JPH04369475A - 固定化抗体カラム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［目的］

【０００２】

【産業上の利用分野】本発明は、優れた簡便性、定量性
を有する、血小板活性化因子誘導体と蛋白との結合物を
免疫原として、第１動物に免疫感作して得られる第１抗
体を、担体に固定化させたカラム用充填剤、その使用物
、その使用方法及びそれを使用した定量法に関する。

【０００３】

【従来の技術】（１）微量で強力な生理活性を有する血
小板活性化因子（以下、「ＰＡＦ」という。）は、以下
の構造式を有する化合物である。

【０００４】

【化１】

【０００５】本化合物は、種々の生理作用を有し、種々
の病態とも関連することより、生体より抽出した体液（
血液、唾液等）中のＰＡＦの濃度を定量することには重
要な意義があるが、該化合物には特異的反応基もなく、
現在採用されている該化合物の定量法には多くの問題点
がある。

【０００６】現在採用されているＰＡＦの検出、定量法
は、生物活性測定法、免疫測定法及び物理化学的測定法
に分類される。

【０００７】（２）生物活性測定法は、ＰＡＦの生物学
的特性、すなわち、ＰＡＦの血小板活性化能（凝集、放
出反応）を測定する方法であり、感度・作業性の点にお
いて優れており繁用されている。しかし、生体中にはＰ
ＡＦと類似の生物活性を有する類似物質が存在し、また
、その生物活性も分子種により差異があるので、この方
法のみを用いて、生体試料中のＰＡＦを定量的に測定す
ることは困難である。

【０００８】（３）免疫測定法は、抗ＰＡＦ抗体を用い
る市販のＰＡＦ測定キット（第一化学薬品（株）、アマ
シャム社等より市販）を使用することにより行なうこと
が可能であり、同時に多数の試料を測定できるという点
で優れている。しかし、生体中には、フォスファチジル
コリン（レシチン）を始めとする、ＰＡＦと類似の構造
を有する物質が多数存在し、これらの物質は抗ＰＡＦ抗
体と交叉反応性を示すので、この方法のみを用いて、生
体試料中のＰＡＦを定量的に測定することは困難である
。

【０００９】（４）更に、物理化学的測定法としては、
ＧＣ、ＧＣ−ＭＳ　法等を挙げることができる。これら
は分離分析法であるため、構造類似化合物に対してもあ
る程度、信頼性の高い結果を得ることができる。

【００１０】しかしながら、これらの方法を臨床的に応
用するためには、生体試料中よりＰＡＦを抽出し、該方
法に供するために予めＰＡＦを精製するための、煩雑か
つ高度な技術を要する前処理が必須である。

【００１１】このため多量の試料を必要とし、また一度
に測定できる試料数に限りがある。 （５）すなわち、上記の各方法は、いずれも測定感度と
しては十分な性能を有するものであるが、これらの方法
を利用するにあたっては、予めＰＡＦを十分に抽出・精
製する必要があった。

【００１２】（６）ＰＡＦの抽出・精製法としては、Ｈ
ＰＬＣがもっとも精度・信頼性が高く、汎用されている
。しかし、ＨＰＬＣは本来、分離定量の手段であり、か
かる方法を抽出、精製の手段として利用するには、作業
性、経済性の両面での負担が過大となっていた。

【００１３】以上より、ＨＰＬＣに代わる簡便かつ高い
選択性を有する前処理法の開発が望まれていた。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、ＰＡＦ
の分離定量法について、永年に亘り鋭意研究を行なった
結果、特異性の高い抗体を固定化したカラム用充填剤及
びかかる充填剤を充填したカラムを用いる方法によって
、血漿中に存在するＰＡＦと交差反応性を示す夾雑物や
抗原抗体反応を阻害する化合物をほぼ完全に除去するこ
とが可能であること、そしてその操作が簡便であること
等、効率良く選択的に前処理が行えることを見出し、又
、かかる前処理を生物活性測定法又は免疫測定法と組み
合わせることにより、合理的、簡便及び高感度にＰＡＦ
の定量が行なえることを見出し、本発明を完成した。

【００１５】［構成］

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は、新規な固定化
抗体カラム用充填剤、その使用物、その使用方法及びそ
れを使用した定量法に関し、 （１）　血小板活性化因子誘導体と蛋白との結合物を免
疫原として、第１動物に免疫感作して得られる第１抗体
を、担体に固定化させたカラム用充填剤。

【００１７】（２）　上記１項記載のカラム用充填剤を
充填したカラム。

【００１８】（３）　上記２項記載のカラムを用いて、
血小板活性化因子を精製する方法。 （４）　上記２項記載のカラムを用いて、血小板活性化
因子を精製し、精製物の量を生物活性測定法又は免疫測
定法により測定する方法。 （５）　少なくとも、（Ａ）　上記２項記載のカラム、
（Ｂ）　血小板活性化因子誘導体と蛋白との結合物を第
１動物に免疫感作して得られる第１抗体、（Ｃ）　酵素
又はラジオ・アイソト−プにて標識された血小板活性化
因子からなる抗原及び（Ｄ）　第１動物の血清若しくは
γ−　グロブリンを第２動物に免疫感作して得られる第
２抗体又はその固相担体結合物からなる血小板活性化因
子の定量用組成物。

【００１９】（６）　少なくとも、（Ａ）　上記２項記
載のカラム、（Ｂ）　血小板活性化因子に感受性を有す
る多血小板血漿からなる血小板活性化因子の定量用組成
物。

【００２０】より構成される。

【００２１】本発明の第１抗体としては、抗ＰＡＦポリ
クロ−ナル抗体および抗ＰＡＦモノクロ−ナル抗体のい
ずれもが用いられ得る。

【００２２】第１動物へのＰＡＦ誘導体と蛋白との結合
物の免疫感作は、ＰＡＦに新たにカルボキシ基又はアミ
ノ基等の特性基を導入し（かかる特性基を導入された化
合物を、本発明では「ＰＡＦ誘導体」と定義する。）、
かかるＰＡＦ誘導体の特性基と蛋白の特性基、例えば、
カルボキシル基、アミノ基、メルカプト基、水酸基等を
結合する反応に付し、得られた結合物を適当なアジュバ
ントと懸濁混合したエマルジョンを調製した後、以下に
述べる方法に従い、第１動物に定期的に皮下注射等の感
作を行うことにより達成される。

【００２３】適当な蛋白としてはアルブミン、グロブリ
ン、サイログロブリン、ヘモシアニン、エデスチン等が
挙げられるが、好ましくはアルブミンである。

【００２４】ＰＡＦ誘導体と蛋白を結合する反応は公知
であり、例えば、適当な溶媒（　例えば、リン酸緩衝液
）　中、蛋白と直接結合できる場合には、活性エステル
化法、カルボジイミド法、酸無水物法等により達成され
、好ましくは、シクロヘキシルカルボジイミド、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）　カルボジ
イミド、１，１’−　オキザリルジイミダゾ−ル、２，
２’−　ピリジルジサルファイド、Ｎ，Ｎ’−　ジサク
シンイミジルカ−ボネ−ト、Ｎ，Ｎ’−　ビス（２−　
オキソ−３−オキサゾリジニル）　ホスフィニッククロ
ライド、Ｎ，Ｎ’−　カルボニルジイミダゾ−ル、Ｎ，
Ｎ’−　ジサクシンイミジルオキザレ−ト（ＤＳＯ）　
、Ｎ，Ｎ’−　ジフタルイミドオキザレ−ト（ＤＰＯ）
　、Ｎ，Ｎ’−　ビス（　ノルボルネニルサクシンイミ
ジル）　オキザレ−ト（ＢＮＯ）　、１，１’−　ビス
（　ベンゾトリアゾリル）　オキザレ−ト（ＢＢＴＯ）
、１，１’−　ビス（６−　クロロベンゾトリアゾリル
）　オキザレ−ト（ＢＣＴＯ）又は１，１’−　ビス（
６−　トリフルオロメチルベンゾトリアゾリル）　オキ
ザレ−ト（ＢＴＢＯ）を縮合剤として用いる方法により
達成される。

【００２５】又、蛋白と直接に結合できない場合には、
この分野で公知の架橋剤、例えば１，５−ジフルオロ−
２，４−　ジニトロベンゼンを用いる方法等を用いて行
なわれる。

【００２６】反応後、目的物はカラムクロマトグラフィ
−又は透析にかけて単離精製される。

【００２７】アジュバントはこの分野で公知のものなら
何でもよいが、例えばフロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）の完
全又は不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、ミョ
ウバン、百日ぜき死菌体及びこれらの混合体が挙げられ
る。又、追加免疫時に不完全フロインド・アジュバント
を用いると好ましい場合がある。

【００２８】感作方法もまた公知であり、上記結合体を
上記アジュバントとの懸濁液とし、適当な動物（　例え
ば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ
、ヒツジ、ヤギ等）　に適当な投与間隔を設けて、数ケ
月間にわたって投与して感作する。

【００２９】ポリクロ−ナル抗体を得る場合は、感作後
感作動物の血清を採取して、公知の処理を行なうことに
より、目的とする抗体が得られる。

【００３０】モノクロ−ナル抗体の調製は、岩崎等「単
クロ−ン抗体　　ハイブリド−マとＥＬＩＳＡ　」　３
０　〜１０３　頁、（　講談社サイエンティフィク）　
記載の方法に準じて実施される。

【００３１】免疫する動物を選ぶ時に、その動物種及び
抗原に対する免疫応答能力が重要になるが、一般に、用
いる脾細胞とミエロ−マが同じ動物種の場合には安定な
抗体産生ハイブリド−マが効率よく形成されることが多
い。特にＢＡＬＢ／ｃマウスを使用するのが好適である
。

【００３２】ミエロ−マ細胞種としては、好適には、Ｐ
３・Ｘ６３　・Ａｇ８（Ｘ６３）、Ｐ３・ＮＳ−１／１
・Ａｇ４　・１（ＮＳ−１）　、ＳＰ２／Ｏ　・Ａｇ１
４（ＳＰ−２）及びＦＯを挙げることができる。

【００３３】クロ−ニング法としては、限界希釈法、軟
寒天法、フィブリンゲル法及び蛍光励起セルソ−タ−法
を挙げることができ、好適には限界希釈法又は軟寒天法
である。

【００３４】本発明において用いられる第１抗体は、市
販の抗体、例えば、ＲＩＡ　測定キット（第一化学薬品
（株）、又はアマシャム社）に用いられている抗体を利
用することもできる。

【００３５】本発明において使用される担体及び担体へ
の抗体の結合法（　固定化法）　は以下の通りである。

【００３６】担体は、常圧又は加圧カラムにおいて、一
般に担体として使用されるものであれば、特に限定はな
いが、担体の選択は固定化する抗体の性質によることは
もちろんであるが、担体の、粒子の大きさ、三次元網目
構造による表面積の広さ、親水性部位と疎水性部位の比
率、化学組成、圧力に対する強度等について検討する必
要がある。

【００３７】担体としてよく用いられるのは、セルロ−
ス、デキストラン、アガロ−スのような多糖類誘導体、
ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂のような合
成高分子、多孔性ガラス、金属酸化物のような無機物質
等を挙げることができる。

【００３８】固定化法として、物理的吸着法、即ち、水
不溶性担体に抗体を物理的に吸着させて固定化する方法
を使用する場合には、担体として更に好適には、活性炭
、多孔性ガラス、酸性白土、漂白土、カオリナイト、ア
ルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ヒドロキシアパタ
イト、リン酸カルシウム、金属酸化物、セラミックのよ
うな無機物質、デンプン、グルテンのような天然高分子
又は多孔性の合成樹脂を挙げることができる。尚、疎水
基をもつブチル−或いはヘキシル−セファデックスのよ
うな担体に抗体を疎水的に吸着固定化する方法も知られ
ている。

【００３９】固定化法として、イオン結合法、即ち、イ
オン交換基を有する水不溶性の担体に抗体をイオン的に
結合させて固定化する方法を使用する場合には、用いる
担体として特に好適には、ＤＥＡＥ−　セファデックス
のようなイオン交換基を有する多糖類又はイオン交換樹
脂のような合成高分子誘導体を挙げることができる。

【００４０】固定化法として、共有結合法、即ち、水不
溶性の担体と抗体を共有結合によって結合させて固定化
する方法を使用する場合には、担体として特に好適には
、ジアゾニウム塩、酸アジド、イソシアナ−ト、活性型
ハロゲン化アルキルと反応する官能基であるアミノ基、
カルボキシ基、スルフヒドリル基、水酸基、イミダゾ−
ル基、フェノ−ル基を有する担体を挙げることができる
。

【００４１】固定化法として、担体架橋法を使用する場
合には、特に好適な担体としては、ＡＥ−　セルロ−ス
、ＤＥＡＥ−　セルロ−ス、部分的に脱アシル化したキ
チン、アミノアルキル化多孔性ガラスのようなアミノ基
をもった水不溶性の担体を拳げることができ、これと抗
体のアミノ基をグルタルアルデヒドのような架橋試薬を
用いて、互いに共有結合させて固定化する。

【００４２】固定化法として、架橋法、即ち、２個以上
の官能基をもつ試薬を用いて、抗体同士を架橋すること
により固定化する方法を使用する場合には、特に担体は
不要であり、好適には、架橋試薬として、シッフ塩基を
つくるグルタルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシ
アン酸誘導体、Ｎ，Ｎ’−　エチレンビスマレイミド、
ジアゾカップリングをするビスジアゾベンジジン、アル
キル化するＮ，Ｎ’−　ポリメチレンビスヨ−ドアセト
アミドを用いることによって行なわれる。但し、これら
各種架橋反応に関与する抗体の官能基として、Ｎ末端の
アミノ基、フェノ−ル基又はスルフヒドリル基、イミダ
ゾ−ル基等が必要である。

【００４３】固定化法として、包括法（　高分子ゲルの
細かい格子の中に抗体を取り込む格子型と、半透膜の高
分子の皮膜によって抗体を被覆するマイクロカプセル型
に分けられる）　を使用する場合には、格子型の場合に
は、担体として好適には、ポリアクリルアミドゲル、ポ
リビニルアルコ−ル、光硬化性樹脂のような合成高分子
物質及びデンプン、コンニャク粉、ゼラチン、アルギン
酸、カラギ−ナンのような天然高分子物質等の高分子化
合物を挙げることができる。又、マイクロカプセル型の
場合には、界面重合法、即ち、親水性のモノマ−と疎水
性のモノマ−とが、その界面で重合するという原理を応
用して抗体を被覆する方法によるときは、担体として好
適には、ヘキサメチレンジアミンとセバコイルクロリド
を使うナイロン皮膜を挙げることができる。液中乾燥法
、即ち、有機溶媒に溶かした高分子化合物中に抗体溶液
を乳化分散させ、これを水溶液に移して乾燥させること
によって抗体を被覆する方法によるときは、担体として
好適には、エチルセルロ−ス、ポリスチレンのような高
分子物質を挙げることができる。相分離法、即ち、水と
混和しない有機溶媒中に高分子化合物を溶かし、この溶
液中に抗体を乳化分散させ、次に相分離を起こす非溶媒
を撹拌しながら徐々に加えて行くと、高分子化合物の濃
厚溶液が抗体液滴の周囲を包み、続いて高分子化合物が
析出し、皮膜を形成して抗体を被覆する方法によるとき
は、上記高分子化合物を挙げることができる。

【００４４】更に、具体的には、ＡＦ−　エポキシトヨ
パ−ル６５０Ｍ、ＡＦ−　アミノトヨパ−ル６５０Ｍ、
ＡＦ−　ホルミルトヨパ−ル６５０Ｍ、ＡＦ−　カルボ
キシトヨパ−ル６５０Ｍ（　以上、東ソ−（株）製）　
、ＲＥＡＣＴＩ−ＧＥＬ（６Ｘ　２５ＤＦ、ＨＷ−６５
Ｆ及びＧＦ−２０００）、ＣＰＧ／ＣＤＩ−ＡＣＴＩＶ
ＡＴＥＤ　ＧＬＹＣＯＰＨＡＳＥ並びにＨＹＤＲＡＺＩ
ＤＥ　ＢＥＡＤＳ　、ＡＬＫＹＬＡＭＩＮＥ　　ＢＥＡ
ＤＳ　、ＳＡＮＧＥＲ　ＲＥＡＧＥＮＴ　　ＢＥＡＤＳ
（　以上、ピア−ス社製）　、ＭＩＮＩ　ＬＥＡＫ（以
上、Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ社製）　、オイパ−ギットＣ
（３０Ｎ　、２５０Ｌ及び１Ｚ）（以上、ロ−ム・ファ
−マ社製）　、ＡＣＴＩＧＥＬ（Ａ，Ａ−ＳＵＰＥＲＦ
ＬＯＷ　、Ｂ　、Ｈ　及びＴ）、ＡＭＩＮＯＧＥＬ（Ａ
、Ｂ）、ＣＡＲＢＯＸＹＧＥＬ、ＴＨＩＯ−ＧＥＬ並び
にＤＩＡＺ−ＧＥＬ（　以上、ステロジ−ン社製）　、
アフィゲル（１０　、１５、１０２　、２０２　、４０
１、５０１　、６０１及び７３１）、アフィプレップ（
１０）、アミノエチル　　バイオゲル（Ｐ−２及びＰ−
１００）並びにＣＭバイオゲルＡ（以上、バイオラッド
社製）　、ＣＮＢｒ−　活性化セファロ−ズ４Ｂ、トレ
シル活性化セファロ−ズ４Ｂ、ＣＨ−セファロ−ズ４Ｂ
、ＡＨ−　セファロ−ズ４Ｂ、活性化ＣＨ−　セファロ
−ズ４Ｂ、エポキシ−活性化セファロ−ズ６Ｂ、活性化
チオ−ル−セファロ−ズ４Ｂ、　　ＣＮＢｒ−　活性化
セファロ−ズ６ＭＢ（以上、ファルマシア社製）　のよ
うな市販の担体を挙げることができるが、これらに限定
されるものではない。

【００４５】実際的な実験方法としては、福井等［　酵
素工学、１６４　頁〜２４３　頁　（１９８１年）　、
東京化学同人］　の方法に従って行なわれる。

【００４６】カラム用充填剤を充填したカラムとは、上
記カラム用充填剤を、例えば、ガラス、プラスチックの
ような、通常カラム管として使用される管に充填したも
のをいい、好ましくは、充填容量５　ｍｌ程度のプラス
チック製で、市販品としては、例えばセパコ−ルミニＰ
Ｐ（　生化学工業社製）　、エコノカラム（　バイオラ
ッド社製）、ディスポ−ザルポリスチレンカラム（　ピ
ア−ス社製）　、マイクロカラム（　ホエ−ル社製）　
等を挙げることができる。又、パスツ−ルピペットにグ
ラスウ−ルのストッパ−を充填したカラムも用いること
ができる。

【００４７】カラムを用いて精製する方法としては、例
えば、次の工程を含むアフィニティ−クロマトグラフィ
−法で行なわれる。

【００４８】（１）　抗体を固定化した担体を上記のカ
ラムに充填する。

【００４９】（２）　被験試料中のＰＡＦが、固定化さ
れた抗体によった保持されるように、被験試料を固定化
抗体と接触させる。

【００５０】（３）　後に行なう測定に際し、妨害とな
る物質をカラムから洗い流す。

【００５１】（４）　固定化抗体からＰＡＦを溶離させ
るための溶離剤を担体に加える。

【００５２】尚、この溶離剤は、メチルアルコ−ル、ア
セトニトリル、アセトン等に代表される極性有機溶媒を
１０％　以上の濃度で含有する水溶液である（１００％
　でも可）　。

【００５３】本発明において用いられる免疫測定法とし
ては、酵素免疫測定法（以下、「ＥＩＡ　」という。）
又はラジオ・イムノアッセイ（以下、「ＲＩＡ　」とい
う。）が好ましい。

【００５４】ＥＩＡ　又はＲＩＡ　は、公知の方法に準
じて達成されるが、一般的には、ヘテロジニアスなＥＩ
Ａ　又はＲＩＡ　である。従って、抗体結合抗原及び／
　又は抗体が結合した酵素もしくはラジオ・アイソト−
プで標識された抗原をフリ−の抗原及び／　又はフリ−
の酵素もしくはラジオ・アイソト−プで標識された抗原
から分離する必要がある。

【００５５】例えば、ＥＩＡ　においては、第二抗体を
用い酵素標識抗原が抗体と結合したもの（Ｂ　型）と結
合していないもの（Ｆ　型）を分離する方法（Ｂ／Ｆ　
分離法）は、一般に知られる二抗体法（Ｄｏｕｂｌｅ　
　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｅｔｈｏｄ　）又は第一抗体固
相法（Ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅ　ｍｅｔｈｏｄ）により行
なうことができる。［　石川栄治、河合忠、宮井潔編、
「酵素免疫測定法」　　第３版、医学書院　（１９８７
）　参照］　。

【００５６】ＲＩＡ　においては、活性炭ないしはポリ
エチレングリコ−ルを用いるＢ／Ｆ　分離法が一般的で
あるが、二抗体法や他の公知の方法に準じても達成され
る。

【００５７】標識抗原は、ＰＡＦを酵素又はラジオ・ア
イソト−プで標識することによって調製される。用いら
れるＰＡＦは測定しようとするＰＡＦでもよいし、その
ほかの任意のＰＡＦであってもよく、最も感度の点等に
おいて好適な「適当な」ＰＡＦを使用することができる
。

【００５８】使用される酵素としては、一般にＥＩＡ　
で用いられる酵素であれば何でもよく、例えばマレート
デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素
、グルコース酸化酵素、ペルオキシダーゼ、アセチルコ
リンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコア
ミラーゼ、リゾチーム、β−Ｄ−　ガラクトシダーゼ等
が挙げられ、好ましくはペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、β−Ｄ−　ガラクトシダーゼである。

【００５９】ＰＡＦと酵素の場合は、前記した第１抗体
の調製方法中、ＰＡＦと蛋白を結合する反応と同様にし
て行なわれる。好ましくは、活性エステル化法、イソブ
チルクロロホルメート等を用いる混合酸無水物法又は４
−（Ｎ−　マレイミドメチル）　シクロヘキサン−１−
　カルボン酸　　Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステ
ルを架橋剤として用いる方法が挙げられる。

【００６０】この際、酵素標識ＰＡＦの特異性を高める
ため、第１抗体の調製方法で述べたような工夫を行なう
ことができる。

【００６１】また必要に応じて酵素と結合するＰＡＦの
量を変えることによって測定感度を上げることができる
。

【００６２】ＰＡＦの標識に用いられるラジオ・アイソ
ト−プは、ＲＩＡ　においてＰＡＦを高感度に検出しう
るものならいずれのものも用いられるが、好ましくは、
　１２５Ｉ又は　３Ｈが用いられる。

【００６３】第２抗体は、第１抗体を調製する際に用い
た感作動物と同種の動物の血清あるいはγ−　グロブリ
ンを一般に知られた方法で、別種の動物に投与、感作し
て調整することができるが、異種動物の血清に対する抗
体は市販されているのでそれを利用してもよい。

【００６４】二抗体法は、第２抗体を単独［　二抗体液
相法（Ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｑｕｉｄ　
ｐｈａｓｅｍｅｔｈｏｄ）］で、又は固相担体結合物［
　二抗体固相法（Ｄｏｕｂｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓ
ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅｍｅｔｈｏｄ）］として使用する
ことができる。

【００６５】第１抗体又は第２抗体と固相との結合は、
前記物理的吸着や化学的結合が用いられる。固相の材質
は、一般のＥＩＡ　に用いられるものであれば何でもよ
いが、例えばアガロース、デキストラン、セルロース等
の多糖類、ポリスチレン等の合成樹脂、ガラス、あるい
はポリアクリルアミド等が挙げられる。その形状は分離
が容易であればどのような形のものでもよいが、例えば
小球、小試験管、チューブ、繊維状のもの、マイクロプ
レートがよい。好ましくはポリスチレンボール又はガラ
スビーズである［　詳細については千畑一郎編、「固定
化酵素」　　講談社　（１９７５年）　参照］　。

【００６６】尚、本発明において、ＲＩＡ　は市販のＲ
ＩＡ　測定キット（第一化学薬品（株）又はアマシャム
社）を使用しても行なうことができる。

【００６７】更に、本発明は、本発明の試薬組成物を用
いるＰＡＦの測定方法をも含有するものである。

【００６８】測定方法は次のようにして行なわれる。

【００６９】例えば、二抗体法では、 （１）第１抗体及び酵素又はラジオ・アイソト−プで標
識された抗原及びＰＡＦを含有する被検体を混合し、競
合的に抗原抗体反応を行った（　第１反応とする）　後
、第２抗体単独（　二抗体液相法）　又は第２抗体を固
相に結合させたもの（　抗体固相法）　を加えて、第１
抗体を結合させ（　第２反応とする）　、次に結合した
酵素又はラジオ・アイソト−プで標識された抗原の酵素
活性又は放射活性を測定するか、或いは （２）先に第１抗体と被検体中のＰＡＦとを抗原抗体反
応に付し（　第１反応とする）　、得られた抗原抗体結
合物に、第２抗体単独（　二抗体液相法）　又は第２抗
体を固相に結合させたもの（　二抗体固相法）　を加え
て、第１抗体を結合させた（　第２反応とする）　後、
酵素又はラジオ・アイソト−プで標識された抗原を加え
て結合させ（　第３反応とする）　、結合した酵素又は
ラジオ・アイソト−プで標識された抗原の酵素活性又は
放射活性を測定することにより行なわれる。

【００７０】いずれの方法も好ましく、被測定物質の種
類によって、いずれかの方法を選択する必要がある。

【００７１】（１）　法の第１反応及び（２）　法の第
１反応及び第２反応は、４　〜５０℃、１　〜４　時間
で行なわれる。この範囲の反応温度と時間においては、
測定感度が左右されない安定した測定が可能である。

【００７２】（１）　法の第２反応と（２）　法の第３
反応は４　℃で一夜かけて行なわれる。

【００７３】（３）第一抗体固相法では、固相化された
第１抗体に酵素又はラジオ・アイソト−プで標識された
抗原とＰＡＦを含有する被検体を加え、競合的に抗原抗
体反応を行った（　第１反応とする）　後、結合しない
ものを除去し、残存する酵素又はラジオ・アイソト−プ
で標識された抗原の酵素活性又は放射活性を測定するこ
とにより行なわれる。この第１　反応は、４　〜５０℃
、１　〜２４時間で行なわれる。

【００７４】酵素標識抗原の酵素活性測定は、公知の方
法［　石川栄治、河合忠、宮井潔編、「酵素免疫測定法
」　　第３版、２１頁、医学書院　　　（１９８７）］
により行なわれる。

【００７５】本発明において用いられる生物活性測定法
は、公知の方法［和久敬蔵、井上圭三編、「血小板活性
化因子」、現代化学増刊、　　１７、２６〜２７頁、東
京化学同人、（１９８９年）］により行なわれる。

【００７６】尚、本発明の定量用組成物は、少なくとも
、（Ａ）　血小板活性化因子誘導体と蛋白との結合物を
免疫原として第１動物に免疫感作して得られる第１抗体
を、担体に固定化させたカラム用充填剤を充填したカラ
ム、（Ｂ）　血小板活性化因子誘導体と蛋白との結合物
を第１動物に免疫感作して得られる第１抗体、ら（Ｃ）
　酵素又はラジオ・アイソト−プにて標識された血小板
活性化因子からなる抗原及び（Ｄ）　第１動物の血清若
しくはγ−グロブリンを第２動物に免疫感作して得られ
る第２抗体又はその固相担体結合物からなる血小板活性
化因子の定量用組成物、あるいは、少なくとも、（Ａ）
　血小板活性化因子誘導体と蛋白との結合物を免疫原と
して第１動物に免疫感作して得られる第１抗体を、担体
に固定化させたカラム用充填剤を充填したカラム、（Ｂ
）　血小板活性化因子に感受性を有する多血小板血漿か
らなる血小板活性化因子の定量用組成物を構成要件とす
るものであるが、これ以外に必要に応じて、検量線作成
用の標準ＰＡＦ、酵素活性又は放射活性を測定するのに
必要な試薬一式（　例えば、基質、基質溶解液、酵素反
応停止液等）　、緩衝化剤等を含んでいてもよく、これ
らは全て公知の方法により調製することができる。

【００７７】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明の構成、効果
等を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に
よって限定されるものではない。

【００７８】実施例１．抗体固定化カラムの作製プロテ
インセＡ　セファロ−ス４Ｂ　　ファ−ストフロ−（フ
ァルマシア社製）５　ｍｌを充填したカラムを０．１　
Ｍ　クエン酸緩衝液（ｐＨ　３．０）、０．１　Ｍ　リ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で順次洗浄し、ここにＰＡＦ
抗血清（第一化学薬品（株）製、ＰＡＦ−ＲＩＡキット
、１００　アッセイ用）を供与し、０．１　Ｍ　リン酸
緩衝液（ｐＨ　８．０）を用いて溶離し、溶出液を波長
　２８０　ｎｍ　の紫外吸収でモニタ−し、その吸収が
得られなくなるまで洗浄した。

【００７９】その後に、０．１　Ｍ　クエン酸緩衝液（
ｐＨ　３．０）を用いて吸着画分を溶出し、紫外吸収モ
ニタ−にて波長２８０　ｎｍ　　の紫外吸収を測定して
、カラムより溶出したＩｇＧ画分を採取した。

【００８０】ＩｇＧ　　　画分は　０．１　Ｍ　　炭酸
緩衝液中（ｐＨ９．０）で希釈し、１０　ｍｌ　にした
（ＩｇＧ濃度　　０．３　ｍｇ／ｍｌ　）。

【００８１】固定化は、公知の方法［続生化学実験講座
（５）　、免疫生化学研究法、日本生化学会編集、東京
化学同人　（１９８６）　、２９〜３１頁］により、以
下のように行なった。即ち、５　ｇ　のセファロ−ス４
Ｂ　　に水　８　ｍｌ　を加え、氷冷下、細かく砕いた
臭化シアン　０．６　ｇ　　を、ｐＨ　１１．０　〜１
１．５に保ちながら添加し、混合した。ｐＨが降下しな
くなった時点でセファロ−ス４Ｂを２０倍容の　０．１
　Ｍ　　炭酸緩衝液中（ｐＨ　９．０）で洗浄し、臭化
シアン活性化セファロ−ス４Ｂを得た。

【００８２】これに、同緩衝液で透析した後のＩｇＧ　
溶液を加え、４　℃にて２４時間撹拌した。０．１　Ｍ
　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ　８．０）にて洗浄後、等張
リン酸緩衝液（ｐＨ　７．４）に置換し、４℃で保存し
た。

【００８３】実施例２．固定化抗体カラムによる前処理
固定化抗体をポリプロピレン製カラム（セパコ−ルミニ
ＰＰ、生化学工業（株）製）に、ゲル容量として　１．
５　ｍｌ　充填した。水、アセトニトリルで洗浄後、２
５　ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　６．９）に置換した。 この充填カラムは２つ作製した。

【００８４】一つのカラムには　３Ｈ−標識ＰＡＦ（１
００　ｎｇ、１．５　μＣｉ：第一化学薬品（株）製）
、別のカラムには、　３Ｈ−標識　Ｌｙｓｏ−ＰＡＦ（
　２０　ｎｇ、１．５　μＣｉ：第一化学薬品（株）製
）をそれぞれ供与した。

【００８５】Ｌｙｓｏ−ＰＡＦは、以下の構造を有する
、ＰＡＦに構造類似の市販の化合物である。

【００８６】

【化２】

【００８７】このカラムを、２０、　３０、　４０、　
５０、　６０、　７０、　８０、　９０　　および１０
０　％　のメタノ−ルをそれぞれ含有するメタノ−ル水
溶液各　５　ｍｌ　でステップワイズ法にて溶出し、各
溶出画分の放射活性を液体シンチレ−ションカウンタ−
（ＬＳＣ−１０００、アロカ）により測定した。

【００８８】その結果を図１に示す。

【００８９】図に示すように、　Ｌｙｓｏ−ＰＡＦは４
０％　までのメタノ−ル水溶液で溶出させた画分にその
ほとんどが溶出したのに対して、ＰＡＦは、８０％　の
メタノ−ル水溶液にて初めて溶出した。

【００９０】この結果は、本発明の抗体カラムの、ＰＡ
Ｆに対する強い特異性を示すものである。従って、実際
に検体試料中のＰＡＦの濃度を測定する場合には、試料
を該カラムに供与した後、先ず４０％　メタノ−ル水で
カラムを洗浄した後、８０％　メタノ−ル水で溶出すれ
ば、構造類似の化合物とは完全に分離できることが示さ
れた。

【００９１】実施例３．固定化抗体カラムによる検量線
実施例２で示した方法により、種々の濃度の　３Ｈ−Ｐ
ＡＦを含むラット血漿を抗体カラムに供与し、４０％　
メタノ−ル水　５　ｍｌ　でカラムを洗浄後、８０％　
メタノ−ル水で　５　ｍｌ　で溶出した。

【００９２】得られた検量線を図２に示す。

【００９３】供与量　０．５〜７　ｐｍｏｌｅ　のＰＡ
Ｆが、原点を通る直線関係で回収された。

【００９４】実施例４．抗体カラムにより抽出されたＰ
ＡＦのＲＩＡ　および生物活性測定法による定量実施例
２において記載した方法により、　３Ｈ−標識ＰＡＦ（
　　１０　ｐｍｏｌｅ）を抗体カラムに供与した。カラ
ムを４０％　メタノ−ル水　５　ｍｌ　で洗浄し居８０
％　メタン−ル水　５　ｍｌ　で溶出した。この溶出液
について、減圧下で溶媒を留去し、残渣をエタノ−ル　
５０　μｌ　に溶かし、以下の方法により、放射能の測
定並びにＲＩＡ　及び生物活性測定を行なった。

【００９５】（１）　放射能の測定 液体シンチレ−ションカウンタ−（ＬＳＣ−１０００、
　アロカ）により測定した。

【００９６】（２）　ＲＩＡ ［　１２５Ｉ］−ＲＩＡキット（第一化学薬品（株）製
）を用いて行なった。

【００９７】（３）　生物活性測定 ■多血小板血漿の調製 モルモットを麻酔下にて開腹し、腹部大動脈採血した。 この際、３．８％クエン酸ナトリウム溶液を血液量の１
／１０加えた。この血液を　２０　℃以下で遠心分離（
５０ｇ、１５分）し、上層をとり、多血小板血漿（ＰＲ
Ｐ　）とした。下層は、再度遠心分離（２０００ｇ、１
５分）し、上層をとり乏血小板血漿（ＰＰＰ　）とした
。

【００９８】ＰＲＰ　をＰＰＰ　により希釈し、血小板
数を　５　ｘ１０８個／ｍｌ　　に調製した。アグリゴ
メ−タ−（二光機材（株）製、モデルＰＡＴ−４Ｍ）に
ＰＰＰ　を入れたキュベットをセットし、これにより凝
集率　１００％　を設定し、次いで、ＰＲＰ　を用いて
同様に凝集率　０％　を設定した。試料の定量（１０μ
ｌ　）をＰＲＰ　に加え、アグリゴメ−タ−により凝集
曲線を求め、さらに、最大凝集率を求めた。

【００９９】別にＰＡＦ標準品（フナコシ社製）を用い
、ＰＲＰ　に加えて求めた検量線から、ＰＡＦ濃度を求
めた。

【０１００】図３は、　３Ｈ−ＰＡＦ標準液（１０　ｐ
ｍｏｌｅ）を抗体カラムに供与し溶出した画分について
、放射能測定による濃度、ＲＩＡ　及び生物活性を測定
した結果を示したものである。

【０１０１】三種の測定結果においてピ−クが一致し、
本発明の抗体カラムのＰＡＦに対する特異性の強さを示
している。

【０１０２】［　発明の効果］

【０１０３】

【効果】本発明により、主として、次のような効果を得
た。

【０１０４】（１）　本発明の固定化抗体カラムによる
前処理及びＰＡＦの生物活性測定法又は免疫測定法を用
いることにより、検体中濃度として０．１〜１０　ｐｍ
ｏｌｅ　　の範囲でＰＡＦの簡便な測定が可能となった
。

【０１０５】（２）　選択的な前処理法を用いることに
より、交差反応性を示す乃至は抗原抗体反応を阻害する
物質の効率的な除去が可能となった。 （３）　前処理に溶媒抽出やＨＰＬＣ法等の熟練を必要
とする工程が含まれておらず、容易であり自動化が可能
である。

【０１０６】（４）　用いた固定化抗体カラムを極性有
機溶媒で洗浄することにより再利用が可能である。

【０１０７】（５）　本発明による酵素免疫測定法はマ
イクロタイタープレートを用いることにより酵素活性の
自動測定も可能である。

【０１０８】（６）　ＧＣ−ＭＳ　法に比べ前処理が簡
単であり、一度に多数の測定が可能である。

【０１０９】

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例２で得られた、メタノ−ルの割合を漸増
させた溶液によるＰＡＦとｌｙｓｏ−　ＰＡＦの回収率
を示す。図２は、実施例３で得られたＰＡＦの標準品の
検量線を示す。図３は、実施例４で得られたＰＡＦの放
射活性、ＲＩＡ　及び生物活性測定による回収量の比較
を示す。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】血小板活性化因子誘導体と蛋白との結合物
   を免疫原として、第１動物に免疫感作して得られる第１
   抗体を、担体に固定化させたカラム用充填剤。
2. 【請求項２】請求項１記載のカラム用充填剤を充填した
   カラム。
3. 【請求項３】請求項２記載のカラムを用いて、血小板活
   性化因子を精製する方法。
4. 【請求項４】請求項２記載のカラムを用いて、血小板活
   性化因子を精製し、精製物の量を生物活性測定法又は免
   疫測定法により測定する方法。
5. 【請求項５】少なくとも、（Ａ）　請求項２記載のカラ
   ム、（Ｂ）　血小板活性化因子誘導体と蛋白との結合物
   を第１動物に免疫感作して得られる第１抗体、（Ｃ）　
   酵素又はラジオ・アイソト−プにて標識された血小板活
   性化因子からなる抗原及び（Ｄ）　第１動物の血清若し
   くはγ−　グロブリンを第２動物に免疫感作して得られ
   る第２抗体又はその固相担体結合物からなる血小板活性
   化因子の定量用組成物。
6. 【請求項６】少なくとも、（Ａ）　請求項２記載のカラ
   ム、（Ｂ）　血小板活性化因子に感受性を有する多血小
   板血漿からなる血小板活性化因子の定量用組成物。