JPH063446B2 - 不均一系免疫分析用の免疫反応性多孔性担体材料及びその製法 - Google Patents
不均一系免疫分析用の免疫反応性多孔性担体材料及びその製法Info
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- JPH063446B2 JPH063446B2 JP62150362A JP15036287A JPH063446B2 JP H063446 B2 JPH063446 B2 JP H063446B2 JP 62150362 A JP62150362 A JP 62150362A JP 15036287 A JP15036287 A JP 15036287A JP H063446 B2 JPH063446 B2 JP H063446B2
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- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、不均一系免疫分析（heterogene immunologis
he Analyse）用の担体材料、その製法に関する。
he Analyse）用の担体材料、その製法に関する。
従来の技術 不均一系免疫分析により、免疫学的に活性のレセプター
例えば抗体、抗原又はハプテンを測定することができ
る。このような方法は、当業者にとっては、例えば競争
試験、JEMA−試験又はサンドイッチ−試験なる名称のも
とで公知である。これらの方法に共通なことは、反応成
分の１つが洗浄除去不能に不溶性担体材料に固定（immo
bilisiert）されていることである。
例えば抗体、抗原又はハプテンを測定することができ
る。このような方法は、当業者にとっては、例えば競争
試験、JEMA−試験又はサンドイッチ−試験なる名称のも
とで公知である。これらの方法に共通なことは、反応成
分の１つが洗浄除去不能に不溶性担体材料に固定（immo
bilisiert）されていることである。
不溶性担体材料へのレセプターの固着は、共有結合又は
吸着結合により行なうことができる〔Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３ｂ ２０３〜２４４
頁（１９８１）及びＢ．Ｅ．Ｔ．Maggio “Enzyme Imm
unoassay”CAC Press,Florida １９８０、殊に１７５
〜１７８頁参照〕。
吸着結合により行なうことができる〔Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３ｂ ２０３〜２４４
頁（１９８１）及びＢ．Ｅ．Ｔ．Maggio “Enzyme Imm
unoassay”CAC Press,Florida １９８０、殊に１７５
〜１７８頁参照〕。
固相へのレセプターの共有結合も吸着結合も重大な欠点
を有する。吸着結合の場合に必要なレセプターの所の化
学的変化は、多くの場合に、レセプターの生物学的活性
の変化にも作用する。吸着結合の欠点は、被覆密度がひ
僅かで、担体材料の洗浄の際に、レセプターの脱着は完
全には阻止できないことにある。
を有する。吸着結合の場合に必要なレセプターの所の化
学的変化は、多くの場合に、レセプターの生物学的活性
の変化にも作用する。吸着結合の欠点は、被覆密度がひ
僅かで、担体材料の洗浄の際に、レセプターの脱着は完
全には阻止できないことにある。
担体材料へのレセプターのもう１つの固着法は、免疫沈
殿物−形成である〔例えばPCT-WO ８２／０２６０１号
及びＵＳ−Ａ−３８８６２９号明細書参照〕。この場合
は、固定すべきレセプターを沈降反応成分と共に担体材
料上で一緒にし、免疫沈降反応を起こさせる。レセプタ
ーとその免疫学的反応成分との間にはその沈降時に網が
生じ、これが担体材料の内部に及び／又は表面内に包埋
され、洗浄によりもはや溶解除去することはできない。
これにより、固定すべきレセプターの化学的変性なしに
高い被覆密度が達成される。
殿物−形成である〔例えばPCT-WO ８２／０２６０１号
及びＵＳ−Ａ−３８８６２９号明細書参照〕。この場合
は、固定すべきレセプターを沈降反応成分と共に担体材
料上で一緒にし、免疫沈降反応を起こさせる。レセプタ
ーとその免疫学的反応成分との間にはその沈降時に網が
生じ、これが担体材料の内部に及び／又は表面内に包埋
され、洗浄によりもはや溶解除去することはできない。
これにより、固定すべきレセプターの化学的変性なしに
高い被覆密度が達成される。
しかしながら、免疫沈降の公知方法は、この際に、レセ
プターが不均一に担体材料上に分配される欠点を有す
る。この欠点は、この担体材料が、例えば定量分析の目
的のために、低い濃度のハプテン又は蛋白質を使用すべ
き際に、特に不利である。この欠点は西ドイツ特許第３
４４６６３６号（その内容は、本発明の開示と関連す
る）によって克服することができる。
プターが不均一に担体材料上に分配される欠点を有す
る。この欠点は、この担体材料が、例えば定量分析の目
的のために、低い濃度のハプテン又は蛋白質を使用すべ
き際に、特に不利である。この欠点は西ドイツ特許第３
４４６６３６号（その内容は、本発明の開示と関連す
る）によって克服することができる。
西ドイツ特許第３４４６６３６号明細書中には、免疫反
応の第１成分及びこれと沈降反応性の第２の成分の各々
の溶液が施与され、この溶液で含浸された担体材料をイ
ンキュベートして免疫沈降反応を起こさせ、場合により
この含浸された担体材料を洗浄し、かつ引続き乾燥する
ことによる免疫反応性の多孔性担体材料の製法が記載さ
れており、その特徴は、免疫沈降の抑制物質を含有する
免疫反応の双方成分の溶液を製造し、担体材料をこの溶
液で含浸し、次いで抑制物質の除去又は抑制作用の解除
により免疫沈降反応を開始させることよりなっている。
応の第１成分及びこれと沈降反応性の第２の成分の各々
の溶液が施与され、この溶液で含浸された担体材料をイ
ンキュベートして免疫沈降反応を起こさせ、場合により
この含浸された担体材料を洗浄し、かつ引続き乾燥する
ことによる免疫反応性の多孔性担体材料の製法が記載さ
れており、その特徴は、免疫沈降の抑制物質を含有する
免疫反応の双方成分の溶液を製造し、担体材料をこの溶
液で含浸し、次いで抑制物質の除去又は抑制作用の解除
により免疫沈降反応を開始させることよりなっている。
しかしながら、免疫沈降反応により固定されたレセプタ
ーを含有する担体材料を使用する際には、多くの場合
に、検量線（測定信号／濃度）の精度及び直線性は満足
しうるものではないことが明らかになっている。
ーを含有する担体材料を使用する際には、多くの場合
に、検量線（測定信号／濃度）の精度及び直線性は満足
しうるものではないことが明らかになっている。
発明が解決しようとする問題点 従って、本発明の課題は、免疫沈殿物中に固定されたレ
セプターを含有する改良された担体材料を製造すること
にあり、これを用いて異種免疫学的試験で検量線の改良
された精度及び直線性を達成することができる。
セプターを含有する改良された担体材料を製造すること
にあり、これを用いて異種免疫学的試験で検量線の改良
された精度及び直線性を達成することができる。
問題点を解決するための手段 この課題は、本発明により、各々、レセプターの溶液及
びこの免疫学的沈降反応成分の溶液を担体材料に施与
し、この溶液で含浸された担体材料を免疫沈降するまで
インキュベートし、場合により、この含浸された担体材
料を洗浄しかつ引続き乾燥することよりなる不均一系免
疫分析用の免疫反応性の多孔性担体材料の製法により解
決され、その特徴は、レセプターと反応成分の濃度を、
含浸時にそのモル比がハイデルベルガー最大（Heidelbe
rger Maximum）で定義される比の値よりも大きいように
選択することよりなる。
びこの免疫学的沈降反応成分の溶液を担体材料に施与
し、この溶液で含浸された担体材料を免疫沈降するまで
インキュベートし、場合により、この含浸された担体材
料を洗浄しかつ引続き乾燥することよりなる不均一系免
疫分析用の免疫反応性の多孔性担体材料の製法により解
決され、その特徴は、レセプターと反応成分の濃度を、
含浸時にそのモル比がハイデルベルガー最大（Heidelbe
rger Maximum）で定義される比の値よりも大きいように
選択することよりなる。
意外にも、レセプターと免疫沈降性反応成分との比は、
検量線の精度及び直線性に著るしく影響することが明ら
かになった。特に、この際、免疫沈降反応に好適な濃度
比（例えばハイデルベルガー最大）では、この検量線の
最適精度及び直線性が達成されないことは意想外のこと
である。
検量線の精度及び直線性に著るしく影響することが明ら
かになった。特に、この際、免疫沈降反応に好適な濃度
比（例えばハイデルベルガー最大）では、この検量線の
最適精度及び直線性が達成されないことは意想外のこと
である。
レセプター及び免疫反応成分のモル濃度を、その比がハ
イデルベルガー最大により定義される比の値よりも大き
くなるように選択する。このハイデルベルガー最大の比
の値は、濁り試験により容易に予め決定することができ
る。相応する濁り曲線は、例えば、Methods in Immunol
ogy and Immunochemistry III巻、Academic press１９
７１、１３章、１０頁に記載されている。このような曲
線の製出の際に、双方の反応成分の１方が一定量で、他
方の反応成分が増加量の際に得られる濁りを図に描く。
この最大の濁りがハイデルベルガー最大である。
イデルベルガー最大により定義される比の値よりも大き
くなるように選択する。このハイデルベルガー最大の比
の値は、濁り試験により容易に予め決定することができ
る。相応する濁り曲線は、例えば、Methods in Immunol
ogy and Immunochemistry III巻、Academic press１９
７１、１３章、１０頁に記載されている。このような曲
線の製出の際に、双方の反応成分の１方が一定量で、他
方の反応成分が増加量の際に得られる濁りを図に描く。
この最大の濁りがハイデルベルガー最大である。
通例、精製使用物質に関するレセプター対沈降反応成分
のモル比に関するハイデルベルガー最大は約１：3.5で
ある。
のモル比に関するハイデルベルガー最大は約１：3.5で
ある。
この比の値がより大きい場合に、本発明による有利な作
用が得られる。１．３以上の比の値を使用するのが有利
である。特に１：2.5より大きく、１：１より小さく選
択するのが有利である。
用が得られる。１．３以上の比の値を使用するのが有利
である。特に１：2.5より大きく、１：１より小さく選
択するのが有利である。
レセプター及び沈降性反応成分は、連続的に又は同時に
担体材料上に施与することができる。連続的方法では、
担体材料を、まずレセプター又は沈降性反応成分で含浸
し、引続き相応する他の成分を溶液として添加する。し
かしながら、担体材料の含浸を同時に実施するのが有利
である。特に、抑制物質の存在での含浸（西ドイツ特許
第３４４６６３６号明細書記載のように）を行なうのが
有利である。この際、１工程法も２工程法も有利であ
る。レセプター及び免疫沈降性反応成分の架橋を得るた
めに、双方の関連するそれらの免疫学的な結合可能性は
相互に少なくとも二価（bivalent）であるべきである。
例えば免疫沈殿物は、２個の二価抗体又は抗体フラグメ
ントの間で又は１個の抗体とハプテン化蛋白質の間で生
じることができる。
担体材料上に施与することができる。連続的方法では、
担体材料を、まずレセプター又は沈降性反応成分で含浸
し、引続き相応する他の成分を溶液として添加する。し
かしながら、担体材料の含浸を同時に実施するのが有利
である。特に、抑制物質の存在での含浸（西ドイツ特許
第３４４６６３６号明細書記載のように）を行なうのが
有利である。この際、１工程法も２工程法も有利であ
る。レセプター及び免疫沈降性反応成分の架橋を得るた
めに、双方の関連するそれらの免疫学的な結合可能性は
相互に少なくとも二価（bivalent）であるべきである。
例えば免疫沈殿物は、２個の二価抗体又は抗体フラグメ
ントの間で又は１個の抗体とハプテン化蛋白質の間で生
じることができる。
従って、レセプターとしては、免疫学的に少なくとも二
価の物質例えば抗体及びその二価のフラグメント（これ
らはモノクロナールでもポリクロナールであってもよ
い）及び他の蛋白質が好適である。同様に、抗原又はハ
プテン化蛋白質が好適である。免疫学的測定のために、
固定されたハプテンを使用すべき際には、レセプターと
してポリハプテンを使用するのが好適である。この場
合、例えば、一価であってもよいハプテン分子数個が二
価又は多価（multivatent）の担体蛋白質に、例えば抗
体又は血清アルブミンに結合している。これにより、一
価のハプテンに関しても免疫沈降が達成されうる。
価の物質例えば抗体及びその二価のフラグメント（これ
らはモノクロナールでもポリクロナールであってもよ
い）及び他の蛋白質が好適である。同様に、抗原又はハ
プテン化蛋白質が好適である。免疫学的測定のために、
固定されたハプテンを使用すべき際には、レセプターと
してポリハプテンを使用するのが好適である。この場
合、例えば、一価であってもよいハプテン分子数個が二
価又は多価（multivatent）の担体蛋白質に、例えば抗
体又は血清アルブミンに結合している。これにより、一
価のハプテンに関しても免疫沈降が達成されうる。
この反応の免疫沈降性反応成分は、レセプターに相応し
て選択されるべきである。このために、二価であり、レ
セプターに対応している抗体を使用するのが有利であ
る。特に、レセプターに対してできるだけ高い親和性を
有し、従って担体材料上の免疫沈殿物の固着ができるだ
け堅固である抗体を使用するのが有利である。
て選択されるべきである。このために、二価であり、レ
セプターに対応している抗体を使用するのが有利であ
る。特に、レセプターに対してできるだけ高い親和性を
有し、従って担体材料上の免疫沈殿物の固着ができるだ
け堅固である抗体を使用するのが有利である。
担体材料としては、本発明の範囲で免疫反応性物質に慣
用の固体担体がこれに該当する。屡々マトリックスとも
称されるこのような担体材料は、例えばガラス、プラス
チック、紙、多孔性金属又は類似物より成っていてよ
く、この担体材料は、充分に繋がりのある液体通過性の
充分な中空室で貫通することを前提としている。天然、
人工、有機又は無機のポリマーも好適である。同様に繊
維状、スポンジ状又は焼結された物質がこれに該当す
る。この試薬担体は平面状、粒状又は他の形で使用する
ことができる。特に、試薬担体としては、平面状の多孔
性担体例えば、紙、フォームシート、ガラスマット又は
類似物を使用するのが有利である。
用の固体担体がこれに該当する。屡々マトリックスとも
称されるこのような担体材料は、例えばガラス、プラス
チック、紙、多孔性金属又は類似物より成っていてよ
く、この担体材料は、充分に繋がりのある液体通過性の
充分な中空室で貫通することを前提としている。天然、
人工、有機又は無機のポリマーも好適である。同様に繊
維状、スポンジ状又は焼結された物質がこれに該当す
る。この試薬担体は平面状、粒状又は他の形で使用する
ことができる。特に、試薬担体としては、平面状の多孔
性担体例えば、紙、フォームシート、ガラスマット又は
類似物を使用するのが有利である。
本発明により製造された免疫反応性担体材料の不均一系
酵素免疫検定の領域での使用は、例えば試料例えば緩衝
液、血清、血漿、尿、培養上澄み等中に含有されている
ハプテン（Ｈ）又は蛋白質（Ｐ）に標識された結合剤
（Ｂ）を添加することにより実施することができる。結
合剤（Binder）としては、特にハプテン又は蛋白質と特
異的に反応する抗体、Fab-−フラグメントもしくはFab
−フラグメント並びにリガンド（Liganden）がこれに該
当する。結合剤の標識としては、例えば、酵素、蛍光−
ラベル又はラジオアイソトープを使用することができ、
後の例ではβ−ガラクトシダーゼを選択した。結合剤添
加量は、試料中に存在するハプテン又は蛋白質に対して
当モルでも、過剰でも少なくてもよい。
酵素免疫検定の領域での使用は、例えば試料例えば緩衝
液、血清、血漿、尿、培養上澄み等中に含有されている
ハプテン（Ｈ）又は蛋白質（Ｐ）に標識された結合剤
（Ｂ）を添加することにより実施することができる。結
合剤（Binder）としては、特にハプテン又は蛋白質と特
異的に反応する抗体、Fab-−フラグメントもしくはFab
−フラグメント並びにリガンド（Liganden）がこれに該
当する。結合剤の標識としては、例えば、酵素、蛍光−
ラベル又はラジオアイソトープを使用することができ、
後の例ではβ−ガラクトシダーゼを選択した。結合剤添
加量は、試料中に存在するハプテン又は蛋白質に対して
当モルでも、過剰でも少なくてもよい。
この混合物をその間に複合体Ｈ−ＢもしくはＰ−Ｂが生
じる一定時間インキュベートする。この時間の経過後
に、反応混合物中に３種の特定物即ちハプテン／蛋白質
及び結合剤よりなる複合体（Ｈ−Ｂ、Ｐ−Ｂ）、残りの
遊離のハプテン／蛋白質（Ｈ／Ｐ）及び残りの遊離結合
剤（Ｂ）が存在する。
じる一定時間インキュベートする。この時間の経過後
に、反応混合物中に３種の特定物即ちハプテン／蛋白質
及び結合剤よりなる複合体（Ｈ−Ｂ、Ｐ−Ｂ）、残りの
遊離のハプテン／蛋白質（Ｈ／Ｐ）及び残りの遊離結合
剤（Ｂ）が存在する。
これら特定物の分離は２工程で免疫吸着を用いて行な
う。このために、この混合物を本発明により製造された
免疫沈降−固相（これは検出すべきハプテンもしくは測
定すべき蛋白質に対する抗体を結合含有する）上に施与
する。
う。このために、この混合物を本発明により製造された
免疫沈降−固相（これは検出すべきハプテンもしくは測
定すべき蛋白質に対する抗体を結合含有する）上に施与
する。
−ハプテン試験時に、今度は、ハプテンで飽和された結
合剤ではなく遊離の結合剤が固相に結合する。結果的
に、固相の上澄みもしくは溶離液は、試料のハプテンで
飽和された結合剤を含有する。ハプテンの定量測定は、
結合剤の標識付けを介して、本発明の例では、о−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド又はクロルフェノー
ルロート−β−Ｄ−カラクトシドを用いるβ−ガラクト
シダーゼの測定を介して行なう。
合剤ではなく遊離の結合剤が固相に結合する。結果的
に、固相の上澄みもしくは溶離液は、試料のハプテンで
飽和された結合剤を含有する。ハプテンの定量測定は、
結合剤の標識付けを介して、本発明の例では、о−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド又はクロルフェノー
ルロート−β−Ｄ−カラクトシドを用いるβ−ガラクト
シダーゼの測定を介して行なう。
−蛋白質試験では、蛋白質及び結合剤からの複合体（し
かしながら遊離の結合剤ではない）が固相に結合し、遊
離結合剤の残分は、洗浄により、本発明で製造された免
疫吸着剤から除去される。蛋白質の定量測定は標識付結
合剤を介し、о−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド又はクロルフェノールロート−β−Ｄ−カラクトシド
を用いるβ−ガラクトシダーゼの測定を経て行なう。
かしながら遊離の結合剤ではない）が固相に結合し、遊
離結合剤の残分は、洗浄により、本発明で製造された免
疫吸着剤から除去される。蛋白質の定量測定は標識付結
合剤を介し、о−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド又はクロルフェノールロート−β−Ｄ−カラクトシド
を用いるβ−ガラクトシダーゼの測定を経て行なう。
他の用途は競争的免疫試験（kompetitive Immuntests）
である。本発明により製造された免疫反応性担体材料の
使用は、試料中に含まれている分析質（Analyt；ハプテ
ン又は蛋白質）に一定量の標識された分析質を添加する
ようにして行なうことができる。この標識は、例えば酵
素、蛍光−ラベル、ラジオアイソトープ及び他のもので
あってよい。この混合物をマトリックス上に加える。こ
のマトリックス上には、分析質に対応している抗体が固
定されている。この混合物をマトリックス上で一定時間
インキュベートする。この時間の間に、非変化分析質も
標識された分析質もマトリックス上の結合位置を競い合
う。試料中に分析質が多く存在するほど、標識された分
析質がより少なくマトリックスにより結合され、その逆
も成り立つ。インキュベーション相の終りに、多孔性マ
トリックスから液体を例えば遠心分離により除去する。
次いで、標識された分析質の量を、遊離相中で又はマト
リックスに結合した標識付分析質の量で測定する。
である。本発明により製造された免疫反応性担体材料の
使用は、試料中に含まれている分析質（Analyt；ハプテ
ン又は蛋白質）に一定量の標識された分析質を添加する
ようにして行なうことができる。この標識は、例えば酵
素、蛍光−ラベル、ラジオアイソトープ及び他のもので
あってよい。この混合物をマトリックス上に加える。こ
のマトリックス上には、分析質に対応している抗体が固
定されている。この混合物をマトリックス上で一定時間
インキュベートする。この時間の間に、非変化分析質も
標識された分析質もマトリックス上の結合位置を競い合
う。試料中に分析質が多く存在するほど、標識された分
析質がより少なくマトリックスにより結合され、その逆
も成り立つ。インキュベーション相の終りに、多孔性マ
トリックスから液体を例えば遠心分離により除去する。
次いで、標識された分析質の量を、遊離相中で又はマト
リックスに結合した標識付分析質の量で測定する。
本発明により製造された担体材料のもう１つの使用は、
分析質（ハプテン又は蛋白質）に、この分析質に対応し
ている標識付抗体一定量を添加するようにして行なうこ
とができる。この抗体の標識の可能な種類は前記した。
この混合物を一定時間インキュベートし、次いで多孔性
担体材料上に加えるか、又は混合の直後に多孔性担体材
料上に加える。分析質がハプテンである場合には、この
担体材料は検出すべきハプテン又はその誘導体を固定さ
れた形で含有し、この分析質が蛋白質である場合には、
担体材料は検出すべき蛋白質又はその誘導体を同様に固
定された形で含有する。第１の混合物を担体材料に施与
する前にインキュベートしたら、標識付き抗体は、多孔
性担体材料のなお自由な結合位置と結合する。混合物を
直ちに担体材料上に加えると、試料の分析質及び担体材
料上に加えると、試料の分析質及び担体材料に固定され
た分析質は標識された抗体の結合位置を競い合う。イン
キュベーション相の最後に、多孔性担体材料から液体を
除去し、液相中で、又は多孔性担体上の標識された抗体
の量を測定する。
分析質（ハプテン又は蛋白質）に、この分析質に対応し
ている標識付抗体一定量を添加するようにして行なうこ
とができる。この抗体の標識の可能な種類は前記した。
この混合物を一定時間インキュベートし、次いで多孔性
担体材料上に加えるか、又は混合の直後に多孔性担体材
料上に加える。分析質がハプテンである場合には、この
担体材料は検出すべきハプテン又はその誘導体を固定さ
れた形で含有し、この分析質が蛋白質である場合には、
担体材料は検出すべき蛋白質又はその誘導体を同様に固
定された形で含有する。第１の混合物を担体材料に施与
する前にインキュベートしたら、標識付き抗体は、多孔
性担体材料のなお自由な結合位置と結合する。混合物を
直ちに担体材料上に加えると、試料の分析質及び担体材
料上に加えると、試料の分析質及び担体材料に固定され
た分析質は標識された抗体の結合位置を競い合う。イン
キュベーション相の最後に、多孔性担体材料から液体を
除去し、液相中で、又は多孔性担体上の標識された抗体
の量を測定する。
実施例 次の例で本発明を詳述する。
試験に使用される装入物質の取得及び試験法（西ドイツ
特許第３４４６６３６号明細書参照）： A)ポリハプテン（ＰＨ）の製造： ＰＨの製造は技術水準である。例えば、ジゴキシン−又
はジフェニル−ヒダントイン−ＰＨは反応性の非対称的
ジカルボン酸エステル／活性化ハプテンエステル及び担
体蛋白質へのその結合により得ることができる。
特許第３４４６６３６号明細書参照）： A)ポリハプテン（ＰＨ）の製造： ＰＨの製造は技術水準である。例えば、ジゴキシン−又
はジフェニル−ヒダントイン−ＰＨは反応性の非対称的
ジカルボン酸エステル／活性化ハプテンエステル及び担
体蛋白質へのその結合により得ることができる。
担体蛋白質の選択は、相応する沈殿性抗体のみが供給さ
れるかもしくは製造されるかぎり、限定されない。
れるかもしくは製造されるかぎり、限定されない。
テオフィリン−ＰＨの製造は、例えばテオフィリン−７
−酪酸（欧州特許第００１３９１０により製造）又はテ
オフィリン−７−プロピオン酸を介して、そのRSA又は
他の蛋白質への結合により行なうこができる（Nishikaw
a,Clin.Chim.Acta９１、１９７９、５９〜６５、Erleng
er,J.Biol.Chem．２２８、１９７５、７１３〜７２７参
照）。
−酪酸（欧州特許第００１３９１０により製造）又はテ
オフィリン−７−プロピオン酸を介して、そのRSA又は
他の蛋白質への結合により行なうこができる（Nishikaw
a,Clin.Chim.Acta９１、１９７９、５９〜６５、Erleng
er,J.Biol.Chem．２２８、１９７５、７１３〜７２７参
照）。
Ｂ．結合剤（例えばテオフィリン）の製造 免疫原並びに抗血清の製造は、例えば特開昭５７−０９
９５９８号、西ドイツ特許出願公開（ＤＥ−ＯＳ）第２
８０５９６１号、欧州特許（ＥＰ）００１３９１０号、
欧州特許００９８１７９号、欧州特許００７７８９６号
明細書、Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.１３、１
９７６、４９５〜５０５又はClin.Chim.Acta.９１、１
９７９、５９〜６５の記載に従って行なうことができ
る。
９５９８号、西ドイツ特許出願公開（ＤＥ−ＯＳ）第２
８０５９６１号、欧州特許（ＥＰ）００１３９１０号、
欧州特許００９８１７９号、欧州特許００７７８９６号
明細書、Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.１３、１
９７６、４９５〜５０５又はClin.Chim.Acta.９１、１
９７９、５９〜６５の記載に従って行なうことができ
る。
抗原及び抗体の免疫吸着的精製 （immunosortive Aufreinigung）を行なう場合、担体と
してベーリンガーマンハイム社の親和性吸着剤、グルタ
ールジアルデヒド（活性）（整理番号６６５５２５）を
用いた。以後に記載の例に関して、抗原−製造者の処方
に依り、抗原−精製のために、ウサギ−IgGに対するSch
af−抗体もしくはそのハプテンに対する特異的抗体及び
抗体−精製のために、ウサギIgGを担体に結合させた。
免疫吸着の実施は、親和性吸着（Affimittsadsorben
s）のための作業指針の記載と同様に行なった。
してベーリンガーマンハイム社の親和性吸着剤、グルタ
ールジアルデヒド（活性）（整理番号６６５５２５）を
用いた。以後に記載の例に関して、抗原−製造者の処方
に依り、抗原−精製のために、ウサギ−IgGに対するSch
af−抗体もしくはそのハプテンに対する特異的抗体及び
抗体−精製のために、ウサギIgGを担体に結合させた。
免疫吸着の実施は、親和性吸着（Affimittsadsorben
s）のための作業指針の記載と同様に行なった。
テオフィリンに対応する抗血清は、硫酸アンモニウム−
沈殿を経て又はDEAE−セルロース上の通過を経て、IgG
−フラクションまで精製した。パパイン−分解（Papain
-Spaltung）は、Ｒ．Ｒ．Porter,Biochem.J.７３、１１
９〜１２６（１９５９）により実施した。
沈殿を経て又はDEAE−セルロース上の通過を経て、IgG
−フラクションまで精製した。パパイン−分解（Papain
-Spaltung）は、Ｒ．Ｒ．Porter,Biochem.J.７３、１１
９〜１２６（１９５９）により実施した。
Fab−フラグメントを、非消化IgG−分子及びFc−フラグ
メントから、セファデックスＧ１００のゲルクロマトグ
ラフィ及びDEAE−セルロース上のイオン交換クロマトグ
ラフィを用いて、文献記載の処方により分離した（K.Mo
linowski及びW.ManskiによるMethods in Enzymology；
J.J.Langone及びH.van Vunakis、Academic Press発行７
３巻（１９８１）４１８〜４５９頁参照）。生じるFab
−フラクションをクロマトグラフィで精製し、β−ガラ
クトシダーゼに、T.kitiwagaによるEnzyme Immunoassa
y；Ishikawa,T.Kawai、K.Miyai,Igaku Shoin,Tokyo／New
York発行（１９８１）、８１〜８９頁に記載の処方に
より、結合させた。
メントから、セファデックスＧ１００のゲルクロマトグ
ラフィ及びDEAE−セルロース上のイオン交換クロマトグ
ラフィを用いて、文献記載の処方により分離した（K.Mo
linowski及びW.ManskiによるMethods in Enzymology；
J.J.Langone及びH.van Vunakis、Academic Press発行７
３巻（１９８１）４１８〜４５９頁参照）。生じるFab
−フラクションをクロマトグラフィで精製し、β−ガラ
クトシダーゼに、T.kitiwagaによるEnzyme Immunoassa
y；Ishikawa,T.Kawai、K.Miyai,Igaku Shoin,Tokyo／New
York発行（１９８１）、８１〜８９頁に記載の処方に
より、結合させた。
C)ウサギ−もしくはマウス−IgG／Fcrに対するSchaf−
抗体の製造 ウサギ−屠殺血清もしくはマウス血清を硫酸アンモニウ
ム沈殿させた。DEAE−セルロース上の通過及びパパイン
分解、ゲル−及びイオン交換体クロマトグラフィ（Ｂ参
照）の後に、免疫原としてのウサギ−もしくはマウス−
IgGのFc−フラグメントが得られる。
抗体の製造 ウサギ−屠殺血清もしくはマウス血清を硫酸アンモニウ
ム沈殿させた。DEAE−セルロース上の通過及びパパイン
分解、ゲル−及びイオン交換体クロマトグラフィ（Ｂ参
照）の後に、免疫原としてのウサギ−もしくはマウス−
IgGのFc−フラグメントが得られる。
Schaf−抗血清の後処理は、B)の記載により行なう。
D) 試験（例テオフィリン）： 牛血清アルブミン含有緩衝液中のテオフィリン標準物を
0.9％Nacl−溶液で１：１００に希釈した。希釈標準物
２００μに対して、B)の記載のように製造された結合
剤２００μ（1.6U／μ、オルト−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシドで測定）をPBS（燐酸塩緩衝塩pH
7.8）中で３７゜Cでインキュベートした。
0.9％Nacl−溶液で１：１００に希釈した。希釈標準物
２００μに対して、B)の記載のように製造された結合
剤２００μ（1.6U／μ、オルト−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシドで測定）をPBS（燐酸塩緩衝塩pH
7.8）中で３７゜Cでインキュベートした。
その後、この混合物の５０μを平面状の免疫反応性担
体材料の１cm2上に与える。３７゜Cで更に５分間インキ
ュベートし、エイペンドルフ遠心機（Eippendorf-Zentr
ifuge）を用いて１分間遠心する。
体材料の１cm2上に与える。３７゜Cで更に５分間インキ
ュベートし、エイペンドルフ遠心機（Eippendorf-Zentr
ifuge）を用いて１分間遠心する。
遊離相中のテオフィリン−結合剤−複合体の酵素活性
を、運動力学的にオルト−ニトロ−フェニル−β−Ｄ−
ガラクトシドの添加により４１０nmで測定することがで
きる。
を、運動力学的にオルト−ニトロ−フェニル−β−Ｄ−
ガラクトシドの添加により４１０nmで測定することがで
きる。
例 １ テオフィリン−免疫沈殿物−フリースの製造 抗原として、ウサギ−IgG及びこれに結合したテオフィ
リン（モル比IgG：テオフィリン＝１：３）よりなるポ
リハプテン（ＰＨ）を用いた。この抗原をイオン交換体
クロマトグラフィで精製した。
リン（モル比IgG：テオフィリン＝１：３）よりなるポ
リハプテン（ＰＨ）を用いた。この抗原をイオン交換体
クロマトグラフィで精製した。
沈殿性抗体（FAK）として、ウサギ−IgGのFc−部に対応
するポリクロナール抗体を用いた。この抗体はウサギ−
IgG−カラム上の免疫吸着により精製した。
するポリクロナール抗体を用いた。この抗体はウサギ−
IgG−カラム上の免疫吸着により精製した。
多孔性担体材料（フリース）として、ステープルファイ
バー（Zellwolle）及びポリエステルからの混合フリー
ス（カルフ社：Firma Kalff Euskirchen,Deutschland）
又はリンター（Linter）、ステープルファイバー、ポリ
アミドからの混合フリース（ビンツァ-社:Firma Binzer,Hat
zfeld,Eder,Deutschland）を用いた。
バー（Zellwolle）及びポリエステルからの混合フリー
ス（カルフ社：Firma Kalff Euskirchen,Deutschland）
又はリンター（Linter）、ステープルファイバー、ポリ
アミドからの混合フリース（ビンツァ-社:Firma Binzer,Hat
zfeld,Eder,Deutschland）を用いた。
抗原（ｃ＝1.5mg／ｍ）及び抗体〔ｃ＝3mg／ｍ比
１：２もしくは5.25mg／ｍ比１：３．５（ハイデルベ
ルガー最大）〕を別々に酢酸５０mM／中に入れる。次
いで、室温で１時間放置する。溶液を比１：１混合す
る。引続く工程で溶液を酢酸５０mM/＋塩化ナトリウ
ム１００mM／の４部で希釈する。この溶液を再度室温
で３０分間放置する。引続きフリースに含浸溶液を吸引
させ、３０゜Cで３０分間循環空気乾燥箱中で乾燥させ
る。
１：２もしくは5.25mg／ｍ比１：３．５（ハイデルベ
ルガー最大）〕を別々に酢酸５０mM／中に入れる。次
いで、室温で１時間放置する。溶液を比１：１混合す
る。引続く工程で溶液を酢酸５０mM/＋塩化ナトリウ
ム１００mM／の４部で希釈する。この溶液を再度室温
で３０分間放置する。引続きフリースに含浸溶液を吸引
させ、３０゜Cで３０分間循環空気乾燥箱中で乾燥させ
る。
得られる検量線の直線性が第１図に示されている。ハイ
デルベルガー最大での濃度比と比べて１：２の反応成分
比では、１０μg／μのテオフィリン標準物の測定の
精度が６％の変動係数から約３％の変動係数まで改良さ
れた。
デルベルガー最大での濃度比と比べて１：２の反応成分
比では、１０μg／μのテオフィリン標準物の測定の
精度が６％の変動係数から約３％の変動係数まで改良さ
れた。
例 ２ テオフィリンに関するハイデルベルガー曲線の作成 キュベット中に、それぞれ沈殿性ＡＫの公知濃度の１定
量（4.1mg／ｍ）を予め装入し、公知濃度（2.6mg／ｍ
）の抗原溶液（pH−溶液）の増加性量を加える。濁り
増加の運動力学（kinetik）を光度計でλ＝３４０nmで
観察する。このハイデルベルガー最大は、最も速い濁り
変化を伴なう濃度比に相当する。第２図から、次の比で
ハイデルベルガー最大が得られる： 例 ３ ジフェニルヒダントイン（DPH）−免疫沈殿物−フリー
スの製造 ジフェニルヒダントイン−免疫沈殿物−フリースの製造
は、例１と同様に行なう。得られる検量線の直線性が第
３図に示されている。
量（4.1mg／ｍ）を予め装入し、公知濃度（2.6mg／ｍ
）の抗原溶液（pH−溶液）の増加性量を加える。濁り
増加の運動力学（kinetik）を光度計でλ＝３４０nmで
観察する。このハイデルベルガー最大は、最も速い濁り
変化を伴なう濃度比に相当する。第２図から、次の比で
ハイデルベルガー最大が得られる： 例 ３ ジフェニルヒダントイン（DPH）−免疫沈殿物−フリー
スの製造 ジフェニルヒダントイン−免疫沈殿物−フリースの製造
は、例１と同様に行なう。得られる検量線の直線性が第
３図に示されている。
第１図は、例１により得られる検量線を示す図、第２図
は例２により得られるテオフィリンに関するハイデルベ
ルガー曲線を示す図、第３図は、例３により得られる較
正曲線を示す図である。
は例２により得られるテオフィリンに関するハイデルベ
ルガー曲線を示す図、第３図は、例３により得られる較
正曲線を示す図である。
Claims (10)
- 【請求項１】不均一系免疫分析用担体材料において、レ
セプター及び免疫学的沈降性反応成分をハイデルベルガ
ー最大により定義される比の値よりも大きいモル比で含
有することを特徴とする、不均一系免疫分析用の免疫反
応性多孔性担体材料。 - 【請求項２】レセプター対反応成分の比の値は１：３よ
り大きいか又は同じである、特許請求の範囲第１項記載
の担体材料。 - 【請求項３】レセプター対反応成分のモル比は１：２．
５と１：１の間である、特許請求の範囲第１項記載の担
体材料。 - 【請求項４】レセプター及びこの免疫学的沈降性反応成
分の各溶液を担体材料上に施与し、この溶液で含浸され
た担体材料を沈降反応までインキュベーションし、場合
により引続き、この含浸された担体材料を洗浄し、かつ
乾燥させることにより不均一系免疫分析用の免疫反応性
多孔性担体材料を製造するため、レセプター及び反応成
分の濃度を、含浸時にそのモル比がハイデルベルガー最
大により定義される比の値よりも大きくなるように選択
することを特徴とする、不均一系免疫分析用の免疫反応
性多孔性担体材料の製法。 - 【請求項５】レセプター及び反応成分を１：３より大き
いか又は同じモル比で使用する、特許請求の範囲第４項
記載の方法。 - 【請求項６】レセプター及び反応成分を１：２．５〜
１：１のモル比で使用する、特許請求の範囲第４項又は
第５項記載の方法。 - 【請求項７】溶液の少なくとも１方に免疫沈降抑制物質
１種を含有するレセプター及び反応成分の各々の溶液を
使用し、担体材料をこれらの溶液で含浸し、次いで抑制
剤の除去により又は抑制作用の解除により免疫沈降反応
を開始させる、特許請求の範囲第４項から第６項までの
いずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】レセプターとして蛋白質を、かつ反応成分
としてこの蛋白質に対応する抗体又はそのフラグメント
を使用する、特許請求の範囲第４項から第７項までのい
ずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】レセプターとして、少なくとも１個のハプ
テン又は抗原が結合している蛋白質を使用する、特許請
求の範囲第８項記載の方法。 - 【請求項１０】蛋白質として、抗体又はその少なくとも
１個のハプテン又は抗原分子が結合しているフラグメン
トを使用する、特許請求の範囲第９項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3620653.9 | 1986-06-20 | ||
| DE19863620653 DE3620653A1 (de) | 1986-06-20 | 1986-06-20 | Verfahren zur herstellung eines immunreaktiven traegermaterials fuer die heterogene immunologische analyse |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6366462A JPS6366462A (ja) | 1988-03-25 |
| JPH063446B2 true JPH063446B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=6303306
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62150362A Expired - Lifetime JPH063446B2 (ja) | 1986-06-20 | 1987-06-18 | 不均一系免疫分析用の免疫反応性多孔性担体材料及びその製法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4820633A (ja) |
| EP (1) | EP0249877B1 (ja) |
| JP (1) | JPH063446B2 (ja) |
| AT (1) | ATE80738T1 (ja) |
| DE (2) | DE3620653A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JPS5787645A (en) * | 1980-11-20 | 1982-06-01 | Ricoh Co Ltd | Priority control system |
| DE3735684A1 (de) * | 1987-10-22 | 1989-05-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Immunreaktives traegermaterial und verfahren zu seiner herstellung |
| DE3802366A1 (de) * | 1988-01-27 | 1989-08-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Traegervlies fuer abloesbar impraegnierte reagenzien |
| FR2638234B1 (fr) * | 1988-10-21 | 1992-11-27 | Rhone Poulenc Chimie | Support pour molecules biologiquement actives ou lui-meme biologiquement actif, son procede de preparation et son application en biologie |
| WO1994006345A2 (en) * | 1992-09-11 | 1994-03-31 | Dambinova Svetlana Alexandrovn | Immunosorbent for use in the diagnosis of neuro-psychological disorders, and use thereof |
| DE4343261C2 (de) * | 1993-12-17 | 1995-11-02 | Susanne Holzer | Verfahren zur präparativen Herstellung von Ausgangsstoffen für Immunoassays und Bioassays |
| JP4545869B2 (ja) * | 2000-02-23 | 2010-09-15 | 日本ケミファ株式会社 | 多孔性フィルタを用いる生理活性試料物質の測定方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1420916A (en) * | 1971-09-08 | 1976-01-14 | Bagshawe K D | Performance of chemical or biological reactions |
| CA983358A (en) * | 1971-09-08 | 1976-02-10 | Kenneth D. Bagshawe | Performance of chemical or biological reactions |
| DE2258822A1 (de) * | 1972-12-01 | 1974-06-06 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und mittel zur analyse von isoenzymmustern |
| US4156081A (en) * | 1977-04-15 | 1979-05-22 | Syva Company | Theophylline antigens and antibodies |
| DE2901218A1 (de) * | 1979-01-13 | 1980-07-17 | Byk Gulden Lomberg Chem Fab | Ung von theophyllin |
| JPS5799598A (en) * | 1980-12-12 | 1982-06-21 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Hapten antigen and its synthetic intermediate |
| US4517288A (en) * | 1981-01-23 | 1985-05-14 | American Hospital Supply Corp. | Solid phase system for ligand assay |
| US4604365A (en) * | 1981-06-02 | 1986-08-05 | Electro-Nucleonics, Inc. | Immunoprecipitation assay |
| US4533493A (en) * | 1981-08-27 | 1985-08-06 | Miles Laboratories, Inc. | Theophylline immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives |
| US4524025A (en) * | 1982-06-30 | 1985-06-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Hybridoma cell lines and monoclonal antibodies to theophylline |
| DE3225027A1 (de) * | 1982-07-05 | 1984-01-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunchemisches messverfahren |
| DE3446636A1 (de) * | 1984-12-20 | 1986-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung eines immunreaktiven poroesen traegermaterials |
-
1986
- 1986-06-20 DE DE19863620653 patent/DE3620653A1/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-06-08 US US07/059,066 patent/US4820633A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-11 EP EP87108408A patent/EP0249877B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-11 DE DE8787108408T patent/DE3781721D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-11 AT AT87108408T patent/ATE80738T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-06-18 JP JP62150362A patent/JPH063446B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE80738T1 (de) | 1992-10-15 |
| EP0249877A3 (en) | 1989-02-01 |
| US4820633A (en) | 1989-04-11 |
| EP0249877A2 (de) | 1987-12-23 |
| DE3620653A1 (de) | 1987-12-23 |
| JPS6366462A (ja) | 1988-03-25 |
| DE3781721D1 (de) | 1992-10-22 |
| EP0249877B1 (de) | 1992-09-16 |
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