JPH0466873A - 検体処理方法及び検体測定方法及び検体測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、抗原抗体反応等の特異的結合の作用によって
担体の凝集反応を生しさせることにより検体内の目的物
質を測定する検体測定の分野に関する。

［従来の技術］ 従来、目的とする目的物質と特異的に結合する反応、例
えば抗原抗体反応を利用して、検体中の目的物質を精度
良く測定する方法が知られている。これは目的物質であ
る特定抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体等の
物質を、ラテックス粒子等の担体粒子の表面に感作した
ものを含む所定濃度の試薬を作成し、この試薬を血清等
の検体と混合して抗原抗体反応により担体粒子同士を結
合凝集させ、一定温度下で十分凝集反応か行なわれる時
間（通常は２０〜３０分程度）程度置、所謂インキュベ
ーションを行ない、その後に、主に光学的な手法で前記
担体の凝集状態を測定することで血清中の目的抗原を定
性的又は定量的に測定するものである。これは一般に粒
子イムノアッセイ法と呼ばれて広く知られており、例え
は特開昭５３−２４０１５号公報、特開昭５４−１０８
６９３号公報、特開昭５４−１０８５９４号公報、特開
昭５４−１０８［ｉ９５号公報、特開昭５４−１０９４
９４号公報、特開昭５５−１５９１５７号公報、特開昭
５２−８１５６７号公報等に詳細に記載されている。

しかしなから上記従来例ては、インキュベーションの際
、担体が硬集して凝集塊を形成する過程で、担体同士の
接触は、担体自身のブラウン運動によるところが大きく
、特に担体の濃度か低い場合は非効率的で時間がかかっ
てしまう問題点があった。

そこで本願出願人は先に特願平２−１０９３２８号にお
いて、光トラツプ現象を利用して担体の凝集を促進する
方法を提案した。

本発明は上記方法に更なる改良を加え、簡略な方法で更
に効果的に凝集反応を促進させることを目的とするもの
である。

［目的を達成するための手段］ この目的を達成する本発明の概要は、目的物質に特異的
に反応する物質を感作させた担体を、前記目的物質か含
まれる検体と混合して混合物を作成する工程と、前記混
合物に対して強度勾配を有する光を照射し、その光圧に
より前記担体を光照射位誼近傍に集中させることによっ
て、前記担体の凝集反応効率を高める工程と、前記混合
物への光照射位置を相対的に変化させる工程と、前記凝
集反応の終了した混合物中の担体の凝集状態を検出して
目的物質の測定を行なう工程を有することを特徴とする
。

［実施例コ 本発明の詳細な説明にあたり、まず本発明の基本原理に
ついて第１図を用いて説明する。

一般に第１図（ａ）に示すように液体中に非常に微小な
微粒子が分散して存在するとき、この液体中に例えばカ
ラス分布を有するレーザ光の如く非常に光強度か大きく
て且つ強度勾配を有する光束を用いてビームウェストを
形成すると、第１図（ｂ）に示す如く、レーザ光の光圧
による求心力が働き、浮遊微粒子がビームウェスト中心
近傍に集まる現象が知られている。これは一般に光トラ
ップと呼ばれ、流体中の微粒子を特定の場所に移動させ
たり、あるいは集合させるのに有用な手法である。本発
明はこの光トラップの現象を利用して、担体微粒子をビ
ームウェスト部分に集中させて粒子密度を高め、そ−れ
によって凝集反応を促進させ、測定速度共に測定感度を
高めることを基本原理とするものである。

次に本発明の実施例の装置を図面を用いて詳細に説明す
る。第２図は本発明の第一実施例の構成図であり、同図
に゛おいて、１は強度勾配を有する照射光を発生する光
トラップのための光源で、本実施例においては波長１０
６４　ｎ　ｍ　％出力８０ｍＷのＮｄ３＋レーザ（ＹＡ
Ｇレーザ）を用いる。

なお使用できる光源はＮｄ”レーザに限定されるもので
はないが、可視波長域以下ののレーザ光を使用すると微
粒子が破壊される畏れがあるので赤外域の光源を使用す
ることが好ましい。２は濃度フィルタ、３はビームエキ
スパンダ、４は光路中に斜設されるビームスプリッタで
ある。ビームスプリッタ４で分岐された光束の一方は集
光レンズ６で集光されて、光検出器７にて光強度が検出
される。不図示の制御回路では光検出器７で得られる光
源１から発する光強度の実出力をモニタし、実出力が設
定強度となるように光源１の発光量を制御する。

また、又、ビームスプリッタ４て分岐されるもう一方の
光束は、ダイクロイックミラー５、対物レンズ１３に至
る。対物レンズ１３は高い開口数（ＮＡ）を持つ液浸形
対物レンズであり、本実施例においてはＮＡ＝１．２５
である。対物レンズ１３を通過したレーザ光は、液浸オ
イル１２を経て、反応セル３１内の被検部に強度勾配を
有する直径０．８μｍ程度の微小なビームウェスト１１
を形成する。反応セル３１は透光性のカラスやフラスチ
ツク等の材質から成り、内部には反応検体か封入される
構造となっている。

ここで反応セル３１内に封入する反応検体は、直径０．
５μｍ程度の多数のラテックス粒子の表面に、目的とす
る特定抗原と特異的に結合するモノクローナル抗体を感
作したものを有する所定濃度の試薬を用意し、これと検
体（血液成分、尿、だ液等の体液が一般的である）とを
混合して作成したものである。より詳しくは前記公報に
記載されているのでここでは詳細な説明は省略する。

更に凝集反応を広範囲に渡って起こさせるため、ダイク
ロイックミラー５には揺動機構４１か設けられ、又、反
応セル３１には振動機構４２が設けられている。揺動機
構４１はダイクロイックミラー５を揺動させることで反
応セル３１でのビームウェスト１１を一次元的に走査し
、振動機構４２は該走査と略直交方向に一次元的に反応
セル３１を振動させる。こうしてビームウェスト１１と
反応セル３１内に封入されている反応検体との位置関係
を二次元的に相対変化させることができる。

なお、振動機構４２あるいは揺動機構４１のどちらか一
方を二次元振動させ得るようにして、反応セル３１を照
射光軸と直交する平面上で二次元的に加振するようにし
ても良い。又、ビームウェスト１１の二次元走査に同期
して前記Ｎｄ’＋レーザ光を一定周期で点灯、消灯を繰
り返すことにより、実質的に複数の固定位置に光トラッ
プのための光照射を行なうようにしても良い。

反応セル３１内の被検部に強度勾配を有するビームウェ
スト１１を形成すると、前記光トラップの現象により、
ビームウェスト中心付近にラテックス粒子が多数集まっ
てラテックス粒子の存在密度が高くなり、部分的濃度が
高くなる。するとラテックス粒子同士が接触する確率が
高くなり、血清中の目的抗原を介してのラテックス粒子
同士の凝集がより促進されることになる。こうして検体
中に目的とする抗原が存在した場合には、ラテックス粒
子同士が結合して２〜５個程度から成る凝集塊を多数形
成する。又、目的抗原か存在しない場合には当然凝集塊
は形成されない。本実施例ではビームウェスト１１を反
応セル３１内に封入されている反応検体内で二次元に移
動させるため、ビームの移動範囲に存在するより広範囲
なラテックス粒子に光照射され、ビームウェストの軌跡
上にあるより多数のラテックス粒子を光トラップによっ
て集めることかできる。

従来は、このラテックス凝集反応を起こすのに、ブラウ
ン運動、攪拌等の偶発的な現象を利用していたため、ラ
テックス粒子同士の接触回数は非常に少なく、結果とし
て十分なラテックス凝集反応を終了させるには２０分〜
３０分程度に渡るインキュベーションを必要とした。こ
れに対して本実施例においては、上記のように光トラッ
プの現象を利用してラテックス粒子を二次元移動あるい
は複数位置に照射されるビームウェスト付近に集中させ
ラテックス凝集反応を促進゛させるようにしているので
、インキュベーションに要する時間を短縮することがで
きる。それと共に、全体的なラテックス粒子の濃度が低
くても、光トラップにより部分的濃度を高めて凝集反応
を起こさせているので、測定感度か高くなる効果もある
。

こうして一定時間に渡って光を照射し続けてラテックス
の凝集塊反応の促進を行なった後に、制御回路の指令に
より、前記レーザ光を遮断するかあるいは強度を弱める
と、これに応して光トラップの力か弱まり、ビームウェ
スト付近に集中していたラテックス粒子は、ブラウン運
動等の作用のために徐々に液体中の全体に分散する。こ
の時、抗原抗体反応により形成されたラテックス凝集塊
は塊を形成したまま分散する。又、前記加振手段４２あ
るいは別個に設けた攪拌手段によって、反応セル３１内
の液体の加振や攪拌を行ない、分散をより短時間で効率
的に行なわせるようにすれは層効果的である。

次に、インキュベーションの完了した検体中のラテック
ス凝集反応の度合を測定するのであるかその測定手段の
働きを説明する。

第１図において図示されていない照明光学系によって波
長４００ｎｍ〜８００ｎｍの可視光によって広範囲に照
明されたラテックス粒子の像は対物レンズ１３によって
集光され、再ひダイクロイックミラー５に至る。ダイク
ロイックミラー５は波長１１０６４ｎのレーザ光を反射
し、可視光を透過する特性を有するため、前記ラテック
ス粒子の可視像は透過し、バントパスフィルタ１４、接
眼レンズ１５を経て受光素子アレイである二次元撮像素
子１６（以下ｒＣＣＤＪと称する）上に結像する。

ＣＣＤ１６て得られた複数枚の画像信号はフレームメモ
リ１７及びＶＴＲ１９に取込まれ、それぞれデジタル及
びアナログの画像情報として記憶される。画像処理装置
１８ではフレームメモリ１７の内容を基に解析のための
画像処理を行ない、この結果はＣＲＴ２０又は不図示の
プリンタに出力する。又、ＶＴＲ１９の画像もＣＲＴ２
０に出力することが可能となっている。なお、−旦ＶＴ
Ｒ１９に全て撮影し、後にこれを再生した出力信号をＡ
／Ｄ変換してフレームメモリ１７に記憶させることもて
きる。こうすることにより、最小限のフレームメモリ容
量で、様々な時点での画像を繰り返し解析することがで
きる。

なお、本実施例では二次元の受光素子アレイを用いて検
体の画像を撮像したが、−次元の受光素子アレイを用い
、反応セルと受光素子アレイを相対的に移動させること
によって実質的に二次元の画像情報を検出するようにし
ても良い。

さて、前記画像処理装置１８は主に以下の３つの画像処
理機能を備えている。これらの機能は操作者により適宜
選択される。

第１の画像処理機能は、２枚の同一画像を位置をずらし
て画像同士の積を演算する機能、すなわち画像の自己相
関を計算する機能である。

般に２枚の同一画像のずれ量を（α、β）とするとき、
画像の二次元自己相関関数はψ（α。

β）は、 ψ（α、β）　＝　ｉ！’：：　ｆ　（ｘ＋ａ　、　ｙ
＋β）　ｆ　（ｘ、ｙ）　ｄｘ　ｄｙて定義される。

画像上に単一径の多数の粒子が乱雑に存在する場合、相
関関数は距ｗｉＦ♂＋６　　＝ｏのとき最大になり１、
ｒｌｌ−コー１１−の増大と共に減少するｅｘｐ（−ａ
　　＋８　　／ζ）の形で表わされる。

ζは相関距離と呼ばれ、粒径を表わすパラメータとなる
。ラテックス粒子が凝集していない場合、ζはラテック
ス粒子径に相当する所定値ζ１となり、α２＋β２＝ζ
１′の時、相関関数は１　／　ｅとなる。ところか、ラ
テックス凝集反応によってラテックス粒子同士が結合し
ている場合には、実質上ラテックス粒子径が大きくなっ
たと見なせるため、相関距離ζ２は所定値ζ、よりも大
きな値となる。

この関係を表わしたものが第５図であり、実線Ａはラテ
ックス凝集反応か生じていない時のもの、−点錯線Ｂは
ラテックス凝集反応か生じている時の相関関数を示して
いる。図から明らかなように、相関関数か１　／　ｅと
なる相関即動ζを求めるか、あるいは一定距１ｍ（α、
β）移動したときの相関関数の値を求めることによって
、ラテックス凝集反応の度合を調べることができる。

具体的には光トラップによりラテックス粒子の凝集塊を
形成し、レーザ光の強度を弱めてからか所に集中してい
たラテックス粒子が十分に分散した時点での画像を一枚
取込み、取込んだ画像をある閾値を基準にして二値化す
る。そして同一の２枚の二値化画像を位置をずらしなか
ら画像同志の積を演算し自己相関を得るものである。

第２の画像処理機能は、時間と共に変化して行く異なる
画像同志の積を演算する機能、すなわち経時変化する画
像同士の相互相関を計算する機能である。

時間ｔをパラメータとする相互相関関数ψ（１）は、 ψ（ｔ）　　＝　ＳＬ　ｆ（ｘ、ｙ、Ｔ＋ｔ）　　ｆ（
ｘ、ｙ、Ｔ）ｄｘ　　ｄｙで定義される。

画像上に単一径の粒子が多数存在し、その位置がブラウ
ン運動等により確率的に変動する場合、相関関数は時間
１＝０のとき最大になり、ｔの増大と共に減少するｅｘ
ｐ（−ｔ／τ）の形で表わされる。τは相関時間と呼ば
れ、やはり粒径を表わすパラメータとなる。第５図にそ
の関係を示す。

具体的には前記レーザ光を弱めて光トラップを解き、一
定時間経過し、ラテックスが十分に分散した時点で、一
定時間の間隔で２枚の画像を取込み、両画像の相関関数
を計算することにより、ラテックス凝集状態の度合を測
定することかできる。但しこの場合、相関時間では同時
にブラウン運動等による位置変動の度合にも依存するた
め、反応セルの温度管理を行なうことが望ましい。

又、温度に応して画像を取込む時間間隔を変更するよう
にすれば更に好ましい。

第３の画像ＩＡ埋種機能、輪郭抽出の技法を応用したも
のである。前記第２の画像処理機能と同様に、前記レー
ザ光の強度を弱めてラテックスの光トラップを解き、所
定時間経過の後、ラテックスか十分に分散した時点て、
−枚の画像を取込み、取込んだ画像を所定の闇値によっ
て二値化し、値化された画像から画像処理によって輪郭
線を抽出する。該輪郭線は円に近似されるか、円の半径
はラテックスの半径として既知であるから、近似は容易
に行なうことができる。この時ラテックス粒子よりも小
さい輪郭線については画像のノイズとして除去する。ラ
テックス凝集反応が生してしλるときは、ラテックス粒
子よりも大きい輪郭線か生しるか、この場合は複数の円
の重なり合わせとして処理する。こうして前記画像処理
の結果得られる輪郭内の面積や形状等を統計的に処理す
ることで画像内のラテックス粒子の数、ラテックス凝集
反応により互いに結合しているラテックス粒子の数、及
び両者の割合等か求まり、ラテックス凝集反応の度合を
測定することかできる。

なお上記では、ラテックス粒子よりも大きい輪郭線に対
して複数の円で近似する方法を示したか、近似せずに単
にラテックス凝集塊として紹識する方法もある。この場
合、画像処理のアルゴリズムが非常に簡単になるため処
理速度が向上するメリット力ぐある。ざらに輪郭線を抽
出する方法として二値化法を示したが、他の方法として
画像を微分しエツジ強調処理することによって輪郭線を
得る方法を採用しても良い。

又、上記の実施例の内、第１、第３の画像処理機能では
、説明を簡略化するため、使用する画像は、前記レーザ
光の強度を弱め一定時間経過した時点で取込んだ一枚で
あるとしたが、−枚に限定する必要はなく、連続的又は
間欠的に測定することで、測定結果の経時的変化を捕ら
え、測定の信頼性を更に向上させることも可能である。

同様に前記第２の画像処理機能においても、複数の画像
を時系列に連続して取込み、各画像間の相互相関を計算
するようにすれは、より正確な測定が可能となる。

又、自己相関、相互相関を計算する際、必ずしも二値画
像を用いる必要はなく、ＣＣＤて取込んだ多値画像を用
いて相関関数の演算を行なっても良い。

［発明の効果］ 以上本発明によれは、光トラツプ現象を利用して凝集反
応効率を高める際に、検体に対する光照射位置を相対変
化させることで、より広範囲で光トラツプ現象を起こし
、これにより凝集反応をより一層促進させることができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は光トラツプ現象の説明図、 第２図は本発明の実施例の構成図、 第３図は自己相関関数を示すグラフ図、であり、図中の
主な符号は、 １・・・・Ｎｄ”レーザ ３・・・・ビームエキスパンダ １１・・・・ビームウエスト １２・・・・ン夜漫オイル １３・・・・対物レンズ １４・・・・バンドパスフィルタ １６・・・・ＣＣＤ １７・・・・フレームメモリ １８・・・・画像処理装置 １９・・・・ＶＴＲ ２０・・・・ＣＲＴ ３１・・・・測定セル ４１・・・・揺動機構、 ４２・・・・加振機構、 第２図 ち、（η）　ら２（で、） 距Ｍ、（時間）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）目的物質に特異的に反応する物質を感作させた担
   体を、前記目的物質が含まれる検体と混合して混合物を
   作成する工程、 前記混合物に対して強度勾配を有する光を照射し、その
   光圧により前記担体を光照射位置近傍に集中させること
   によって、前記担体の凝集反応効率を高める工程、 前記混合物への光照射位置を相対的に変化させる工程、 を有することを特徴とする検体処理方法。
2. （２）目的物質に特異的に反応する物質を感作させた担
   体を、前記目的物質が含まれる検体と混合して混合物を
   作成する工程、 前記混合物に対して強度勾配を有する光を照射し、その
   光圧により前記担体を光照射位置近傍に集中させること
   によって、前記担体の凝集反応効率を高める工程、 前記混合物への光照射位置を相対的に変化させる工程、 前記凝集反応の終了した混合物中の担体の凝集状態を検
   出して目的物質の測定を行なう工程、 を有することを特徴とする検体測定方法。
3. （３）目的物質に特異的に反応する物質を感作させた担
   体を、前記目的物質が含まれる検体と混合して作成した
   混合物を入れる測定セル、前記測定セル中の混合物に強
   度勾配を有する光を照射して、照射位置付近に前記担体
   を集中させ、凝集反応効率を高める光照射手段、前記測
   定セル中の混合物への光照射位置を相対的に変化させる
   手段、 前記凝集反応の終了した混合物中の担体の凝集状態を検
   出する検出手段、 前記検出手段の検出値に基づいて目的物質の測定を行な
   う解析手段、 を有することを特徴とする検体測定装置。
4. （４）前記凝集状態の検出は、反応混合物を受光素子ア
   レイにより画像検出する請求項（２）記載の検体測定方
   法または請求項（３）記載の検体測定装置。