JPH04365500A - 胆汁酸の一斉分析法 - Google Patents
胆汁酸の一斉分析法Info
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- JPH04365500A JPH04365500A JP23674291A JP23674291A JPH04365500A JP H04365500 A JPH04365500 A JP H04365500A JP 23674291 A JP23674291 A JP 23674291A JP 23674291 A JP23674291 A JP 23674291A JP H04365500 A JPH04365500 A JP H04365500A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、胆汁酸の分析法に関す
る。詳しくは３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼ（以下、３α−ＨＳＤと略す。）固定化酵素カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣ
と略す。）による実験動物等の生体内多成分胆汁酸の一
斉分析法である。
る。詳しくは３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼ（以下、３α−ＨＳＤと略す。）固定化酵素カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣ
と略す。）による実験動物等の生体内多成分胆汁酸の一
斉分析法である。
【０００２】
【従来の技術】ヒトの胆汁や血液中には、胆汁酸として
コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、
ウルソデオキシコール酸及びリトコール酸がそれぞれ遊
離型、グリシン抱合型並びにタウリン抱合型の計１５種
の形で存在する（以下、これらの１５種の胆汁酸を「ヒ
ト胆汁酸」という。）。これらの各胆汁酸成分を分離定
量することは、臨床検査の分野において特に肝胆道系疾
患の診断等に有用であり、従来より種々の分析法が検討
され実用化されている。
コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、
ウルソデオキシコール酸及びリトコール酸がそれぞれ遊
離型、グリシン抱合型並びにタウリン抱合型の計１５種
の形で存在する（以下、これらの１５種の胆汁酸を「ヒ
ト胆汁酸」という。）。これらの各胆汁酸成分を分離定
量することは、臨床検査の分野において特に肝胆道系疾
患の診断等に有用であり、従来より種々の分析法が検討
され実用化されている。
【０００３】一方、新薬開発にあっては、ヒトでの臨床
試験に入る前に、主としてヒト以外の動物を用いてその
有効性や安全性の確認が行われる。実験動物の生体中の
各胆汁酸成分の分析は、肝胆道系疾患治療薬等の開発に
おける種々多様な前臨床試験において、極めて重要な役
割を担っている。
試験に入る前に、主としてヒト以外の動物を用いてその
有効性や安全性の確認が行われる。実験動物の生体中の
各胆汁酸成分の分析は、肝胆道系疾患治療薬等の開発に
おける種々多様な前臨床試験において、極めて重要な役
割を担っている。
【０００４】これらの実験動物の中には、生体中にヒト
胆汁酸には含まれない胆汁酸成分を含有するものがある
。例えば、ラットやブタの胆汁中では、前記１５種のヒ
ト胆汁酸以外にα−ムリコール酸、β−ムリコール酸、
ヒオデオキシコール酸及びヒオコール酸並びにこれらの
抱合型胆汁酸が加わり計２７種の胆汁酸が存在する（以
下、これらの２７種の胆汁酸を「ラット胆汁酸」という
。）。
胆汁酸には含まれない胆汁酸成分を含有するものがある
。例えば、ラットやブタの胆汁中では、前記１５種のヒ
ト胆汁酸以外にα−ムリコール酸、β−ムリコール酸、
ヒオデオキシコール酸及びヒオコール酸並びにこれらの
抱合型胆汁酸が加わり計２７種の胆汁酸が存在する（以
下、これらの２７種の胆汁酸を「ラット胆汁酸」という
。）。
【０００５】これらの実験動物の生体中の胆汁酸の分析
は、多成分であるためヒト胆汁酸の分析法に比べ高い分
離能を必要とし、ヒト胆汁酸分析法をそのまま応用する
ことはできない。
は、多成分であるためヒト胆汁酸の分析法に比べ高い分
離能を必要とし、ヒト胆汁酸分析法をそのまま応用する
ことはできない。
【０００６】例えば、ヒト胆汁酸の分析においてはＨＰ
ＬＣによる方法が主流となりつつあるが、ラット胆汁酸
に用いた場合、分離能が不足し満足した結果が得られて
いない。特公昭５６−３８２００号公報には、遊離型及
び抱合型胆汁酸を含有する試料をＨＰＬＣにより各胆汁
酸成分に分離し、次いで３α−ＨＳＤ固定化酵素カラム
を用いて各胆汁酸成分を検出する胆汁酸の分析法が示さ
れている。しかし、同公報には、ヒト胆汁酸１５成分中
１３成分の分析結果しか開示されておらず、実際後述す
るように、同公報に記載の方法ではラット胆汁酸２７成
分の分離定量はできない（比較例８）。
ＬＣによる方法が主流となりつつあるが、ラット胆汁酸
に用いた場合、分離能が不足し満足した結果が得られて
いない。特公昭５６−３８２００号公報には、遊離型及
び抱合型胆汁酸を含有する試料をＨＰＬＣにより各胆汁
酸成分に分離し、次いで３α−ＨＳＤ固定化酵素カラム
を用いて各胆汁酸成分を検出する胆汁酸の分析法が示さ
れている。しかし、同公報には、ヒト胆汁酸１５成分中
１３成分の分析結果しか開示されておらず、実際後述す
るように、同公報に記載の方法ではラット胆汁酸２７成
分の分離定量はできない（比較例８）。
【０００７】また、ラット胆汁酸をアルカリで前処理し
、抱合型をすべて遊離型に加水分解した後、固定化酵素
カラムを用いてＨＰＬＣにより遊離型胆汁酸（９成分）
の総量として定量する方法が報告されている（「医学の
あゆみ」第１３０巻、第３号、昭和５９年７月２１日）
。しかし、同分析法では、ラット胆汁酸を遊離型、グリ
シン抱合型及びタウリン抱合型に分離して定量すること
ができず、前臨床試験における分析法としては実用性が
低い。
、抱合型をすべて遊離型に加水分解した後、固定化酵素
カラムを用いてＨＰＬＣにより遊離型胆汁酸（９成分）
の総量として定量する方法が報告されている（「医学の
あゆみ」第１３０巻、第３号、昭和５９年７月２１日）
。しかし、同分析法では、ラット胆汁酸を遊離型、グリ
シン抱合型及びタウリン抱合型に分離して定量すること
ができず、前臨床試験における分析法としては実用性が
低い。
【０００８】また、ヒト胆汁酸をイオン交換基を有する
疎水性ゲルで処理して遊離型、グリシン抱合型及びタウ
リン抱合型の各胆汁酸群に分画し（以下、「抱合分画」
という。）、固定化酵素カラムを用いたＨＰＬＣにより
各フラクションごとに定量する方法が知られている（特
公昭６２−３０５８８号公報等）。この方法をそのまま
用いたのではラット胆汁酸の定量はできないが、この方
法と上述のアルカリ処理の方法を組み合わせることによ
り、すなわち、ラット胆汁酸を抱合分画し、抱合型のフ
ラクションについてはさらに上述のアルカリ処理の方法
により脱抱合した後、各フラクションごとにそれぞれ固
定化酵素カラムを用いたＨＰＬＣにより定量する方法が
考えられる。しかし、この方法では、抱合分画や脱抱合
等の前処理に４〜５日を要し、各フラクションごとに測
定しなければならないため、煩雑で汎用に耐えない。
疎水性ゲルで処理して遊離型、グリシン抱合型及びタウ
リン抱合型の各胆汁酸群に分画し（以下、「抱合分画」
という。）、固定化酵素カラムを用いたＨＰＬＣにより
各フラクションごとに定量する方法が知られている（特
公昭６２−３０５８８号公報等）。この方法をそのまま
用いたのではラット胆汁酸の定量はできないが、この方
法と上述のアルカリ処理の方法を組み合わせることによ
り、すなわち、ラット胆汁酸を抱合分画し、抱合型のフ
ラクションについてはさらに上述のアルカリ処理の方法
により脱抱合した後、各フラクションごとにそれぞれ固
定化酵素カラムを用いたＨＰＬＣにより定量する方法が
考えられる。しかし、この方法では、抱合分画や脱抱合
等の前処理に４〜５日を要し、各フラクションごとに測
定しなければならないため、煩雑で汎用に耐えない。
【０００９】また、ヒト胆汁酸の分析に従来用いられて
いたガスクロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー
マススペクトロメトリー等による方法でも、遊離型胆汁
酸としてしか分析できず、トリメチルシリル化等の煩雑
な前処理が必要である等の多くの問題があり、有効な方
法とはいえない。
いたガスクロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー
マススペクトロメトリー等による方法でも、遊離型胆汁
酸としてしか分析できず、トリメチルシリル化等の煩雑
な前処理が必要である等の多くの問題があり、有効な方
法とはいえない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】このように、実験動物
の生体内胆汁酸に関する情報を得ることは前臨床試験に
おいて極めて重要であり、これらの胆汁酸を遊離型及び
抱合型の各胆汁酸成分ごとに定量できる分析法の確立が
要望されているにもかかわらず、定量性に優れかつ汎用
性の高い分析法はいまだ見出されていない。
の生体内胆汁酸に関する情報を得ることは前臨床試験に
おいて極めて重要であり、これらの胆汁酸を遊離型及び
抱合型の各胆汁酸成分ごとに定量できる分析法の確立が
要望されているにもかかわらず、定量性に優れかつ汎用
性の高い分析法はいまだ見出されていない。
【００１１】本発明の目的は、抱合分画等の煩雑な前処
理を必要とせず、簡便かつ短時間にラット胆汁酸等の多
成分胆汁酸を高感度で各胆汁酸成分に分離定量する方法
を提供することにある。
理を必要とせず、簡便かつ短時間にラット胆汁酸等の多
成分胆汁酸を高感度で各胆汁酸成分に分離定量する方法
を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、３α−ＨＳＤ固定化酵素カラムを用いたＨＰＬ
Ｃによるラット胆汁酸等の多成分胆汁酸の一斉分析法を
完成させた。
の結果、３α−ＨＳＤ固定化酵素カラムを用いたＨＰＬ
Ｃによるラット胆汁酸等の多成分胆汁酸の一斉分析法を
完成させた。
【００１３】すなわち、本発明は、遊離型、グリシン抱
合型及びタウリン抱合型胆汁酸を含有する試料液を溶離
液とともに分離用カラム内に導入してＨＰＬＣにより各
胆汁酸成分に分離した後、固定化された３α−ＨＳＤを
有する固定化酵素カラムに通してニコチン酸アミドアデ
ニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と略す。）と反応
させ、生成した還元型ＮＡＤ（以下、ＮＡＤＨと略す。 ）を紫外線吸収測定及び／又は蛍光測定を行って各胆汁
酸成分を検出することにより胆汁酸を分析する方法にお
いて、二液以上の勾配溶離により、（イ）少なくとも低
級脂肪族ニトリル、塩を含有するｐＨ７〜１２の水溶液
及び低級アルコールが混合されてなり、低級脂肪族ニト
リル１．５〜６Ｍ、塩０．５〜２５０ｍＭ及び低級アル
コール５Ｍ以下を含有する初期組成Ａから、（ロ）少な
くとも低級脂肪族ニトリル、塩を含有するｐＨ４〜１２
の水溶液及び低級アルコールが混合されてなり、低級脂
肪族ニトリル０．９〜８Ｍ、塩０．５〜１２０ｍＭ及び
低級アルコール２〜１２Ｍを含有する最終組成Ｂへ、移
動相の組成を連続的及び／又は段階的に変化させること
により各胆汁酸成分に分離定量することを特徴とする胆
汁酸の一斉分析法である。
合型及びタウリン抱合型胆汁酸を含有する試料液を溶離
液とともに分離用カラム内に導入してＨＰＬＣにより各
胆汁酸成分に分離した後、固定化された３α−ＨＳＤを
有する固定化酵素カラムに通してニコチン酸アミドアデ
ニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と略す。）と反応
させ、生成した還元型ＮＡＤ（以下、ＮＡＤＨと略す。 ）を紫外線吸収測定及び／又は蛍光測定を行って各胆汁
酸成分を検出することにより胆汁酸を分析する方法にお
いて、二液以上の勾配溶離により、（イ）少なくとも低
級脂肪族ニトリル、塩を含有するｐＨ７〜１２の水溶液
及び低級アルコールが混合されてなり、低級脂肪族ニト
リル１．５〜６Ｍ、塩０．５〜２５０ｍＭ及び低級アル
コール５Ｍ以下を含有する初期組成Ａから、（ロ）少な
くとも低級脂肪族ニトリル、塩を含有するｐＨ４〜１２
の水溶液及び低級アルコールが混合されてなり、低級脂
肪族ニトリル０．９〜８Ｍ、塩０．５〜１２０ｍＭ及び
低級アルコール２〜１２Ｍを含有する最終組成Ｂへ、移
動相の組成を連続的及び／又は段階的に変化させること
により各胆汁酸成分に分離定量することを特徴とする胆
汁酸の一斉分析法である。
【００１４】本発明の分析法によれば、ラット胆汁酸等
に含まれるコール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシ
コール酸、ウルソデオキシコール酸、リトコール酸、α
−ムリコール酸、β−ムリコール酸、ヒオデオキシコー
ル酸及びヒオコール酸のそれぞれ遊離型、グリシン抱合
型並びにタウリン抱合型の計２７種の胆汁酸を、抱合分
画等の前処理なしに簡便かつ短時間に分離定量すること
ができる。
に含まれるコール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシ
コール酸、ウルソデオキシコール酸、リトコール酸、α
−ムリコール酸、β−ムリコール酸、ヒオデオキシコー
ル酸及びヒオコール酸のそれぞれ遊離型、グリシン抱合
型並びにタウリン抱合型の計２７種の胆汁酸を、抱合分
画等の前処理なしに簡便かつ短時間に分離定量すること
ができる。
【００１５】以下、本発明の分析法についてさらに詳細
に説明する。本発明は、ＨＰＬＣにおいて、二液以上の
勾配溶離（グラジエント）により、移動相の組成を特定
の初期組成Ａから最終組成Ｂまで連続的及び／又は段階
的に変化させることにより達成される。
に説明する。本発明は、ＨＰＬＣにおいて、二液以上の
勾配溶離（グラジエント）により、移動相の組成を特定
の初期組成Ａから最終組成Ｂまで連続的及び／又は段階
的に変化させることにより達成される。
【００１６】初期組成Ａにおける移動相は、少なくとも
低級脂肪族ニトリル、塩を含有するｐＨ７〜１２の水溶
液及び低級アルコールが混合されてなる。低級脂肪族ニ
トリルとしては、アセトニトリル、プロピオニトリル等
が用いられる。塩としては、リン酸、炭酸、酢酸等のア
ンモニウム、ナトリウム、カリウム塩等の無機塩又は有
機塩が用いられる。また、塩水溶液のｐＨは７〜１２で
あることが必要である。ｐＨが７未満では各成分の分離
が不十分となり、ｐＨが１２を越えるとカラムの劣化が
早く実用的でない。水溶液のｐＨは直接これらの塩の水
溶液として、または塩の水溶液に適当なアルカリを加え
ることにより調整される。低級アルコールとしては、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール等が用いられ
る。
低級脂肪族ニトリル、塩を含有するｐＨ７〜１２の水溶
液及び低級アルコールが混合されてなる。低級脂肪族ニ
トリルとしては、アセトニトリル、プロピオニトリル等
が用いられる。塩としては、リン酸、炭酸、酢酸等のア
ンモニウム、ナトリウム、カリウム塩等の無機塩又は有
機塩が用いられる。また、塩水溶液のｐＨは７〜１２で
あることが必要である。ｐＨが７未満では各成分の分離
が不十分となり、ｐＨが１２を越えるとカラムの劣化が
早く実用的でない。水溶液のｐＨは直接これらの塩の水
溶液として、または塩の水溶液に適当なアルカリを加え
ることにより調整される。低級アルコールとしては、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール等が用いられ
る。
【００１７】また、初期組成Ａは、これらの含有量が低
級脂肪族ニトリル１．５〜６Ｍ、塩０．５〜２５０ｍＭ
及び低級アルコール５Ｍ以下であることが必要である。 移動相の初期組成において、低級脂肪族ニトリル又は低
級アルコールの含有量がかかる範囲の上限を越えると、
移動相の溶出力が過剰となり胆汁酸は分離することなく
一斉に溶出してしまう。一方、低級脂肪族ニトリルの含
有量がかかる範囲の下限を下回ると、移動相の溶出力が
低下し胆汁酸の保持力が強まるため、溶出に長時間を要
することとなる。また、移動相の初期組成における塩の
含有量が０．５ｍＭ以下では、最初に溶出するα，β−
ムリコール酸群の分離が不可能となり、２５０ｍＭ以上
では移動相中に塩の析出が生じ、装置やカラムの故障に
つながる。
級脂肪族ニトリル１．５〜６Ｍ、塩０．５〜２５０ｍＭ
及び低級アルコール５Ｍ以下であることが必要である。 移動相の初期組成において、低級脂肪族ニトリル又は低
級アルコールの含有量がかかる範囲の上限を越えると、
移動相の溶出力が過剰となり胆汁酸は分離することなく
一斉に溶出してしまう。一方、低級脂肪族ニトリルの含
有量がかかる範囲の下限を下回ると、移動相の溶出力が
低下し胆汁酸の保持力が強まるため、溶出に長時間を要
することとなる。また、移動相の初期組成における塩の
含有量が０．５ｍＭ以下では、最初に溶出するα，β−
ムリコール酸群の分離が不可能となり、２５０ｍＭ以上
では移動相中に塩の析出が生じ、装置やカラムの故障に
つながる。
【００１８】最終組成Ｂにおける移動相は、少なくとも
低級脂肪族ニトリル、塩を含有するｐＨ４〜１２の水溶
液及び低級アルコールが混合されてなり、低級脂肪族ニ
トリル０．９〜８Ｍ、塩０．５〜１２０ｍＭ及び低級ア
ルコール２〜１２Ｍを含有するものであることが必要で
ある。最終組成Ｂにおける低級脂肪族ニトリル、塩及び
低級アルコールは、初期組成Ａで用いたものと同一また
は異なるものであってもよく、初期組成Ａで列記したも
のが用いられる。初期組成においてと同様、移動相の最
終組成がかかる範囲外のものでは良好な分離成績は得ら
れない。
低級脂肪族ニトリル、塩を含有するｐＨ４〜１２の水溶
液及び低級アルコールが混合されてなり、低級脂肪族ニ
トリル０．９〜８Ｍ、塩０．５〜１２０ｍＭ及び低級ア
ルコール２〜１２Ｍを含有するものであることが必要で
ある。最終組成Ｂにおける低級脂肪族ニトリル、塩及び
低級アルコールは、初期組成Ａで用いたものと同一また
は異なるものであってもよく、初期組成Ａで列記したも
のが用いられる。初期組成においてと同様、移動相の最
終組成がかかる範囲外のものでは良好な分離成績は得ら
れない。
【００１９】移動相の初期組成Ａから最終組成Ｂまでの
連続的及び／又は段階的組成変化は、グラジエント装置
等により、所定の組成勾配になるよう２液以上の溶離液
の混合割合を調製することにより達成される。グラジエ
ントの方法は、例えば組成Ａに調製された溶離液１００
％から組成Ｂに調製された溶離液１００％への２液グラ
ジエントであっても良く、異なった組成を有する溶離液
を組み合わせた３液以上のグラジエントであっても良い
。
連続的及び／又は段階的組成変化は、グラジエント装置
等により、所定の組成勾配になるよう２液以上の溶離液
の混合割合を調製することにより達成される。グラジエ
ントの方法は、例えば組成Ａに調製された溶離液１００
％から組成Ｂに調製された溶離液１００％への２液グラ
ジエントであっても良く、異なった組成を有する溶離液
を組み合わせた３液以上のグラジエントであっても良い
。
【００２０】その他のグラジエント条件は、カラムの充
填剤の種類や移動相の組成、混合比等によって適宜選択
される。
填剤の種類や移動相の組成、混合比等によって適宜選択
される。
【００２１】本発明における試料としては、ヒトや動物
の胆汁、血液、尿、肝臓等の生体試料が該当する。これ
らの生体試料は、必要に応じて脱塩、除蛋白、抽出、濃
縮、洗浄等の前処理に付され、遊離型及び抱合型の胆汁
酸がメタノール溶液等として回収、精製される。また、
内標準法による場合は、試料液に内標準物質が加えられ
る。内標準物質としては、３α，７β−ジヒドロキシ−
１２−オキソ−５β−コラン酸、３α−ヒドロキシ−７
，１２−ジオキソ−５β−コラン酸、３α，７β，１２
α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸、３α−ヒドロキ
シ−７−オキソ−５β−コラン酸、３α−ヒドロキシ−
１２−オキソ−５β−コラン酸、３α，１２α−ジヒド
ロキシ−７−オキソ−５β−コラン酸及びこれらのグリ
シン抱合型並びにタウリン抱合型胆汁酸、５β−プレグ
ナン−３α，１２α，２０α−トリオール、５β−アン
ドロスタン−３α，１１α，１７β−トリオール、５β
−アンドロスタン−３α，１７β−ジオール等が用いら
れる。
の胆汁、血液、尿、肝臓等の生体試料が該当する。これ
らの生体試料は、必要に応じて脱塩、除蛋白、抽出、濃
縮、洗浄等の前処理に付され、遊離型及び抱合型の胆汁
酸がメタノール溶液等として回収、精製される。また、
内標準法による場合は、試料液に内標準物質が加えられ
る。内標準物質としては、３α，７β−ジヒドロキシ−
１２−オキソ−５β−コラン酸、３α−ヒドロキシ−７
，１２−ジオキソ−５β−コラン酸、３α，７β，１２
α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸、３α−ヒドロキ
シ−７−オキソ−５β−コラン酸、３α−ヒドロキシ−
１２−オキソ−５β−コラン酸、３α，１２α−ジヒド
ロキシ−７−オキソ−５β−コラン酸及びこれらのグリ
シン抱合型並びにタウリン抱合型胆汁酸、５β−プレグ
ナン−３α，１２α，２０α−トリオール、５β−アン
ドロスタン−３α，１１α，１７β−トリオール、５β
−アンドロスタン−３α，１７β−ジオール等が用いら
れる。
【００２２】本発明を実施するための代表的な装置を図
１に示した。１ａ及び１ｂは溶離液槽、２ａ及び２ｂは
溶離液用ポンプである。試料注入器４より注入された試
料液は、グラジエント装置３により所望の混合割合に調
製された移動相とともに分離用カラム５に導入される。
１に示した。１ａ及び１ｂは溶離液槽、２ａ及び２ｂは
溶離液用ポンプである。試料注入器４より注入された試
料液は、グラジエント装置３により所望の混合割合に調
製された移動相とともに分離用カラム５に導入される。
【００２３】分離用カラムの充填剤としては、オクタデ
シル基、オクチル基、ブチル基、メチル基、フェニル基
、フェニルエチル基、シアノプロピル基、アミノプロピ
ル基等の官能基で修飾されたシリカゲルやポーラスポリ
マー等の逆相系の化学結合型充填剤が用いられる。充填
剤の粒子径は３〜１０μｍが好ましく、細孔径は５０〜
３００Åが好ましい。また、分離用カラムの大きさは、
直径４〜６ｍｍ、長さ１０〜３０ｃｍが好ましい。
シル基、オクチル基、ブチル基、メチル基、フェニル基
、フェニルエチル基、シアノプロピル基、アミノプロピ
ル基等の官能基で修飾されたシリカゲルやポーラスポリ
マー等の逆相系の化学結合型充填剤が用いられる。充填
剤の粒子径は３〜１０μｍが好ましく、細孔径は５０〜
３００Åが好ましい。また、分離用カラムの大きさは、
直径４〜６ｍｍ、長さ１０〜３０ｃｍが好ましい。
【００２４】試料液は分離用カラム５においてＨＰＬＣ
により各胆汁酸成分に分離され、分離用カラムから流出
した分離液にＮＡＤ＋を含む反応液が反応液槽６から供
給される。
により各胆汁酸成分に分離され、分離用カラムから流出
した分離液にＮＡＤ＋を含む反応液が反応液槽６から供
給される。
【００２５】次いで、分離液は固定化された３α−ＨＳ
Ｄを有する固定化酵素カラム８に導入される。固定化酵
素カラムは、３α−ＨＳＤを化学的に球状セルロースや
アミノアルキル化シリカ担体等に固定化させ、ステンレ
スカラム等に充填したものが用いられる。
Ｄを有する固定化酵素カラム８に導入される。固定化酵
素カラムは、３α−ＨＳＤを化学的に球状セルロースや
アミノアルキル化シリカ担体等に固定化させ、ステンレ
スカラム等に充填したものが用いられる。
【００２６】固定化酵素カラム８において、３α−ＨＳ
Ｄの触媒作用により、胆汁酸とＮＡＤ＋とが特異的に反
応して３α−ヒドロキシ胆汁酸は３−オキソ体に変り、
同時に等量のＮＡＤＨが生成する。生成したＮＡＤＨは
３４０ｎｍの波長の光で励起されることにより、４６０
ｎｍに極大値を持つ蛍光を発する。これを検出器９によ
り蛍光測定することにより間接的に胆汁酸が検出され、
その結果が記録計１０により記録される。
Ｄの触媒作用により、胆汁酸とＮＡＤ＋とが特異的に反
応して３α−ヒドロキシ胆汁酸は３−オキソ体に変り、
同時に等量のＮＡＤＨが生成する。生成したＮＡＤＨは
３４０ｎｍの波長の光で励起されることにより、４６０
ｎｍに極大値を持つ蛍光を発する。これを検出器９によ
り蛍光測定することにより間接的に胆汁酸が検出され、
その結果が記録計１０により記録される。
【００２７】
【発明の効果】本発明の分析法は優れた分離能を有し、
抱合分画等の前処理なしにラット胆汁酸等の多成分胆汁
酸を簡便かつ短時間に各胆汁酸成分に分離定量すること
ができる。
抱合分画等の前処理なしにラット胆汁酸等の多成分胆汁
酸を簡便かつ短時間に各胆汁酸成分に分離定量すること
ができる。
【００２８】すなわち、本発明の分析法によれば、コー
ル酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ウル
ソデオキシコール酸、リトコール酸、α−ムリコール酸
、β−ムリコール酸、ヒオデオキシコール酸及びヒオコ
ール酸のそれぞれ遊離型、グリシン抱合型並びにタウリ
ン抱合型の計２７種の胆汁酸の分離定量が可能であり、
ヒト、サル、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、クマ、
イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、ガチョ
ウ、フグ、コイ等の種々の動物の生体内胆汁酸の分析に
利用することができる。
ル酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ウル
ソデオキシコール酸、リトコール酸、α−ムリコール酸
、β−ムリコール酸、ヒオデオキシコール酸及びヒオコ
ール酸のそれぞれ遊離型、グリシン抱合型並びにタウリ
ン抱合型の計２７種の胆汁酸の分離定量が可能であり、
ヒト、サル、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、クマ、
イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、ガチョ
ウ、フグ、コイ等の種々の動物の生体内胆汁酸の分析に
利用することができる。
【００２９】
【実施例】以下に、本発明の分析法を実施例を持って説
明する。 実施例１ １．分離分析 （１）試料液 ラット胆汁酸成分である下記の遊離型、グリシン抱合型
及びタウリン抱合型の計２７種類の胆汁酸をそれぞれ１
０ｍｇずつ１１のメタノールに溶解して試料液とし、注
入量としては、その２０μｌを用いた。なお、各胆汁酸
名の後の括弧書は、本明細書における各胆汁酸の略称を
表す。 ■ 遊離型 コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）
、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ウルソデオキシコール
酸（ＵＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、α−ムリコ
ール酸（α−ＭＣＡ）、β−ムリコール酸（β−ＭＣＡ
）、ヒオデオキシコール酸（ＨＤＣＡ）、ヒオコール酸
（ＨＣＡ） ■ グリシン抱合型 グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコケノデオキシコール
酸（ＧＣＤＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ
）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、グ
リコリトコール酸（ＧＬＣＡ）、グリコ−α−ムリコー
ル酸（Ｇ−α−ＭＣＡ）、グリコ−β−ムリコール酸（
Ｇ−β−ＭＣＡ）、グリコヒオデオキシコール酸（ＧＨ
ＤＣＡ）、グリコヒオコール酸（ＧＨＣＡ）■ タウ
リン抱合型 タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロケノデオキシコール
酸（ＴＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ
）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、タ
ウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、タウロ−α−ムリコー
ル酸（Ｔ−α−ＭＣＡ）、タウロ−β−ムリコール酸（
Ｔ−β−ＭＣＡ）、タウロヒオデオキシコール酸（ＴＨ
ＤＣＡ）、タウロヒオコール酸（ＴＨＣＡ）（２）ＨＰ
ＬＣ装置 ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−ＶＩ （日本分光工業（株）製） （３）検出器 ＪＡＳＣＯ ＦＰ−２１０ （日本分光工業（株）製） （４）分離用カラム イナートシル ＯＤＳ−２（５μｍ）、４．６ｍｍφ
×１５ｃｍ （ＧＬサイエンス社製） （５）固定化酵素カラム セキスイ−Ｅ−３α−ＨＳＤ固定化酵素カラム、４ｍｍ
φ×２ｃｍ （積水化学工業社製） （６）カラム温度 ３０℃ （７）反応液 ０．３ｍＭのＮＡＤ＋を含むリン
酸緩衝液（ｐＨ７．８） （８）流量 移動相、反応液とも１ｍｌ／分（９
）移動相 １０ｍＭのリン酸三アンモニウム水溶液（７３ｖｏｌ％
）、アセトニトリル（１９ｖｏｌ％）及びメタノール（
８ｖｏｌ％）の混合液（Ａ液）と、２０ｍＭのリン酸三
アンモニウム水溶液（４０ｖｏｌ％）、アセトニトリル
（２０ｖｏｌ％）及びメタノール（４０ｖｏｌ％）の混
合液（Ｂ液）の２種の溶離液を用いた。 （１０）グラジエント条件 まず、Ａ液１００％で５０分間流し、その後６０分間で
Ａ液１００％からＢ液１００％まで直線的に変化させた
。実施例１で得られたクロマトグラムを図２に示した。 各胆汁酸成分の分離は、極めて良好であった。
明する。 実施例１ １．分離分析 （１）試料液 ラット胆汁酸成分である下記の遊離型、グリシン抱合型
及びタウリン抱合型の計２７種類の胆汁酸をそれぞれ１
０ｍｇずつ１１のメタノールに溶解して試料液とし、注
入量としては、その２０μｌを用いた。なお、各胆汁酸
名の後の括弧書は、本明細書における各胆汁酸の略称を
表す。 ■ 遊離型 コール酸（ＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）
、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ウルソデオキシコール
酸（ＵＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、α−ムリコ
ール酸（α−ＭＣＡ）、β−ムリコール酸（β−ＭＣＡ
）、ヒオデオキシコール酸（ＨＤＣＡ）、ヒオコール酸
（ＨＣＡ） ■ グリシン抱合型 グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコケノデオキシコール
酸（ＧＣＤＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ
）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、グ
リコリトコール酸（ＧＬＣＡ）、グリコ−α−ムリコー
ル酸（Ｇ−α−ＭＣＡ）、グリコ−β−ムリコール酸（
Ｇ−β−ＭＣＡ）、グリコヒオデオキシコール酸（ＧＨ
ＤＣＡ）、グリコヒオコール酸（ＧＨＣＡ）■ タウ
リン抱合型 タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロケノデオキシコール
酸（ＴＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ
）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、タ
ウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、タウロ−α−ムリコー
ル酸（Ｔ−α−ＭＣＡ）、タウロ−β−ムリコール酸（
Ｔ−β−ＭＣＡ）、タウロヒオデオキシコール酸（ＴＨ
ＤＣＡ）、タウロヒオコール酸（ＴＨＣＡ）（２）ＨＰ
ＬＣ装置 ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−ＶＩ （日本分光工業（株）製） （３）検出器 ＪＡＳＣＯ ＦＰ−２１０ （日本分光工業（株）製） （４）分離用カラム イナートシル ＯＤＳ−２（５μｍ）、４．６ｍｍφ
×１５ｃｍ （ＧＬサイエンス社製） （５）固定化酵素カラム セキスイ−Ｅ−３α−ＨＳＤ固定化酵素カラム、４ｍｍ
φ×２ｃｍ （積水化学工業社製） （６）カラム温度 ３０℃ （７）反応液 ０．３ｍＭのＮＡＤ＋を含むリン
酸緩衝液（ｐＨ７．８） （８）流量 移動相、反応液とも１ｍｌ／分（９
）移動相 １０ｍＭのリン酸三アンモニウム水溶液（７３ｖｏｌ％
）、アセトニトリル（１９ｖｏｌ％）及びメタノール（
８ｖｏｌ％）の混合液（Ａ液）と、２０ｍＭのリン酸三
アンモニウム水溶液（４０ｖｏｌ％）、アセトニトリル
（２０ｖｏｌ％）及びメタノール（４０ｖｏｌ％）の混
合液（Ｂ液）の２種の溶離液を用いた。 （１０）グラジエント条件 まず、Ａ液１００％で５０分間流し、その後６０分間で
Ａ液１００％からＢ液１００％まで直線的に変化させた
。実施例１で得られたクロマトグラムを図２に示した。 各胆汁酸成分の分離は、極めて良好であった。
【００３０】２．繰り返し測定精度
各胆汁酸２００ｎｇを５回注入し、保持時間及びピーク
高さ比の再現性を検討した。結果を表１に示した。
高さ比の再現性を検討した。結果を表１に示した。
【００３１】
【表１】
【００３２】保持時間は、各胆汁酸とも、相対偏差０．
０１〜０．２９％と良好な再現性を示した。また、内標
準物質のピーク高さに対する胆汁酸のピーク高さ比も相
対偏差０．３〜１．３％と良好な再現性を示した。
０１〜０．２９％と良好な再現性を示した。また、内標
準物質のピーク高さに対する胆汁酸のピーク高さ比も相
対偏差０．３〜１．３％と良好な再現性を示した。
【００３３】３．検量線
注入量として、１０〜２０００ｎｇの間の６濃度で各胆
汁酸を測定し、検量線を作成した。 結果を図３に示す。遊離型、グリシン抱合型及びタウリ
ン抱合型の各胆汁酸とも、相関係数０．９９９で原点を
通る良好な直線性を示した。
汁酸を測定し、検量線を作成した。 結果を図３に示す。遊離型、グリシン抱合型及びタウリ
ン抱合型の各胆汁酸とも、相関係数０．９９９で原点を
通る良好な直線性を示した。
【００３４】４．検出限界
注入量として、０．５〜１０ｎｇの範囲で各胆汁酸を測
定し、Ｓ／Ｎ＝２での各胆汁酸の検出限界を求めた。 結果を表２に示す。
定し、Ｓ／Ｎ＝２での各胆汁酸の検出限界を求めた。 結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】Ｓ／Ｎ＝２での各胆汁酸の検出限界は、注
入量として１〜５ｎｇであり、高い検出感度を有するこ
とがわかった。
入量として１〜５ｎｇであり、高い検出感度を有するこ
とがわかった。
【００３７】実施例２〜１２及び比較例１〜７Ａ液及び
Ｂ液の塩水溶液として、種々のｐＨ値を持つ塩水溶液を
用いて分離分析を行った。実験は、実施例１において、
リン酸三アンモニウム水溶液の代わりに表３に記載した
塩水溶液を用いた以外はほぼ同様に操作して行った。分
離成績を表３に示す。
Ｂ液の塩水溶液として、種々のｐＨ値を持つ塩水溶液を
用いて分離分析を行った。実験は、実施例１において、
リン酸三アンモニウム水溶液の代わりに表３に記載した
塩水溶液を用いた以外はほぼ同様に操作して行った。分
離成績を表３に示す。
【００３８】
【表３】
【００３９】また、参考のため、実施例４及び比較例１
のクロマトグラムをそれぞれ図４及び５に示す。
のクロマトグラムをそれぞれ図４及び５に示す。
【００４０】比較例８
比較のため、ヒト胆汁酸１５成分（ＣＡ、ＣＤＣＡ、Ｄ
ＣＡ、ＵＤＣＡ、ＬＣＡ、ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＧＤＣ
Ａ、ＧＵＤＣＡ、ＧＬＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＴＤ
ＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＴＬＣＡ）及びラット胆汁酸２７成
分を従来法（特公昭５６−３８２００号公報）により分
析した。 （１）分離用カラム μＢＯＮＤＡＰＡＫ／Ｐｈｅｎｙｌ、 ３．９ｍｍφ
×３０ｃｍ （ウォーターズ社製） （２）反応液 ０．３ｍＭのＮＡＤ＋を含むリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０） （３）流量 移動相１ｍｌ／分、反応液０．５ｍ
ｌ／分 （４）移動相 ０．３％の炭酸アンモニウム水溶液（Ａ液）と、アセト
ニトリル（Ｂ液）の２種の溶離液を用いた。 （５）グラジエント条件 ６４分間でＡ液：Ｂ液（５：１）からＡ液：Ｂ液（２５
：１１）まで直線的に変化させた。 その他の条件については、実施例１と同様に行った。
ＣＡ、ＵＤＣＡ、ＬＣＡ、ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＧＤＣ
Ａ、ＧＵＤＣＡ、ＧＬＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＴＤ
ＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＴＬＣＡ）及びラット胆汁酸２７成
分を従来法（特公昭５６−３８２００号公報）により分
析した。 （１）分離用カラム μＢＯＮＤＡＰＡＫ／Ｐｈｅｎｙｌ、 ３．９ｍｍφ
×３０ｃｍ （ウォーターズ社製） （２）反応液 ０．３ｍＭのＮＡＤ＋を含むリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０） （３）流量 移動相１ｍｌ／分、反応液０．５ｍ
ｌ／分 （４）移動相 ０．３％の炭酸アンモニウム水溶液（Ａ液）と、アセト
ニトリル（Ｂ液）の２種の溶離液を用いた。 （５）グラジエント条件 ６４分間でＡ液：Ｂ液（５：１）からＡ液：Ｂ液（２５
：１１）まで直線的に変化させた。 その他の条件については、実施例１と同様に行った。
【００４１】比較例８で得られた、ヒト胆汁酸１５成分
のクロマトグラムを図６に、ラット胆汁酸２７成分のク
ロマトグラムを図７に示した。ラット胆汁酸成分の分離
は不完全であり、定量はできなかった。
のクロマトグラムを図６に、ラット胆汁酸２７成分のク
ロマトグラムを図７に示した。ラット胆汁酸成分の分離
は不完全であり、定量はできなかった。
【００４２】
【図１】本発明の胆汁酸の分析法に使用する装置の一例
を示す説明図である。
を示す説明図である。
【図２】実施例１におけるラット胆汁酸２７成分のクロ
マトグラムである。
マトグラムである。
【図３】実施例１における検量線である。
【図４】実施例４におけるラット胆汁酸２７成分のクロ
マトグラムである。
マトグラムである。
【図５】比較例１におけるラット胆汁酸２７成分のクロ
マトグラムである。
マトグラムである。
【図６】比較例８におけるヒト胆汁酸１５成分のクロマ
トグラムである。
トグラムである。
【図７】比較例８におけるラット胆汁酸２７成分のクロ
マトグラムである。
マトグラムである。
１ａ、１ｂ 溶離液槽
２ａ、２ｂ 溶離液用ポンプ
３ グラジエント装置
４ サンプル注入器
５ 分離用カラム
６ 反応液槽
７ 反応液用ポンプ
Claims (1)
- 【請求項１】 ３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ固定化酵素カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーによる胆汁酸分析法において、二液以上の勾配
溶離により、（イ）少なくとも低級脂肪族ニトリル、塩
を含有するｐＨ７〜１２の水溶液及び低級アルコールが
混合されてなり、低級脂肪族ニトリル１．５〜６Ｍ、塩
０．５〜２５０ｍＭ及び低級アルコール５Ｍ以下を含有
する初期組成Ａから、（ロ）少なくとも低級脂肪族ニト
リル、塩を含有するｐＨ４〜１２の水溶液及び低級アル
コールが混合されてなり、低級脂肪族ニトリル０．９〜
８Ｍ、塩０．５〜１２０ｍＭ及び低級アルコール２〜１
２Ｍを含有する最終組成Ｂへ、移動相の組成を連続的及
び／又は段階的に変化させることにより各胆汁酸成分に
分離定量することを特徴とする胆汁酸の一斉分析法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3236742A JP2570021B2 (ja) | 1991-06-12 | 1991-06-12 | 胆汁酸の一斉分析法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3236742A JP2570021B2 (ja) | 1991-06-12 | 1991-06-12 | 胆汁酸の一斉分析法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04365500A true JPH04365500A (ja) | 1992-12-17 |
| JP2570021B2 JP2570021B2 (ja) | 1997-01-08 |
Family
ID=17005120
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3236742A Expired - Lifetime JP2570021B2 (ja) | 1991-06-12 | 1991-06-12 | 胆汁酸の一斉分析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2570021B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003139753A (ja) * | 2001-11-02 | 2003-05-14 | Mitsubishi Pharma Corp | 胆汁酸１８成分の一斉分析法 |
| JP2015031541A (ja) * | 2013-07-31 | 2015-02-16 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | 胆汁酸同時分析方法 |
| CN107064348A (zh) * | 2017-03-30 | 2017-08-18 | 杭州佰辰医学检验所有限公司 | 高效液相色谱串联质谱检测血清中五种甘氨结合型胆汁酸的方法 |
| JP6806948B1 (ja) * | 2020-09-04 | 2021-01-06 | 株式会社アデランス | 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム |
| WO2022049726A1 (ja) * | 2020-09-04 | 2022-03-10 | 株式会社アデランス | 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム |
| CN114235995A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-03-25 | 天津国科医工科技发展有限公司 | 检测血清中15种胆汁酸的方法 |
-
1991
- 1991-06-12 JP JP3236742A patent/JP2570021B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003139753A (ja) * | 2001-11-02 | 2003-05-14 | Mitsubishi Pharma Corp | 胆汁酸１８成分の一斉分析法 |
| JP2015031541A (ja) * | 2013-07-31 | 2015-02-16 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | 胆汁酸同時分析方法 |
| CN107064348A (zh) * | 2017-03-30 | 2017-08-18 | 杭州佰辰医学检验所有限公司 | 高效液相色谱串联质谱检测血清中五种甘氨结合型胆汁酸的方法 |
| JP6806948B1 (ja) * | 2020-09-04 | 2021-01-06 | 株式会社アデランス | 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム |
| WO2022049726A1 (ja) * | 2020-09-04 | 2022-03-10 | 株式会社アデランス | 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム |
| JP2022043412A (ja) * | 2020-09-04 | 2022-03-16 | 株式会社アデランス | 胆汁酸類、ステロール類、及びホルモン類の分析方法及び分析システム |
| CN114235995A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-03-25 | 天津国科医工科技发展有限公司 | 检测血清中15种胆汁酸的方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2570021B2 (ja) | 1997-01-08 |
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