロモーターがタンデムにつながった形でしかもコピー
数の多い新たなプラスミドを構築した。
１８に変換することによりｌａｃプロモーターとｔｒｃ
プロモーターがタンデムにつながった形でしかもコピー
数の多い新たなプラスミドを構築した。
【００３９】すなわち、図２に示されるようにプラスミ
ドｐＧＬ３を制限酵素ＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで消化し、１．２％アガロースゲル電気泳動により
およそ５００ｂｐに相当するグリセンチン遺伝子部分を
含む断片を分離し文献記載の方法（Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ
．， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， １９８８， ２
ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ． ３７２〜３７３，
ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ）に従ってこのＤ
ＮＡ断片を抽出精製した。
ドｐＧＬ３を制限酵素ＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで消化し、１．２％アガロースゲル電気泳動により
およそ５００ｂｐに相当するグリセンチン遺伝子部分を
含む断片を分離し文献記載の方法（Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ
．， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， １９８８， ２
ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ． ３７２〜３７３，
ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ）に従ってこのＤ
ＮＡ断片を抽出精製した。
【００４０】ベクターのｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ で消化し、フェノール抽
出後イソプロピルアルコールで沈殿させた。イソプロピ
ルアルコールによる沈殿は溶液に酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．８）を０．３Ｍとなるように加え、イソプロピルア
ルコールを終濃度で４０％になるように加え、０℃で１
５分間放置して行なった。得られた沈殿は４０％イソプ
ロピルアルコール−水で洗浄し、次に７０％エタノール
−水で洗浄した。このようにして得られたベクター断片
をＣＩＰにより脱リン酸化し、このベクター断片２に対
しさきにｐＧＬ３から得たグリセンチン遺伝子を含む断
片１の比率でＴ４−リガーゼによりライゲーションした
。このライゲーションで得られるＤＮＡを用いてＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５を形質転換し
た。得られた形質転換体をアンピシリンを５０μｇ／ｍ
ｌの濃度で含むＬＢ培地で培養しプラスミドを抽出し、
制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ およびＢａ
ｍＨ Ｉを適当に組み合わせてこれを消化してグリセン
チン遺伝子を含む断片が正しい向きに正しい長さで挿入
されているかどうかを確認した。このようにしてグリセ
ンチン遺伝子が正しく挿入されているプラスミドが確認
され、これをｐＧＬ５と命名した。
ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ で消化し、フェノール抽
出後イソプロピルアルコールで沈殿させた。イソプロピ
ルアルコールによる沈殿は溶液に酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．８）を０．３Ｍとなるように加え、イソプロピルア
ルコールを終濃度で４０％になるように加え、０℃で１
５分間放置して行なった。得られた沈殿は４０％イソプ
ロピルアルコール−水で洗浄し、次に７０％エタノール
−水で洗浄した。このようにして得られたベクター断片
をＣＩＰにより脱リン酸化し、このベクター断片２に対
しさきにｐＧＬ３から得たグリセンチン遺伝子を含む断
片１の比率でＴ４−リガーゼによりライゲーションした
。このライゲーションで得られるＤＮＡを用いてＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５を形質転換し
た。得られた形質転換体をアンピシリンを５０μｇ／ｍ
ｌの濃度で含むＬＢ培地で培養しプラスミドを抽出し、
制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ およびＢａ
ｍＨ Ｉを適当に組み合わせてこれを消化してグリセン
チン遺伝子を含む断片が正しい向きに正しい長さで挿入
されているかどうかを確認した。このようにしてグリセ
ンチン遺伝子が正しく挿入されているプラスミドが確認
され、これをｐＧＬ５と命名した。
【００４１】また、このプラスミドｐＧＬ５を用いてＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換
した菌株（微工研菌寄第１１０３１号）も同様に作製し
た。
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換
した菌株（微工研菌寄第１１０３１号）も同様に作製し
た。
【００４２】この菌株によるグリセンチンの生産量は培
養液１ｌあたり０．０８ｍｇであった。
養液１ｌあたり０．０８ｍｇであった。
【００４３】更にこのｐＧＬ５を用いて、プロテアーゼ
非生産株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓ
Ｇ２１０５９を形質転換した菌株（微工研菌寄第１２２
８３号）も作製した。この菌株でのグリセンチン生産量
は１ｌあたり０．４ｍｇであった。
非生産株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓ
Ｇ２１０５９を形質転換した菌株（微工研菌寄第１２２
８３号）も作製した。この菌株でのグリセンチン生産量
は１ｌあたり０．４ｍｇであった。
【００４４】上記したｐＧＬ３のＥｃｏＲ ＩおよびＨ
ｉｎｄ ＩＩＩ による消化によってｔｒｃプロモータ
を保有するグリセンチン遺伝子断片の取り出しと、ｐＵ
Ｃ１８のＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ による
消化とこのようにして切断されたプラスミドｐＵＣ１８
とさきに得られたグリセンチン遺伝子断片のライゲーシ
ョンによるプラスミドｐＧＬ５の精製は図２に模式的に
示される。
ｉｎｄ ＩＩＩ による消化によってｔｒｃプロモータ
を保有するグリセンチン遺伝子断片の取り出しと、ｐＵ
Ｃ１８のＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ による
消化とこのようにして切断されたプラスミドｐＵＣ１８
とさきに得られたグリセンチン遺伝子断片のライゲーシ
ョンによるプラスミドｐＧＬ５の精製は図２に模式的に
示される。
【００４５】抗グリセンチンウサギ抗血清の作製本発明
の形質転換大腸菌が産生するグリセンチンを検定するた
めに、抗グリセンチンウサギ抗血清を作製した。
の形質転換大腸菌が産生するグリセンチンを検定するた
めに、抗グリセンチンウサギ抗血清を作製した。
【００４６】すなわち、次のアミノ酸配列を有するグリ
センチンのアミノ酸配列のうちＮ末端から３２番目まで
のペプチド、
センチンのアミノ酸配列のうちＮ末端から３２番目まで
のペプチド、
【化６】
をＢＯＣ法によるペプチド合成機（アプライドバイオ社
製）により合成した。この合成は同社のマニュアルに従
った。
製）により合成した。この合成は同社のマニュアルに従
った。
【００４７】抗原として上記合成ポリペプチドをまた抗
原のキャリアーとしてキーホールリンペットヘモシアニ
ンを用いイエウサギに１４日間隔で６回感作させて免疫
を施し、抗体を形成させた。得られた抗グリセンチンウ
サギ抗血清の抗体価は酵素抗体法により評価した。すな
わち、抗原を５〜５００ｎｇニトロセルロース膜に吸着
させ、この膜に対してエンザイムイムノアッセイキット
（ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、同社のマニュアルに従っ
てアッセイを行った。抗血清は２００倍に希釈し、二次
抗体は２０００倍に希釈した。
原のキャリアーとしてキーホールリンペットヘモシアニ
ンを用いイエウサギに１４日間隔で６回感作させて免疫
を施し、抗体を形成させた。得られた抗グリセンチンウ
サギ抗血清の抗体価は酵素抗体法により評価した。すな
わち、抗原を５〜５００ｎｇニトロセルロース膜に吸着
させ、この膜に対してエンザイムイムノアッセイキット
（ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、同社のマニュアルに従っ
てアッセイを行った。抗血清は２００倍に希釈し、二次
抗体は２０００倍に希釈した。
【００４８】その結果５ｎｇ検体において対照に比較し
て十分な発色を示し、本抗体を用いれば５ｎｇからの検
知が可能であることが示された。
て十分な発色を示し、本抗体を用いれば５ｎｇからの検
知が可能であることが示された。
【００４９】グリセンチンの発現および精製プラスミド
ｐＧＬ５を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＪＭ１０５株（微工研菌寄第１１０２８号）を５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で６時間３７℃
で培養した。培養液を６５００回転／分で１５分間遠心
分離し、菌体を分離沈殿させた。
ｐＧＬ５を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＪＭ１０５株（微工研菌寄第１１０２８号）を５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で６時間３７℃
で培養した。培養液を６５００回転／分で１５分間遠心
分離し、菌体を分離沈殿させた。
【００５０】２０ｌの培養液に相当する菌体を３００ｍ
ｌの６Ｍグアニジン塩酸を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５溶液に懸濁し、３分間ずつ５回超音波処
理した。 １５，０００回転／分で１０分間遠心分離し上清を集め
これを０．１％トリフルオロ酢酸溶液で３ｌに希釈し、
次に１０，０００回転／分で２０分間の遠心分離により
不溶物を除去した。上清は、あらかじめ０．１％トリフ
ルオロ酢酸で平衡化しておいた逆相系シリカゲルカラム
〔ウォーターズ社製、プレパラティブ Ｃ１８１００Å
（内径１６ｍｍ×１００ｍｍ）〕に吸着させ、２００ｍ
ｌの０．１％トリフルオロ酢酸で洗浄後、０．１％トリ
フルオロ酢酸から９０％アセトニトリル、０．１％トリ
フルオロ酢酸へ３０分間；１分間５ｍｌの流速で直線グ
ラディエント溶出を行った。溶出液は１０ｍｌずつ分画
し各画分の２μｌずつをニトロセルロース膜に吸着させ
、前記方法により酵素抗体法でグリセンチン含有画分を
選定した。選定画分を集めロータリーエバポレータによ
り濃縮乾固した。これを２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５
．６ １００ｍｌで懸濁し、不溶物を１５，０００回転
／分、１０分間の遠心分離により除去し、これを予め２
０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．６で平衡化しておいた陽
イオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア社
製ＦＰＬＣ用 ＭｏｎｏＳ ５−５）に吸着させ、２０
ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５．６で３０ｍｌ洗浄後、同
液から０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ 酢酸ナトリ
ウムｐＨ５．６への直線グラディエントを３０分間の間
１分間に１ｍｌの流速で行い溶出した。１ｍｌずつ分画
した各画分１μｌを用い上記酵素抗体法によりグリセン
チン含有画分を集めた。
ｌの６Ｍグアニジン塩酸を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５溶液に懸濁し、３分間ずつ５回超音波処
理した。 １５，０００回転／分で１０分間遠心分離し上清を集め
これを０．１％トリフルオロ酢酸溶液で３ｌに希釈し、
次に１０，０００回転／分で２０分間の遠心分離により
不溶物を除去した。上清は、あらかじめ０．１％トリフ
ルオロ酢酸で平衡化しておいた逆相系シリカゲルカラム
〔ウォーターズ社製、プレパラティブ Ｃ１８１００Å
（内径１６ｍｍ×１００ｍｍ）〕に吸着させ、２００ｍ
ｌの０．１％トリフルオロ酢酸で洗浄後、０．１％トリ
フルオロ酢酸から９０％アセトニトリル、０．１％トリ
フルオロ酢酸へ３０分間；１分間５ｍｌの流速で直線グ
ラディエント溶出を行った。溶出液は１０ｍｌずつ分画
し各画分の２μｌずつをニトロセルロース膜に吸着させ
、前記方法により酵素抗体法でグリセンチン含有画分を
選定した。選定画分を集めロータリーエバポレータによ
り濃縮乾固した。これを２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５
．６ １００ｍｌで懸濁し、不溶物を１５，０００回転
／分、１０分間の遠心分離により除去し、これを予め２
０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．６で平衡化しておいた陽
イオン交換クロマトグラフィーカラム（ファルマシア社
製ＦＰＬＣ用 ＭｏｎｏＳ ５−５）に吸着させ、２０
ｍＭ 酢酸ナトリウムｐＨ５．６で３０ｍｌ洗浄後、同
液から０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ 酢酸ナトリ
ウムｐＨ５．６への直線グラディエントを３０分間の間
１分間に１ｍｌの流速で行い溶出した。１ｍｌずつ分画
した各画分１μｌを用い上記酵素抗体法によりグリセン
チン含有画分を集めた。
【００５１】これを高速液体クロマトグラフィー装置（
日立製６５５シリーズ）で逆相系カラム（ガスクロ工業
社製イナートシル ＯＤＳ ５μｍ）により分離した
。 分離条件は流速１分間１ｍｌでグラディエントは２０分
間で２４％アセトニトリル ０．０５％トリフルオロ酢
酸から４０％アセトニトリル ０．０５％トリフルオロ
酢酸への直線グラディエントを用いるものである。
日立製６５５シリーズ）で逆相系カラム（ガスクロ工業
社製イナートシル ＯＤＳ ５μｍ）により分離した
。 分離条件は流速１分間１ｍｌでグラディエントは２０分
間で２４％アセトニトリル ０．０５％トリフルオロ酢
酸から４０％アセトニトリル ０．０５％トリフルオロ
酢酸への直線グラディエントを用いるものである。
【００５２】ピークの検知は２８０ｎｍの紫外吸収によ
り行なった。カラム温度は４０℃とした。得られたメイ
ンピークの画分を分取し減圧乾固した。
り行なった。カラム温度は４０℃とした。得られたメイ
ンピークの画分を分取し減圧乾固した。
【００５３】このＪＭ１０５株によるグリセンチン生産
量は培養液１ｌあたり０．０８ｍｇであることが分かっ
た。
量は培養液１ｌあたり０．０８ｍｇであることが分かっ
た。
【００５４】グリセンチンの確認
上記のようにして得られた試料が純粋なヒト型グリセン
チンであるかどうかの確認を、ウエスタンブロッティン
グ、アミノ酸分析およびアミノ酸配列決定によって行な
った。
チンであるかどうかの確認を、ウエスタンブロッティン
グ、アミノ酸分析およびアミノ酸配列決定によって行な
った。
【００５５】ウエスタンブロッティングは以下の方法で
行なった。すなわち、電気泳動は既成のゲルを用いる泳
動装置（ファルマシア社製ファーストシステム）を使用
し、同社のマニュアルに従って行なった。使用したゲル
は２０％ポリアクリルアミドの均一ゲルでＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により、試料をｐＨ６．８
の５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、５％２−メ
ルカプトエタノール、７．５％グリセロール、および１
０μｇ／ｍｌブロムフェノールブルーを含む液に０．１
ｍｇ／ｍｌの程度の濃度となるように溶解し、１００℃
に３分間加熱し、これを泳動させた。泳動は同時に同一
試料を２レーンに泳動させ、片方をクマシブリリアント
ブルーで同社の方法に従い染色した。もう一方はプラス
チック膜からゲルを分離し、そのゲルを用いニトロセル
ロース膜にゲル中の蛋白質を転写装置（ザルトリウス社
製セミドライブロッター）で電気泳動的に転写した。そ
の方法は同社のマニュアルに従い行なった。転写後ニト
ロセルロース膜を抗グリセンチン抗血清を用い前記クロ
マトグラフィー後のグリセンチン含有画分の検定に用い
た方法と同一の方法で処理しグリセンチンを含有するバ
ンド位置を特定した。その結果、上記試料はクマシブリ
リアントブルー染色で単一のバンドを示し、抗体による
染色においても強く発色し、単一バンドであることが示
された。
行なった。すなわち、電気泳動は既成のゲルを用いる泳
動装置（ファルマシア社製ファーストシステム）を使用
し、同社のマニュアルに従って行なった。使用したゲル
は２０％ポリアクリルアミドの均一ゲルでＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動法により、試料をｐＨ６．８
の５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、５％２−メ
ルカプトエタノール、７．５％グリセロール、および１
０μｇ／ｍｌブロムフェノールブルーを含む液に０．１
ｍｇ／ｍｌの程度の濃度となるように溶解し、１００℃
に３分間加熱し、これを泳動させた。泳動は同時に同一
試料を２レーンに泳動させ、片方をクマシブリリアント
ブルーで同社の方法に従い染色した。もう一方はプラス
チック膜からゲルを分離し、そのゲルを用いニトロセル
ロース膜にゲル中の蛋白質を転写装置（ザルトリウス社
製セミドライブロッター）で電気泳動的に転写した。そ
の方法は同社のマニュアルに従い行なった。転写後ニト
ロセルロース膜を抗グリセンチン抗血清を用い前記クロ
マトグラフィー後のグリセンチン含有画分の検定に用い
た方法と同一の方法で処理しグリセンチンを含有するバ
ンド位置を特定した。その結果、上記試料はクマシブリ
リアントブルー染色で単一のバンドを示し、抗体による
染色においても強く発色し、単一バンドであることが示
された。
【００５６】アミノ酸の分析は以下の方法で行なった。
すなわち、上記高速液体クロマトグラフィーで単一にな
ったピークの試料８０μｇ（１０ｎｍｏｌ）を加水分解
管に入れ、これに６Ｎ塩酸２００μｌを加え減圧封管の
のち１１０℃で２４時間加熱した。内容物を減圧乾固し
、残留物を０．０１Ｎ塩酸に溶解し、自動アミノ酸分析
装置（日立社製８３５型）により分析した。その結果を
表２に示す。
ったピークの試料８０μｇ（１０ｎｍｏｌ）を加水分解
管に入れ、これに６Ｎ塩酸２００μｌを加え減圧封管の
のち１１０℃で２４時間加熱した。内容物を減圧乾固し
、残留物を０．０１Ｎ塩酸に溶解し、自動アミノ酸分析
装置（日立社製８３５型）により分析した。その結果を
表２に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】アミノ酸配列の決定
上記の高速液体クロマトグラフィーで単一ピークとなっ
た試料２４０μｇ（３０ｎｍｏｌ）をｐＨ８．８の５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３μｇのリシルエンドペプチ
ダーゼ（４．５ＡＵ／ｍｇ，和光純薬社製）とともに５
００μｌ中で３７℃で４時間反応させた。反応液を高速
液体クロマトグラフィー装置（日立製６５５シリーズ）
で逆相系カラム（ガスクロ工業製イナートシルＯＤＳ）
を用い分離した。分離条件は流速１分間１ｍｌでグラデ
ィエントは０．１％トリフルオロ酢酸から７２％アセト
ニトリル０．１％トリフルオロ酢酸へ６０分間で行なっ
た。画分の検知は２２０ｎｍの紫外部吸収によって行な
った。このようにして得られた５つのピークを夫々分取
し、それぞれのピークについて気相式アミノ酸配列決定
装置（島津社製ＰＳＱ−１）によりアミノ酸配列を決定
した。その操作方法は同社のマニュアルに従った。ピー
ク１〜ピーク５のペプチド断片のアミノ酸配列は次の表
３の通りであることが明らかにされ、ヒト型グリセンチ
ンの分解によって生成すると考えられるペプチド断片の
アミノ酸配列と一致した。
た試料２４０μｇ（３０ｎｍｏｌ）をｐＨ８．８の５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３μｇのリシルエンドペプチ
ダーゼ（４．５ＡＵ／ｍｇ，和光純薬社製）とともに５
００μｌ中で３７℃で４時間反応させた。反応液を高速
液体クロマトグラフィー装置（日立製６５５シリーズ）
で逆相系カラム（ガスクロ工業製イナートシルＯＤＳ）
を用い分離した。分離条件は流速１分間１ｍｌでグラデ
ィエントは０．１％トリフルオロ酢酸から７２％アセト
ニトリル０．１％トリフルオロ酢酸へ６０分間で行なっ
た。画分の検知は２２０ｎｍの紫外部吸収によって行な
った。このようにして得られた５つのピークを夫々分取
し、それぞれのピークについて気相式アミノ酸配列決定
装置（島津社製ＰＳＱ−１）によりアミノ酸配列を決定
した。その操作方法は同社のマニュアルに従った。ピー
ク１〜ピーク５のペプチド断片のアミノ酸配列は次の表
３の通りであることが明らかにされ、ヒト型グリセンチ
ンの分解によって生成すると考えられるペプチド断片の
アミノ酸配列と一致した。
【００５９】
【表３】
【００６０】以上の結果より本発明方法により得られる
グリセンチンはヒト腸管中に存在すると考えられるヒト
型グリセンチンであることが確認された。
グリセンチンはヒト腸管中に存在すると考えられるヒト
型グリセンチンであることが確認された。
【図１】ヒト型グリセンチンをコードする合成ＤＮＡの
二重鎖と、プラスミドｐＫＫ２３３−２をＥｃｏＲ Ｉ
およびＨｉｎｄ ＩＩＩ で切断して得られるものとの
ライゲーションによるプラスミドｐＧＬ３の生成を模式
的に示す図である。
二重鎖と、プラスミドｐＫＫ２３３−２をＥｃｏＲ Ｉ
およびＨｉｎｄ ＩＩＩ で切断して得られるものとの
ライゲーションによるプラスミドｐＧＬ３の生成を模式
的に示す図である。
【図２】プラスミドｐＧＬ３のＥｃｏＲ ＩおよびＨｉ
ｎｄ ＩＩＩ による消化によって得られるプロモータ
ー部位を保有するグリセンチン遺伝子断片と、プラスミ
ドｐＵＣ１８をＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ
で切断して得られるものとのライゲーションによるプラ
スミドｐＧＬ５の生成を模式的に示す図である。
ｎｄ ＩＩＩ による消化によって得られるプロモータ
ー部位を保有するグリセンチン遺伝子断片と、プラスミ
ドｐＵＣ１８をＥｃｏＲ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ
で切断して得られるものとのライゲーションによるプラ
スミドｐＧＬ５の生成を模式的に示す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 次のアミノ酸配列 【化１】
- 【請求項２】 ヒト型グリセンチンをコードするＤＮ
Ａ配列が、 【化２】 である請求項１記載の合成遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16969291A JPH04364199A (ja) | 1990-08-15 | 1991-07-10 | ヒト型グリセンチンの合成遺伝子 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-214424 | 1990-08-15 | ||
| JP21442490 | 1990-08-15 | ||
| JP16969291A JPH04364199A (ja) | 1990-08-15 | 1991-07-10 | ヒト型グリセンチンの合成遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04364199A true JPH04364199A (ja) | 1992-12-16 |
Family
ID=26492945
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16969291A Pending JPH04364199A (ja) | 1990-08-15 | 1991-07-10 | ヒト型グリセンチンの合成遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04364199A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0635573A3 (en) * | 1993-06-30 | 1995-05-03 | Nisshin Flour Milling Co | Process for the production of native, human glicentin. |
| US5432156A (en) * | 1993-02-24 | 1995-07-11 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Therapeutic agent for digestive tract diseases |
| EP0662482A1 (en) * | 1993-12-28 | 1995-07-12 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Process for preparation of human glicentin |
| US5576295A (en) * | 1993-10-18 | 1996-11-19 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Agent for suppressing the motor activity of gastrointestinal tracts |
-
1991
- 1991-07-10 JP JP16969291A patent/JPH04364199A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5432156A (en) * | 1993-02-24 | 1995-07-11 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Therapeutic agent for digestive tract diseases |
| US5547938A (en) * | 1993-02-24 | 1996-08-20 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Therapeutic agent for digestive tract diseases using glicentin |
| EP0635573A3 (en) * | 1993-06-30 | 1995-05-03 | Nisshin Flour Milling Co | Process for the production of native, human glicentin. |
| US5576295A (en) * | 1993-10-18 | 1996-11-19 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Agent for suppressing the motor activity of gastrointestinal tracts |
| EP0662482A1 (en) * | 1993-12-28 | 1995-07-12 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Process for preparation of human glicentin |
| US5641646A (en) * | 1993-12-28 | 1997-06-24 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Process for preparation of human glicentin |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5506121A (en) | Fusion peptides with binding activity for streptavidin | |
| US6072039A (en) | Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest | |
| Hochuli et al. | Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent | |
| Gierl et al. | TnpA product encoded by the transposable element En‐1 of Zea mays is a DNA binding protein. | |
| JP2665359B2 (ja) | 免疫親和性による精製方法 | |
| JP3370094B2 (ja) | リーダー配列なしに細胞質外に輸送される融合ポリペプチドの発現 | |
| CN109321480B (zh) | 用于控制重组胶原羟基化的酵母菌株和方法 | |
| EP0531404B1 (en) | Ubiquitin-specific protease | |
| JPH05507209A (ja) | チオレドキシンおよびチオレドキシン様分子に対するペプチドおよび蛋白融合 | |
| EP0238101A1 (en) | Microbial expression of interleukin II | |
| US5318900A (en) | Method for producing antiviral protein utilizing E. coli transformant, and gene and E. coli vector used in the method | |
| EP0205475B2 (en) | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and dna sequences useful for same | |
| EP2075336B1 (en) | Purification of recombinant proteins fused to multiple epitopes | |
| JP2554459B2 (ja) | β−ウロガストロン遺伝子、対応プラスミド組換体及び対応形質転換体 | |
| EP0222876A1 (en) | Fused proteine for enzyme immunoassay system | |
| EP1117693B1 (en) | Intein mediated peptide ligation | |
| US4828988A (en) | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine | |
| US7001745B1 (en) | Intein mediated peptide ligation | |
| US5888775A (en) | Peptide synthesis and purification by fusion to penI protein or precipitation effective portion thereof | |
| PT614982E (pt) | Vector recombinante e o seu uso para a preparacao exocelular de anticorpos sob a forma de molecula unica a partir de bacillus subtilis | |
| JPH04364199A (ja) | ヒト型グリセンチンの合成遺伝子 | |
| EP0230777B1 (en) | Antitumor protein gene of streptococcus pyogenes su, plasmids containing the gene, transformant cells harboring the plasmids, and process for producing the antitumor protein | |
| JPH11510683A (ja) | エピトープタギングシステム | |
| EP0300459A2 (en) | Human pancreatic secretory trypsin inhibitor | |
| CN111647049B (zh) | 多肽和多肽偶联物及其制备方法和应用 |