JPH05507209A - チオレドキシンおよびチオレドキシン様分子に対するペプチドおよび蛋白融合 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 チオレドキシンおよびチオレドキシン様分子に対するペプチドおよび蛋白融合こ の発明は、総括的には原核生物および真核生物細胞における融合蛋白の製造に関 するものである。さらに具体的には、この発明は、選択した異種ペプチドまたは 蛋白の配列に融合したチオレドキシンまたはチオレドキシン様配列を含む組換え 融合配列の宿主細胞における発現、並びに上記融合分子の使用による組換え蛋白 およびペプチドの生産性、活性、安定性または溶解性の増強に関するものである 。

発明の背景 多くのペプチドおよび蛋白は、多様な発現系、例えば様々な株の細菌、真菌、は 乳類または昆虫細胞における組換え技法により製造され得る。しかしながら、異 種遺伝子発現に関して細菌を宿主細胞として使用すると、多くの場合幾つかの問 題が発生する。

例えば、小ペプチドをコード化する異種遺伝子は、細菌ではうまく発現しないこ とが多い。はとんどの小ペプチドは、それらのサイズ故に、安定した可溶性立体 配座をとり得す、宿生細胞に存在するプロテアーゼおよびペプチダーゼによる細 胞内分解にふされる。エシェリキア・コリまたは他の細菌宿主において直接発現 される場合に自発的に蓄積するそれらの小ペプチドは、通常不溶性または「細胞 封入体」フラクションから見出され、その存在故にそれらは生物学的または生化 学的検定でのスクリーニング目的に関してほとんど役に立たない。

さらに、小ペプチドが細胞封入体で製造されない場合でも、新規薬剤または酵素 阻害剤に関する候補としての組換え技法による小ペプチドの製造は、さらに別の 問題に遭遇する。小型線状ペプチドでも、立体配座の自由さの度合が高いため、 重大な数の可能な構造をとり得る。すなわち、「活性」ペプチド立体配座は自由 な溶液中でとられる選択すべき多くの構造のうちの唯一のものであるため、小ペ プチドは、「望ましい」アミノ酸配列を有し得るが、検定では非常に低い活性し か示し得ない。このことは、有効な研究および治療用途を目的とする組換え技法 による小型異種ペプチドの製造時に直面する別の問題点を提示する。

また、細胞封入体形成は、異種蛋白の遺伝子が細菌細胞で発現される場合に観察 されることが多い。これらの封入体は、通常異種蛋白を可溶化および再生するた めに、経験的に決定された条件下、各場合とも不確実さを伴うさらに別の操作を 必要する。

これらの追加的方法が成功しない場合、生物活性を保持している蛋白はほとんど または全く宿主細胞からは採取され得ない。さらに、これらの追加的方法は技術 的に困難な場合が多（、治療、診断または他の研究用途を目的とする組換え蛋白 の実際的製造は極めて高い費用を要する。

これらの問題を克服するため、当業界では、望ましい異種ペプチドまたは蛋白と の融合「相手」としである種のペプチドまたは蛋白を使用することにより、細菌 発現系における融合蛋白としての小型ペプチドまたは大型蛋白の組換え的発現お よび／または分泌を可能にした。それらの融合相手の中には、１ａｃＺおよび廿 ｐＥ融合蛋白、麦芽糖結合蛋白融合体、およびグルタチオン−８−トランスフェ ラーゼ融合蛋白が含まれる［一般的には、「カレント・プロトコルズ・イン・モ レキュラー・バイオロジー」、第２巻、補遺１０、ジョン・ウィリー・アンド・ サンズ出版、ニューヨーク、ニューヨーク、１６．４．１−１６．８．１頁（１ ９９０）、およびスミス等、「ジージ」６７：３ｌ−４０（１９８８）参照］。

アメリカ合衆国特許４８０１５３６は、細菌細胞における異種遺伝子の製造およ び融合蛋白として培養培地へのその分泌を可能にする目的蛋白との細菌フラジェ リン蛋白の融合を記載している。ＰＣＴ特許公開Ｗ０９１／１１４５４は、融合 相手としてビオチニル化レニンを用いた融合蛋白を開示している。レニンは、精 製カラムに固定化され、分離および開裂を容易にする。

しかしながら、これらの融合相手蛋白のアミノ−またはカルボキシル−末端にお ける他の蛋白（すなわち融合相手として）への目的ペプチドまたは蛋白の融合は 、他の潜在的不利益を呈することが多い。エシェリキア・コリにおける経験は、 高レベルの遺伝子発現の達成における重大因子が、翻訳開始効率であることを示 した。エシェリキア・コリにおける翻訳開始作用は、目的異種ペプチドまたは蛋 白配列の開始メチオニンコドンを囲むヌクレオチド配列に対して非常に敏感であ るが、この現象を支配する規則は明らかではない。この理由のため、多くの融合 相手蛋白のアミノ末端における配列の融合は、予測不可能な形で発現レベルに影 響を及ぼす。さらに、エシェリキア・コリには融合相手蛋白へのアミノ−または カルボキシルー末端ペプチド伸長体を分解する多数のアミノ−およびカルボキシ ーペプチダーゼが存在するため、若干の既知融合相手は安定した融合蛋白製造に 関する低い成功率を示す。

組換え発現系により製造された蛋白の精製は、深刻な難題であることが多い。

組換え蛋白の異種製品を製造する新規でより容易な方法が永続的に要望されてい るが、当業界で現在使用されている若干の融合相手は精製プロセスを容易にする 固有の特性を全くもたない。従って、組換え発現系の技術分野では、研究、診断 および治療適用における使用を目的とする安定した可溶性ペプチドおよび蛋白の 製造および精製に関する新規組成物および方法が依然として要望されている。

発明の要旨 一態様において、本発明は、選択した異種ペプチドまたは蛋白に融合したチオレ ドキシン様蛋白配列を含む融合配列を提供する。ペプチドまたは蛋白は、チオレ ドキシン様配列のアミノ末端、チオレドキシン様配列のカルボキシル末端または チオレドキシン様配列内（例、チオレドキシンの活性部位ループ内）に融合され 得る。この発明による融合配列は、所望によりチオレドキシン様配列および選択 したペプチドまたは蛋白間にリンカ−ペプチドを含み得る。このリンカ−は、必 要な場合、チオレドキシン様分子および選択したペプチドまたは蛋白間の立体障 害を阻止し得るアミノ酸の選択した開裂部位または伸長部分を提供する。

別の態様として、本発明は、所望の宿主細胞において融合蛋白の発現を指示し得 る発現制御配列を随伴し、その制御下で上記融合配列をコード化するＤＮＡ分子 を提供する。

本発明のさらに別の態様は、選択した異種ペプチドまたは蛋白のＤＮＡ配列に融 合したチオレドキシン様蛋白配列を含むＤＮＡ配列により形質転換されたが、ま たは前記配列がそのゲノム中へ組み込まれた宿生細胞である。この融合配列は、 望ましくは細胞における融合蛋白の発現を指示する能力をもつ発現制御配列の制 御下に置かれる。

さらに別の態様として、本発明は、可溶性組換え蛋白発現の新規増強方法を提供 する。この方法では、適当な条件下で上記宿主細胞を培養して、融合蛋白を製造 させる。

この方法の一態様では、生成した融合蛋白が細胞質である場合、この細胞を慣用 的手段で溶解することにより、可溶性融合蛋白が得られる。さらに好ましくは、 細胞質融合蛋白の場合、この方法では、細胞に浸透圧ショックまたは冷凍／解凍 処理を適用することにより宿主細胞から融合蛋白を放出させる。この場合、融合 蛋白は、エシェリキア・コリの内膜および外膜間に存在する付着ゾーンを介して 細胞の内側から選択的に放出される。次いで、融合蛋白は慣用的手段により精製 される。

この方法の別の態様において、分泌先導物質を融合蛋白構築物で使用する場合、 融合蛋白は、ペリプラスミック抽出物または細胞培養培地がら回収され得る。

これらの両方法における追加段階は、慣用的手段によるチオレドキシン様蛋白か らの目的蛋白の開裂である。

以下、本発明の好ましい態様の詳細な記載を熟考すれば、本発明の他の態様およ び利点は明白である。

図面の要約 図１は、実施例１に記載された、発現プラスミドｐＡＬＴＲＸＡ／ＥＫ／ＴＬ１ １ΔＰｒｏ７５８１のＤＮＡ配列およびその中の融合蛋白に関するアミノ酸配列 を示す。

図２は、実施例３記載のチオレドキシン融合蛋白の構築で使用されるマクロファ ージ阻害蛋白１α（ＭＩＰ−１α）蛋白のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す 。

図３は、実施例４記載のチオレドキシン融合蛋白の構築で使用される骨形態形成 蛋白２（ＢＭＰ−２）蛋白のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。

図４は、実施例５に記載されたエシェリキア・コリのチオレドキシン（ｔｒｘＡ ）の活性部位ループへのエンテロキナーゼ開裂部位の挿入を示す概略図である。

図５は、実施例５に記載されたエシェリキア・コリのチオレドキシン（ｔｒｘＡ ）の活性部位ループへの無作為なペプチド挿入を示す概略図である。

図６は、実施例６記載のチオレドキシン融合蛋白の構築で使用されるひとインタ ーロイキン−６（ＩＬ−６）蛋白のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。

図７は、実施例７記載のチオレドキシン融合蛋白の構築で使用されるＭ−Ｃ８Ｆ 蛋白のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。

発明の詳細な記載 この発明によると、通常では限られた量の異種ペプチドまたは蛋白を発現するあ る種の宿主細胞において安定した可溶性形態を呈する大量の異種ペプチドまたは 蛋白の製造が可能となる。この発明によって産生細胞からの融合蛋白の放出が可 能となり、細胞の溶解を必要としないため、精製プロセスが合理化される。また 、チオレドキシン様配列の内部領域（例、チオレドキシンの活性部位ループ）に おける小ペプチド挿入を用いることにより、本発明は、分子表面上に接近し得る 容易な開裂部位を提供する。また、この発明の融合蛋白は、目的ペプチドまたは 蛋白においてその望ましい立体配座を達成させ得る。

本発明によると、組換え体系における発現に関して選択した異種ペプチドまたは 蛋白をコード化するＤＮＡ配列は、チオレドキシン様ＤＮＡ配列に融合されるこ とにより宿主細胞において発現される。チオレドキシン様ＤＮＡ配列は、本明細 書では８０アミノ酸のアミノ酸配列長にわたってエシェリキア・コリのチオレド キシンのアミノ酸配列と少なくとも１８％の相同性を有するアミノ酸配列を特徴 とする蛋白または蛋白のフラグメントをコード化するＤＮＡ配列として定義され る。別法として、チオレドキシンＤＮＡ配列は、ひとまたはエシェリキア・コリ のチオレドキシンの場合と実質的に類似した結晶構造を特徴とする蛋白または蛋 白のフラグメントをコード化するＤＮＡ配列として定義される。ゲルタレトキシ ンのＤＮＡ配列は、それらの−配列である。エシェリキア・コリのチオレドキシ ンのアミノ酸配列は、Ｈ，エクルンド等、ｒＥＭＢｏジャーナルＪ３：１４４３ −１４４９（１９８４）に記載されている。エシェリキア・コリのチオレドキシ ンの３次元構造は、Ａ、ホルムグレン、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ ケミストリーＪ２６４：１３９６３−１３９６６（１９８９）の図２に描かれて いる。

ヌクレオチド２２４２−２５６８下の図１は、エシェリキア・コリのチオレドキ シン蛋白をコード化するＤＮＡ配列を含む［リム等、「ジャーナル・オブ・バク テリオロジー」１６３：３１１−３１６（１９８５）コ。当業界の一熟練者に知 られているチオレドキシンに関する情報を提供する目的で、最後の３出版物を本 明細書中に引用して説明の一部とする。

この発明で有用なチオレドキシン様蛋白の生な例として、エシェリキア・コリの チオレドキシンは次の特徴を有する。エシェリキア・コリのチオレドキシンは１ １．７ｋＤのみの小さな蛋白であり、高レベル（〉１０％、細胞が１０Ａｓｓ。

／ｍｌで溶解される場合１５マイクロモルの濃度に対応）まで発現され得る。蛋 白の高度発現のための小さなサイズおよび受容力は、高い細胞内濃度の一因とな る。さらにエシェリキア・コリのチオレドキシンは、目的ペプチドまたは蛋白へ の融合に起因する全体的な構造安定性に対する影響を最少限にし得る非常に安定 した堅固な構造を特徴とする。

エシェリキア・コリのチオレドキシンの３次元構造は公知である。それは、蛋白 の本体から突き出る残基Ｃ）’ＳｓｓおよびＣ’！Ｓｓａ間にある特有の活性部 位ループを含め、幾つかの表面ループを含む。この活性部位ループは、同定され 得る接近可能な表面ループ領域であり、全体的構造安定性の一因となる蛋白の残 りとの相互作用には全く関与しない。従って、それは、ペプチド挿入用部位とし て優れた候補である。エシェリキア・コリのチオレドキシンのアミノ−およびカ ルボキシル−両末端は、蛋白表面にあり、容易に接近して融合し得る。

また、エシェリキア・コリのチオレドキシンはプロテアーゼに対して安定してい る。すなわち、エシェリキア・コリ蛋白としてエシェリキア・コリのプロテアー ゼに対する安定性を特徴とするため、エシェリキア・コリのチオレドキシンは、 エシェリキア・コリ発現系での使用に望ましいものであり得る。また、エシェリ キア・コリのチオレドキシンは、８０℃以下の加熱および低ｐＨに対して安定し ている。この発明で有用なチオレドキシン様ＤＮＡ配列によりコード化される他 のチオレドキシン様蛋白は、相同性アミノ酸配列および類似した物理的および構 造的特徴を共有し得る。すなわち、他のチオレドキシン様蛋白をコード化するＤ ＮＡ配列も、この発明によるエシェリキア・コリのチオレドキシンの代わりに使 用され得る。例えば、他の種のチオレドキシン、例えばひとチオレドキシンをコ ード化するＤＮＡ配列も、この発明の組成物および方法中で使用され得る。ひと およびエシェリキア・コリのチオレドキシンの１次配列およびコンピューター予 測による２次構造は、両方とも非常に類似している。また、ひとチオレドキシン は、エシェリキア・コリ蛋白から見出されるものと同じ活性部位ループをもつ。

ひとチオレドキシン活性部位ループ中およびアミノおよびカルボキシル末端への 挿入は、エシェリキア・コリのチオレドキシンにおける場合と同程度に耐容性が あり得る。

この発明で使用され得る他のチオレドキシン様配列には、蛋白ゲルタレトキシン およびその様々な種の相同体の全部または一部分が含まれる［Ａ、ホルムグレン 、前出］。エシェリキア・コリのゲルタレトキシンおよびエシェリキア・コリの チオレドキシンは２０％未満のアミノ酸相同性を共有するが、２種の蛋白は実際 に立体配座的および機能的類似性を有する［エクルンド等、ｒＥＭＢｏジャーナ ルＪ３：１４４３−１４４９（１９８４）］。

また、蛋白ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の反復ドメインはエシェリキア ・コリのチオレドキシン様と〉１８％の相同性を共有するため、ＰＤＩおよびそ の様々な種の相同体［Ｊ、　Ｅ、ニドマン等、［ネイチャ刊３１７：２６７−２ ７０（１９８５）］をコード化するＤＮＡ配列の全部または一部分もチオレドキ シン様ＤＮＡ配列として使用され得る。当業界の一熟練者に熟知され利用され得 るゲルタレトキシンおよびＰＤＩに関する情報を提供する目的で、最後の２出版 物を引用して説明の一部とする。

同様に、ホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）をコード化 するＤＮＡ配列、そのフラグメントおよびその様々な種の相同体［Ｃ，Ｆ、ベネ ット等、「ネイチャーＪ３３４：２６８−２７０（１９８８）］もまた、本発明 ではエシェリキア・コリのチオレドキシンとのアミノ酸配列相同性に基づいたチ オレドキシン様配列として使用され得る。小胞体蛋白、例えばＥｒｐ７２をコー ド化するＤＮＡ配列の全部または一部分、またはその様々な種の相同体もまた、 アミノ酸配列相同性に基づいたこの発明の目的に適うチオレドキシン様ＤＮＡ配 列［Ｒ，Ａ、マツツアレラ等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト リー」２６５：１０　。

９４−１１０１（１９９０）］として含まれる。別のチオレドキシン様配列は、 エシェリキア・コリのチオレドキシンとのアミノ酸配列相同性に基づいた成人Ｔ 細胞白血病由来の因子（ＡＤＦ）をコード化するＤＮＡ配列の全部または一部分 またはその他の種の相同体［Ｎ、若杉等、［プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ ー７・オブ・アメリカＪ８７：８２８２−８２８６（１９９０）］である。当業 界の一熟練者に既知かつ入手可能なＰＩ−ＰＬＣＳＥｒｐ７２およびＡＤＦに関 する情報を提供する目的で、最後の３出版物を本明細書中に引用して説明の一部 とする。

上記で具体的には同定されておらず、または恐らくまだ同定もしくは公表されて いない他の配列が、エシェリキア・コリのチオレドキシンとのそれらのアミノ酸 配列類似性並びにエシェリキア・コリのチオレドキシンおよび他のチオレドキシ ン様蛋白との特徴的な結晶構造類似性に基づいたチオレドキシン様配列として有 用であり得ることは、上記で使用されているチオレドキシン様ＤＮＡ配列の定義 から予測される。上記に基づくと、当業界の一熟練者であれば、過度の実験を行 わすともこの発明で使用されるチオレドキシン様ＤＮＡ配列を選択および同定ま たは所望ならば修飾することは当然可能である。例えば、生成した分子の構造に は影響を及ぼさない天然チオレドキシンまたは天然チオレドキシン様配列の一部 分に為された単純な点突然変異配列は、天然チオレドキシンまたは天然チオレド キシン様配列の対立遺伝子変異型の場合と同様、代替的チオレドキシン様配列で ある。

ストリンジェントまたはリラックスなハイブリダイゼーション下でエシェリキア ・コリのチオレドキシンの配列またはその構造的相同体とハイブリダイズするＤ ＮＡ配列もまた、この発明で使用されるチオレドキシン様蛋白をコード化する。

ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、本明細書中では６５℃４ＸＳＳ Ｃでのハイブリダイゼーション、次いで６５℃で１時間０．ｌＸ５ＳＣ中での洗 浄として定義される。別法として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション は、４２℃で５０％ホルムアミド、４ｘＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションと して定義される。非ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、本明細書中 では５０℃で４ＸＳＳＣでのハイブリダイゼーション、または４２℃で３０−４ ０％ホルムアミドによるハイブリダイゼーションとして定義される。それら全て のチオレドキシン様配列の使用は、この発明に包含されるものと考えられる。

選択したペプチドまたは蛋白のＤＮＡ配列およびチオレドキシン様配列のＤＮＡ 配列を含む本発明の融合配列の構築は、慣用的遺伝子工学技術を使用する［サム プルツク等、「モレキュラー・クローニング。ア・ラボラトリ−・マニュアル」 、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハ ーバ−、ニューヨーク（１９８８）参照コ。融合配列は、若干の相異なる方法で 製造され得る。例えば、選択した異種蛋白は、チオレドキシン様分子のアミノ末 端に融合され得る。別法として、選択した蛋白配列は、チオレドキシン様分子の カルボキシル末端に融合され得る。小ペプチド配列もまた、チオレドキシン様配 列の上述の位置のいずれかに融合され、構造的に拘束を受けていない形でそれら を製造し得る。

このチオレドキシン様蛋白に対する目的異種ペプチドまたは蛋白の融合により、 ペプチドまたは蛋白の安定性は増強される。アミノまたはカルボキシル末端では 、目的異種ペプチドまたは蛋白への融合は、その融合がいずれの蛋白の天然構造 をも不安定にすることのないように行なわれる。さらに、可溶性チオレドキシン 様蛋白への融合により、選択した異種ペプチドまたは蛋白の溶解性は改善される 。

様々な理由により、ペプチドはチオレドキシン様分子の活性部位ループ内で融合 されるのが好ましいと思われ得る。活性部位ループを囲むチオレドキシンの表面 は、非特異的蛋白ジスルフィド・オキシドレダクターゼとしての蛋白の主要機能 を保ちながら漸進的に変化することにより、多様な蛋白表面と相互作用し得る。

活性部位ループ領域は、強い２次構造のセグメント間に見出され、ペプチド融合 に関して多くの利点を呈する。チオレドキシン様蛋白の活性部位ループへ挿入さ れた小ペプチドは、３次構造の維持に関与しない蛋白領域に存在する。従って、 前記融合蛋白の構造は当然安定している。以前の研究結果は、エシェリキア・コ リのチオレドキシンが活性部位ループに近い位置で２つのフラグメントに開裂さ れ得、まだ蛋白を安定させる第３相互作用は残存していることを示している。

エシェリキア・コリのチオレドキシンの活性部位ループは、配列ＮＨ２，，，Ｃ ｙｓ３３−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓｓｓ、、、Ｃ０ＯＨを有する。蛋白の活性ル ープ部分におけるチオレドキシン様蛋白と選択したペプチドの融合により、両端 のペプチドは拘束され、ペプチドの立体配座の自由さの度合は低減化し、従って ペプチドがとる代替的構造の数も低減化する。挿入されたペプチドはシスティン 残基により各端で結合し、それが天然チオレドキシンにおける場合と同様に互い にジスルフィド連鎖を形成し、挿入されたペプチドの立体配座の自由さはさらに 制限され得る。

さらに、この発明は、チオレドキシン様蛋白の表面にペプチドを配列させる。

すなわち、本発明は、この構造状況において活性部位ループに挿入されたペプチ ドを提示することにより生物活性ペプチド立体配座に関するスクリーニングおよ び他の検定におけるペプチドの使用に関して明確な利点を提供する。

さらに、ループへのペプチドの融合は、エシェリキア・コリのアミノ−およびカ ルボキシル−ペプチダーゼの作用からそれを保護する。さらに、制限エンドヌク レアーゼ開裂部位ＲｓｒｒＩは、ペプチド融合に関して正確に正しい位置にある ループ領域をコード化するエシェリキア・コリのチオレドキシンＤＮＡ配列の部 分に既に存在する［図４参照コ。ＲｓｒＩＩは、３ヌクレオチド長５゛−突出接 着末端を残すＤＮＡ配列ＣＧＧ（Ａ／Ｔ）ＣＣＧを認識する。従って、相補的突 出末端をもつＤＮＡは、−配向だけでこの部位に挿入される。

この発明によるチオレドキシン様配列および目的蛋白またはペプチド配列の融合 配列は、所望によりチオレドキシン様配列および選択した異種ペプチドまたは蛋 白間に挿入されたリンカ−ペプチドを含み得る。このリンカ−配列は、所望なら ば、慣用的化学的または酵素的方法により選択的に開裂可能または消化可能なポ リペプチドをコード化し得る。例えば、選択した開裂部位は酵素的開裂部位であ り得る。酵素的開裂部位の例には、蛋白加水分解酵素、例えばエンテロキナーゼ 、第Ｘａ因子、トリプシン、コラゲナーゼおよびトロンビンによる開裂部位があ る。別法として、リンカ−における開裂部位は、選択した化学物質、例えば臭化 シアン、ヒドロキシルアミンまたは低ｐＨ暴露時に開裂され得る部位であり得る 。

選択した開裂部位での開裂により、チオレドキシン融合蛋白から異種蛋白または ペプチドが分離され、成熟異種ペプチドまたは蛋白が得られる。次いで、成熟ペ プチドまたは蛋白は、以前に結合していたチオレドキシン様蛋白のポリペプチド フラグメントを全く含まない精製形態で得られる。開裂部位は、この発明の融合 配列に有用なリンカ−に挿入されても、この発明を制限することはない。当業界 でその多くが知られている望ましい開裂部位は全て、この目的に使用され得る。

本発明の融合配列の所望によるリンカ−配列は、開裂部位の提供以外の目的にも 役立ち得る。また、リンカ−は、チオレドキシン様分子および選択した異種ペプ チドまたは蛋白間の立体障害を阻止するのに充分な長さの単純なアミノ酸配列で あり得る。

前記のリンカ−配列が必要であるか否かは、選択した異種ペプチドまたは蛋白の 構造的特徴および生成した融合蛋白が開裂せずとも有用であるか否かにより異な る。例えば、チオレドキシン様配列がひと配列である場合、選択した蛋白または ペプチドがそこから開裂されずとも、融合蛋白はそれ自体治療薬として有用であ り得る。別法として、成熟蛋白配列が自然開裂されている場合、リンカ−は全ぐ 必要とはされ得ない。

従って、−態様において、この発明の融合配列は、そのアミノまたはカルボキシ ル末端が選択したペプチドまたは蛋白の配列へ直接融合したチオレドキシン様配 列を含む。すなわち、生成した融合蛋白は、可溶性細胞質融合蛋白である。別の 態様において、融合配列は、さらにチオレドキシン様配列および選択したペプチ ドまたは蛋白配列間にはさまれたリンカ−配列を含む。また、この融合蛋白は、 可溶性細胞質蛋白として製造される。同様に、選択したペプチド配列が活性部位 ループ領域またはチオレドキシン様配列内の他の場所に挿入されている場合、細 胞質融合蛋白が製造される。

細胞質融合蛋白は、慣用的手段により精製され得る。好ましくは、本発明の新規 態様として、この発明の幾つかのチオレドキシン融合蛋白は、チオレドキシンの 異常な特性を活かすことにより精製され得る。エシェリキア・コリの細胞質は、 硬いペプチドグリカン細胞壁内に存在するペリプラスミッタ空間により互いに分 離された内方および外方の２膜を含む細胞エンベロープにより外部培地から効果 的に単離される。ペプチドグリカン壁は細胞に形状および強度の両方を与える。

細胞エンベロープのある位置において、内および外膜が会合し、恐らくは一緒に なって融合していると思われるペプチドグリカン壁には「ギャップ」（バイエル ・バッチ、バイエル・ジャンクションまたは付着部位と様々に呼ばれる）が存在 する。Ｍ、Ｅ、バイエル、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジーＪ９３：１１ ０４−１１１２（１９６７）および「ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロ バイオロジーＪ５３：３９５−４０４（１９６８）参照。細胞チオレドキシンの 大部分は、これらの付着部位で膜の内部表面と緩やかに会合し、突然の浸透圧シ ョックまたは単純な凍結／解凍方法によりこれらの付着部位を通して細胞から定 量的に放出され得る。Ｃ，Ａ、ルンおよびｖ、　ｐ、ビジエツト、「ジャーナル ・オブ・バイオロジカル・ケミストリーＪ２５７＋１１４２４−１１４３０（１ ９８２）および［チオレドキシン・アンド・ゲルタレトキシン・システムズ：ス トラクチャー・アンド・ファンクションＪ：１６５−１７６（１９８６ＸＡ、ホ ルムグレン等線、ラーベン・プレス、ニューヨーク）参照。それより低い程度で 、Ｅ　Ｆ　−Ｔｕ（伸長因子−Ｔｕ）の中には同じ方法で放出され得るものもあ るが［ジャコブソン等、［バイオケミストリーＪ１５：２２９７−２３０２（１ ９７６）］、ベリプラスミック内容物の場合を除き、重大な数となるエシェリキ ア・コリ蛋白の大多数はこれらの処理によっては放出され得ない。

エシェリキア・コリの細胞質で製造される限られた数の異種蛋白の浸透圧ショッ クによる放出については報告されているが［デネフル等、「ジーンコ８５：４９ ９−５１０（１９８９）、ジョセフーリアウヅン等、「ジーンＪ８６：２９１− ２９５（１９９０）、ローゼンバッセル等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカ ル・ケミストリーＪ２６５：１３０６６−１３０７３（１９９０）］、放出され る能力は大多数の異種蛋白が共有することのない稀で望ましい特性である。本発 明により記載されているチオレドキシンへの異種蛋白の融合は、上記の通りその 発現性、溶解性および安定性を向上させるだけでなく、浸透圧ショックまたは凍 結／解凍処理により細胞からそれを放出させ得、その精製を太き（簡易化し得る 。場合によって例えばＭＩＰとの融合蛋白のチオレドキシン部分は、付着部位に 対する融合蛋白を指向し、これらの処理により前記部位からそれを外部へ放出さ せ得る。

別の態様において、本発明は、この発明の融合蛋白に枠内で機能し得るように結 合した、多くが当業界において公知のものである別の成分、すなわち分泌先導配 列、例えばｐｈｏＡ、ＭＢＰ、β−ラクタマーゼの先導配列を用いることにより 、細菌ベリプラスミック空間または培養培地への成熟融合蛋白の発現および分泌 を可能にする。選択したペプチドまたは蛋白配列がカルボキシル末端またはチオ レドキシン様配列内の内側部位に融合されている場合、この先導配列はチオレド キシン様分子のアミノ末端に融合し得る。また、所望によるリンカ−は、ペプチ ドまたは蛋白がカルボキシル末端で融合している場合に存在し得る。この融合配 列構築物は、適当な宿主細胞で発現される場合、細胞質融合蛋白ではなく分泌融 合蛋白として発現されることが予測される。しかしながら、安定性、溶解性およ び高い発現性は、当然これらの様々な代替的具体例のいずれかを用いて製造され る融合蛋白の特徴となる。

この発明は、特定タイプの異種ペプチドまたは蛋白に限定されるわけではない。

広範で多様な異種遺伝子または遺伝子フラグメントが本発明の融合配列の形成に は有用である。この発明の組成物および方法は、細胞封入体で発現または細菌お よび酵母宿主において非常に少量しか発現されないペプチドまたは蛋白に非常に 有用であって、異種ペプチドまたは蛋白は、いずれかの発現系においてひとの治 療または獣医学的治療、診断または研究適用に有用なあらゆるペプチドまたは蛋 白を含み得る。例えば、ホルモン、サイトカイン、成長または阻害因子、酵素、 修飾または全合成蛋白またはペプチドは、この発明により細菌、酵母、は乳類ま たは他の真核生物細胞およびそれに適した発現系において生産され得る。

この発明を説明している下記実施例において、この発明により発現される蛋白に は、ＩＬ−１１、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦ、ＢＭＰ−２と呼ばれる 骨形誘導因子およびランダム配列を有する様々な小ペプチドがある。これらの蛋 白には、チオレドキシンの融合相手無しで発現される場合にエシェリキア・コリ では不安定であるかまたは細胞封入体から見出される蛋白の例が含まれる。

上記融合配列が組み込まれた様々なりＮＡ分子は、この発明による異種ペプチド または蛋白の発現用に構築され得る。最低限でも、この発明による望ましいＤＮ Ａ配列は、所望の宿主細胞における融合蛋白の発現を指図し得る発現制御配列を 随伴し、その制御下にある上記融合配列を含む。例えば、宿主細胞がエシェリキ ア・コリ株である場合、ＤＮＡ分子は、望ましくはエシェリキア・コリにおいて 機能するプロモーター、リポソーム結合部位を含み、さらに所望により、ＤＮＡ 分子が染色体外である場合、選択可能なマーカー遺伝子および複製開始点を含ん でいてもよい。細菌発現に関して当業界ではこれらの成分を含む多くの細菌発現 ベクターが知られており、標準分子生物学技術により容易に構築され得る。同様 に、宿主細胞が酵母細胞またはは乳類細胞である場合、公知酵母およびは乳類細 胞ベクターおよびベクター成分が使用され得る。

融合配列を含むＤＮＡ分子は、当業界で知られている通り、選択した宿生細胞で の発現を最適化するように異なるコドンを含ませるべくさらに修飾が加えられ得 る。

これらのＤＮＡ分子は、唯一のＤＮＡ配列に融合した異種蛋白またはチオレドキ シン様配列の全コピーに融合した異種蛋白と共に、さらにチオレドキシン様ＤＮ Ａ配列の多数のコピーを含み得る。また、選択した宿主の染色体へチオレドキシ ン様／異種ペプチドまたは蛋白コード化融合配列を組み込むことにより、天然チ オレドキシン様配列を置換または複製することも可能であり得る。

本発明に適した宿主細胞は、好ましくは細菌細胞である゛。例えば、エシェリキ ア・：＋ｌＪのｉ々な株（例、ＨＢＩＯＩ、Ｗ３１１０および下記実施例で使用 される株）は、バイオテクノロジー分野では宿主細胞としてよく知られている。

下記実施例で使用されるエシェリキア・コリ株ＧＩ７２４は、下記で詳記されて いる通り（アメリカ）合衆国微生物保管所に寄託されている。また、ノくチラス ・サチリス、シュードモナスの様々な株および他の細菌もこの方法において使用 され得る。

また、当業界の熟練者に知られている酵母の多くの株および他の真核生物細胞も 、本発明ポリペプチド発現用宿主細胞として有用であり得る。同様に、公知は乳 類細胞もまたこれらの融合蛋白の発現において使用され得る。

この発明の融合蛋白を製造するため、宿主細胞は、望ましくは融合蛋白の発現を 指図し得る発現制御配列の制御下、選択した異種ペプチドまたは蛋白のＤＮＡ配 列に融合したチオレドキシン様ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子により形質転換され るか、またはそれがそのゲノムへ組み込まれている。次いで、融合蛋白製造に適 した公知条件下で宿主細胞を培養する。融合蛋白が細胞の細胞質で蓄積される場 合、それは慣用的細菌細胞溶解技術により放出され、選択的沈澱、可溶化および カラム・クロマトグラフィ一方法を含む慣用的方法により精製され得る。分泌先 導成分が融合分子に組み込まれていると、融合蛋白がペリプラスミック空間また は生長培地へ分泌される場合に実質的精製が達成される。

結／解凍方法により細胞からの選択的放出が達成され得る。たいていの用途にお いては依然として最終精製が要求されるが、これらの方法により生成された製品 における融合蛋白の初期純度は、慣用的全細胞リゼイトで得られる純度よりも優 れており、均一性の達成に必要とされる後続精製段階の数は減少する。典型的浸 透圧ショック方法では、融合蛋白を含むバックした細胞を、ＥＤＴＡを含み、通 常溶質、例えば２０％ｖ／ｖＬよ糖の含有故に高い容量オスモル濃度を有する緩 衝液、容易には細胞質膜と交差し得ない緩衝液に氷上で再懸濁する。氷上での短 いインキュベーション中、水が浸透圧勾配の低い方へと細胞質から移動すると細 胞は原形質分離する。次いで、細胞を低オスモル濃度の緩衝液へ転換すると、浸 透圧再平衡中にバイエル・パッチに局在するペリプラズムおよび蛋白の両内容物 は外部へ放出される。この放出後の簡単な遠心分離により、融合蛋白製品から細 菌細胞由来の汚染物質の大部分が除去される。別法として、凍結／解凍方法では 、まずＥＤＴＡを含む緩衝液に融合蛋白を含むバックした細胞を再懸濁し、次い で冷凍する。続いて、冷凍細胞懸濁液を解凍させることにより、融合蛋白放出が 行なわれる。汚染物質の大部分は遠心分離段階により上記要領で除去され得る。

融合蛋白は、公知の慣用的方法によりさらに精製される。

これらの処理によって、細胞培養物を溶解せずとも典型的には融合蛋白の少な（ とも３０％が放出される。広範囲の蛋白に前記技術を用いても一般的には成功し ないことが多いため、かなりの量の広範な種類のチオレドキシン融合蛋白の放出 におけるこれらの方法の成果は驚くべきものである。他の融合蛋白系によって要 求される精製方法よりも著しく簡単で費用も少なくてすむ前記処理によりこれら の融合蛋白が実質的に精製され得ることから、本発明の融合蛋白にはエシェリキ ア・コリにおける蛋白製造に使用される他のシステムを凌ぐ顕著な利点が与えら れ得る。

生成した融合蛋白は安定性および可溶性があり、異種ペプチドまたは蛋白はその 生物活性を保持していることが多い。異種ペプチドまた蛋白は、上記で検討した 通り、所望によりチオレドキシン様蛋白から開裂により分離され得る。

この発明の組成物および方法の具体的および説明的態様では、エシェリキア・コ リのチオレドキシン（ｔｒｘＡ）遺伝子はクローン化され、エシェリキア・コリ 発現系に組み込まれる。発現プラスミドｐＡＬｔｒｘＡ−７８１を構築した。ｐ ＡＬｔｒｘＡ／ＥＫ／ＩＬＩＩΔＰｒｏ−５８１と呼ばれるチオレドキシン配列 に融合したＩＬ−１１を含むこのプラスミドは、後記実施例１および図１に記載 されている。

異なるリポソーム結合部位を含むこのプラスミドの修飾バージョンは他の実施例 で使用され、実施例３に具体的に記載されている。他の慣用的ベクターもこの発 明では使用され得る。本発明は、これらの実施例に記載されたプラスミドに限定 されるわけではない。

プラスミドｐＡＬｔｒｘＡ−７８０修飾ＩＬ−１１を伴わない）は、エシェリキ ア・コリ宿主株ＧＩ７２４におけるチオレドキシンとして全細胞蛋白の〉１０％ の蓄積を指令する。実施例２ないし６は、このプラスミドの使用によって、ポリ ペプチドであるＢＭＰ−２、ＩＬ−６およびＭＩＰ−１αとのチオレドキシン融 合蛋白を形成および発現させる方法を記載している。

活性部位ループに挿入された小ペプチドの発現の一例として、特異的プロテアー ゼ・エンテロキナーゼ［レイプ二二りスおよびライト、「ジャーナル・オブ・バ イオロジカル・ケミストリーＪ２５４：１０７７−１０８３（１９７９）］に関 する開裂部位を含む１３アミノ酸リンカ−ペプチド配列がチオレドキシンの活性 部位ループに融合されたｐＡＬｔｒｘＡ−７８１の誘導体が構築された。このプ ラスミド（ｐＡ　Ｌ　ｔｒｘＡ　−Ｅ　Ｋ）は、融合蛋白として全細胞蛋白の〉 １０％の蓄積を指令する。

融合蛋白は全て可溶性であり、それが恐らくは「天然」３次構造をとっていたこ とを示している。同様に、それは８０℃での長いインキュベーションに対して野 生型チオレドキシンと同程度に安定しており、チオレドキシンの強い３次構造が 活性部位ループへの挿入により損なわれなかったことを示唆している。融合蛋白 はエンテロキナーゼにより特異的に開裂され、チオレドキシンは開裂されないた め、活性部位ループに挿入されたペプチドが融合蛋白の表面に存在することを示 している。

下記実施例５でより詳細に記載されている通り、小ペプチドの融合はチオレドキ シンの活性部位ループに為された。挿入されたペプチドは１４残基長であって、 全体的にランダムな組成を有しており、疎水性、親水性および中性配列とのシス テムの対処能力が試験された。

この発明の方法および組成物により、研究、診断および治療分野に有用な蛋白お よびペプチドの製造が可能となる。この発明による融合蛋白の製造は若干の利点 を有する。−例として、エシェリキア・コリのチオレドキシンまたは別のチオレ ドキシン様蛋白へのカルボキシル末端融合としての本発明による選択した蛋白の 製造により、エシェリキア・コリでの真核生物蛋白製造において直面することが 多い翻訳開始問題が回避され得る。さらに、通常異種蛋白のアミン末端に残存す る開始物質メチオニンは存在せず、異種蛋白がカルボキシル末端チオレドキシン 融合体として生産される場合には除去される必要は無い。

この発明による融合蛋白の製造により、目的異種蛋白の溶解性は確実に改善され 、発現系でのプロテアーゼに対するそれらの安定性は高められる。またこの発明 は、他の方法では細菌宿主細胞において低レベルでしか製造されないある種の望 ましい治療用蛋白、例えばｌ　Ｌ−１１の高レベルの発現を可能にする。

また、この発明は、特に異種蛋白自体が熱安定性である場合、融合蛋白に熱安定 性を付与し得る。チオレドキシンおよび恐らくは全チオレドキシン様蛋白は８０ ℃以下で熱安定性であるため、本発明は、チオレドキシン融合蛋白によっては初 期有効精製段階としての単純な熱処理の使用を可能にする場合がある。

治療または他の用途に関して融合蛋白からの開裂時における高レベルの選択した 異種蛋白またはペプチドの提供に加えて、本発明の融合蛋白または融合ペプチド はそれら自体治療薬として有用であり得る。さらに、チオレドキシン様融合蛋白 は、生物活性ペプチド送達用ビークルを提供し得る。−例として、ひとチオレド キシンはひとにおいで抗原性を示さないため、ひとチオレドキシンとの本発明融 合蛋白は、それが融合される生物活性ペプチドのひとへの送達用ビークルとして 有用であり得る。ひとチオレドキシンは細胞内蛋白であるため、ひとチオレドキ シン融合蛋白はエシェリキア・コリ細胞内発現系で製造され得る。すなわち、こ の発明はまた、許容し得るチオレドキシン様蛋白との融合蛋白形態での患者への 生物活性ペプチドまたは蛋白の送達方法を提供する。

また本発明は、潜在的酵素阻害、ホルモン／生長因子アゴニストおよびホルモン ／生長因子きっ抗活性に関してランダムペプチドのライブラリーをスクリーニン グするための方法および試薬を提供する。また、レセプター結合部位、基質結合 部位、燐酸化／修飾部位、プロテアーゼ開裂部位およびエピトープを含め、潜在 的興味の対象である領域に関する既知蛋白配列の地図作製方法および試薬も提供 される。

チオレドキシン様／ランダムペプチド融合蛋白を発現する細菌コロニーは、プロ ーブとして放射性標識蛋白、例えばホルモンまたは生長因子を用いてスクリーニ ングされ得る。このタイプのスクリーンから生じる陽性は、レセプター結合部位 の模倣を同定し、治療用途を有する化合物の設計が誘導され得る。また、チオレ ドキシン様ランダムペプチド融合蛋白を発現する細菌コロニーは、天然活性ホル モンまたは生長因子に対して産生じた抗体を用いてスクリーニングされ得る。

このタイプのスクリーンから生じる陽性は、もとの抗原に存在する表面エピトー プの模倣である。前記表面エピトープがレセプター結合に関与する場合、「陽性 」融合蛋白は生物活性を有する。

さらにまた、この発明のチオレドキシン様融合蛋白または融合ペプチドを使用す ることにより、診断、精製または治療用途に対して既知方法により生成される、 モノクローナルおよびポリクローナル抗体または組換え抗体またはキメラ抗体が 発現され得る。チオレドキシン様分子の試験は、免疫応答を高め得る可能なり細 胞／Ｔ細胞生長因子活性［Ｎ、若杉等、前出コを示す。本発明の融合蛋白または ペプチドを抗原として使用することにより、望ましい抗体が誘導され得、それら 自体既知技術によりモノクローナルまたは組換え抗体へとさらに操作され得る。

別法として、チオレドキシン様配列に対して誘導された抗体はまた、多くの相異 なるチオレドキシン融合蛋白の精製において有用であり得る。

以下、実施例により、本発明の実施態様を説明するが、本開示の範囲を限定する 意図は無い。

実施例１ チオレドキシン−ＩＬ−１１融合分子 チオレドキシン様配列としてエシェリキア・コリのチオレドキシンおよび選択し た異種蛋白として組換えＩＬ−１１を用いて、本発明のチオレドキシン様融合分 子を製造した。Ｉ　Ｌ−１１のＤＮＡおよびアミノ酸記列は既に公表されている 。

パウル等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカＪ８７： ７５１２−７５１６（１９９０）およびＰＣＴ特許公開ＷＯ９１１０７４９（１ ９９１年５月３０日公開）参照。ＩＬ−１１ＤＮＡは、その公表された配列に基 づいたクローニングにより得られる。エシェリキア・コリのチオレドキシン（ｔ ｒｘＡ）遺伝子をその公表された配列に基づいてクローン化し、それを用いて、 サムプルツク、フリッシュおよびマニアチス、「モレキュラー・クローニング。

ア・ラボラトリー・マニュアル」、第２版、コールド・スプリング・ハーバ−・ ラボラトリ−、ニューヨーク（１９８９）により充分に記載された標準ＤＮＡ操 作技術を使用することにより様々な関連エシェリキア・コリ発現プラスミドを構 築した。

別の配列とは融合せずにエシェリキア・コリ廿ＸＡ遺伝子を含む第１発現プラス ミドｐＡＬＴＲｘａ７８１を構築した。このプラスミドは、さらに関連ＩＬ−１ １融合プラスミドに関して詳細に記載されている配列を含んでいた。エシェリキ ア・コリ宿主株ＧＩ７２４においてチオレドキシンとして全細胞蛋白の〉１０％ の蓄積を指向するこの第１プラスミドを下記要領でさらに操作することにより、 ｔｒｘＡ／　Ｉ　Ｌ−１１融合配列を構築した。

図１に示されている関連プラスミド発現ベクターｐＡ　Ｌ　ｔｒｘＡ／　Ｅ　Ｋ ／　Ｉ　Ｌ　１１ΔＰｒｏ−５８１の全配列は、下記の主な特徴を含む。

ヌクレオチド１−２０６０は、宿主エシェリキア・コリ株において抗生物質アン ピンリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼの遺伝子を含む配列およびｃ ｏｌＥ１由来の複製開始点を含む、プラスミドｐＵＣ−１８［ノランダー等、「 ジーン」２６・１０１−１０６（１９８３）コを起源とするＤＮＡ配列を含む。

ヌクレオチド２０６１−２２２１は、３つのオペレーター配列ＯＬ１、ＯＬ２お よび０，３３を含む、バクテリオファージλ［サンガー等、「ジャーナル・オブ ・モレキュラー・バイオロジー且６２ニア２９−７７３（１９８２）］の主な左 方向プロモーターに関するＤＮＡ配列を含む。オペレーターはλｃｌレプレッサ ー蛋白に関する結合部位であり、その細胞内レベルはｐＬからの転写開始量を制 御する。ヌクレオチド２２２２−２２４１は、バクテリオファージＴ７［ダンお よびステユディア、［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ１６６ ：４７７−５３５（１９８３）］の遺伝子１０の配列に由来する強いリポソーム 結合配列を含む。

ヌクレオチド２２４２−２５６８は、エシェリキア・コリのチオレドキシン蛋白 をコード化するＤＮＡ配列を含む［リム等、「ジャーナル・オブ・バクテリオロ ジーＪ１６３：３１１−３１６（１９８５）］。このププラストにおけるチオレ ドキシン暗号化配列の末端に翻訳終止コドンは存在しない。

ヌクレオチド２５６９−２５８３は、短い親水性の柔軟なスペーサーペプチドｒ −−ＧＳＧＳＧ−−Ｊに関するアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列を含む。

ヌクレオチド２５８４−２５９８は、エンテロキナーゼ（Ｅ　Ｃ３，４，４，８ ）の開裂認識部位ｒ−−ＤＤＤＤＫ−−Ｊに関するアミノ酸配列をコード化する ＤＮＡ配列を提供する［マロー等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ ストリー」２４６：５０３１−５０３９（１９７１）コ。

ヌクレオチド２５９９−３１３２は、天然蛋白から通常見出されるＮ−末端プロ リル残基について欠失した、成熟ひとＩＬ−１１［バウル等、［プロシーディン ゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンンーズ・オブ・ザ・ ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカコ８７：７５１２−７５１６（１９９ ０）］の修飾形態のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列を含む。この配列は 、ＩＬ−１１配列の３゛−末端に翻訳終止コドンを含む。

ヌクレオチド３１３３−３１５９は、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む「リン カ−ＪＤＮＡ配列を提供する。ヌクレオチド３１６０−３２３２は、エシェリキ ア・コリａｓｐＡ遺伝子［タカギ等、「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ」１ ３：２０６３−２０７４（１９８５）］の配列に基づいた翻訳終止配列を提供す る。ヌクレオチド３２３３−３６３２は、ｐＵＣ−１８に由来するＤＮＡ配列で ある。

下記実施例２に記載されている通り、適当なエシェリキア・コリ宿主株において 適当な条件下で培養すると、このプラスミドベクターは、チオレドキシン−ＩＬ −１１融合蛋白の高レベル（全細胞蛋白の約１０％）の製造を指令し得る。反対 に、チオレドキシンに融合していないとき、ＩＬ−１１は、類似宿主／ベクター 系で発現する場合に全細胞蛋白の０．２％までしか蓄積しなかった。

実施例２ 融合蛋白の発現 チオレドキシン−ＩＬ−１１融合蛋白は、実施例１の記載に従い構築されたプラ スミドを用いたプロトコルに従って製造された。ダシエートおよびエールリッヒ 、「ジー：／Ｊ６　：２３（１９７９）の方法により、ｐＡ　Ｌ　ｔｒｘＡ／　 Ｅ　Ｋ／　Ｉ　Ｌ　１１ΔＰｒｏ−５８１をエシェリキア・コリ宿主株ＧＩ７２ ４（Ｆ−１ｌａｃ　Ｉ　Ｑ、　１ａｃＰ　”、ａｍｐｃ：　λｃＩ”）中に形質 転換した。非形質転換宿主株エシェリキア・コリＧＩ７２４は、適用可能な法律 および規則に準する特許目的のためＡＴＣＣナンバー５５１５１として１９９１ 年１月３１日付けでメリーランド、ロックビル、１２３０１バークローン・ドラ イブのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された。０．５％ Ｗ／Ｖグルコース、０．２％Ｗ／Ｖカサミノ酸および１００μｇ７ｍｌアンピシ リンを補ったＭ９培地［ミラー、「エクスベリメンツ・イン・モレキュラー・シ エネティクス」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨー ク（１９７２）］により構成される、ＩＭＣ培地を含む１．５％ｗ／ｖ寒天プレ ートにおいて形質転換体を選択した。

ＧＩ７２４は、ａｍｐｃ遺伝子座の染色体へ安定した状態で組み込まれた野生型 λｃｌレプレッサー遺伝子のコピーを含み、前記遺伝子座においてそれはサルモ ネラ・ティフィムリウムｔｒｐプロモーター／オペレーター配列の転写制御下に 置かれている。ＧＩ７２４において、λＣ１蛋白は、トリブトファン不含有培地 、　−例えば最少培地または上記のカサミノ酸、例えばＩＭＣを補った最少培地 における生長期間中のみ製造される。Ｇｌ　７２４の培養にトリプトファンを加 えると、ｔｒｐプロモーターは抑制され、λｃｌの合成は停止し、ｐＬプロモー ターが細胞に存在する場合それらからの転写誘導が徐々に誘発される。

ｐＡＬｔｒｘＡ／ＥＫ／ＩＬ１１ΔＰｒｏ−５８１により形質転換されたＧＩ７ ２４をＩＭＣＭＣ中３７℃で０５のＡ　５５６に生長させた。トリプトファンを 加えてＪ００μｇ／ｍｌの最終濃度とし、培養物をさらに４時間インキュベーシ ョンした。

この時間中、チオレドキンンーＩＬ−１１融合蛋白は、全細胞蛋白の約１０％ま で蓄積した。

融合蛋白は全て、可溶性細胞フラクションであることが見出され、次の要領で精 製された。細胞を、フレンチ高圧セルにおいて５０ミリモルＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　 （ｐＨ８。

０）、１ミリモルのフェニルメチルスルホニルフルオリド中２００００ｐｓｉで 溶菌した。３０分間１５０００ｘｇでの遠心分離によりリゼイトを浄化し、上清 をＱＡＥ−トヨパール・カラムに充填した。フロー−スルー・フラクションを廃 棄し、融合蛋白を５０ミリモルＨＥＰＥＳ（ｐＨ８，０）、１００ミリモルＮａ Ｃ１により溶離した。溶離液を２モルＮａＣ１に調節し、フェニル−トヨバール のカラムに充填した。フロー−スルー・フラクションを再び廃棄し、融合蛋白を ５０ミリモルＨＥＰＥＳ（ｐＨ８，０）、０，５モルＮａＣ１１：より溶離した 。

次いで、融合蛋白を２５ミリモルＨＥＰＥＳＣｐＨ８，０）に対して透析すると 、この段階で純度は〉８０％であった。Ｔ１．１６５バイオアツセイ［パウル等 、前出コによると、精製チオレドキシン−ＩＬ−１１蛋白は８　Ｘ　１０　’Ｕ ／ｍｇの活性を呈した。この値は、モルに基づくと、均一に精製されたＣＯ８細 胞由来のＩＬ−１１に関して見出され、同検定で活性に関して測定された２　Ｘ 　１０＠Ｕ／ｌｌ１ｇの活性と厳密に一致する。次いで、１ミリグラムの融合蛋 白を、３７℃で２０時間１ｍｌのトリス−Ｃ１（ｐＨ８，０）／１．０ミリモル のＣａＣｌ２中１０００単位の牛エンテロキナーゼ［レイプ二二りスおよびライ ト、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」２５４：１６７７− １６８３（１９７９）コにより開裂した。それらを２５ミリモルＨＥ　Ｐ　Ｅ　 Ｓ　（ｐＨ８，０）中ＱＡＥ−）ヨパール・カラムに通すことにより、ＩＬ−１ １を反応産物から回収すると、フロー−スルー・フラクションからＩＬ−１１が 見出された。非開裂融合蛋白、チオレドキシンおよびエンテロキナーゼはカラム に結合した状態で残存していた。

この方法で製造された均一なＩＬ−１１は、Ｔ１１６５検定において２．５×１ ０６Ｌ″／ｍｇの生物活性を有していた。その物理的および化学的特性を次の要 領で決定した。

（１）分子量 ジャガー等、「アナリティカル・バイオケミストリーＪ１６６：３６８−３７９ （１９８７）の方法に従い非還元的条件下（トリシン・システム）１０％５ＤＳ −ＰＡＧＥで測定されたところによると、ＩＬ−１１の分子量は約２１ｋＤであ ることが見出された。化合物は単一バンドとして動いた。

（２）エンドトキシン含有量 ＩＬ−１１のエンドトキンン含有量は、製造者の指示に従って行なわれた、ＬＡ Ｌ（リムルス変形細胞リゼイト、ピロチル、アメリカ合衆国マサチューセッツ、 ウッズ・ホールのアソーシエイツ・オブ・ケープ・コツト、インコーホレイテッ ドから入手可能）検定において１ミリグラムのＩ　Ｌ−１１当たり０．１ナノグ ラム未満であることが見出された。

（３）等電点 ＩＬ−１１の理論的等電点はｐＨ１１，７０である。ｐＨ範囲が３５〜９５のＬ ＫＢアンフォリンＰ　Ａ　Ｇプレートを用いたポリアクリルアミドゲル等電点電 気泳動により測定されたところによると、Ｉ　Ｌ−１１は９．５より大で動いた 。利用できる信頼性のあるゲルにとってＩＬ−１１は高すぎる塩基性の蛋白であ るため、正確な測定値は得られなかった。

（４）蛍光吸収スペクトル １ｃｍ石英セルにおける領１％水溶液で測定されたところによると、ＩＬ−１１ の蛍光吸収スペクトルは、３３５−３３７ｎｍで最大放出を示した。

（５）’ＵＶ吸収 １ｃｍ石英セルにおける０、１％水溶液でのＩＬ−１１のＵＶ吸収は、２７８− ２８０ｎｍで最大吸収を示した。

（６）アミノ酸組成 アミノ酸配列に基づいたＩＬ−１１に関する理論的アミノ酸組成は次の通りであ る。

均質なＩＬ−１１の試料を、次の要領で蒸気相加水分解に付した。

６ＮのＨＣＩおよび２Ｎのフェノール試薬を、濃縮乾固された、１・１０希釈（ Ｗ／Ｈ２０）Ｉ　Ｌ−１１，４５μｍを含む管が挿入されている加水分解容器に 加えた。

試料を真空下密封し、１１０℃で３６時間加水分解した。加水分解後、試料を乾 燥し、５００μｌＮａ−５試料希釈緩衝液に再懸濁した。ベックマン７３００自 動式アミノ酸分析装置＋こおいてアミノ酸分析を行った。カチオン交換カラムを 使用して、ニンヒドリンによる後のカラム誘導体化後にアミノ酸を分離した。１ 次アミノ酸は５７０ｎｍで検出され、２次アミノ酸は４４０ｎｍで検出された。

８点較正曲線をアミノ酸の各々に関して作製した。

ある種のアミノ酸は一般的には回収されないため、５アミノ酸のみに関する結果 を下記に示す。蛋白を脱塩せずに加水分解を行ったため、はとんどのアミノ酸に 関して１００％回収が遠戚された。

ＧＬＸ＝１０（ｃＤＮＡ配列に基づいたＩＬ−１１におけるグルタミンおよびグ ルタミン酸残基の予測された数）を正規化することにより、１分子の組換えＩＬ −１１当たりの個々の各アミノ酸残基の相対回収率を決定した。ピコモルでのＧ ＬＸの回収率に関して得られた値を１０で割ると、ＧＬＸ指数が得られた。各ア ミノ酸のピコモルでの回収に関して得られた値をＧＬＸ指数で割ると、ＧＬＸ残 基の定量的回収率に正規化された、試料中の各アミノ酸の相対回収率を表す数が 与えられる。観察された各アミノ酸の残基の平均数に対する予測値を比較する相 関係数は０．９８５より大きく、各アミノ酸について観察された残基の数が予測 された配列と充分に一致することを示している。

２　Ｇｌｕ　１０．００　１０ ３　Ｇｌｙ　１２．８０　１４　０．９８５２４　Ａｒｇ　１６．１０　１８ ５　Ｐｒｏ　１８．４０　２１ （７）アミノ末端配列決定 Ａ、ＢＩ４７１Ａ蛋白配列決定装置ｔ（ＡＢＩ、インコーホレイテッド）を用い て、製造者の指示に従いＩＬ−１１（９５％アセトニトリルＴＦＡ中で緩衝状態 ）の配列決定を行った。アミノ末端配列決定により、チオレドキシン融合蛋白製 造ＩＬ−１１は正確なＩＬ−１１アミノ酸配列を含み、唯一のアミノ末端が観察 されることが確認された。

（８）ペプチドマツピング ３７℃で４時間１０ミリモルのトリス、ｐＨ８，１モルの尿素および２ミリモル の４−アミノベンズアミジン・ジ塩酸塩（ＰＡＢＡ）中エンドプロティナーゼＡ ｓｐ−Ｎ（ベーリンガー・マンハイム）（１：５００のＡｓｐ−Ｎ対重Ｌ−１１ 比）によＱ　Ｉ　Ｌ−１１ヲＭ裂１．ｌ−０次イテ、試料を、ｄＨ２０中５０　 ミ！Ｊ　モｋ（ＤＮａＨＰ　０４、ｐＨ４，３のＡ緩衝液、１００％イソプロパ ツールのＢ緩衝液を用いて１ｍ１／分で１００％Ａから２５％Ａおよび７５％Ｂ への勾配（１％変変化分）にょるｃ４バイダック・カラムにおけるＨＰＬＣにか けた。次いで、ＡＢＩ　４７１Ａ蛋白配列決定装置（ＡＢＩ、インコーホレイテ ッド）を用いて、製造者の指示に従い溶離したペプチド・フラグメントの配列決 定を行った。ペプチドマツピングにより、チオレドキシン融合蛋白から製造され たＩＬ−１１は適切な１Ｌ−１１Ｎ−末端およびＣ−末端配列を含むことが確認 された。

（９）溶解性 下記物質中における溶解性についてＩＬ−１１蛋白を試験すると、次の結果が得 られた。

水　非常に高い溶解性 エチルアルコール　非常に高い溶解性 アセトン　非常に高い溶解性 １モルの塩化ナトリウム　非常に高い溶解性１０％しょ糖　非常に高い溶解性 （１０）組成および蛋白／多積類含有率（％）Ｉ　Ｌ−１１蛋白のポリペプチド ・バックボーンに結合した糖部分の非存在は、典型的な糖結合部位を全く含まな いそのアミノ酸配列により示される。

実施例３ チオレドキシン−ＭＩＰ融合分子 ひとマクロファージ炎症性蛋白１α（ＭＩＦ−１α）は、上記実施例１記載のｐ ＡＬｔｒｘＡ／ＥＫ／ＩＬ１１Ｐｒｏ−５８１と類似してはいるが、バクテリオ ファージＴ７のリポソーム結合部位をλＣ１ｌのそれと置き換えるべく下記方法 で修飾した発現ベクターを用いることにより、チオレドキシン融合蛋白としてエ シェリキア・コリにおいて高レベルで発現された。実施例１のプラスミドでは、 慣用的手段によりヌクレオチド２２２２および２２４１を除去した。前出のサン ガー等（１９８２）による記載に従いバクテリオファージ・ラムダからのヌクレ オチド３５５６６〜３５４７２および３８１３７〜３８３６１により形成された ヌクレオチド配列を、それらのヌクレオチドの代わりに挿入した。この配列を開 示する目的で、この参考文献を引用して説明の一部とする。チオレドキシン−Ｍ ＴＰ−１α融合蛋白を発現させるため、ひとＩＬ−１１をコード化するこうして 修飾されたｐＡＬｔｒｘＡ／ＥＫ／ＩＬ１１ΔＰｒｏ−５８１におけるＤＮＡ配 列（ヌクレオチド２５９９−３１３２）を、完全長成熟ひとＭＸＰ−１α［中足 等、ｒＭｏｌ、Ｃｅ１１、Ｂｉｏｌ、Ｊｌｏ：３６４６−３６５８（１９９０） ］をコード化する図２に示された２１３ヌクレオチドＤＮＡ配列により置き換え る。

チオレドキシン−ＭＩＰ−１α融合蛋白の製造に使用された宿主株および発現プ ロトコルは、実施例１に記載されている。チオレドキシン−ＩＬ−１１融合蛋白 の場合から明らかなことであるが、チオレドキンンーＭＩＰ−１α融合蛋白は全 て可溶性細胞フラクションから見出され、全蛋白の２０％以下を占める。

実施例１の場合と同様に細胞を溶解すると、粗すゼイト中で１０ｍｇ／ｍｌの蛋 白濃度が得られた。次いで、このリゼイトを１０分間８０℃で加熱すると、汚染 性エシェリキア・コリ蛋白の大多数が沈澱し、６０分間１３００００ｘｇでの遠 心分離により不純物が除去された。沈澱物を廃棄し、上溝をモノＱカラムに充填 した。融合蛋白はこのカラムから約０．５モルＮａＣ１で溶離し、この段階での 純度は〉８０％であった。透析により塩を除去後、融合蛋白は、実施例１記載の エンテロキナーゼ処理により開裂され、ＭＩＰ−１αが放出され得る。

実施例４ チオレドキシン−ＢＭＰ−２融合分子 ひと骨形態形成蛋白２（ＢＭＰ−２）は、実施例３記載の修飾発現ベクターを用 いることによりチオレドキシン融合蛋白としてエシェリキア・コリにおいて高レ ベルで発現された。修飾ｐＡ　ＬｔｒｘＡ／　Ｅ　Ｋ／　Ｉ　Ｌ　１１ΔＰｒｏ −５８１におけるひとＩＬ−１１をコード化するＤＮＡ配列（ヌクレオチド２５ ９９−３１３２）を、完全長成熟ひとＢＭＰ−２［ウォズニー等、［サイエンス Ｊ２４２：１５２８−１５３４（１９８８）］をコード化する図３に示された３ ４５ヌクレオチドＤＮＡ配列により置き換える。

この場合、発現ベクターを含む株ＧＩ７２４を、トリプトファンを含む培地にお いて３７℃で生長させると、チオレドキシン−ＢＭＰ−２融合蛋白は不溶性細胞 フラクション中に現れた。しかしながら、生長培地の温度を２０℃に下げると、 融合蛋白は可溶性細胞フラクションから見出された。

実施例５ チオレドキシン−小ペプチド融合分子 天然エンエリキア・コリのチオレドキシンは、ヌクレオチド２５６９−３１２９ について欠失した実施例３記載の同プラスミド発現ベクターを含む株ＧＴ７２４ を使用し、実施例１で概説された生長および誘導プロトコルを用いることにより 、エシェリキア・コリから高レベルで発現された。これらの条件下、チオレドキ シンは全蛋白の約１０％まで蓄積し、その全ては可溶性細胞フラクション中に存 在した。

図４は、チオレドキシン蛋白配列の残基Ｇ３４およびｐｓｓチ間における、オレ ドキシンの活性部位ループへのエンテロキナーゼ開裂部位をコード化する１３ア ミノ酸残基の挿入を示す。この内部エンテロキナーゼ部位を含む融合蛋白は、天 然チオレドキシンと等しいレベルで発現され、上記実施例１で概説したエンテロ キナーゼ処理により開裂された。融合蛋白は、加熱処理に対して天然チオレドキ シンと同程度に安定しており、実施例４に記載された通り８０℃で１０分間のイ ンキュベーションに耐性を示すことが見出された。

下記に、Ｇ３４および２０間のチオレドキシンの活性部位ループに組み込まれた １２の追加ペプチド挿入体を列挙する。配列は各々長さ１４のアミノ酸残基であ り、組成はランダムである。これらのランダムな挿入体を含むチオレドキシン融 合蛋白の各々は、天然チオレドキシンと同等のレベルで生成された。それらは全 て、可溶性細胞フラクションから見出された。これらのペプチドは、下記の配列 挿入された配列は、疎水性および親水性の両方の例およびシスティン残基を含む 例を含んでいた。チオレドキシンの活性部位ループは、可溶性融合蛋白を生成す る広範な種類のペプチド挿入体に耐容性を示し得ると思われる。標準的方法を用 いることにより、これらのループ「挿入体」が精製され得る。

実施例６ ひどインターロイキン−６ ひとインターロイキン−５（ＩＬ−６）は、上記実施例３記載の修飾ｐＡＬｔｒ ｘＡ／ＥＫ／ＩＬＩＩΔＰｒｏ−５８１と類似した発現ベクターを用いることに よりチオレドキシン融合蛋白としてエシェリキア・コリにおいて高レベルで発現 された。

チオレドキシン−ＩＬ−６融合体を発現させるため、ひとＩＬ−１１をコード化 する修飾ｐＡＬｔｒｘＡ／ＥＫ／ＩＬ１１ΔＰｒｏ−５８１におけるＤＮＡ配列 （ヌクレオチド２５９９−３１３２）を、完全長成熟ひとＩＬ−６［平野等、「 ネイチャーＪ３２４ニア３−７６（１９８６）］をコード化する図６に示された ５６１ヌクレオチドＤＮＡ配列により置き換える。チオレドキシン−ＩＬ−５融 合蛋白の製造に使用される宿主株および発現プロトコルは、実施例１記載の通り である。

融合蛋白を３７℃で合成する場合、それの約５０％は「細胞封入体」または不溶 性フラクションから見出された。しかしながら、チオレドキンンーＩＬ−６融合 蛋白は全て、全細胞蛋白の１０％以下を占めており、合成温度を２５℃に下げる と、可溶性フラクションから見出された。

実施例７ ひとマクロファージ・コロニー刺激因子ひとマクロファージ・コロニー刺激因子 （Ｍ−Ｃ８Ｆ）は、上記実施例３記載のｐＡＬｔｒｘＡ／ＥＫ／ＩＬ１１ΔＰｒ ｏ−５８１と類似した修飾発現ベクターを用いることによりチオレドキシン融合 蛋白としてエシェリキア・コリにおいて高レベルで発現された。

修飾りＡ　ＬｔｒｘＡ／　Ｅ　Ｋ／　Ｉ　Ｌ　１１ΔＰｒｏ−５８１においてひ とＩＬ−１１をコード化するＤＮＡ配列（ヌクレオチド２５９９−３１３５）を 、成熟ひとＭ−Ｃ５Ｆβ［Ｇ、Ｇ、　ウォング等、「サイエンスＪ２３５＋１． ５０４−１５０８（１９８７）］の最初の２２３アミノ酸をコード化する図７に 示された６６９ヌクレオチドＤＮＡ配列と置き換える。チオレドキシン−Ｍ−Ｃ ８Ｆ融合蛋白の製造に使用される宿主株および発現プロトコルは、上記実施例２ の記載と同様であった。

チオレドキシン−ＩＬ−１１融合蛋白の場合から明らかなことであるが、チオレ ドキシン−Ｍ−Ｃ３Ｆ融合蛋白は全て、可溶性細胞フラクションから見出され、 全蛋白の１０％以下を占めていた。

実施例８ 浸透圧ショックまたは凍結／解凍による融合蛋白の放出この発明によるチオレド キシンへの異種蛋白の融合が宿主細胞の付着部位に対する標的設定を可能にし、 細胞から融合蛋白を放出させ得るか否かを決定するため、細胞を単純な浸透圧シ ョックおよび凍結／解凍方法にかけた。

下記方法では、野生型エシェリキア・コリのチオレドキシン、ひとチオレドキシ ン、エシェリキア・コリのチオレドキシン−ＭＩＰＩα融合体またはエシェリキ ア・コリのチオレドキシン−ＩＬ−１１融合体を過剰生産する細胞を使用した。

浸透圧ショック処理の場合、細胞を２０ミリモルのトリス−Ｃ１、ｐＨ８，０／ ２．５ミリモルのＥＤＴＡ／２０％＊／ｖしょ糖に２Ａｓｓｏ／ｍｌで再懸濁し 、１０分間水上で保冷した。次いで、細胞を遠心分離（１２０００ｘｇ、３０秒 ）により沈澱させ、上記と同じではあるがしょ糖を省いた緩衝液に徐々に再懸濁 した。氷上でさらに１０分間おいて蛋白を浸透圧により放出させた後、細胞を遠 心分離（１２０００ｘｇ、２分間）により再沈澱させ、上清（「シａッケートＪ （ｓｈｏｃｋａｔｅ））をその蛋白含有率について調べた。野生型エシェリキア ・コリのチオレドキシンおよびひとチオレドキシンは定量的に放出され、＞８０ ％純粋チオレドキシンである「ショッケート」製品を与えた。さらに重要なこと に、チオレドキシン−ＭＩＰＩαの＞８０％およびチオレドキシン−ＩＬ−６− １１融合蛋白の＞５０％がこの浸透圧処理により放出された。

単純な凍結／解凍方法によっても類似した結果が得られ、チオレドキシン融合蛋 白を選択的に放出し、壁の内側の他の細胞蛋白の大部分を残した。典型的な凍結 ／解凍方法では、細胞を２Ａｓｓｏ／ｍｌで２０ミリモルのトリス−Ｃ１、ｐＨ ８，０−／２，５ミリモルのＥＤＴＡに再懸濁し、ドライアイスまたは液体窒素 で懸濁液を迅速に凍結させる。次いで、冷凍懸濁液をゆっくりと解凍した後、細 胞を回転（１，２０００ｘｇ、２分間）させ、蛋白について上清を調べる。

生成した「ショッケート」は追加的精製を必要とし得るが、初期「ショッケート 」は核酸汚染物質の非存在を特徴とする。初期リゼイトと比較すると、「ショッ ケート」の純度は顕著に優れており、細菌リゼイトからのＤＮＡの困難な除去を 必要としない。

すなわち、この放出段階は、実施例２の溶菌段階と置き換えられ得る。次いで、 同実施例に開示された方法で遠心分離後に得られた上清はさらに精製される。

本発明の多くの修正および変形も本明細書に包含され、当業界の一熟練者には明 白なものであると予測される。本発明の組成物および方法に加えられるそれらの 修正および改変もまた、後記請求の範囲に包含されると考えられる。

ＦＩＧＵＲＥ　ＩＡ ＴＡＴＧＧＡＴＧ入Ａ　ＣＧＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＣＧＣＴＧＡ　ＧＡＴＡ ＧＧＴＧＣＣ１０４０ＦＩＧＵＲＥ　１Ｂ ＡＴにＣＣＣＣＣＣＴ　ＧＣＡＡＡＡＡＡＴＡ　ＡＡ’ＩＴＣＡＴＡＴＡ　ＡＡ ＡＡＡＣＡＴＡＣ２１２０ＦＩＧＵＲＥ　ＩＧ ＦＩＧＵＲＥ　ＩＤ ＦＩＧＵＲＥ　ＩＥ ＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧ　ＡＡＡＣＧＣＧＣＧＡ　３６３２Ｆ工σσＲＥ２ に工Ｐ−１ ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＣＴｒ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＡＣＧ　ＣＣＧ　ＡＣＣＧＣ ＣＴＧＣＴＧＣ３６’ｆｆｃ　ＡＧＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧＡ　ＣＡＧ　ＡＴ Ｔ　ＣＣＡ　Ｃ入ＧＪｋＡＴＴＴＣ７２ＡＴＡ　ＧｃＴ　ＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧ ＡＧ　ＡＣＧ　ＡＧＣＡＧＣＣＡＧ　’Ｉ’ＧＣＴＣＣ１０９人入Ｇ　ＣＣＣＡ ＧＴ　ＧＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＡ　ＡＣＣＭＧ　ＡＧＡ　ＧＧＣＣＧＧ　１４５ ＣＡＧ　ＧＴＣＴＧＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＣＣＣＡＧＴ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＴＧＧ 　ＧＴＣＣＡＧ　１８１ＡＡＡ　’Ｌ’ＡＣＧＴＣＡＧＴ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＡ Ｇ　ＣＴＧ　ＡＧ’ｌ’　ＧＣＣＴＭ　２１４？工ＧＵＲＥ３ ！ＩＭＰ−２ ６５フ０ ＧＡＧ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＧＧＧ　ＴＧＴ　ＣＧＣＴＡＧ　３４６ｒ工Ｇ４ エシェリキア・コリのチオレドキシン（ｔｒｘＡ）の活性部位ループへのエンテ ロキナーゼ部位の挿入 Ｒｓｒ工Ｉ エンテロキナーゼ部位 （１３残基） 、−−−ＨＳ　Ｄ　Ｙ　Ｋ　Ｄ　Ｄ　Ｄ　Ｄ　Ｋ　Ａ　Ｓ　Ｇ、、。

開裂部位 ＴＴＧ　５ エシェリキア・コリのチオレドキシン（ｔｒｘ、Ａ）の活性部位ループへのラン ダムペプチド挿入 Ｒｓｒ工工 部位／Ｌ、７’　、　、　、　−ＣＴＣＡＣＣＡＣＧＣＣＡＧＧＣＡＣＧ−ＡＣ ，−−−、、、、Ｅ　％ｆ　ＣＧ　Ｐ　ＣＫ　Ｍ　＋＋＋＋３１　３Ｂ 、、、＋Ｅ　Ｗ　ＣＧ　Ｐ　ＣＫ　Ｍ　＋＋＋＋３１　３Ｂ ｔｒｘＡ活性部位ループへの挿入 、　−、−ＣＴＣＡＣＣＡＣＧＣＣＡＧＧＣ，−、（Ｎ３６）　、　−ＣＣＡＧ ＧＣＡＣＧＴＴＦＪ’ＡＣ，、、−Ｆ工ＧＵＲＥ６ ＧＣＣＧＣＣＣＣＡ　ＣＡＣＡＧＡ　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＣＴＣＡｃｅ　ＴＣＴＴ ＣＡ　ＧＡＡ　ＣＧＡ　７８Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ 　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　ｓａｒ　Ｇｌｕ　ＡｒｇＧｅｅ　ＣＴＧ　 ＡＧＡ　ＡＡＧ　ＧＪＩＧ　ＡＣＡ　ＴＧＴ　ＡＡＣＡＡＧ　ＡＧＴ　ＡＡＣＡ ＴＧ　ＴＧＴ　１５６Ａｌａ　Ｉａｕ　ｋ１Ｌｙ！Ｂ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ 　ＪＩＪｎ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　ＡＪｎ　Ｍｅｔ　ＣＹ！！Ｇ＾＾ＡＧＣＡＧＣＡ ＡＡ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣＩ’Ｇ　ＡＡＣ １９５Ｇｌｕ　Ｓ＠ｊ−５＠ｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　’Ｌａｕ　Ａｌａ　 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＪｋＪａｎ　Ｌｍｕ　Ａｓｎ６５　フ０　フ５ ＣＴＴ　ＣＣＡＡＡＧ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　Ｇ入＾Ａ入入（ａＴ　ＧＧＡ　ＴＧＣ ＴＴＣＣ入入ＴＣＩ’　２３４Ｉａｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｍ　Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｇｌ ｕ　Ｌ７ｇ　ＪＬｓｐ　Ｇｌｙ　ｃｙｓ　Ｐｈ５ｉ　Ｇｉｎ　Ｓ＠ｒＧＧＴ　Ｃ Ｔ！’　ＴＴＧ　ＧＡＧ　’ｆｆｉ’　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＴＡＣＣＴＡ　ＧＡＧ 　ＴＡＣＣＩ’ＣＣＡＧ　３１２ＧｌｙＬａｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌ ｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｇ１ｎＡＡＣＡＣＡ　 ’ＩＴＴ　ＧＡＧ　ＡＧＴ　ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＧＣＣＡＧＡ　 ＧＣＴ　ＧＴＧ　３５１Ａｓｎ　Ａｒｑ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　ＡｒｇＡｌａ　Ｖａ１ＦＺＧ’ＯＲＥ　６　（ ｃｏｎｔｉｎｕａｄ）ＡＣＣＡＣＡ　ＡＡＴ　ＧＣＣＡＧＣＣＴＧ　ＣＴＧ　Ａ ＣＧ　ＡＡＧ　ｃ１％Ｇ　ｃ入ＧＧＣ入Ｃ入Ｇ　４６８Ｔｈｒ’ｒｈｒ　ＪＩＪ ｎ　Ａｌａ　ｓａｒ　Ｉａｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　−ｕ　Ｇｉｎ　ＡＩＪ ｉ　Ｇ１ｎ２工ＧσＲＥ７ ６５１αＬＡＧＣＡＧＩχｃ　ＣＣＡＣＣＣＡＧＧ要約書 この発明は、選択した異種ペプチドまたは蛋白をコード化するＤＮＡ配列に融合 したチオレドキシン様蛋白をコード化するＤＮＡ配列を含む融合分子を提供する 。ペプチドまたは蛋白は、チオレドキシン様分子のアミノ末端、チオレドキシン 様分子のカルボキシル末端、またはチオレドキシン様分子内、例えば前記分子の 活性部位ループに融合され得る。望ましい宿主細胞においてその発現を指示する 能力をもつ調節配列の制御下におけるこの融合分子の発現により、高レベルの安 定した可溶性融合蛋白が製造される。細菌の細胞質に存在する融合蛋白は、浸透 圧ショックまたは凍結／解凍方法により選択的に細胞から放出され得る。それは 、所望により、開裂の結果、チオレドキシン様蛋白から可溶性の正確に折り畳ま れた異種蛋白を遊離させ得る。

手続補正書 平成　５年　４月２０日１

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）選択した異種蛋白をコード化するＤＮＡ配列に融合したチオレドキシン様 蛋白をコード化するＤＮＡを含む、融合蛋白をコード化するＤＮＡ配列。
2. （２）チオレドキシン様蛋白をコード化するＤＮＡ配列が融合蛋白のアミノ末端 を含む、請求項１記載のＤＮＡ配列。
3. （３）チオレドキシン様蛋白をコード化するＤＮＡ配列が融合蛋白のカルボキシ 末端を含む、請求項１記載のＤＮＡ配列。
4. （４）チオレドキシン様蛋白をコード化するＤＮＡ配列がエシエリキア・コリ（ ＥＣｏｌｉ）チオレドキシンおよびひとチオレドキシンからなる群から選ばれる 、請求項１、２または３記載のＤＮＡ配列。
5. （５）選択した蛋白をコード化するＤＮＡ配列がＩＬ−１１、ＩＬ−６、マクロ ファージ阻害蛋白１αおよび骨形態形成蛋白２からなる群から選ばれる、請求項 １、２または３記載のＤＮＡ配列。
6. （６）さらにチオレドキシン様蛋白をコード化するＤＮＡと選択した異種蛋白を コード化するＤＮＡの間に融合したリンカーＤＮＡ配列を含む、請求項１、２ま たは３記載のＤＮＡ配列。
7. （７）配列が、選択した宿主細胞中における融合蛋白の発現を指示する能力をも つ適当な発現制御配列の制御下にある、請求項１−６のＤＮＡ配列を含むプラス ミドＤＮＡ分子。
8. （８）請求項７記載のプラスミドで形質転換されるか、またはそれをそのゲノム 中へ組込まれた、エシエリキア・コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）宿主細胞。
9. （９）（ａ）適当な条件下、培地中で請求項８記載の宿主細胞を培養し、（ｂ） それにより産された融合蛋白を上記培地から採取し、（ｃ）上記融合蛋白から選 択した異種蛋白を切断し、（ｄ）選択した異種蛋白を分離することを含む選択し た異種蛋白の製造法。
10. （１０）請求項９記載の方法で製造されるＩＬ−１１蛋白。
11. （１１）請求項９記載の方法におけるチオレドキシンの使用。