JPH0436637A - 検体測定方法及び検体測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［ａ業上の利用分野〕 本発明は、抗原抗体反応等の特異的結合の作用によって
担体の凝集反応を生じさせることにより検体内の目的物
質を測定する検体測定の分野に関する。

［従来の技術］ 従来、目的とする目的物質と特異的に結合する反応、例
えば抗原抗体反応を利用して、検体中の目的物質を精度
良く測定する方法が知られている。これは目的物質であ
る特定抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体等の
物質を、ラテックス粒子等の担体粒子の表面に感作した
ものを含む所定濃度の試薬を作成し、この試薬を血清等
の検体と混合して抗原抗体反応により担体粒子同士を結
合凝集させ、一定温度下で十分凝集反応が行なわれる時
間（通常は２０〜３０分程度）の放置、所謂インキュベ
ーションを行なう。その後に、主に光学的な手法で前記
担体の凝集状態を測定することで血清中の目的抗原を定
性的又は定量的に測定するものである。これは一般に粒
子イムノアッセイ法と呼ばれて広く知られており、例え
ば特開昭５３−２４０１５号公報、特開昭５４−１０８
６９３号公報、特開昭５４−１０８［ｉ９４号公報、特
開昭５４−１０８６９５号公報、特開昭５４−１０９４
９４号公報、特開昭５５−１５９１５７号公報、特開昭
６２〜８１５６７号公報等に詳細に記載されている。

しかしながら上記従来例では、インキュベーションの際
、担体が凝集して凝集塊を形成する過程で、担体同士の
接触は、担体自身のブラウン運動によるところが大きく
、特に担体の濃度が低い場合は非効率的で時間がかかつ
てしまう問題点があった。

そこで本願出願人は先に特願平２−１０９３２８号にお
いて、光トラツプ現象を利用して担体の凝集を促進する
方法を提案した。

本発明は、簡略な方法で効果的に凝集反応効率を高め、
その結果を更に精度良く測定することのできる手法の提
供を目的とする。

［目的を達成するための手段］ この目的を達成する本発明の概要は、目的物質に特異的
に反応する物質を感作させた担体を、前記目的物質が含
まれる検体と混合して混合物を作成する工程と、前記混
合物に対して強度勾配を有する光を照射し、その光圧に
より前記担体を光照射位置近傍に集中させることによっ
て、前記担体の凝集反応効率を高める工程と、前記凝集
反応の終了した混合物中の担体の′ａ某状態をｆｌｉｆ
ｆｉ情報として検出して、画像解析することにより目的
物質の定性的あるいは定量的な測定を行なう工程を有す
ることを特徴とする。

［実施例］ 本発明の詳細な説明にあたり、まず本発明の基本原理に
ついて第１図を用いて説明する。

一般に第１図（ａ）に示すように液体中に非常に微小な
微粒子が分散して存在するときに、液体中にガウス分布
を有するレーザ光のような、強度勾配を有する光束を用
いてビームウェストを形成すると、第１図（ｂ）に示す
如く、レーザ光の光圧による求心力が働ぎ、浮遊微粒子
がビームウェスト中心近傍に集まる現象が知られている
。これは一般に光トラップと呼ばれ、流体中の微粒子を
特定の場所に移動させたり、あるいは集合させるのに有
用な手法である。本発明はこの光トラップの現象を利用
して、担体微粒子をビームウェストＳ分に集中させて粒
子密度を高め、それによって凝集反応を促進させ、測定
速度共に測定感度を高めることを基本原理とするもので
ある。

次に本発明の実施例の装置を図面を用いて詳細に説明す
る。第２図は本発明の第一実施例の構成図であり、同図
において、１は強度勾配を有する照射光を発生する光源
で、本実施例においては波長１１０６４ｎのＹＡＧレー
ザを用いる。２は濃度フィルタ、３はズームエキスパン
ダ、４は光路中に斜設されるビームスプリッタである。

ビームスプリッタ４で分岐された光束の一方は集光レン
ズ６で集光されて、光検出器７にて光強度が検出される
。不図示の制御回路では光検出器７で得られる光源１か
ら発する光強度の実出力をモニタし実出力が設定強度と
なるように光源１の発光量を制御する。

又、ビームスプリッタ４で分岐されるもう一方の光束は
、ダイクロイックミラー５、対物レンズ１３に至る。対
物レンズ１３は高い開口数（ＮＡ）を持つ液浸形対物レ
ンズであり、本実施例においてはＮＡ＝１．２５である
。対物レンズ１３を通過したレーザ光は、液浸オイル１
２を経て、反応セル３１内の被検部に強度勾配を有する
ビームウェスト１１を形成する。反応セル３１は透光性
のガラスやプラスチック等の材質から成り、内部には反
応検体が封入される構造となっている。

ここで反応セル３１内に封入する反応検体は、直径０．
５μｍ程度の多数のラテックス粒子の表面に、目的とす
る特定抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体を感
作したものを有する所定濃度の試薬を用意し、これと検
１体（血液成分、尿、だ液等の体液が一般的である）と
を混合して作成したものである。より詳しくは前記公報
に記載されているのでここでは詳細な説明は省略する。

反応セル３１内の被検部５に強度勾配を有するビームウ
ェスト１１を形成すると、前記光トラップの現象により
、ビームウェスト中心付近にラテックス粒子が多数集ま
フてラテックス粒子の存在密度が高くなり、部分的濃度
が高くなる。するとラテックス粒子同士が接触する確率
が高くなり、血清中の目的抗原を介してのラテックス粒
子同士の凝集がより促進されることになる。こうして検
体中に目的とする抗原が存在した場合には、ラテックス
粒子同士が結合して２〜５個程度から成る凝集塊を多数
形成する。又、目的抗原が存在しない場合には当然凝集
塊は形成されない。

従来はこのラテックス凝集反応を起こすのに、ブラウン
運動、攪拌等の偶発的な現象を利用していたため、ラテ
ックス粒子同士の接触回数は非常に少なく、結果として
十分なラテックス凝集反応を終了させるには２０分〜３
０分程度に渡るインキュベーションを必要とした。これ
に対して本実施例においては、上記のように光トラップ
の現象を利用してラテックス粒子をビームウェスト中心
付近に集中させ、ラテックス凝集反応を促進させるよう
にしているので、インキュベーションに要する時間を短
縮することができる。それと共に、全体的なラテックス
粒子の濃度が低くても、光トラップにより部分的濃度を
高めて凝集反応を起こさせているので、測定感度が高く
なる効果もある。

こうして一定時間に渡って光を照射し続けてラテックス
の凝集塊反応の促進を行なった後に、制御回路の指令に
より、前記レーザ光を遮断するかあるいは強度を弱める
と、これに応じて光トラップの力が弱まり、ビームウェ
スト付近に集中していたラテックス粒子は、ブラウン運
動等の作用のために徐々に液体中の全体に分散する。こ
の時、抗原抗体反応により形成されたラテックス凝集塊
は塊を形成したまま分散する。又、ここで攪拌手段や加
振手段を設けて、反応セル３１内の液体を攪拌や加振し
、分散をより短時間て効草的に行なわせるようにすれば
一層効果的である。

次に、インキュベーションの完了した検体中のラテック
ス凝集反応の度合を測定するのであるが、その測定手段
の働きを説明する。

３４１図において図示されていない照明光学系によって
波長４００ｎｍ〜８００ｎｍの可視光によって照明され
たラテックス粒子の像は、対物レンズ１３によって集光
され、再びダイクロイックミラー５に至る。ダイクロイ
ックミラー５は前記のように波長１１０６４ｎのレーザ
光を反射し、可視光を透過する特性を有するため、前記
ラテックンズ１５を経て受光素子アレイである二次元撮
像素子１６（以下ｒｃｃＤＪと称する）上に結像する。

ＣＣＤ１６で得られた複数枚の画像信号はフレームメモ
リ１７及びＶＴＲ１９に取込まれ、それぞれデジタル及
びアナログの画像情報として記憶される１画像処理装置
１８ではフレームメモリ１７の内容を基に解析のための
画像処理を行ない、この結果はＣＲＴ２０又は不図示の
プリンタに出力する。又、ＶＴＲ１９（７）画像もＣＲ
Ｔ２０に出力することが可能となりている。なお、−旦
ＶＴＲ１９に全て撮影し、後にこれを再生した出力信号
をＡ／Ｄ変換してフレームメモリ１７に記憶させること
もできる。こうすることにより、最小限のフレームメモ
リ容量で、様々な時点での画像を繰り返し解析すること
ができる。

なお、本実施例では二次元の受光素子アレイを用いて検
体の画像を撮像したが、−次元の受光素子アレイを用い
、反応セルと受光素子アレイを相対的に移動させること
によって実質的に二次元の画像情報を検出するようにし
ても良い。

さて、前記画像処理装置１８は主に以下の３つの画像処
理機能を備えている。これらの機能は操作者により適宜
選択される。

第１の画像処理機能は、２枚の同一画像を位置をずらし
て画像同士の積を演算する機能、すなわち画像の自己相
関を計算する機能である。

一般に２枚の同一画像のずれ量を（α、β）とするとき
、画像の二次元自己相関関数はψ（α。

β）は、 ψ（α、β）弓＝ｆ（Ｘ・α、ｙ＋β）　ｆ（ｘ、ｙ）
ｄｘ　ｄｙで定義される。

画像上に単一径の多数の粒子が乱雑に存在する場合、相
関関数ハＦ＆ｌＩｉ　　ａ　　＋Ｉ３　　＝Ｏ（Ｄトｔ
ｋ最大になり、　ａ　　＋１３７の増大と共に減少する
ｅｘｐ　（−（τ７Ｔ了７／ｌ）の形で表わされる。

ζは相関距離と呼ばれ、粒径を表わすパラメータとなる
。ラテックス粒子が凝集していない場合、ζはラテック
ス粒子径に相当する所定値ζ１となり、α２＋β２＝ζ
１′の時、相関関数は１　／　ｅとなる。ところが、ラ
テックス凝集反応によってラテックス粒子同士が結合し
ている場合には、実質上ラテックス粒子径が大きくなっ
たと見なせるため、相関距離ζ２は所定値ζ、よりも大
きな値となる。

この関係を表わしたものが第５図であり、実線Ａはラテ
ックス凝集反応が生じていない時のもの、−点錯線Ｂは
ラテックス凝集反応が生じている時の相関関数を示して
いる０図から明らかなように、相関関数が１　／　ｅと
なる相関距離ζを求めるか、あるいは一定路ＩＩＩ（α
、β）移動したときの相関関数の値を求めることによっ
て、ラテックス凝集反応の度合を調べることができる。

具体的には光トラップによりラテックス粒子の凝集塊を
形成し、レーザ光の強度を弱めてから−か所に集中して
いたラテックス粒子が十分に分散した時点での画像を一
枚取込み、取込んだ画像をある閾値を基準にして二値化
する。そして同一の２枚の二値化画像を位置をずらしな
がら画像同志の積を演算し自己相関を得るものである。

第２の画像処理機能は、時間と共に変化して行く異なる
画像同志の横を演算する機能、すなわち経時変化する画
像同士の相互相関を計算する機能である。

時間ｔをパラメータとする相互相関関数ψｆｔ）は、 ψ（ｔ）　　＝　’Ｉｒ−，ｆ（ｘ、ｙ、Ｔ◆ｔ）　　
ｆ（ｘ、ｙ、Ｔ）ｄｘ　　ｄｙで定義される。

画像上に単一径の粒子が多数存在し、その位置がブラウ
ン運動等により確率的に変動する場合、相関関数は時間
１＝０のとき最大になり、ｔの増大と共に減少するｅｘ
ｐ（−ｔ　／τ）の形で表わされる。τは相関時間と呼
ばれ、やはり粒径を表わすパラメータとなる。第５図に
その関係を示す。

具体的には前記レーザ光を弱めて光トラップを解き、一
定時間経過し、ラテックスが十分に分散した時点で、一
定時間の間隔で２枚の画像を取込み、両画像の相関関数
を計算することにより、ラテックス凝集状態の度合を測
定することができる。但しこの場合、相関時間τは同時
にブラウン運動等による位置変動の度合にも依存するた
め、反応セルの温度管理を行なうことが望ましい。

又、温度に応じて画像を取込む時間間隔を変更するよう
にすれば更に好ましい。

第３の画像処理機能は、輪郭抽出の技法を応用上たもの
である。前記第２の画像処理機能と同様に、前記レーザ
光の強度を弱めてラテックスの光トラップを解き、所定
時間経過の後、ラテックスが十分に分散した時点で、−
枚の画像を取込み、所定の閾値を用いて取込んだ画像を
二値化し輪郭線を抽出する。該輪郭線は円に近似される
が、円の半径はラテックスの半径として既知であるから
、近似は容易に行なうことができる。この時ラテックス
粒子よりも小さい輪郭線については画像のノイズとして
除去する。ラテックス凝集反応が生じているとぎは、ラ
テックス粒子よりも大きい輪郭線が生じるが、この場合
は複数の円の重なり合わせとして処理する。こうして前
記画像処理の結果得られる輪郭内の面積や形状等を統計
的に処理することで画像内のラテックス粒子の数、ラテ
ックス凝集反応により互いに結合しているラテックス粒
子の数、及び両者の割合等が求まり、ラテックス凝集反
応の度合を測定することができる。

なお上記では、ラテックス粒子よりも大きい輪郭線に対
して複数の円で近似する方法を示したが、近似せずに隼
にラテックス凝集塊として認識する方法もある。この場
合、画像処理のアルゴリズムが非常に簡単になるため処
理速度が向上するメリットがある。さらに輪郭線を抽出
する方法として二値化法を示したが、他の方法として画
像を微分しエツジ強調処理することによって輪郭線を得
る方法を採用しても良い。

又、上記の実施例の内、第１、第３の画像処理機能では
、説明を簡略化するため、使用する画像は、前記レーザ
光の強度を弱め一定時間経過した時点で取込んだ一枚で
あるとしたが、−枚に限定する必要はなく、連続的又は
間欠的に測定することで、測定結果の経時的変化を捕ら
え、測定の信頼性を更に向上させることも可能である。

同様に前記第２の画像処理機能においても、複数の画像
を時系列に連続して取込み、各画像間の相互相関を計算
するようにすれば、より正確な測定が可能となる。

又、自己相関、相互相関を計算する際、必ずしも二値画
像を用いる必要はなく、ＣＣＤで取込んだ多値画像を用
いて相関関数の演算を行なっても良い。

［第二実施例］ 次に本発明の第二実施例を第３図を用いて説明するが、
第２図と同一の符号は同−又は同様の部材を表わす。

先の実施例では画像情報を得るために受光素子アレイで
あるＣＣＤを用いて測定セル内の画像を撮像したが、本
実施例においては微小な光ビームスポットで測定セル内
を二次元的に光走査して、発生する光を単一の受光素子
にて時系列に検出することで画像情報を得るものである
。

光トラツプ現象によりラテックス粒子の凝集反応を促進
する機構は先の第２図の実施例と同様であり、測定セル
３１内にビームウェスト＋１を形成し、担体の凝集反応
を促進させる。

走査光の光源であるレーザ光源２１としては、光トラツ
プ用のレーザ光源１　（ＹＡＧレーザ）とは波長の異な
る、例えば波長６７０ｎｍの半導体レーザを用いる。レ
ーザ光源２１から射出したレーザ光は音響光学素子２２
（以下ｒ　Ａ　ＯＤ　Ｊと称する）により主走査方向に
走査し、ビームエクスパンダ２３を経た後、振動ミラー
２４によって先の主走査方向とは直交する副走査方向に
走査する。このようにＡＯＤと振動ミラーの組合せによ
り二次元走査光学系を形成している。

この走査光はハーフミラ−２５によって測定セル３１方
向に向けられ、対物レンズ１３によって測定セル３１内
に０．５μｍ程度の微小な結像スポットを形成し、測定
セル３１内の測定部を結像スポットにより二次元的に光
走査する。第４図はこの時の様子を示すもので、レーザ
光のビームウェスト１１にラテックス粒子が集中し、結
像スポット３０が矢印方向に二次元的に走査される。

このとき結像スポット３０が照射される位置から発生す
る散乱光は、バンドパスフィルタ１４、集光レンズ１５
を介して単一受光素子のフォトディテクタ２６に入射す
る。そして前記二次元走査光学系を制御する前記同期信
号に基づいてフォトディテクタ２６の出力を時系列に取
込み、フレームメモリ１７に蓄える。こうして実質的に
先の実施例と同等の二次元的な画像情報が得られる。フ
レームメモリ１７に得られるこの画像情報の解析法は先
の実施例と同様であり、画像処理装置１８において、操
作者が適宜選択した解析法によって画像処理を行なう。

［発明の効果コ 以上本発明によれば、簡略な方法で効果的に凝集反応効
率を高めることができ、この凝集状態を画像解析して測
定を行なうため、非常に精度の高い測定が行なえる。

【図面の簡単な説明】

第１図は光トラツプ現象の説明図、 第２図は本発明の第一実施例の構成図、第３図は本発明
の第二実施例の構成図、第４図は第二実施例においてス
ポット光により走査している状態を示す図、 第５図は自己相関関数を示すグラフ図、であり、図中の
主な符号は、 １・・・・ＹＡＧレーザ ３・・・・ビームエキスパンダ １１・・・・ビームウェスト １２・・・・液浸オイル １３・・・・対物レンズ １４・・・・バンドパスフィルタ １６・・・・ＣＣＤ １７・・・・フレームメモリ １８・・・・画像処理装置 １９・・・・ＶＴＲ ２０・・・・ＣＲＴ ２１・・・・半導体レーザ ２２　・・・・ＡＯＤ ２３・・・・ビームエキスパンダ ２′４・・・・振動ミラー ２６・・・・光検出器 ３１・・・・測定セル 第３図 距離（時間）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）目的物質に特異的に反応する物質を感作させた担
   体を、前記目的物質が含まれる検体と混合して混合物を
   作成する工程、 前記混合物に対して強度勾配を有する光を 照射し、その光圧により前記担体を光照射位置近傍に集
   中させることによって、前記担体の凝集反応効率を高め
   る工程、 前記凝集反応の終了した混合物中の担体の 凝集状態を画像情報として検出して、画像解析すること
   により目的物質の測定を行なう工程、を有することを特
   徴とする検体測定方法。
2. （２）目的物質に特異的に反応する物質を感作させた担
   体を、前記目的物質が含まれる検体と混合して作成した
   混合物を入れる測定セル、前記測定セル中の所定位置に
   強度勾配を有 する光を照射して、照射位置付近に前記担体を集中させ
   、凝集反応効率を高める光照射手段、前記凝集反応の終
   了した混合物中の担体の 凝集状態を画像情報として検出する検出手段、前記検出
   手段で得られる画像情報を解析 することにより目的物質の測定を行なう解析手段、 を有することを特徴とする検体測定装置。
3. （３）前記画像情報の検出は、検体を受光素子アレイに
   より画像検出する請求項（１）記載の検体測定方法また
   は請求項（２）記載の検体測定装置。
4. （４）前記画像情報の検出は、検体を２次元光走査して
   画像検出する請求項（１）記載の検体測定方法または請
   求項（２）記載の検体測定装置。
5. （５）前記検出手段は、検出した画像情報をデジタル的
   又はアナログ的に記憶する手段を有する請求項（２）記
   載の検体測定装置。
6. （６）前記画像情報の解析は、検出した画像を所定閾値
   により二値化した画像を用いて行なう請求項（１）記載
   の検体測定方法または請求項（２）記載の検体測定装置
   。
7. （７）前記画像情報の解析は、検出した画像の自己相関
   あるいは相互相関を計算することで前記凝集の度合を演
   算する請求項（１）記載の検体測定方法または請求項（
   ２）記載の検体測定装置。
8. （８）前記画像情報の解析は、検出した画像の輪郭を抽
   出することで前記凝集の度合を演算する請求項（１）記
   載の検体測定方法または請求項（２）記載の検体測定装
   置。